CN110551722B - 一种核酸复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种核酸复合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110551722B
CN110551722B CN201910843814.4A CN201910843814A CN110551722B CN 110551722 B CN110551722 B CN 110551722B CN 201910843814 A CN201910843814 A CN 201910843814A CN 110551722 B CN110551722 B CN 110551722B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
strand
dna
seq
chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910843814.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110551722A (zh
Inventor
丁宝全
刘建兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Center for Nanosccience and Technology China
Original Assignee
National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Center for Nanosccience and Technology China filed Critical National Center for Nanosccience and Technology China
Priority to CN201910843814.4A priority Critical patent/CN110551722B/zh
Publication of CN110551722A publication Critical patent/CN110551722A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110551722B publication Critical patent/CN110551722B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供了一种核酸复合物及其制备方法和应用，所述核酸复合物由一条核酸长链与一条核酸短链互补配对形成；所述核酸长链包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链；所述核酸短链包括3’延伸链的互补链。本发明通过合理的序列和结构设计，将行使基因编辑和基因沉默功能的两类基因治疗体系集成于一种核酸复合物中，构建的核酸复合物同时发挥基因编辑和基因沉默的功能，实现协同的基因治疗效果，作为基因治疗药物具有优良的潜力，在肿瘤治疗、遗传病治疗和各类疾病的早期诊断等方面具有潜在的应用价值。

Description

一种核酸复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种核酸复合物及其制备方法和应用。
背景技术
生命体系遵循中心法则，编码生命遗传信息的脱氧核糖核酸(DNA)可以转录形成核糖核酸(RNA)，核糖核酸继而被翻译成特定的蛋白质，最终形成缤纷多彩的生物界。然而，在由DNA转录产生RNA继而被翻译成蛋白质这一系列复杂的生命过程中，任何一个环节的功能紊乱都会引发相应的疾病。传统小分子药物和抗体蛋白类药物的治疗靶标大多是最下游的蛋白质。近年来随着人们对核酸操控技术的不断发展，研究人员可以在RNA水平通过反义核酸和RNA干扰技术实现对靶标RNA翻译水平的调控，同时也可以在DNA水平通过基因传递和基因编辑技术实现对靶标基因转录水平的调控。
然而，上述基因编辑和基因沉默系统各自独立地在不同的细胞部位发挥功能，为实现细胞核内基因水平和细胞质内RNA水平的有效调控，通常需要同时传递两套基因治疗系统。然而，基因治疗类药物的共传递在很大程度上对传递载体提出了更高的要求。
CN105002214A公开了用于载体表达的复合多联gRNA和RNAi的表达框架，该复合多联表达框架包括：一个启动转录的启动子、一个或多个gRNA表达框架、一个或多个RNAi表达框架以及一个终止转录的终止子，所述表达框架具有在DNA水平和mRNA水平修饰靶基因的功能，其中所述gRNA/CRISPR基因修饰表达框架与所述RNAi表达框架通过间隔序列以交替串联的方式连接，解决了一个启动子只能连接一个gRNA和一个转录终止子的现有表达结构的困局。但是所述表达框架构建方法繁琐，成本较高，且不具有通用性，不利于推广应用。
如果能在源头上实现基因编辑和基因沉默的功能组分的集成，将极大程度上简化用于共传递基因治疗类药物的载体，对于基因治疗药物的开发具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种核酸复合物及其制备方法和应用，所述核酸复合物同时结合了基因编辑和基因沉默功能，通过与基因编辑系统的功能性蛋白相结合，能够实现对靶标基因的细胞核内基因编辑和细胞质内基因沉默，在疾病治疗药物的开发方面具有重要意义。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种核酸复合物，所述核酸复合物由一条核酸长链与一条核酸短链互补配对形成；
所述核酸长链包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链；
所述核酸短链包括3’延伸链的互补链。
本发明通过合理的序列和结构设计，将行使基因编辑和基因沉默功能的两类基因治疗体系集成于一种核酸复合物中，构建的核酸复合物同时发挥基因编辑和基因沉默的功能，与传统的独立的基因编辑和基因沉默系统相比，本发明的核酸复合物能够很好地将基因编辑和基因沉默功能相结合，实现协同的基因治疗效果，作为基因治疗药物具有优良的潜力，在肿瘤治疗、遗传病治疗和各类疾病的早期诊断等方面具有潜在的应用价值。
本发明中，行使基因编辑功能的sgRNA的靶标可以是任意基因，优选为与肿瘤发生发展相关的基因，所述sgRNA的靶标序列例如可以是无靶标组AAGGCUAAGGGGCCGAUGAC(SEQID NO:15)、靶向绿色荧光蛋白基因(EGFP)GGGCACGGGCAGCUUGCCGG(SEQ ID NO:16)或靶向Polo样激酶1基因(PLK1)UACCUACGGCAAAUUGTGCU(SEQ ID NO:17)。
优选地，所述互补链为DNA和/或RNA。
本发明中，行使基因沉默功能的互补链的靶标可以是任意mRNA，优选为与肿瘤发生发展相关的mRNA，例如发挥基因沉默功能的反义核酸DNA可以为无靶标组ACGTGACACGTTCGGAGAATT(SEQ ID NO:9)、靶向EGFP的反义核酸GACCAGGATGGGCACCACCC(SEQID NO:11)或靶向肿瘤相关基因PLK1的反义核酸GCACTTGGCAAAGCCGCCCTT(SEQ ID NO:13)；发挥基因沉默功能的RNA干扰序列可以为无靶标组ACGUGACACGUUCGGAGAAUU(SEQ ID NO:10)、靶向EGFP的RNA干扰序列GACCAGGAUGGGCACCACCC(SEQ ID NO:12)或靶向肿瘤相关基因PLK1的RNA干扰序列GCACUUGGCAAAGCCGCCCUU(SEQ ID NO:14)。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的核酸复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建DNA模板；
(2)DNA模板转录形成核酸长链；
(3)核酸长链与核酸短链杂交，形成所述核酸复合物。
本发明的核酸复合物的制备方法过程简单，重复性好，可实现大规模生产。
优选地，所述核酸长链包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链。
优选地，所述核酸短链包括3’延伸链的互补链。
优选地，步骤(1)所述构建DNA模板的方法包括：
将两条DNA单链混合后退火组装形成双链DNA，设计引物对进行PCR扩增，得到的产物在5’端含有T7转录启动子，在3’端含有延伸链。
优选地，所述DNA单链的核酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；
SEQ ID NO:1：
GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT；
SEQ ID NO:2：
AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTAAACTTGCTATGCTGTTTCCAGCATAGCTCTTAAAC.
优选地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO:3～8所示；
SEQ ID NO:3(无靶标组的正向引物)：
TAATACGACTCACTATAGGGAAGGCTAAGGGGCCGATGACGTTTAAGAGCTATGCTGGA；
SEQ ID NO:4(无靶标组的反向引物)：
ACGTGACACGTTCGGAGAATTAAAAAAAGCACCGACTCGGT；
SEQ ID NO:5(靶向EGFP的正向引物)：
TAATACGACTCACTATAGGGGGGCACGGGCAGCTTGCCGGGTTTAAGAGCTATGCTGGA；
SEQ ID NO:6(靶向EGFP的反向引物)：
GACCAGGATGGGCACCACCCAAAAAAAGCACCGACTCGGT；
SEQ ID NO:7(靶向PLK1的正向引物)：
TAATACGACTCACTATAGGGTACCTACGGCAAATTGTGCTGTTTAAGAGCTATGCTGGA；
SEQ ID NO:8(靶向PLK1的反向引物)：
GCACTTGGCAAAGCCGCCCTTAAAAAAAGCACCGACTCGGT.
优选地，步骤(2)所述转录采用转录试剂盒进行，优选为采用T7转录试剂盒进行，得到的产物为包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链的核酸长链。
优选地，步骤(3)所述核酸短链的核酸序列如SEQ ID NO:9～14所示；
SEQ ID NO:9(无靶标组的反义核酸DNA)：
ACGTGACACGTTCGGAGAATT；
SEQ ID NO:10(无靶标组的RNA干扰序列)：
ACGUGACACGUUCGGAGAAUU；
SEQ ID NO:11(靶向EGFP的反义核酸DNA)：
GACCAGGATGGGCACCACCC；
SEQ ID NO:12(靶向EGFP的RNA干扰序列)：
GACCAGGAUGGGCACCACCC；
SEQ ID NO:13(靶向PLK1的反义核酸DNA)：
GCACTTGGCAAAGCCGCCCTT；
SEQ ID NO:14(靶向PLK1的RNA干扰序列)：
GCACUUGGCAAAGCCGCCCUU.
作为优选技术方案，本发明提供了一种如第一方面所述的核酸复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将两条DNA单链SEQ ID NO:1～2混合后退火组装形成双链DNA为通用模板，设计引物对SEQ ID NO:3～8进行PCR扩增，得到的产物在5’端含有T7转录启动子，在3’端含有延伸链；
(2)利用转录试剂盒对DNA模板进行转录，获得包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链的核酸长链，分离纯化；
(3)将获得的核酸长链与包括3’延伸链的互补链的核酸短链SEQ ID NO:9～14杂交，形成所述核酸复合物。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的核酸复合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、肝癌、非小细胞癌、前列腺癌、头颈癌或非何金氏淋巴瘤中的任意一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过合理的序列和结构设计，基于sgRNA引入基因编辑系统，基于sgRNA的3’延伸链引入基因沉默系统；
(2)本发明进行简单的序列设计，实现了具有相同或不同靶标的两种基因治疗体系的构建；
(3)本发明的核酸复合物集成了基因编辑和基因沉默功能，有利于实现协同的基因治疗效果；
(4)本发明的核酸复合物的靶标可以是任意基因，通用性强，制备方法过程简单，重复性好，可实现大规模生产。
附图说明
图1为实施例1制备的核酸复合物的凝胶电泳检测结果图；
图2为核酸复合物结合Cas9蛋白对绿色荧光蛋白基因的切割结果图；
图3为核酸复合物结合Cas9蛋白对细胞内绿色荧光蛋白的沉默效果；
图4为核酸复合物结合Cas9蛋白对细胞内PLK1 mRNA的沉默效果；
图5为核酸复合物结合Cas9蛋白对肿瘤细胞的抑制效果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例中采用的仪器和材料如下：
器材：梯度PCR仪(Eppendorf，德国)，小型高速离心机(Eppendorf，德国)，紫外-可见分光光度计(岛津，日本)，荧光显微镜(Leica，德国)，荧光定量PCR仪(Real-4，德国)，全波长酶标仪(TECAN，瑞士)；
原料：核酸序列购自生工生物工程(上海)股份有限公司，Cas9蛋白购自北京英茂盛业生物科技有限公司；
试剂：实验中使用的缓冲溶液1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为：136.9×10- 3mol·L-1(8.00g·L-1)NaCl，2.68×10-3mol·L-1(0.20g·L-1)KCl，9.75×10-3mol·L-1(1.56g·L-1)Na2HPO4·H2O和1.47×10-3mol·L-1(0.20g·L-1)KH2PO4，缓冲溶液的试剂均为分析纯，购自Sigma-Aldrich公司；La-Taq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司，RNA转录试剂盒购自美国NEB，转染试剂Lipo2000购自美国ThermoFisher，Trizol RNA提取试剂购自美国Invitrogen，逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，荧光定量PCR试剂盒购自中国Novoprotein，细胞活力实验使用的试剂盒购自日本同仁化学；
细胞：人乳腺癌MCF7和MCF7-EGFP细胞系购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心；
培养基：DMEM培养基(ThermoFisher，美国)，添加10％胎牛血清(ThermoFisher，美国)，细胞接种于100mm培养皿中，置于5％CO2培养箱37℃培养，当细胞生长至融合度80％左右时传代。
实施例1核酸复合物的制备
(1)构建核酸复合物长链的DNA模板
DNA模板用于转录后形成包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链的核酸复合物长链RNA，具体为：
将两条DNA单链SEQ ID NO:1～2以1:1的比例混合，温度从95℃逐渐降温到25℃进行退火组装；组装完成后，以形成的双链DNA为模板进行PCR，引物对为无靶标组的正反向引物SEQ ID NO:3～4，进行DNA模板的3’延伸，PCR的程序设计为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸2min，4℃保存；反应完成后，采用纯化柱(30kDa截留分子量)在5000rpm/min的速度下、离心3min进行纯化和浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的离心管中备用；
(2)转录形成核酸复合物长链RNA
将获得的DNA模板加入到T7转录体系中，37℃孵育24小时，加入DNA酶I消化DNA模板15min，随后加入氯化锂溶液，-20℃放置30min，4℃环境下，以13000rpm/min的速度离心10min沉淀RNA；去上清，将获得的沉淀溶解于水中，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，将电泳纯化后的RNA在4℃环境下，经纯化柱(10kDa截留分子量)在8000rpm/min的速度下、离心5min进行浓缩，收集纯化柱内截留的液体于新的离心管中备用；
(3)核酸复合物长链和短链的杂交
将获得的核酸复合物长链与其3’延伸链的互补链无靶标组的反义核酸DNA SEQID NO:9或无靶标组的RNA干扰序列SEQ ID NO:10以1:1的比例混合，温度从45℃逐渐降温到4℃进行退火杂交，得到所述核酸复合物。
核酸复合物的凝胶电泳检测结果如图1所示，其中，泳道1为互补链SEQ ID NO:9，泳道2为长链，泳道3为杂交上互补链的核酸复合物，可以看出，杂交上互补链的核酸复合物的电泳迁移率较慢，明显滞后于未杂交上互补链的长链RNA。
实施例2
与实施例1相比，在构建核酸复合物长链DNA模板的过程中，采用的正向引物为靶向EGFP的正向引物SEQ ID NO:5，其他条件与实施例1相同。
实施例3
与实施例1相比，在构建核酸复合物长链DNA模板的过程中，采用的正向引物为靶向EGFP的正向引物SEQ ID NO:5，反向引物为靶向EGFP的反向引物SEQ ID NO:6，互补链为靶向EGFP的反义核酸DNA SEQ ID NO:11或靶向EGFP的RNA干扰序列SEQ ID NO:12，其他条件与实施例1相同。
核酸复合物结合Cas9蛋白的体外编辑效果
将实施例2构建的核酸复合物与Cas9蛋白在37℃孵育10min，加入构建的绿色荧光蛋白基因片段作为目的基因，在NEBuffer 3的条件下，37℃孵育2小时。
核酸复合物结合Cas9蛋白对绿色荧光蛋白基因的切割结果如图2所示，其中，泳道1为绿色荧光蛋白靶标基因，泳道2为sgRNA长链(其靶标序列为SEQ ID NO:16)结合Cas9蛋白对靶标基因的切割效果，泳道3为核酸复合物结合Cas9蛋白对靶标基因的切割效果，可以看出，在结合了Cas9蛋白后，核酸复合物表现出同传统sgRNA相当的基因编辑能力。
核酸复合物结合Cas9蛋白的细胞水平编辑、沉默效果
稳定表达绿色荧光蛋白的人乳腺癌MCF7-EGFP细胞接种于35mm培养皿中，置于5％CO2培养箱37℃培养；
将实施例1-3的核酸复合物与Cas9蛋白在37℃孵育10min后，经Lipo2000转染进入MCF7-EGFP细胞(药物浓度：40nM)，孵育72小时后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的荧光强度。
如图3所示为实施例1-3的核酸复合物结合Cas9蛋白，经转染后对细胞内绿色荧光蛋白的沉默效果，结果表明，实施例1的无靶标组同空白对照组类似，能够观察到非常强的绿色荧光信号；实施例2的基因编辑组(只含有基因编辑的靶标，没有基因沉默的靶标)的绿色荧光信号有所减弱；实施例3的基因编辑和沉默组(同时含有基因编辑和基因沉默的靶标)表现出显著的绿色荧光蛋白的沉默效果，由此可知，核酸复合物结合Cas9蛋白，经转染后能够在细胞水平实现协同的基因编辑和基因沉默效果。
实施例4
与实施例1相比，在构建核酸复合物长链DNA模板的过程中，采用的正向引物为靶向PLK1的正向引物SEQ ID NO:7所示，其他条件与实施例1相同。
实施例5
与实施例1相比，在构建核酸复合物长链DNA模板的过程中，采用的正向引物为靶向PLK1的正向引物SEQ ID NO:7，反向引物为靶向PLK1的反向引物SEQ ID NO:8所示，互补链为靶向PLK1的反义核酸DNA SEQ ID NO:13或靶向PLK1的RNA干扰序列SEQ ID NO:14，其他条件与实施例1相同。
核酸复合物结合Cas9蛋白的细胞水平编辑、沉默效果
人乳腺癌MCF7细胞接种于35mm培养皿中，置于5％CO2培养箱37℃培养；
将实施例1、4-5的核酸复合物与Cas9蛋白在37℃孵育10min后，经Lipo2000转染进入MCF7细胞(药物浓度：40nM)，孵育72小时后，利用Trizol试剂提取细胞内的总RNA，利用逆转录试剂盒合成cDNA，再通过荧光定量PCR试剂盒进行mRNA的相对定量检测，PCR引物为：PLK1基因的正向引物GGCAACCTTTTCCTGAATGA(SEQ ID NO:18)，PLK1基因的反向引物AATGGACCACACATCCACCT(SEQ ID NO:19)。
如图4所示为实施例1、4-5的核酸复合物结合Cas9蛋白，经转染后对细胞内PLK1mRNA的沉默效果，结果表明，实施例4的基因编辑组(只含有基因编辑的靶标，没有基因沉默的靶标)表现出一定的对靶标基因PLK1的沉默效果，实施例5的基因编辑和沉默组(同时含有基因编辑和基因沉默的靶标)表现出显著的靶标基因PLK1 mRNA的沉默效果，由此可知，核酸复合物结合Cas9蛋白，经转染后能够在细胞水平实现协同的基因编辑和基因沉默效果。
核酸复合物结合Cas9蛋白对肿瘤细胞的生长抑制效果
人乳腺癌MCF7细胞接种于100mm培养皿中，置于5％CO2培养箱37℃培养，当细胞生长至融合度为80％左右时传代；
将细胞培养至对数生长期，胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞悬液浓度为5×104个/mL，接种96孔板，每孔100μL；
将96孔板置于CO2培养箱中培养过夜，吸出培养液，加入经转染试剂包载的实施例1、4-5的核酸复合物同Cas9蛋白的结合物(药物浓度：40nM)，孵育72小时后，弃培养基，加入细胞活力检测试剂，每孔100μL，继续孵育1小时；
用酶标仪(450nm)检测每孔的OD值，根据OD值计算出肿瘤细胞存活率，计算公式为：存活率％＝实验组OD值/对照组OD值×100。
结果如图5所示，实施例1的无靶标的核酸复合物实验组同空白对照组类似，未观察到明显的肿瘤细胞抑制效果，实施例4的基因编辑组(只含有基因编辑的靶标，没有基因沉默的靶标)表现出一定的肿瘤细胞抑制效果(细胞存活率<40％)，实施例5的基因编辑和沉默组(同时含有基因编辑和基因沉默的靶标)表现出显著的肿瘤细胞抑制效果(细胞存活率<10％)，由此可知，核酸复合物结合Cas9蛋白，经转染后能够实现协同的基因编辑和基因沉默效果，从而高效地抑制肿瘤细胞的增殖。
综上所述，本发明通过合理的序列和结构设计，将行使基因编辑和基因沉默功能的两类基因治疗体系集成于一种核酸复合物中，构建的核酸复合物同时发挥基因编辑和基因沉默的功能，与传统的独立的基因编辑和基因沉默系统相比，本发明的核酸复合物能够很好地将基因编辑和基因沉默功能相结合，实现协同的基因治疗效果，作为基因治疗药物具有优良的潜力，在肿瘤治疗、遗传病治疗和各类疾病的早期诊断等方面具有潜在的应用价值，所述核酸复合物的靶标可以是任意基因，通用性强，制备方法过程简单，重复性好，可实现大规模生产。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种核酸复合物及其制备方法和应用
<130> 20190905
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 93
<210> 2
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttatttaaa 60
cttgctatgc tgtttccagc atagctctta aac 93
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
taatacgact cactataggg aaggctaagg ggccgatgac gtttaagagc tatgctgga 59
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
acgtgacacg ttcggagaat taaaaaaagc accgactcgg t 41
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
taatacgact cactataggg gggcacgggc agcttgccgg gtttaagagc tatgctgga 59
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gaccaggatg ggcaccaccc aaaaaaagca ccgactcggt 40
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
taatacgact cactataggg tacctacggc aaattgtgct gtttaagagc tatgctgga 59
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gcacttggca aagccgccct taaaaaaagc accgactcgg t 41
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
acgtgacacg ttcggagaat t 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 10
acgugacacg uucggagaau u 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
gaccaggatg ggcaccaccc 20
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 12
gaccaggaug ggcaccaccc 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gcacttggca aagccgccct t 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 14
gcacuuggca aagccgcccu u 21
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 15
aaggcuaagg ggccgaugac 20
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 16
gggcacgggc agcuugccgg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
uaccuacggc aaauugtgcu 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
ggcaaccttt tcctgaatga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
aatggaccac acatccacct 20

Claims (12)

1.一种核酸复合物，其特征在于，所述核酸复合物由一条核酸长链与一条核酸短链互补配对形成；
所述核酸长链包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链；
所述核酸短链包括3’延伸链的互补链；
所述sgRNA的3’延伸链为行使基因沉默功能的反义核酸DNA的互补链或RNA干扰序列。
2.根据权利要求1所述的核酸复合物，其特征在于，所述sgRNA的靶标序列的核酸序列如SEQ ID NO:16～17所示。
3.根据权利要求1所述的核酸复合物，其特征在于，所述互补链为DNA和/或RNA。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的核酸复合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建DNA模板；
(2)DNA模板转录形成核酸长链；
(3)核酸长链与核酸短链杂交，形成所述核酸复合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述核酸长链包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述核酸短链包括3’延伸链的互补链，为行使基因沉默功能的反义核酸DNA或RNA干扰序列。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述构建DNA模板的方法包括：
将两条DNA单链混合后退火组装形成双链DNA，设计引物对进行PCR扩增，得到的产物在5’端含有T7转录启动子，在3’端含有延伸链。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述DNA单链的核酸序列如SEQ IDNO:1～2所示。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO:3～8所示。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述转录采用转录试剂盒进行。
11.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述核酸短链的核酸序列如SEQ ID NO:9～14所示。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将两条DNA单链SEQ ID NO:1～2混合后退火组装形成双链DNA为通用模板，设计引物对SEQ ID NO:3～8进行PCR扩增，得到的产物在5’端含有T7转录启动子，在3’端含有延伸链；
(2)利用转录试剂盒对DNA模板进行转录，获得包括sgRNA和sgRNA的3’延伸链的核酸长链，分离纯化；
(3)将获得的核酸长链与包括3’延伸链的互补链的核酸短链SEQ ID NO:9～14杂交，形成所述核酸复合物。
CN201910843814.4A 2019-09-06 2019-09-06 一种核酸复合物及其制备方法和应用 Active CN110551722B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910843814.4A CN110551722B (zh) 2019-09-06 2019-09-06 一种核酸复合物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910843814.4A CN110551722B (zh) 2019-09-06 2019-09-06 一种核酸复合物及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110551722A CN110551722A (zh) 2019-12-10
CN110551722B true CN110551722B (zh) 2021-01-01

Family

ID=68739348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910843814.4A Active CN110551722B (zh) 2019-09-06 2019-09-06 一种核酸复合物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110551722B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941072B (zh) * 2021-02-10 2022-12-06 国家纳米科学中心 一种核酸自组装结构及其制备方法和应用
CN113025638B (zh) * 2021-03-16 2022-07-12 国家纳米科学中心 一种基于双链核酸的折纸结构及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086012A (zh) * 2016-06-23 2016-11-09 百奥迈科生物技术有限公司 一种线性双链腺相关病毒基因组的体外制备方法
IT201700120699A1 (it) * 2017-10-24 2019-04-24 Humanitas Mirasole Spa Cellule nk o cellule t e loro usi

Also Published As

Publication number Publication date
CN110551722A (zh) 2019-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10428106B2 (en) Phosphate replacement mRNA cap analogs
EP3041948B1 (en) Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
US10385088B2 (en) Polynucleotide molecules and uses thereof
CN107177591A (zh) 利用CRISPR技术编辑CCR5基因的sgRNA序列及其用途
US20140371302A1 (en) Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
KR20140057374A (ko) Hsf1-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물
CN110551722B (zh) 一种核酸复合物及其制备方法和应用
CN114685588B (zh) 一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物
US20220298516A1 (en) Compositions and methods for delivery of nucleic acids
CN112941072B (zh) 一种核酸自组装结构及其制备方法和应用
CN117510565A (zh) 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用
KR20020067959A (ko) 단방향성 안티센스 ｃＤＮＡ 라이브러리 구축을 통한 신규대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템
US20210024915A1 (en) Method for activating p21 gene expression
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN114796525B (zh) 细胞周期调控蛋白抑制剂在肿瘤治疗中的应用
CN115927480A (zh) 一种基于核酸纳米结构的基因递送系统及其制备方法和应用
KR20200026106A (ko) miRNA 억제제-알부민의 복합체를 유효성분으로 포함하는 암 치료제
EP4036232A1 (en) Nucleic acid molecule for treating immune thrombocytopenia and application thereof
CN112608923B (zh) 一种抑制ddx17相关rna表达产物的核苷酸及其应用
Hanania et al. Isolation of single stranded transcription sites from human nuclear DNA
CN112410430B (zh) 一种与肿瘤细胞对顺铂耐药性相关的标志物及其应用
WO2022143784A1 (en) Methods for producing extracellular vesicles enriched in anti-inflammatory micrornas
CN118043460A (zh) 产品和组合物
Motorin et al. RNA structure, maturation, interactions and functions
CN104630225B (zh) 一种针对miR-99a种子序列的微小反义寡聚核苷酸及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant