CN117510565A - 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117510565A CN117510565A CN202311471862.8A CN202311471862A CN117510565A CN 117510565 A CN117510565 A CN 117510565A CN 202311471862 A CN202311471862 A CN 202311471862A CN 117510565 A CN117510565 A CN 117510565A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- alkoxy
- alkyl
- modified mrna
- mrna cap
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 title claims abstract description 45
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 32
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 35
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 29
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 16
- -1 cyano, hydroxy, methoxy, ethoxy Chemical group 0.000 claims description 16
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 12
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000000530 1-propynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C#C* 0.000 claims description 6
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 claims description 6
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000480 butynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 claims description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 11
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 abstract description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 187
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 178
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 142
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 86
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 25
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 25
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 18
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 17
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 17
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 14
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 13
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic acid anhydride Natural products CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 12
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M tetraethylammonium bromide Chemical compound [Br-].CC[N+](CC)(CC)CC HWCKGOZZJDHMNC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- CCZWSTFVHJPCEM-UHFFFAOYSA-N 2-iodopyridine Chemical compound IC1=CC=CC=N1 CCZWSTFVHJPCEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 9
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 7
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 7
- LDHWBEHZLFDXCU-UHFFFAOYSA-N 3-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound N#CCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N LDHWBEHZLFDXCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 6
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 6
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 6
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 5
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 5
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FTVLMFQEYACZNP-UHFFFAOYSA-N trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate Chemical compound C[Si](C)(C)OS(=O)(=O)C(F)(F)F FTVLMFQEYACZNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OMBVEVHRIQULKW-DNQXCXABSA-M (3r,5r)-7-[3-(4-fluorophenyl)-8-oxo-7-phenyl-1-propan-2-yl-5,6-dihydro-4h-pyrrolo[2,3-c]azepin-2-yl]-3,5-dihydroxyheptanoate Chemical compound O=C1C=2N(C(C)C)C(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)=C(C=3C=CC(F)=CC=3)C=2CCCN1C1=CC=CC=C1 OMBVEVHRIQULKW-DNQXCXABSA-M 0.000 description 3
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical class [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 3
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940126540 compound 41 Drugs 0.000 description 3
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- OJVWCPKLFCTIPB-UHFFFAOYSA-N n,n-dibutylbutan-1-amine;phosphoric acid Chemical compound OP(O)([O-])=O.CCCC[NH+](CCCC)CCCC OJVWCPKLFCTIPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N trimethyl phosphate Chemical compound COP(=O)(OC)OC WVLBCYQITXONBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N (1R,9R,10S,11R,12R,15S,18S,21R)-10,11,21-trihydroxy-8,8-dimethyl-14-methylidene-4-(prop-2-enylamino)-20-oxa-5-thia-3-azahexacyclo[9.7.2.112,15.01,9.02,6.012,18]henicosa-2(6),3-dien-13-one Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@@]23C(C1=C)=O)C[C@H]2[C@]12C(N=C(NCC=C)S4)=C4CC(C)(C)[C@H]1[C@H](O)[C@]3(O)OC2 UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N 0.000 description 2
- AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-6-[(3-chlorophenyl)methyl]-12,19-difluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-9,13-dimethyl-6-azapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-one Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2[C@H]3[C@]([C@]4(C=CC(=O)C=C4[C@@H](F)C3)C)(F)[C@@H](O)C[C@@]2([C@@]1(C1)C(=O)CO)C)N1CC1=CC=CC(Cl)=C1 AOSZTAHDEDLTLQ-AZKQZHLXSA-N 0.000 description 2
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 2
- IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N (3S,8S,10R,13S,14S,17S)-17-isoquinolin-7-yl-N,N,10,13-tetramethyl-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-amine Chemical compound CN(C)[C@H]1CC[C@]2(C)C3CC[C@@]4(C)[C@@H](CC[C@@H]4c4ccc5ccncc5c4)[C@@H]3CC=C2C1 IWZSHWBGHQBIML-ZGGLMWTQSA-N 0.000 description 2
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 2
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVTJUIAKQFIXCE-HUKYDQBMSA-N 2-amino-9-[(2R,3S,4S,5R)-4-fluoro-3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-prop-2-ynyl-1H-purine-6,8-dione Chemical compound NC=1NC(C=2N(C(N(C=2N=1)[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H]1O)F)CO)=O)CC#C)=O TVTJUIAKQFIXCE-HUKYDQBMSA-N 0.000 description 2
- QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 3-[(1r)-1-[(2r,6s)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]ethyl]-n-[6-methyl-3-(1h-pyrazol-4-yl)imidazo[1,2-a]pyrazin-8-yl]-1,2-thiazol-5-amine Chemical compound N1([C@H](C)C2=NSC(NC=3C4=NC=C(N4C=C(C)N=3)C3=CNN=C3)=C2)C[C@H](C)O[C@H](C)C1 QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 0.000 description 2
- RKVHNYJPIXOHRW-UHFFFAOYSA-N 3-bis[di(propan-2-yl)amino]phosphanyloxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N RKVHNYJPIXOHRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126657 Compound 17 Drugs 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 102000009617 Inorganic Pyrophosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010009595 Inorganic Pyrophosphatase Proteins 0.000 description 2
- 101000844801 Lactiplantibacillus plantarum (strain ATCC BAA-793 / NCIMB 8826 / WCFS1) D-alanyl carrier protein 2 Proteins 0.000 description 2
- MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N N-Butyllithium Chemical compound [Li]CCCC MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N [(2r,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[[(3s,5s,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-4,5-disulfo Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]([C@@H]([C@H]1OS(O)(=O)=O)OS(O)(=O)=O)O[C@@H]1C[C@@H]2CC[C@H]3[C@@H]4CC[C@@H]([C@]4(CC[C@@H]3[C@@]2(C)CC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H]1O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]1OS(O)(=O)=O LNUFLCYMSVYYNW-ZPJMAFJPSA-N 0.000 description 2
- TWJVNKMWXNTSAP-UHFFFAOYSA-N azanium;hydroxide;hydrochloride Chemical class [NH4+].O.[Cl-] TWJVNKMWXNTSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 2
- 229940126543 compound 14 Drugs 0.000 description 2
- 229940125810 compound 20 Drugs 0.000 description 2
- 229940125846 compound 25 Drugs 0.000 description 2
- 229940125851 compound 27 Drugs 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N gtpl8555 Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)N[C@H](B1O[C@@]2(C)[C@H]3C[C@H](C3(C)C)C[C@H]2O1)CCC1=CC=C(F)C=C1 JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 2
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 2
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- UDQTXCHQKHIQMH-KYGLGHNPSA-N (3ar,5s,6s,7r,7ar)-5-(difluoromethyl)-2-(ethylamino)-5,6,7,7a-tetrahydro-3ah-pyrano[3,2-d][1,3]thiazole-6,7-diol Chemical compound S1C(NCC)=N[C@H]2[C@@H]1O[C@H](C(F)F)[C@@H](O)[C@@H]2O UDQTXCHQKHIQMH-KYGLGHNPSA-N 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 125000005918 1,2-dimethylbutyl group Chemical group 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 1-methylguanine Chemical compound O=C1N(C)C(N)=NC2=C1N=CN2 RFLVMTUMFYRZCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006176 2-ethylbutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004493 2-methylbut-1-yl group Chemical group CC(C*)CC 0.000 description 1
- 125000005916 2-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- DGMOBVGABMBZSB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropanoyl chloride Chemical compound CC(C)C(Cl)=O DGMOBVGABMBZSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 125000003542 3-methylbutan-2-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005917 3-methylpentyl group Chemical group 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 4-Thiouridine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLLCDONDZDHLCI-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-hydroxy-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1O NLLCDONDZDHLCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NGOCBWZVBNMKES-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-methoxy-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound COC1=CNC(=O)N=C1N NGOCBWZVBNMKES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZSBZZVMBAXCIA-JTFADIMSSA-N 9-[(2s,3r,4s,5r)-2-acetyl-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-amino-3h-purin-6-one Chemical compound C1=NC(C(NC(N)=N2)=O)=C2N1[C@]1(C(=O)C)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O LZSBZZVMBAXCIA-JTFADIMSSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical group OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000006646 Dess-Martin oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229940122426 Nuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010021119 Trichosanthin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940125936 compound 42 Drugs 0.000 description 1
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- VBWIZSYFQSOUFQ-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarbonitrile Chemical compound N#CC1CCCCC1 VBWIZSYFQSOUFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- NKLCNNUWBJBICK-UHFFFAOYSA-N dess–martin periodinane Chemical compound C1=CC=C2I(OC(=O)C)(OC(C)=O)(OC(C)=O)OC(=O)C2=C1 NKLCNNUWBJBICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N ginsenoside K Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTQSADJAYQOCDD-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Rd2 Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC(C(C(O)C1O)O)OC1COC1OCC(O)C(O)C1O ZTQSADJAYQOCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004491 isohexyl group Chemical group C(CCC(C)C)* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- NXPHGHWWQRMDIA-UHFFFAOYSA-M magnesium;carbanide;bromide Chemical compound [CH3-].[Mg+2].[Br-] NXPHGHWWQRMDIA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- FIYYMXYOBLWYQO-UHFFFAOYSA-N ortho-iodylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1I(=O)=O FIYYMXYOBLWYQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000003538 pentan-3-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- HBEFYGYBMKPNSZ-UHFFFAOYSA-N s-phenyl chloromethanethioate Chemical compound ClC(=O)SC1=CC=CC=C1 HBEFYGYBMKPNSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWMFRHBXRUITQE-UHFFFAOYSA-N trimethylsilylacetylene Chemical group C[Si](C)(C)C#C CWMFRHBXRUITQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- SCHZCUMIENIQMY-UHFFFAOYSA-N tris(trimethylsilyl)silicon Chemical compound C[Si](C)(C)[Si]([Si](C)(C)C)[Si](C)(C)C SCHZCUMIENIQMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
本发明提供了一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用,该mRNA帽类似物如下结构中的五元糖环上与碳原子连接R1、R4、R5、R7、R8位置的氢原子选择性的独立的被OH、烷基、O‑烷基、CH2‑O‑烷基、CH2‑N‑烷基、CH2‑S‑烷基、卤素取代修饰,被修饰后的五元糖环分子构象优势,elF4E蛋白活性口袋结合能力更强,同时该结构不容易被脱帽酶识别,使得帽子结构更加稳定,最终表现出更好的mRNA翻译效果。
Description
技术领域
本发明涉及化学及生物工程技术领域,具体涉及一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用。
背景技术
真核mRNA在其5'-末端带有“帽”结构,众所周知,此“帽”结构在翻译中起重要作用。天然存在的帽结构由7-甲基鸟苷组成,该鸟苷通过三磷酸桥连接到第一个转录核苷酸的5'-末端,从而导致7G(5')ppp(5')N,其中N是任何核苷酸。mRNA帽在基因表达中起重要作用。帽结构可以保护mRNA免受外切核酸酶的降解,使RNA可以从细胞核转运到细胞质,并参与翻译起始复合物的组装。m7G(5’)ppp(5’)G(mCAP)已用作体外T7或SP6 RNA聚合酶转录的引物,以获得在其5'末端具有帽结构的RNA。
通过体外转录合成mRNA已经成为引入外源基因并进行表达蛋白的重要工具,并广泛应用于疾病的治疗和预防中,体外转录合成mRNA使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产,例如,在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽,或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中,合成进行显著更长的时间,并因此产生更多的蛋白质。
帽子结构与真核起始因子(elF4E)结合能力的高低决定了该mRNA在细胞内的翻译表达效果。现有的帽类似物结构一般是天然的帽子结构,其mRNA的翻译效果不稳定,对于不同的序列或者不同的表达宿主结果差异较大。
发明内容
本申请提供了一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用,该mRNA帽类似物结构中的五元糖环上与碳原子连接的氢原子独立的被OH、烷基、O-烷基、卤素、烯基、炔基和氰基取代修饰,被修饰后的五元糖环与elF4E蛋白活性口袋结合能力更强,因此可以促进该mRNA的翻译效果。同时该结构由于是非天然结构,无法被生物体内的核酶水解,也不容易被脱帽酶识别,使得帽子结构更加稳定,最终表现出更好的mRNA翻译效果和更低的脱帽率。
一种核糖环修饰的mRNA帽类似物,其包含以下结构:
其中,X1、X2和X3分别独立的为O、CH2或NH;
Y1、Y2和Y3分别独立的为O、S、Se或BH3;
R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R12、R13、R14独立的为H、OH、烷基、O-烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素;
且R2、R13不同时为OH、O-烷基,R3、R14不同时为OH、O-烷基;
R6、R7、R10、R11独立的为H、烷基、CH2-O-烷基、CH2-N-烷基、CH2-S-烷基、卤素;
B1、B2独立的为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
上述X1、X2和X3分别独立的为O、CH2或NH;Y1、Y2和Y3分别独立的为O或S。
上述R1、R2、R3、R4、R5、R8、R9、R12、R13、R14独立的为H、OH、甲基、乙基、丙基或丁基;R6、R7、R10、R11独立的为H、甲基、乙基、丙基或丁基。
上述B1、B2独立的为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶。
上述X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3均为O;R1、R5、R7、R9、R11均为H;R2、R13中一个为OH、一个为H或CH3;R3、R14中一个为OH、一个为H;R4、R6、R8、R10、R12为H或CH3;B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤;具体结构如下所示:
上述X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3均为O;R1、R5、R7、R9、R10、R11、R12均为H;R2、R13中一个为OH、一个为H或CH3;R3、R14中一个为OH、一个为H;R4、R6、R8为H或CH3;B1为腺嘌呤、B2为鸟嘌呤。
进一步的,本发明为了改善帽类似物的加帽率和翻译效率的同时,改善脱帽率,提供一种核糖环修饰的mRNA帽类似物,其为式(I)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐:
其中,
X1、X2和X3分别独立地为O、CH2或NH;
Y1、Y2和Y3分别独立地为O、S、Se或BH3;
R1、R4、R5、R7、R8、分别独立地为H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;且R1、R4、R5、R7、R8中至少一个为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;
R2、R3、R13、R14分别独立地为H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
R6、R9、R10、R11、R12独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
B1、B2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,R2和R13中至少一个为H,R3和R14中至少一个为H。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,R1、R4、R5、R7或R8中只有一个为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;R1、R4、R5、R7或R8中其余四个分别独立地为H。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其为式(Ⅱ)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐:
R1或R5中只有一个为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;R1或R5的另一个为H;
R13、R14分别独立地为H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
B1、B2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,R13、R14分别独立地为OH。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,R1选自乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl;R5为H。
或者R5选自乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl;R1为H。
所述核糖环修饰的mRNA帽类似物,其为式(Ⅲ)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐:
R1为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;
R13、R14分别独立地为H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
B1、B2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,R1为乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,R13、R14分别独立地为H、OH、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl。
所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其为以下化合物、其立体异构体、或其药学上可接受的盐:
本申请所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,具有更高的产量、加帽率,更高的翻译效率,以及更低的脱帽率。
本申请还提供了一种所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物在制备体外共转录RNA加帽试剂中的应用。
所述核糖环修饰的mRNA帽类似物的应用,用于制备体外共转录RNA加帽试剂。该核糖环修饰的mRNA帽类似物用于T7 RNA聚合酶体系或SP6 RNA聚合酶体系下的mRNA加帽。其中T7RNA聚合酶是一种依赖DNA的RNA聚合酶,其对噬菌体T7启动子序列有高特异性。该酶从T7启动子插入到转录载体下游的DNA上合成大量RNA。T7RNA聚合酶催化的IVT(体外转录)反应体系是目前最成熟的mRNA制备体系。
通常在IVT反应体系中加入T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶,同时搭配本发明所述帽类似物可以获得加帽mRNA。
本申请还提供了一种所述核糖环修饰的mRNA帽类似物的DNA模板,其中所述DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区,所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸;以及B1与所述DNA模板位置+1处的核苷碱基互补,并且B2与所述DNA模板上转录模板位置+2处的核苷碱基互补。
本申请还提供了一种RNA分子,其包含上述任一项所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物。
本申请还提供了一种药物组合物,其包含上述所述的RNA分子,以及药学上可接受的载体。
本发明提供了一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用,该核糖环修饰的mRNA帽类似物适用于以DNA序列为模板利用体外共转录方法生产的mRNA,该DNA序列可以来源或改造自病毒、动物、植物等物种,同时其生产的mRNA具有更低的免疫原性、更高的蛋白翻译效率、更好的稳定性。
本发明相比现有技术具有以下优点:
与现有帽结构类似物Cleancap相比,本发明设计的新型帽子结构,含有五元糖环的取代基团,可以有效地固定5’末端帽子的空间结构,并且提高mRNA的5’末端帽子结构与真核起始因子(elF4E)结合能力,进而可以提高mRNA的翻译效果;本发明的核糖环修饰的mRNA帽类似物,由于被修饰后的五元糖环分子构象优势,elF4E蛋白活性口袋结合能力更强,同时该结构不容易被脱帽酶识别,使得帽子结构更加稳定,最终表现出较好的体外转录产量以及加帽效率数据、更好的mRNA翻译效果,同时具有更低的脱帽率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
术语解释:
本发明中“eq.”为当量。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团,其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团,优选含有1至6个(例如1、2、3、4、5和6个)碳原子的烷基,更优选为含有1至4个碳原子的烷基。烷基可以是取代或未取代的。
术语“C1-6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和烃基团。C1-6烷基的例子包括:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。
术语“C1-6烷氧基”是指-O-R基团,其中R如上文的“C1-6烷基”所定义。
术语“C1-6烯基”是指至少含有一个碳碳双键的,并且包含1-6个碳原子的烷基,其中烷基的定义如上文所述。
术语“C1-6炔基”是指具有一个或多个碳碳三键的直链或支链,并且包含1-6个碳原子的烷基,其中烷基的定义如上文所述。
“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
本申请中的“碱基”和“核苷碱基”可以互换使用,既可以是天然核苷碱基,也可以是修饰核苷碱基。天然核苷碱基包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)以及它们的衍生物中的任意一种。
“修饰的碱基”和“修饰的核苷碱基”可以互换使用,是指天然核苷碱基的一个或两个以上氢被取代而得到的物质,例如包括但不限于N6-甲基腺嘌呤等,在本实施例中,修饰基团选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2'-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶,N1-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、异鸟嘌呤。
“立体异构体”是指具有相同化学构造,但原子或基团在空间上排列方式不同的化合物。立体异构体包括对映异构体、非对映异构体、构象异构体(旋转异构体)、几何异构体(顺/反)异构体、阻转异构体等。
各实施例中所使用的原料名称及来源参见下表1:
表1
/>
以下各实施例中所使用的中间体A反应路线流程均通过方程式(1)所示步骤制备得到:
1)取20g 2,3-O-异亚丙基-β-D-甲基呋喃核糖苷溶解在300mL的乙腈中,室温下将2-碘酰基苯甲酸(1.8eq.)一次性加入到反应液中。得到的混悬液加热回流5小时后室温过夜。混悬液抽滤,用乙酸乙酯洗涤,滤液浓缩得到中间体A1。
2)取20g中间体A1和甲醛水溶液(37%,76mL)溶解在380mL的1,4-二氧六环中,0℃下将NaOH水溶液(2.0M,188mL)加入到反应液中,随后室温搅拌过夜后用10%的醋酸中和,浓缩后柱层析得到中间体A2。
3)取20g中间体A2和4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.2eq.)溶解在吡啶中(400mL),室温搅拌过夜。反应完全后在0℃下用甲醇(40mL)淬灭反应。浓缩后柱层析得到中间体A3。
4)取20g中间体A3溶解在200.0mL的无水吡啶中,冰浴下将苯甲酰氯(1.2eq.)滴加到反应液中,室温搅拌3小时,反应完全。浓缩得到中间体A4的粗品。
5)将中间体A4的粗品溶解在80%的醋酸水溶液中,室温搅拌过夜,反应完全。浓缩后柱层析得到中间体A5。
6)将15g中间体A5,DMAP(3.0eq.)和硫代氯甲酸苯酯(1.2eq.)溶解在150.0mL的乙腈中,室温搅拌3小时,反应完全。浓缩后溶解在二氯甲烷中,用0.5M稀盐酸洗涤2次后有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩得到中间体A6粗品。
7)将中间体A6粗品溶解在150.0mL的甲苯中,将三(三甲基硅基)硅烷(1.5eq.)和1,1'-偶氮(氰基环己烷)(0.25eq.)加入到反应液中后升温至100℃,搅拌15小时后反应完全。反应液浓缩后柱层析得到中间体A7。
8)取5g中间体A7溶解在冷的三氟乙酸/水(9:1,50.0mL)中,随后0℃下搅拌1小时,反应完全。低温下浓缩除去溶剂,随后溶解在50.0mL的冰醋酸和乙酸酐(3.0eq.)中,冰浴下缓慢滴加浓硫酸(0.1eq.)。室温搅拌过夜,反应完全。将反应液倒入冰水中,用二氯甲烷萃取。有机相干燥后浓缩,柱层析得到中间体A。
以下各实施例中所使用的中间体B反应路线流程均通过方程式(2)所示步骤制备得到:
/>
1)取40g戴斯-马丁氧化剂悬浮在200.0mL的二氯甲烷中,降温至冰浴,20g 1,3,5-三苯甲酰基-D-呋喃核糖加入到反应液中。室温搅拌过夜,反应完全。反应液浓缩后悬浮在甲基叔丁基醚中打浆,抽滤。滤液分别用15%硫代硫酸钠,冷的饱和碳酸氢钠水溶液,饱和食盐水洗涤后无水硫酸钠干燥,浓缩得到中间体B1。
2)取17.5g中间体B1溶解在175.0mL的四氢呋喃中,-78℃下将甲基溴化镁(3M inEt2O,3.0eq.)滴加到反应液中。随后-78℃下搅拌2小时,反应完全。将反应液倒入饱和氯化铵溶液中进行淬灭,随后用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤后,无水硫酸钠干燥,浓缩得到中间体B2的粗品。
3)取18g中间体B2的粗品,DMAP(2.0eq.),三乙胺(3.0eq.)溶解在180.0mL二氯甲烷中,降温至0℃后将异丁酰氯(3.0eq.)滴加到反应液中,室温搅拌过夜。反应液用饱和碳酸氢钠洗涤,水相用二氯甲烷萃取。合并有机相,无水硫酸钠干燥后浓缩,柱层析纯化得到中间体B。
实施例1:以中间体C和D为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体C(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体D(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(3)所示:
其中,化合物C通过以下步骤得到:
1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到N2-异丁酰鸟嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中,升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温,将中间体A(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后,将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性,乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体C1。
2)取30g中间体C1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1:1)中,室温搅拌过夜。反应结束后浓缩,反相色谱纯化得到中间体C2。
3)将中间体C2溶解在150ml的磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,缓慢滴加1.2eq.三氯氧磷,冰浴下搅拌4小时后,加水淬灭反应,反相色谱纯化得中间体C3。
4)将中间体C3,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C4。
5)取10g中间体C4溶解DMF中,加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体C5。
6)将中间体C5溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯,过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后离子色谱纯化得到中间体C6。
7);将中间体C6,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体C。反应路线流程,如方程式(4)所示:
化合物D通过以下步骤得到:
1)称取1kg的2’OMe-rA亚磷酰胺单体溶解在二氯甲烷(6.0L)中,室温下将2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中,冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入,室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后,反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩,经柱层析得到中间体D1。
2)将D1溶解在4L二氯甲烷中,室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时,TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在3L甲醇和3L浓氨水,室温反应14小时,监测反应,反应结束后浓缩,粗品装载到DEAESephadex柱上,使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物。反应路线流程,如方程式(5)所示:
实施例2:
以中间体D和E为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体E(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体D(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(6)所示:
其中,化合物E通过以下步骤得到:
1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到N2-异丁酰鸟嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中,升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温,将中间体B(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后,将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性,乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体E1。
2)取30g中间体E1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1:1)中,室温搅拌过夜。反应结束后浓缩,反相色谱纯化得到中间体E2。
3)将中间体E2溶解在150ml的磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,缓慢滴加1.2eq.三氯氧磷,冰浴下搅拌4小时后,加水淬灭反应,反相色谱纯化得中间体E3。
4)将中间体E3,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E4。
5)取10g中间体E4溶解DMF中,加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体E5。
6)将中间体E5溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯,过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后离子色谱纯化得到中间体E6。
7);将中间体E6,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体E。反应路线流程,如方程式(7)所示:
实施例3:
以中间体F和G为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体G(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(8)
其中,中间体F通过以下步骤得到:
1)称取5g鸟苷,溶解在70.0ml的磷酸三甲酯中,反应液冷却至0℃,缓慢滴加三氯氧磷(1.8eq.),冰浴下搅拌4小时后,加水淬灭反应,反相色谱纯化得中间体F1。
2)将中间体F1,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体F2。
3)取10g中间体F2溶解DMF中,加入磷酸三丁胺(3.0eq.)和氯化锌(8.0eq.)后室温搅拌5小时。反应结束后离子色谱纯化得到中间体F3。
4)将中间体F3溶解在20倍体积的纯化水中,反应液冷却至4℃,缓慢滴加硫酸二甲酯,过程中用2M的氢氧化钠调节pH不超过5,HPLC监测反应,反应结束后离子色谱纯化得到中间体F4。
5);将中间体F4,三苯基膦(1.0eq.),2,2’二硫二吡啶(2.0eq.),咪唑(8.0eq.)和三乙胺(1.0eq.)溶解在DMF中充分搅拌10小时,反应结束后加入4M的高氯酸钠丙酮溶液中析出,滤饼用丙酮充分洗涤得中间体F。反应路线流程,如方程式(10)所示:
化合物G通过以下步骤得到:
1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到腺嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中,升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温,将中间体A(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后,将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性,乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体G1。
2)取30g中间体G1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1:1)中,室温搅拌过夜。反应结束后浓缩,反相色谱纯化得到中间体G2。
3)将中间体G2溶解在150ml的DMF中,冰浴下将氢化钠(60%,2.0eq.)缓慢加入后室温搅拌0.5小时,随后将碘甲烷(1.8eq.)加入。室温搅拌2小时结束反应。冰浴下用饱和氯化铵水溶液淬灭反应后将溶液浓缩后柱层析纯化得到中间体G3。
4)将中间体G3溶解在100.0mL的吡啶中,冰浴下将三甲基氯硅烷(5.0eq.)加入后继续搅拌5小时。0℃下将苯甲酰氯(1.5eq.)滴加到反应液中,升温至室温搅拌2小时。降温至0℃,将氨水(30%,6.5eq.)滴加到反应液中,10℃以下搅拌2小时。浓缩后先后用二氯甲烷和水打浆得到中间体G4。
5)将中间体G4溶解在吡啶中,冰浴下将4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.2eq.)加入到反应液中。升温至室温搅拌4小时。反应结束后用甲醇(5.0eq.)淬灭反应。将反应液浓缩后柱层析得到中间体G5。
6)将中间体G5和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.5eq.)溶解在二氯甲烷中,冰浴下将四氮唑(1.2eq.)加入,升至室温后搅拌2小时。反应结束后,用饱和碳酸氢钠将反应液洗涤后,有机相经无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析得到中间体G6。
7)将中间体G6溶解在二氯甲烷中,室温下将2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中,冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入,室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后,反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩,经柱层析得到中间体G7。
8)将G7溶解在4L二氯甲烷中,室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时,TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1:1)中,室温反应14小时,监测反应,反应结束后浓缩,粗品装载到DEAESephadex柱上,使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体G。反应路线流程,如方程式(11)所示:
实施例4:
以中间体F和H为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体H(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(12)所示:
其中,化合物H通过以下步骤得到:
1)将BSA(2.0eq.)室温下滴加到腺嘌呤(1.2eq.)的甲苯悬浮液中,升温至回流搅拌1小时后得到澄清溶液。降至室温,将中间体B(50g)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.5eq.)加入后升温至回流继续反应1小时。反应结束后,将反应液降至室温后用饱和碳酸氢钠水溶液调节pH至中性,乙酸乙酯萃取后浓缩。粗品用柱层析纯化得到中间体H1。
2)取30g中间体H1溶解在300.0mL的氨水/甲醇(1:1)中,室温搅拌过夜。反应结束后浓缩,反相色谱纯化得到中间体H2。
3)将中间体H2溶解在150ml的DMF中,冰浴下将氢化钠(60%,2.0eq.)缓慢加入后室温搅拌0.5小时,随后将碘甲烷(1.8eq.)加入。室温搅拌2小时结束反应。冰浴下用饱和氯化铵水溶液淬灭反应后将溶液浓缩后柱层析纯化得到中间体H3。
4)将中间体H3溶解在100.0mL的吡啶中,冰浴下将三甲基氯硅烷(5.0eq.)加入后继续搅拌5小时。0℃下将苯甲酰氯(1.5eq.)滴加到反应液中,升温至室温搅拌2小时。降温至0℃,将氨水(30%,6.5eq.)滴加到反应液中,10℃以下搅拌2小时。浓缩后先后用二氯甲烷和水打浆得到中间体H4。
5)将中间体H4溶解在吡啶中,冰浴下将4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(1.2eq.)加入到反应液中。升温至室温搅拌4小时。反应结束后用甲醇(5.0eq.)淬灭反应。将反应液浓缩后柱层析得到中间体H5。
6)将中间体H5和双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(1.5eq.)溶解在二氯甲烷中,冰浴下将四氮唑(1.2eq.)加入,升至室温后搅拌2小时。反应结束后,用饱和碳酸氢钠将反应液洗涤后,有机相经无水硫酸钠干燥,浓缩,柱层析得到中间体H6。
7)将中间体H6溶解在二氯甲烷中,室温下将2’,3’-乙酰基鸟苷(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中,冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入,室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后,反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩,经柱层析得到中间体H7。
8)将H7溶解在4L二氯甲烷中,室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时,TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1:1)中,室温反应14小时,监测反应,反应结束后浓缩,粗品装载到DEAESephadex柱上,使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体H。反应路线流程,如方程式(13)所示:
实施例5:
以中间体F和I为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体I(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(14)所示:
其中,化合物I通过以下步骤得到:
1)取20g中间体C2溶解在200.0mL的吡啶中,随后将乙酸酐(4.0eq.)和DMAP(1.0eq.)加入到反应液中。升温至70℃搅拌3小时,反应结束后浓缩除去吡啶。粗品经柱层析得到中间体I1。
2)取20g中间体I1溶解在200.0mL的碘(3.0eq.)/甲醇溶液中,升温至67℃搅拌30小时。反应结束后浓缩。将浓缩后的反应液溶解在二氯甲烷中,分别用5%的硫代硫酸钠水溶液和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥后过滤、浓缩、柱层析得到中间体12。
3)将中间体I2溶解在二氯甲烷中,室温下将2’OMe-rA亚磷酰胺单体(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中,冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入,室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后,反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩,经柱层析得到中间体I3。
4)将I3溶解在4L二氯甲烷中,室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时,TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1:1)中,室温反应14小时,监测反应,反应结束后浓缩,粗品装载到DEAESephadex柱上,使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体I。反应路线流程,如方程式(15)所示:
实施例6:
以中间体F和J为原料的核糖环修饰的mRNA帽类似物的合成方法
将中间体F(2mol)溶解在含有MnCl2(20mol)的DMF溶液中,随后将中间体J(1.8mol)加入到反应液中。在室温下搅拌反应。24小时后,用10L的0.25MEDTA溶液终止反应。将混合物装载到DEAESephadex柱上。将产物使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得目标产物,反应路线流程,如方程式(16)所示:
其中,化合物J通过以下步骤得到:
1)取20g中间体E2溶解在200.0mL的吡啶中,随后将乙酸酐(4.0eq.)和DMAP(1.0eq.)加入到反应液中。升温至70℃搅拌3小时,反应结束后浓缩除去吡啶。粗品经柱层析得到中间体J1。
2)取20g中间体J1溶解在200.0mL的碘(3.0eq.)/甲醇溶液中,升温至67℃搅拌30小时。反应结束后浓缩。将浓缩后的反应液溶解在二氯甲烷中,分别用5%的硫代硫酸钠水溶液和饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥后过滤、浓缩、柱层析得到中间体12。
3)将中间体J2溶解在二氯甲烷中,室温下将2’OMe-rA亚磷酰胺单体(1.0eq.)加入。冰浴下加入四氮唑(1.0eq.)后升温至25℃搅拌5小时。TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。浓缩后的油膏溶解在4L二氯甲烷中,冰浴下将三氟乙酸(4.0eq.)缓慢加入,室温搅拌2小时。TLC监测反应结束后,反应液分别用饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩,经柱层析得到中间体J3。
4)将J3溶解在4L二氯甲烷中,室温下将双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(1.5eq.)和四氮唑(1.5eq.)加入到反应液中室温搅拌3小时,TLC监测反应结束后,将1.2eq.的碘吡啶溶液加入到反应液中。TLC监测反应结束后反应液分别用5%的硫代硫酸钠溶液,饱和碳酸氢钠溶液,饱和食盐水洗涤后将有机相浓缩。粗品溶解在10倍体积的甲醇/浓氨水(1:1)中,室温反应14小时,监测反应,反应结束后浓缩,粗品装载到DEAESephadex柱上,使用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱。浓缩得中间体J。反应路线流程,如方程式(17)所示:
实施例7:以中间体D和K为原料合成化合物7的铵盐合成路径
以中间体D和K为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物7的铵盐。反应路线如方程式(18)所示:
/>
其中,化合物K通过以下步骤得到:参考实施例4中中间体H1和H2的合成方法分别得到中间体K2和K3。参考实施例3中中间体F1-F的合成方法得到中间体K4-K。
实施例8:以中间体D和L为原料合成化合物8的铵盐合成路径
以中间体D和L为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物8的铵盐。反应路线如方程式(20)所示:
其中,化合物L通过以下步骤得到:
1)将三甲基硅基乙炔(2.1mol)的THF(3.5L)溶液降温至-78℃。将正丁基锂(2.3mol,2.5M in hexanes)-78℃下缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后继续搅拌半小时。再将化合物L1(1.4mol)的THF(0.5L)溶液滴加到上述混合物中,继续搅拌3小时。将反应液用饱和氯化铵水溶液淬灭后用乙酸乙酯萃取2次,每次1L。有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩,经柱层析纯化得到中间体L2。
2)取中间体L2(1.0mol)溶解在DCM(940.0mL)中,加入TEA(1.4mol)和DMAP(0.01mol)后,冰浴下将乙酸酐(1.3mol)滴加到反应液中。恢复室温后搅拌5小时。反应液依次用水、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,减压浓缩有机相,柱层析纯化得中间体L3。
3)参考实施例7中中间体K2的合成方法得到中间体L4。
4)取中间体L4(0.35mol)溶解在THF(2.0L)中,冰浴下将冰醋酸(1.22mol)和四丁基氟化铵(0.7mol,1M in THF)加入到反应液中。恢复室温搅拌2小时。反应液减压浓缩后经柱层析纯化得到中间体L5。
5)取中间体L5(0.25mol)溶解在80%的甲酸水溶液中,室温反应过夜。反应液减压浓缩后经柱层析纯化得到中间体L6。
参考实施例7中中间体K4-K的合成方法分别得到中间体L7-L。
实施例9:以中间体D和M为原料合成化合物13的铵盐合成路径
以中间体D和M为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物13的铵盐。如方程式(22)所示:
其中,化合物M通过以下步骤得到:参考实施例8中中间体L7-L的合成方法分别得到中间体M2-M。
实施例10:以中间体D和N为原料合成化合物14的铵盐合成路径
以中间体D和N为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物14的铵盐。反应路线如方程式(24)所示:
其中,化合物N通过以下步骤得到:参考实施例9中中间体M2-M的合成方法分别得到中间体N2-N。
实施例11:以中间体D和O为原料合成化合物17的铵盐合成路径
以中间体D和O为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物17的铵盐。反应路线如方程式(26)所示:
其中,化合物O通过以下步骤得到:参考实施例10中中间体N2-N的合成方法分别得到中间体O2-O。
实施例12:以中间体D和P为原料合成化合物18的铵盐合成路径
以中间体D和P为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物18的铵盐。反应路线如方程式(28)所示:
其中,化合物P通过以下步骤得到:参考实施例7中中间体K2、K3的合成方法得到中间体P2、P3;参考实施例11中中间体O2-O的合成方法分别得到中间体P4-P。
实施例13:以中间体D和Q为原料合成化合物19的铵盐合成路径
以中间体D和Q为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物19的铵盐。反应路线如方程式(30)所示:
其中,化合物Q通过以下步骤得到:参考实施例12中中间体P3-P的合成方法分别得到中间体Q2-Q。
实施例14:以中间体D和R为原料合成化合物20的铵盐合成路径
以中间体D和R为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物20的铵盐。反应路线如方程式(32)所示:
其中,化合物R通过以下步骤得到:参考实施例13中中间体Q2-Q的合成方法分别得到中间体R2-R。
实施例15:以中间体F和S为原料合成化合物25的铵盐合成路径
以中间体F和S为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物25的铵盐。反应路线如方程式(34)所示:
其中,化合物S通过以下步骤得到:
称取S1(0.23mol)和N-异丁酰基-2’,3’乙酰基鸟苷(0.23mol)溶解在DCM(2.0L)中。氮气氛围下加入四氮唑(0.5mol)。室温搅拌2小时。反应结束后,将叔丁基过氧化氢水溶液(0.69mol,70%)滴加到反应液中,室温继续反应1小时。向反应液滴加三氯乙酸(0.69mol)的DCM(0.4L)溶液,室温反应2小时。将反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液,10%碳酸氢钠水溶液,饱和食盐水洗涤后,有机相减压浓缩后用柱层析纯化得到中间体B1。
取中间体S2(0.18mol)和双(2-氰乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺(0.25mol)溶解在DCM(1.7L)。氮气氛围下加入四氮唑(0.39mol)。室温搅拌2小时。反应结束后,将叔丁基过氧化氢水溶液(0.51mol,70%)滴加到反应液中,室温继续反应1小时。将反应液分别用10%亚硫酸钠水溶液,10%碳酸氢钠水溶液,饱和食盐水洗涤后,有机相减压浓缩后溶解在甲醇(0.5L)和氨水(1.0L)中,室温搅拌过夜。浓缩除去溶剂后用水稀释,装载到DEAE Sephadex上,用0-1.0M的TEAB洗脱液线性梯度洗脱,浓缩得到中间体S。反应路线如方程式(35)所示:
实施例16:以中间体F和T为原料合成化合物27的铵盐合成路径
以中间体F和T为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物27的铵盐。反应路线如方程式(36)所示:
其中,化合物T通过以下步骤得到:参考实施例15中中间体S2-S的合成方法分别得到中间体T2-T。
实施例17:以中间体F和U为原料合成化合物28的铵盐合成路径
以中间体F和U为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物28的铵盐。反应路线如方程式(38)所示:
其中,化合物U通过以下步骤得到:参考实施例16中中间体T2-T的合成方法分别得到中间体U2-U。
实施例18:以中间体F和V为原料合成化合物41的铵盐合成路径
以中间体F和V为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物41的铵盐。反应路线如方程式(40)所示:
其中,化合物V通过以下步骤得到:参考实施例17中中间体U2-U的合成方法分别得到中间体V1-V。
实施例19:以中间体F和W为原料合成化合物41的铵盐合成路径
以中间体F和W为原料,参考实施例1目标产物中化合物1的合成方法得到化合物42的铵盐。反应路线如方程式(42)所示:
其中,化合物W通过以下步骤得到:参考实施例18中中间体V1-V的合成方法分别得到中间体W1-W。
对比例1:m7GpppA2’OmepG
m7GpppA2’OmepG的合成方法参考上述实施例的合成方法(所使用的原料参考各实施例中的制备方法),反应路线流程,如方程式(44)所示:
测试例1:mRNA体外转录产量及加帽效率检测
利用核糖环修饰的mRNA帽类似物进行mRNA的体外合成:先用NotI线性化质粒,4℃酶切过夜;DNA模板抽提;体外转录合成mRNA,分别使用核糖环修饰的mRNA帽类似物及对比例1的mRNA帽类似物作为帽结构。
反应体系如表3:
表3
体系 | 用量 |
T7 RNA聚合酶 | 50U |
10X buffer | 2μl |
100mM ATP | 1μl |
100mM GTP | 1μl |
100mM CTP | 1μl |
100mM N1-Me-pUTP | 1μl |
100mM帽类似物 | 1μl |
无机焦磷酸酶 | 0.05U |
核酸酶抑制剂 | 20U |
无菌无酶水 | 补足至20μl |
模板 | 1μg |
在实验过程中,首先计算好体系所需物料体积,然后进行加样。首先在体系中加入无菌无酶水,随后依次加入10X buffer、NTPs、帽类似物,混匀后轻轻离心,随后加入核酸酶抑制剂、无机焦磷酸酶、T7 RNA聚合酶、线性化DNA模板,充分混匀后轻轻离心,于37℃下孵育。2小时后加入DNase I 1U,37℃继续孵育30分钟以去除DNA模板,然后进行RNA纯化,通常使用磁珠纯化方法。纯化的mRNA用无菌无酶水进行溶解,随后利用Nanodrop One进行定量检测。
液相色谱质谱法(LC-MS)被用来检测不同起始帽类似物的mRNA的IVT加帽率;首先需要设计一段与转录产物mRNA起始碱基匹配的具有标记的DNA探针,通常的标记为biotin标记,将链霉亲和素标记的磁珠清洗后与合成的DNA探针、mRNA及10×RNase H reactionbuffer室温室温孵育30分钟,边孵育边缓慢混匀,随后加入20ul RNase H(5U/ul)孵育37度3h,每半个小时混匀一次。孵育结束后对磁珠进行清洗,清洗完成后的磁珠加入100μL加热到80℃的75%甲醇,混合物在加热板上加热到80℃,保持3分钟,然后放置磁力架上吸取上清,使用蒸发离心机在室温下干燥45分钟至10μl。然后将样品重新悬浮在50μl的100μMEDTA/1% MeOH中,即可用于LC-MS分析,确定转录反应中RNA的加帽情况。由于加帽与非加帽的碱基在分子量上有明显区别,利用分子质量差别即可判定不同帽类似物起始的mRNA转录的加帽率。具体结果见表4。
表4
/>
/>
/>
由表4实验结果可知,本申请的核糖环修饰的帽类似物均能够通过IVT转录出相应的目标mRNA。且其帽类似物转录的产量和加帽率都显著高于对比例1,部分与对比例1相当。
测试例2:翻译效率检测
mRNA翻译效率采用eGFP编码序列为DNA模板,利用核糖环修饰的mRNA帽类似物及对比例1的帽类似物为起始进行体外转录。随后将获得的不同的mRNA产物进行293T细胞的转染。293T细胞以(0.5-1)×105个细胞进行铺板(24孔板)。转染时细胞密度一般60-80%为佳,每孔转染2μg mRNA,转染试剂选用Lipofectamine MessengerMAX TransfectionReagent(Invitrogen)并参考其使用方法进行操作。转染后的细胞放置在37℃,CO2孵育箱中,转染4-6小时后,更换为新鲜的完全培养基。在37℃的CO2培养箱箱中孵育24小时以后,荧光显微镜观察其中GFP的荧光强度,并且根据荧光强度计算核糖环修饰的mRNA帽类似物相对于对比例1的荧光强度比例。
表5
/>
/>
/>
由表5可知,本申请的核糖环修饰的帽类似物转录的mRNA在细胞内翻译效果显著优于对比例1,部分与对比例1相当。
因此,当帽类似物结构中含有五元糖环不同修饰取代结构,可能对提高帽类似物与elF4E蛋白的结合能力有一定的提高,并且最终促进了目的mRNA在细胞内的翻译效果。
测试例3:稳定性测试
取30pmol经聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE纯化后的RNAs与50U mRNA脱帽酶(NewEngland Biolabs)、1×MDE缓冲液混匀后37℃酶促反应45min。将酶促反应物进行PAGE电泳、SYBR Green II(Lonza)染色后在Typhoon FLA 7000(GE Healthcare)仪器上观察电泳后的胶图。使用Image Quant(GE Healthcare)软件统计加帽RNA与脱帽RNA电泳条带强度比率,计算得出经脱帽酶(DCP2酶)处理后,帽类似物的脱帽率。使用KaleidaGraph(Synergy)软件的Dunnett检验进行统计学检验。脱帽酶处理后的脱帽率如表6所示。
表6
/>
/>
/>
由表6可知,经脱帽酶(DCP2酶)处理后,本发明的帽类似物的脱帽率显著低于对比例1,部分帽类似物的脱帽率跟对比例1相当。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (15)
1.一种核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,其为式(I)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐:
其中,
X1、X2和X3分别独立地为O、CH2或NH;
Y1、Y2和Y3分别独立地为O、S、Se或BH3;
R1、R4、R5、R7、R8分别独立地为H、OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;且R1、R4、R5、R7、R8中至少一个为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;
R2、R3、R13、R14分别独立地为H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
R6、R9、R10、R11、R12独立地为H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
B1、B2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
2.根据权利要求1所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R2和R13中至少一个为H,R3和R14中至少一个为H。
3.根据权利要求1所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R1、R4、R5、R7或R8中只有一个为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;R1、R4、R5、R7或R8中其余四个分别独立地为H。
4.根据权利要求1所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,其为式(Ⅱ)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐:
R1或R5中只有一个为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;R1或R5中另一个为H;
R13、R14分别独立地为H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
B1、B2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
5.根据权利要求4所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R13、R14分别独立地为OH。
6.根据权利要求4所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R1选自乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl;R5为H。
7.根据权利要求4所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R5选自乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl;R1为H。
8.根据权利要求1或4所述核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,其为式(Ⅲ)所示化合物、立体异构体、或药学上可接受的盐:
R1为OH、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6烯基、C1-6炔基、氰基;所述C1-6烷氧基未被取代或被R15取代,R15为C1-6烷氧基;
R13、R14分别独立地为H、OH、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素;
B1、B2独立地为天然的、或修饰的、或非天然的核苷碱基。
9.根据权利要求8所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R1为乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、丁炔基、氰基、羟基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl。
10.根据权利要求8所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,R13、R14分别独立地为H、OH、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、-O-亚甲基-O-甲基、-O-亚乙基-O-甲基、-O-亚甲基-O-乙基、-O-亚乙基-O-乙基、F或Cl。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物,其特征在于,其为以下化合物、其立体异构体、或其药学上可接受的盐:
12.权利要求1-11任一项所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物在制备体外共转录RNA加帽试剂中的应用。
13.一种复合体,其包含权利要求1-11任一项所述核糖环修饰的mRNA帽类似物的DNA模板,其中所述DNA模板包括含有转录起始位点的启动子区,所述转录起始位点具有在核苷酸位置+1处的第一核苷酸和在核苷酸位置+2处的第二核苷酸;以及B1与所述DNA模板位置+1处的核苷碱基互补,并且B2与所述DNA模板上转录模板位置+2处的核苷碱基互补。
14.一种RNA分子,其特征在于,包含权利要求1-11任一项所述的核糖环修饰的mRNA帽类似物。
15.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求14所述的RNA分子,以及药学上可接受的载体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211394746.6A CN116143854A (zh) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 |
CN2022113947466 | 2022-11-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117510565A true CN117510565A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=86360758
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211394746.6A Pending CN116143854A (zh) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 |
CN202311471862.8A Pending CN117510565A (zh) | 2022-11-08 | 2023-11-07 | 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211394746.6A Pending CN116143854A (zh) | 2022-11-08 | 2022-11-08 | 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN116143854A (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116375781B (zh) * | 2023-03-24 | 2023-12-29 | 江苏申基生物科技有限公司 | 一种tna修饰的帽类似物及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-11-08 CN CN202211394746.6A patent/CN116143854A/zh active Pending
-
2023
- 2023-11-07 CN CN202311471862.8A patent/CN117510565A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116143854A (zh) | 2023-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sung | Synthesis of 4-triazolopyrimidinone nucleotide and its application in synthesis of 5-methylcytosine-containing oligodeoxyribonucleotides | |
JPH10510433A (ja) | 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド | |
CN115109110A (zh) | 一种含六元糖环结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 | |
CN114685588B (zh) | 一种含开环核苷结构的起始加帽寡核苷酸引物 | |
CN115057903B (zh) | 一种含吗啉环结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 | |
CN117510565A (zh) | 一种核糖环修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 | |
US7101992B1 (en) | Nucleic acid base pair | |
CN111971396A (zh) | 单链rna的制造方法 | |
CN117384988B (zh) | 一种医药中间体2'-o-丙炔基-鸟苷的合成方法 | |
CN110551722B (zh) | 一种核酸复合物及其制备方法和应用 | |
CN114656511B (zh) | 乙酰化胞嘧啶三磷酸盐及其中间体的制备方法 | |
CN116143855B (zh) | 一种乙烯基膦酸修饰的mRNA帽类似物及其制备方法和应用 | |
WO2023246860A1 (zh) | 一种起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 | |
CN116768950B (zh) | 一种起始加帽寡核苷酸引物及其应用 | |
CN116987137B (zh) | 一种加帽化合物及其在mRNA加帽中的应用 | |
JPH07188278A (ja) | オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドおよび酵素的に切断可能な保護基を有するヌクレオシド誘導体 | |
CN114853836B (zh) | 一种含gna结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 | |
Lindberg et al. | Synthesis of sucrose 4′-(L-arabinose-2-yl phosphate)(Agrocinopihe A) using an arabinose 2-H-phosphonate intermediate | |
CN116375781B (zh) | 一种tna修饰的帽类似物及其制备方法和应用 | |
WO2021024467A1 (ja) | 一本鎖rnaの製造方法 | |
CN114853836A (zh) | 一种含gna结构的起始加帽寡核苷酸引物及其制备方法和应用 | |
US20240132534A1 (en) | Oligonucleotide primer with an acyclic nucleoside structure for initial capping | |
Madsen et al. | LNA 5′-phosphoramidites for 5′→ 3′-oligonucleotide synthesis | |
CN117417400B (zh) | 2'-o-丙炔基-5'-二甲氧三苯甲基-n4-乙酰基-胞苷的合成方法 | |
CN116554250A (zh) | 一种pace结构修饰的帽类似物及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |