CN112587670B - 一种靶向调控白色脂肪棕色化的dna纳米花药物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向调控能量代谢的DNA纳米花药物及其制备方法与应用，该药物由脂肪细胞靶向的DNA纳米花NF（Nano Flowers）和大蒜素A（Allicin）组成。大蒜素通过多种相互作用力与核酸发生作用并结合在DNA纳米花表面；生成的DNA纳米花具有脂肪细胞靶向性和大蒜素高效装载能力。本发明的DNA纳米花药物，对脂肪细胞有很好的靶向性，相比较于单链DNA适配体，形成的DNA纳米花对脂肪细胞的靶向能力更强且稳定性更高，可以特异性的进入脂肪细胞；而大蒜素具有很好的调节能量代谢能力，可调控白色脂肪棕色化，两者结合后，可以特异性的递送大蒜素进入脂肪细胞，因而构建的DNA纳米花药物可以起到靶向到肥胖组织精准调控能量代谢的目的且具有较高的生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米药物技术领域，具体涉及一种靶向调控白色脂肪棕色化的DNA纳米药物及其制备方法与应用。
背景技术
肥胖已被世界卫生组织认定为世界上最严重的公共卫生疾病，严重影响人民生活质量，诱导各类重大疾病及并发症。目前，对于肥胖的临床治疗策略及临床研究主要通过控制人体能量摄取、吸收以及机体的新陈代谢等途径进行的。但是，目前关于肥胖的抵制策略效果欠佳，且存在明显的个体差异性。同时，绝大多数抗肥胖药物常常引起严重的副作用，从而导致治疗的失败，严重时甚至威胁到患者的生命安全。因此，发展安全、有效的、通用的肥胖及其并发症的治疗策略对于提高患者生活质量，降低能量代谢失调所引发的重大疾病产生具有非常重要的意义。科学家发现随着机体对营养物质的过量吸收，过多的能量不断在白色脂肪中积累，就会导致肥胖及代谢失调。因此，可以通过激活棕色脂肪组织，增加能量产出，来燃烧储存的脂肪以达到改善能量代谢的目的。
白色脂肪组织和棕色脂肪组织在调节能量平衡方面发挥重要作用。白色脂肪组织以脂滴的形式存储能量，当能量摄入超过能量消耗时，脂肪组织积累引起肥胖。棕色脂肪组织依赖其线粒体内膜上的解耦联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1)以产热的方式消耗能量。然而，棕色脂肪在成人体内表达量很低，通过刺激白色脂肪细胞产生棕色样脂肪细胞，激活后的棕色样脂肪细胞表达UCP1和生热基因的能力显著高于棕色脂肪。与棕色脂肪发挥功能相关的信号通路主要有棕色脂肪细胞分化形成、产热、线粒体生物合成、脂肪酸代谢等通路。其中，与能量代谢密切相关的基因包括Ucp1, Cpt1, Pgc1家族基因等。KLF15在脂肪细胞中高度表达，并且在棕色脂肪细胞分化过程中起重要作用，可能与激活UCP1的表达有关。PGC-1α能够促进线粒体的生物合成，调节适应性产热。AMPK（AMP-activatedprotein kinase）即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，控制PGC-1α的表达和线粒体生物合成。CPT1是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用，被公认为决定脂肪酸氧化速率的有效因子。因此，通过DNA纳米花装载大蒜素靶向到脂肪组织，促进白色脂肪棕色化，通过激活相关基因或蛋白表达，上调线粒体生物合成、提高产热能力来调控能量代谢，是对抗代谢失调，缓解肥胖的有效策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物安全性高，结构稳定性好、尺寸可调，且具有靶向脂肪细胞，调节能量代谢作用的DNA纳米药物及其制备方法与应用。
本发明这种脂肪细胞靶向的DNA纳米药物，由脂肪细胞靶向的DNA纳米花和大蒜素通过1）与胸腺嘧啶分子结合；2）嵌入核酸小沟内；3）与含氮碱基上正电荷的静电相互作用结合而成；生成的DNA纳米花具有脂肪细胞靶向性和大蒜素高效装载能力，装载大蒜素后其与大蒜素的浓度比可达到1:1000～10000，对大蒜素具有高效装载能力。所述的脂肪细胞靶向的DNA纳米花平均尺寸为0.6～1 μm。
所述的脂肪细胞靶向的DNA纳米花，包含如SEQ ID NO:1所示的DNA适配体序列重复单元，该序列通过与金属镁离子堆积形成片层状的DNA纳米花结构，装载大蒜素后，具有一定地抵抗体内复杂环境降解能力。
本发明这种脂肪细胞靶向的DNA纳米花的制备方法，包括以下步骤：
1)连接：包含有脂肪细胞适配体靶向序列或突变序列的5’端磷酸化DNA模板(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示)和引物(如SEQ ID NO:4所示)混合于DNA连接酶缓冲液中，进行缓慢退火处理，退火之后的产物与T4 DNA连接酶进行孵育，形成环化的DNA模板；
2)聚合：将步骤1)中环化的DNA模板与phi29 DNA聚合酶、dNTP和BSA在聚合酶缓冲液中进行聚合反应，反应结束后，反应混合物在设定温度加热终止聚合反应，反应产物洗涤后，得到脂肪细胞靶向的DNA纳米花。
所述步骤1)中，5’端磷酸化DNA模板浓度为8～12 μM，引物的浓度为8～12 μM，DNA连接酶缓冲液由5 mM Tris-HCl、1 mM MgCl2、0.1 mM ATP和1 mM二硫苏糖醇组成，T4 DNA连接酶的浓度为50～70 U/μL；退火具体工艺参数为：95℃下保持5 min，然后在2 h之内缓慢降温至室温，连接反应温度为25 ℃，反应时间为2 h。
所述步骤2)中，环化的DNA模板的浓度为0.5～0.7 μM，phi29 DNA聚合酶的浓度为8～12 U/μL，BSA的浓度为(0.04～0.06)%，聚合酶缓冲液由50 mM Tris-HCl、10 mM(NH4)2SO4、10 mM MgCl2和4 mM二硫苏糖醇组成，四者混合的体积比为(45～55):(15～25): (0.5～1.5): (95～105)；聚合反应温度为28～32℃，聚合反应时间为18～30 h，设定温度为70～80 ℃，加热时间为8～12 min。
本发明这种脂肪细胞靶向的DNA纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
向DNA纳米花溶液中加入大蒜素在设定温度下进行摇床上结合反应，反应完毕后，离心，即可得到脂肪细胞靶向的DNA纳米药物。
所述的纳米花溶液的浓度为0.1～0.4 μM，大蒜素的浓度为5～15 mM，两者的混合体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
所述的脂肪细胞靶向调节能量代谢的DNA纳米药物在作为减肥药物中的应用。
本发明的原理
本发明构建一种脂肪细胞靶向的DNA纳米药物，在本发明中首先利用DNA分子的可编程性，巧妙地将脂肪细胞靶向的核酸适配体序列设计在DNA5’端磷酸化模板中，再以滚环复制技术和DNA自组装能力相结合的方式合成了脂肪细胞靶向的DNA纳米花，然后DNA纳米花结构可以通过静电作用，碱基堆积，高效地结合天然产物大蒜素。DNA纳米花强大的比表面积存在大量的大蒜素结合位点，使其具有较高的大蒜素负载能力。同时，大蒜素对DNA纳米框架的压缩能力，使其能精确地控制纳米花的尺寸和表面化学性质。基于大蒜素具有促进白色脂肪棕色化能力，通过纳米花和大蒜素相互作用形成的脂肪细胞靶向、多功能NFA既具有可调的尺寸、高的大蒜素负载能力、广泛的调节能量代谢功能，又具有特异性的结合脂肪细胞的能力。一旦，NFA特异性的进入脂肪细胞，就可以增加脂肪产热，调节能量代谢，从而达到DNA纳米花装载大蒜素靶向调节能量代谢、抵抗肥胖的效果。
本发明具有如下有益效果：
1、在环状模板上引入适配体互补序列和装载药物的发卡结构，用扩增出的DNA纳米花对大蒜素进行装载，能明显提升大蒜素的溶解能力和靶向性。大蒜素经DNA纳米花装载后被运输至脂肪组织，与细胞膜表面蛋白发生特异性结合被运输至细胞内，再在溶酶体中酸性条件和核酸酶的共同作用下完成释放，这种方式能明显提升大蒜素的作用效果和降低大蒜素的副作用，且具有特异性强，稳定性高，安全性高，简单易操作，生物相容性好，体内可降解的优点。
2、本发明的DNA纳米药物中包含有脂肪细胞适配体和大蒜素，大蒜素负载在DNA纳米花结构上；DNA框架结构包括有脂肪细胞靶向的核酸适配体序列，对脂肪细胞有很好的靶向性，可以特异性的进入脂肪细胞，而大蒜素具有很好的促进白色脂肪棕色化能力可增加产热、调节能量代谢。因而两者结合后，可以特异性的进入脂肪细胞，因而可以对肥胖组织能量代谢起调控作用，从而达到靶向增加产热，治疗肥胖的目的。
3、本发明的DNA纳米药物的载体为DNA框架结构，其主体为核苷酸，配体为生物相容性好的镁离子，形成的DNA纳米花，不存在毒性。而且，本发明的DNA纳米药物是利用天然产物良好的促进白色脂肪棕色化和调节能量代谢能力和较高的生物安全性设计的，因而副作用小，且治疗效果好，安全性高。
4、本发明的DNA纳米药物中，DNA框架上有大量的大蒜素的结合位点，使其具有高的负载能力，大蒜素对DNA纳米花的压缩能力，使其能精确地控制DNA纳米花的尺寸和表面化学性质，疏水性的大蒜素将有利于DNA纳米药物被胞吞进入细胞。
5、本发明的DNA纳米药物装载的大蒜素是一种具有降血糖、保肝、抗氧化等功能的天然植物化学物，本研究通过DNA纳米花装载大蒜素，利用了核酸适配体的靶向能力，增加了大蒜素的水溶性和靶向性，将大大拓展其在能量代谢调控方面的应用前景。
附图说明
图1A：滚环扩增反应产生DNA纳米花示意图；B：大蒜素装载示意图。
图2A：不同比例引物与环状模板结合能力验证；B：不同浓度dNTP对滚环扩增反应效率的影响；C：不同浓度phi29酶对扩增效率的影响；D：滚环扩增不同时间后DNA纳米花产物表征。
图3滚环扩增不同时间后（A-F：2 h；4h ；8 h；12 h；24 h；36 h）扫描电镜照片。
图4滚环扩增不同时间后产生的纳米花核磁共振图谱。
图5滚环扩增24 h产生的纳米花电位表征和粒径分布。
图6DNA纳米花形貌和元素组成分析。
图7A：紫外光谱测定滚环扩增产生的DNA纳米花对大蒜素的装载效率；B：DNA纳米花和单链核酸对大蒜素转载能力对比；C：滚环扩增不同时间后产生DNA纳米花装载效率。
图8滚环扩增产生的DNA纳米花对大蒜素的装载电镜图：A：扫描电镜照片，B：能谱照片。
图9A：DNA纳米花装载大蒜素的热稳定性分析；B：酸性条件下DNA纳米花药物释放大蒜素对比。
图10酸性条件下DNA纳米花降解情况。A：pH= 7；B：pH= 6；C：pH= 5；D：pH= 7,核酸酶 (5 U/mL)；E：pH= 6, 核酸酶 (5 U/mL)；F：pH= 5, 核酸酶 (5 U/mL)。
图11 油红染色验证诱导3T3L1细胞分化。A：诱导分化前；B：诱导分化后。
图12DNA纳米药物靶向脂肪细胞能力验证。A：适配体序列；B：适配体突变序列。
图13 DNA纳米花药物生物相容性。
图14DNA纳米药物处理促进相关基因表达。
图15 活体验证DNA纳米花药物对脂肪组织靶向能力。
具体实施方式
实施例1DNA纳米药物NFA的制备过程。
本发明的DNA纳米药物的制备过程图，如图1所示，具体如下：
1. 连接：包含有脂肪细胞适配体靶向序列的5’磷酸化DNA模板(10 μM，4.5 μL)(SEQ ID NO:2所示)和引物(10 μM, 4.5 μL) (SEQ ID NO:4所示)混合于终体积27 μL DNA连接酶缓冲液(5 mM Tris-HCl、1 mM MgCl2、0.1 mM ATP和1 mM二硫苏糖醇)中，进行退火（95℃下保持5 min，然后在2 h之内缓慢降温至室温）。退火之后的产物与T4 DNA连接酶(40U/μL，3 μL)在25 ℃下放置2 h连接成环化的DNA模板。
2.聚合：环化的DNA模板的浓度为0.6～0.8 μM，phi29 DNA聚合酶的浓度为8～12U/μL，BSA的浓度为(0.04～0.06)%，聚合酶缓冲液由50 mM Tris-HCl、10 mM (NH4)2SO4、10mM MgCl2和4 mM二硫苏糖醇组成；聚合反应温度为28～32 ℃，聚合反应时间为18～30 h，聚合结束后，在设定温度为60～70 ℃条件下加热时间为8～12 min灭活。收集DNA纳米花，用双蒸水洗两次并储存在-20℃冰箱中备用。
3.大蒜素负载：20 μL 0.3 μM DNA纳米花溶液同大蒜素A(10 mM，20 μL)于4℃摇床上混合2 h，再离心并收集上清液，用紫外可见分光光度仪测上清中大蒜素在220 nm波长处的紫外吸收值，以此定量DNA纳米花对大蒜素的负载效率。
表1序列信息表
备注：黑色加粗的部分与SEQ ID NO:4（引物DNA链）部分互补，SEQ ID NO:5 （CY5标记DNA链）与滚环扩增产生的核酸适配体或随机对照链部分互补。
实施例2DNA纳米花制备的条件优化
在本实施例中构建的DNA纳米花通过脂肪细胞特异性核酸适配体作为RCA扩增模板，成功合成了具有致密层状结构的DNA纳米花，且具有靶向脂肪细胞的作用。DNA纳米花制备过程中反应条件优化如图2所示，通过Page研究了引物和环状模板结合用于滚环扩增反应的最佳比例(1：0；0：1; 2：1; 1：1; 1：2)，结果表明，引物和环状模板浓度比为1：1时，结合情况良好。同时对dNTP (0.05-0.30mmol/L)和phi29酶浓度(0.10-0.35U/μL)及反应体系进行了优化，如图2B、图2C琼脂糖电泳结果所示，在dNTP浓度为0.15-0.30 mmol/L，phi29酶浓度为0.20-0.35 U/μL时，扩增良好。图2D结果表明随着滚环扩增反应的进行，滚环扩增产物分子量逐渐增大，这为其扩增产生纳米花提供了必要条件。
实施例3DNA纳米花的形成与表征
图3 结果显示随着滚环扩增反应的进行，DNA纳米花的粒径逐渐增大，且为单分散的片层结构，这证明DNA纳米花粒径可调且与滚环时间呈现一定的相关性，也为大蒜素的装载和靶向提供了良好的基础。我们首次用核磁共振技术对DNA纳米花的形成过程进行追踪验证，因为随着滚环扩增的进行，滚环扩增产物分子量逐渐增大，滞留在孔里，因此琼脂糖凝胶电泳后期无法表征此反应进行情况。图4结果显示，随着滚环扩增的进行，6.87 ppm和7.35ppm两处信号峰逐渐增强，明显看出滚环扩增反应的有效进行。
实施例4DNA纳米花对大蒜素的装载
对本实施例的DNA纳米花和DNA纳米花药物进行Zeta-电位分析，如图5所示，滚环24 h 产生的DNA纳米花电位为-28 mV，呈现明显的负电性。与大蒜素进行结合后，电位提升至-24 mV，表明大蒜素成功的结合在DNA纳米花表面，大蒜素的屏蔽作用降低了DNA纳米花表面的负电荷。生成的DNA纳米药物，粒径为0.6-1.0μm，装载大蒜素后粒径减小，说明大蒜素可调节DNA纳米花结构。图6的扫描电镜和能谱结果显示DNA纳米花主要由C，P，N，Mg组成，表明由滚环扩增产生的DNA纳米花主要成分为核酸及金属镁离子，这一结果一方面表明DNA纳米花的内部结构组成，另一方面，无有害元素被发现也证明了DNA纳米花高的生物安全性。图7通过紫外光谱定量DNA纳米花对大蒜素的负载能力。核酸本身对大蒜素的装载能力很低，但是，当滚环扩增产生DNA纳米花时，其对大蒜素的装载能力显著提升，且随着滚环扩增反应的进行，对大蒜素的装载能力进一步提升，这可能与DNA纳米花强大的比表面积和重复的核酸链提供了更多的大蒜素结合位点有关。图8的能谱结果显示，除了DNA纳米花的基本元素C，N，P，Mg外，还存在大蒜素的特征元素S元素，表明大蒜素被成功的装载DNA纳米花表面，这也表明用DNA纳米花装载大蒜素方案的可行性。
实施例5DNA纳米花装载大蒜素的稳定性与释放机制
将本实施例制备的DNA纳米花药物进行热稳定性和在不同pH条件下进行大蒜素释放研究，其结果如图9所示，相同浓度的大蒜素随着温度升高其携带的大蒜素含量逐渐降低，经DNA纳米花装载后，其稳定性显著提升。值得注意的是，大蒜素易挥发，受热不稳定，这将导致大蒜素的生物活性的大大降低，DNA纳米花中负载的大蒜素却可以在DNA纳米花框架的保护下，能有效的阻止大蒜素的损失，这样的结果，可以为大蒜素能顺利的在活体应用方面打下坚实的基础。同时，通过不同pH处理研究发现，DNA纳米花药物在生理条件下能保持稳定性，没有发生明显的大蒜素的释放，在酸性条件下其核酸结构发生部分降解，大蒜素释放量增加。图10直观地显示DNA纳米花在不同酸性条件下（pH 5.0 - 7.0）保持稳定，但DNA纳米花在不同酸性条件下和核酸酶 (5 U/mL) 共同处理2 h后发生降解，DNA纳米花将大蒜素分子递送至脂肪细胞后，脂肪细胞中的溶酶体pH值为5左右，结合溶酶体中的核酸酶，可以破坏DNA纳米花的空间立体结构，实现大蒜素的靶向控释。这一研究结果与图9大蒜素的释放结果基本一致，可以推测大蒜素的释放是由于DNA纳米花降解所致。整体结果表明，DNA纳米药物是一种不仅具有单分散的、尺寸可调的、即使在严酷的生理环境下也能耐酶切、耐高温、抗解离的框架DNA结构。
实施例6DNA纳米花药物的生物性能研究
按照实施例1的方法(所有步骤和参数都相同)，只是将脂肪细胞核酸适配体靶向序列的5’磷酸化DNA模板(SEQ ID NO:2)部分碱基进行突变形成SEQ ID NO:3，最终获得了一种突变的DNA纳米药物MNFA，与DNA纳米药物作用效果进行对照。
结果分析
细胞实验
细胞肥胖模型
为了建立细胞的肥胖模型，3T3-L1前脂肪细胞用含有10%FBS和1%双抗的DMEM完全培养液在37℃、5% CO2的条件下培养。为了诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成成熟的脂肪细胞，待细胞长到70-80%，将DMEM培养液，换为分化培养液(DMEM含有10% FBS、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和1.67 mol/L胰岛素)诱导两天。再换成脂肪细胞保持培养液(DMEM含有10% FBS和10 μg/mL胰岛素)继续培养，每两天换一次液。诱导过程中，细胞的分化情况用油红染色，显微镜观察。
细胞靶向实验
为了研究DNA纳米花对脂肪细胞的特异性结合能力，3T3-L1前脂肪细胞和成熟的脂肪细胞与DNA纳米花或者突变的DNA纳米花在缓冲液(1 mL 4.5g/L葡萄糖、5 mM MgCl2、0.1 mg/mL鲑鱼精DNA(Sigma Aldrich , St .Louis , MO)和10% FBS)中37℃下孵育7分钟。然后用清洗缓冲液(1 mL 4 .5g/L葡萄糖和5 mM MgCl2于D-PBS中)洗三遍后，细胞中重新加入1 mL清洗缓冲液，并用FV10共聚焦显微镜(Olympus, Japan)对细胞进行荧光共聚焦成像。
细胞毒性实验
将3T3-L1前脂肪细胞种在96孔板中，104个/孔，贴壁培养24 h后，加入大蒜素、DNA纳米花或者DNA纳米花药物孵育24 h。将旧的培养液移去，用PBS清洗两遍，每孔加入100 μL培养液和10 μL CCK-8培养0.5 h-1 h，并用Synergy 2多功能酶标仪(Bio-Tek ,Winooski,VT)记录450 nm波长处的紫外吸收值。
结果分析：
建立脂肪细胞模型
先用诱导培养液去诱导细胞，构建3T3-L1细胞的脂肪细胞研究模型。油红染色表明诱导的细胞内明显的脂滴的积累，且随着诱导时间的延长，油红颜色逐渐加深，表明细胞慢慢分化为成熟的脂肪细胞(图11)。由于细胞在诱导9天时已经有明显的分化效果，后面我们都采用诱导9天的脂肪细胞进行相关的实验。我们通过对DNA纳米花或突变DNA纳米花进行CY5标记，研究DNA纳米花药物对脂肪细胞的靶向能力。如图12所示，相比经过突变DNA纳米花药物处理的成熟的脂肪细胞，经过DNA纳米花药物处理的成熟的脂肪细胞内有明显增强的红色荧光，表明DNA纳米花药物优异的靶向和内在化能力，这为DNA纳米花药物的靶向抗肥胖研究提供强大的支持依据。细胞毒性实验研究表明，浓度大于100 μM的大蒜素，能显著的影响细胞的活性，DNA纳米花和DNA纳米花药物即使在浓度大于160 μM时，也不会对细胞的增殖分化造成明显的影响(图13)，证明DNA纳米花药物的安全无毒。
最后，在DNA纳米花药物具有良好的靶向能力和安全性的基础上，我们研究了DNA纳米花药物的抗肥胖效果(图14)。为了评价DNA纳米药物对3T3-L1细胞的抗肥胖干预能力，我们在细胞诱导的过程中加入DNA纳米花药物或者突变DNA纳米花药物对细胞进行干预治疗，每三天一次，总共3次，之后细胞内PGC1α， CPT1，UCP1等分别用定量PCR定量。明显地，与成熟的脂肪细胞相比，经DNA纳米花药物与突变DNA纳米药物相比，DNA纳米药物处理的细胞表现为更强的PGC1α， CPT1，UCP1表达，证明了其较高的抗肥胖能力。
实施例7动物实验研究
活体实验
活体实验和肥胖模型的建立
C57BL/6N雄鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物实验经中国农业大学实验动物管理中心批准同意。为了建立肥胖模型，6周龄的小鼠喂以高脂饲料(HFD，60%卡路里，penSourceDiet D12492，Research Diet)。小鼠体重每周称量一次，直至喂养到约30g。
DNA纳米药物的生物分布
待小鼠用高脂饲料喂养到～30g，正常C57BL/6N小鼠或者肥胖小鼠通过腹腔注射以Cy7-DNA纳米花药物或者Cy7-突变DNA纳米花药物。然后，用IVIS Lumina II活体成像系统(Caliper Life Science, USA)对不同的时间点的小鼠进行成像。24 h后，处死小鼠，收集主要器官(心、肝、脾、肺和肾)，并对主要器官进行成像。
结果分析：DNA纳米药物在活体内的生物分布
以高脂饲料喂养的小鼠作为肥胖小鼠模型，进一步进行DNA纳米药物的活体抗肥胖的研究。首先，为了研究DNA纳米药物的活体抗肥胖研究，我们对DNA纳米药物在肥胖小鼠中的活体分布进行监测。如图15所示，Cy7- DNA纳米花药物和Cy7- 突变DNA纳米花药物两种荧光纳米药物都是以时间依赖的形式在小鼠肝脏内积累，但是靶向DNA纳米药物在HFD小鼠脂肪组织的累积明显高于非靶向的突变DNA纳米药物，并且呈现明显地长滞留效应，这对于大蒜素功能的发挥是极其有利的。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 一种靶向调控白色脂肪棕色化的DNA纳米花药物制备方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgagaagcg tcggtgtggt taaacacgga acgaaggtgc aggaagattt gtcgatgcgg 60
tgcctgagcg ggctggcaag gcgcata 87
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tatgcgcctt gccagcccgc tcaggcaccg catcgacaaa tcttcctgca ccttcgttcc 60
gtgtttaacc acaccgacgc ttctcat 87
<210> 3
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tatgcgcctt gctttttttt ttttttaccg catcgacaaa tcttcctgtt tttttttttt 60
tttttttttt tttttgacgc ttctcat 87
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 4
caaggcgcat aatgagaagc gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cttcctgcac cttcgttccg tg 22
Claims (9)
1.一种脂肪细胞靶向的DNA纳米花药物NFA，其特征在于，其由脂肪细胞靶向的适配体反向互补序列经滚环扩增产生DNA纳米花后和大蒜素结合而成；
所述DNA纳米花包含如SEQ ID NO:1所示的DNA适配体序列重复单元，该序列通过与金属镁离子堆积形成片层状的DNA纳米花结构；
所述DNA纳米花具有脂肪细胞靶向性和大蒜素高效装载能力，其与大蒜素的浓度比可达到1:1000～10000。
2.根据权利要求1所述的脂肪细胞靶向的DNA纳米花药物NFA，其特征在于，所述DNA纳米花经大蒜素压缩后形成的DNA纳米花药物，粒径分布在0.6～1 um之间。
3.根据权利要求1或2所述的脂肪细胞靶向的DNA纳米花药物NFA的制备方法，包括以下步骤：
1) 连接：包含有脂肪细胞适配体靶向序列的磷酸化DNA模板SEQ IDNO:2，与引物SEQID NO: 4混合于DNA连接酶缓冲液中，进行缓慢退火处理，退火之后的产物与连接酶进行连接反应，形成环化的DNA模板；
2) 聚合：将步骤1) 中环化的DNA模板与DNA聚合酶、dNTP和BSA在缓冲液中进行聚合反应，反应结束后，反应混合物在设定温度加热终止聚合反应，反应产物洗涤后，得到脂肪细胞靶向的DNA纳米花。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，磷酸化DNA模板浓度为8～12 μM，引物的浓度为8～12 μM，DNA连接酶的浓度为50～70 U/μL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，退火参数为：90-98℃下保持2-10min，然后缓慢降温至室温，连接反应温度为20-28℃，反应时间为1-3h。
6.根据权利要求3-5任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，环化的DNA模板的浓度为0.6～0.8 μM，DNA聚合酶的浓度为8～12 U/μL，BSA的浓度为(0.04～0.06)%；聚合反应温度为28～32 ℃，聚合反应时间为18～30 h，聚合结束后，在60～70 ℃条件下8～12min灭活。
7.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，包括以下步骤：向DNA纳米花溶液中加入大蒜素，设定温度20-30 ℃下在摇床上进行结合反应，反应完毕后离心，即可得到脂肪细胞靶向的DNA纳米花药物NFA。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的DNA纳米花溶液的浓度为0.1～0.4 μM，大蒜素的浓度为5～15 mM，两者的混合体积比为(0.5～1 .5) : (0.5～1 .5)。
9.根据权利要求1或2所述脂肪细胞靶向的DNA纳米花药物NFA或由权利要求3-8任一所述的制备方法获得的脂肪细胞靶向DNA纳米花药物在制备调节脂肪细胞能量代谢药物中的应用。
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