CN115747211B - 一种纳米孔测序用测序接头的设计及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米孔测序用测序接头的设计及应用，通过对测序接头的引导序列进行特殊设计，省去了无碱基的空间子，大大降低了测序接头合成的成本，提高了测序效率。

Description

一种纳米孔测序用测序接头的设计及应用

技术领域

本发明涉及一种纳米孔基因测序接头的设计方法，尤其涉及一种pH控制的纳米孔测序用测序接头复合物的核酸序列。

背景技术

纳米孔基因测序技术是近年来兴起的的新一代测序技术，其在原理上与其它测序方法有根本性的差异。它基于膜片钳技术，利用生物纳米孔道独特的生物物理特性，通过检测单链核酸通过孔道时引起通道电流的变化，来获取核酸的序列信息。但是如果不施加任何控制，核酸序列在电压作用下通过纳米孔的速度非常快，导致获得的电流信号无法进行解码，因此需要通过控速蛋白对核酸过孔速度进行必要的控制，增加每一个碱基的过孔时间以提高信号分辨能力。此外，由于纳米孔只能通过单链核酸，在待测序列的最前端还需要一段额外的单链片段来引导核酸通过纳米孔。因此，与二代测序类似，纳米孔测序实验也需要一个文库构建步骤。在文库构建过程中，控速蛋白与待测核酸的单链区域结合，然后采用含有iSp18或iSpC3等衔接子来阻滞控速蛋白前进。由于引导序列的存在，每条待测核酸上可能会结合不止一个控速蛋白，这会导致测序信号的不稳定，纳米孔堵孔的概率大大增加，极大地降低了测序效率。一种解决方案是采用带负电的无碱基的空间子来替代单链核酸片段，但合成包含这些无碱基空间子的效率低下，且成本昂贵。因此仍然需要开发更优的引导链方法，以控制待测核酸的过孔效率及易位速度并提高测序的效率。

发明内容

本发明人发现利用pH诱导的i-motif核酸二级结构可以很好地控制控速蛋白在引导链单链区域的结合数量，由此实现了本发明。

发明第一方面提供用于表征靶多核苷酸的接头，所述接头含有四段区域：第一区段为用于引导待测核酸进入纳米孔的单链核苷酸区域，第二区段为多核苷酸结合蛋白(核酸结合蛋白或控速蛋白)结合区域，第三区段为阻滞多核苷酸结合蛋白前进衔接子区域，第四区段为用于连接靶多核苷酸的区域，在所述第一区段，设有可形成i-motif二级结构的核酸片段，该片段可依赖与pH值的不同，呈现单链或i-motif状态。

其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为两个或多个。

其中所述两个或多个可形成i-motif二级结构的核酸片段为简单的重复单元，也可为不同片段的组合。

其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为人端粒i-motif序。

其中所述第二区段和第三区段为同一区段。

其中所述第四区段为连接待测核酸片段或靶核酸片段的双链区域。

其中所述第四区段为连接待测核酸片段或靶核酸片段的单链区域。

发明第二方面提供用于表征靶多核苷酸的构建体，所述构建体包含靶多核苷酸和上述任一所述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

发明第三方面提供一种用于表征靶多核苷酸的复合物，其中，所述复合物包含多核苷酸结合蛋白，和本发明所述的接头或本发明所述的构建体；

优选地，所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；所述多核苷酸处理酶选自聚合酶、解旋酶或核酸外切酶。

发明第四方面提供构建用于表征靶多核苷酸的复合物的方法，所述方法包括：

1)构建含有可形成i-motif二级结构的核酸片段作为引导序列的接头；

2)将所述接头与待测核酸片段或靶核酸组装形成构建体；

3)任选在步骤2)之前或之后，在引导序列形成i-motif状态的条件下，将所述接头或构建体与多核苷酸结合蛋白结合形成复合物，优选所述形成i-motif状态的条件为弱酸性，进一步优选所述弱酸条件为pH6。

其中所述接头如本发明第一方面所述。

其中所述复合物结合1个所述多核苷酸结合蛋白；

优选地，所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；所述多核苷酸处理酶选自聚合酶、解旋酶或核酸外切酶。

发明第五方面提供一种控制靶多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法，所述方法包括：

(a)实施本发明构建复合物的方法；

(b)在引导序列形成单链的条件下，将步骤(a)中提供的装载有所述多核苷酸结合蛋白的靶多核苷酸与所述跨膜孔接触，所述形成单链的条件为中性条件或弱碱性性条件，优选为pH8.0；

以及

(c)跨所述跨膜孔施加电势，使得所述多核苷酸结合蛋白移动穿过阻滞多核苷酸结合蛋白前进的衔接子区域，并控制所述靶多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动。

其中所述方法包括提供系链用于使所述构建体靠近所述跨膜孔；所述系链包括捕获区和锚定区，所述捕获区用于捕获所述构建体的接头，所述锚定区用于与所述跨膜孔或所述跨膜孔所在的膜锚定结合。

发明第六方面提供一种表征靶多核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)实施本发明控制靶多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法；以及

(b)随着所述靶多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述靶多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述靶多核苷酸。

其中所述跨膜孔是蛋白孔或固态孔；和/或，所述膜是两亲层或固态层。

其中所述靶多核苷酸是完全双链多核苷酸、部分双链多核苷酸或单链多核苷酸。

发明第七方面提供一种用于控制靶多核苷酸移动的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)如本发明所述的接头，(b)多核苷酸结合蛋白，和/或(c)跨膜孔蛋白。

发明第八方面提供所述的接头、所述的构建体、所述的复合物、所述方法、所述的试剂盒在制备用于表征靶多核苷酸的产品或在表征靶多核苷酸中的应用。

本发明的技术方案取得了以下技术效果：

本发明通过使用具有pH依赖的单链核酸引导序列，既可以发挥引导待测核酸通过纳米孔功能，也可以实现一条核酸链只结合一个控速蛋白分子。

本发明的pH敏感的核酸片段，在酸性pH值下，该片段自发折叠成稳定的i-motif结构，无法结合控速蛋白；在中性pH值下，该片段呈单链状态，可作为引导链序列，促进核酸过孔。

本发明的pH敏感的核酸片段可含有一个至多个相同的重复单元，可有效增加引导链的序列长度，提高其过孔效率，同时又不影响控速蛋白的结合。

术语定义：

为了更清楚地解释本发明的实施方式，本文中使用了一些科学术语和专有名词。除非在本文中进行了明确定义，所有这些术语和名词应当被理解为具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更清楚起见，对于本文中使用的某些术语进行了以下定义。

待测核酸片段或靶多核苷酸

本发明的方法用于对单链、部分双链和双链多核甘酸进行测序。

多核苷酸可为核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。靶多核苷酸可包含与一条DNA链杂交的一条RNA链。多核苷酸可为本领域已知的任何合成核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或其他具有核苷酸侧链的合成聚合物。

多核苷酸优选是DNA、RNA或DNA或RNA杂交体。靶多核苷酸可以包含单链区和具有其它结构的区域，例如发夹环、三链体和/或四链体。DNA/RNA杂交体可以在同一条链上包含DNA和RNA。优选地，DNA/RNA杂交体包含与RNA链杂交的一条DNA链。

靶多核苷酸可为任意长度。例如，多核苷酸可为至少10个，至少50个，至少100个，至少150个，至少200个，至少250个，至少300个，至少400个或至少500个核苷酸对的长度。多核苷酸可为1000或更多个核苷酸对，5000或更多个核苷酸对的长度或100000或更多个核苷酸对的长度。

靶多核苷酸可以存在于任何合适的样品中。本发明通常对已知含有或怀疑含有靶多核苷酸的样品进行。或者，本发明可对样品进行，以确定一种或多种已知或预期存在于样品中的靶多核苷酸的种类。

用于多核苷酸表征的接头或测序接头

本发明所述的用于多核苷酸表征的接头或测序接头具有相同的含义，其具有本领域通常的结构，即含有四段区域：第一区段为用于引导待测核酸进入纳米孔的单链核苷酸区域，第二区段为多核苷酸结合蛋白(解旋酶或控速蛋白)结合区域，第三区段为阻滞核酸结合蛋白或控速蛋白前进衔接子区域，第四区段为用于连接待测核酸或靶核酸片段的区域。

进一步的，上述第二区段可以为本领域已知的任何设置方式。

进一步的，上述第三区段可以为本领域已知的任何设置方式，例如含有iSp18或iSpC3等的衔接子，可参见CN105209634A等文献。

进一步的，上述第二区段或者第三区段可以为同一区段，如CN114457145A中所定义的“阻滞带”。

可选地，所述第四片段为单链寡核苷酸片段，该片段可作为靶核酸片段的上游引物。可通过PCR的方式对目的片段进行定向扩增。大大提高了测序效率，同时又避免了连接酶进行连接反应这一步骤，提高测序效率。

可选地，第四区段为用于连接待测核酸片段或靶多核酸的双链区域。

所述第一区段，设有两个或多个可形成i-motif结构的片段组合，该片段可为简单的重复单元，也可为不同片段的组合。多个片段增加了引导区的长度，可有效提高待测核酸片段的过孔速度。

所述多个为大于两个。

在本发明中，i-Motif是指在酸性条件下，富含与鸟嘌呤互补的胞嘧啶碱基C的DNA分子通过胞嘧啶C碱基的半质子化C·C⁺碱基对形成稳定的平行双螺旋，两个平行双螺旋上的C·C⁺碱基对可以以交替排列和互相嵌入的形式形成四螺旋结构，这种四螺旋结构即为i-Motif。

本发明优选的i-Motif结构为人端粒i-Motif。

构建体

构建体包含靶多核苷酸和本发明上述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

复合物

在本发明中，用于测序的复合物，或用于多核苷酸表征的复合物具有相同的含义，皆指本发明所述的接头或构建体与多核苷酸结合蛋白结合形成的复合物。

多核苷酸结合蛋白

多核苷酸结合蛋白可以是能够与多核苷酸结合并且控制其通过孔的移动的任何蛋白质，也可称作控速蛋白。在本领域中确定蛋白质是否与多核苷酸结合是很简单的。蛋白质通常与多核苷酸相互作用并且修饰其至少一种性质。蛋白质可以通过裂解多核苷酸以形成单独的核苷酸或如二核苷酸或三核苷酸的更短的核苷酸链来修饰多核苷酸。所述部分可通过将多核苷酸定位或移动到特异性位置(即控制其移动)来修饰多核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸结合蛋白是多核苷酸解链酶，例如ED1酶或DDa酶。多核苷酸解链酶是能够使双链靶多核苷酸解链成单链的酶。在一些实施方案中，多核苷酸解链酶能够使双链DNA解链成单链。在一些实施方案中，多核苷酸解链酶是具有解旋酶活性的酶。多核苷酸解链酶的实例包括例如本文所述的解旋酶。

多核苷酸结合能力可以使用本领域中已知的任何方法来测量。例如，可以使蛋白质与多核苷酸接触，并且可以测量蛋白质与多核苷酸结合并沿所述多核苷酸移动的能力。蛋白质可以包括有助于多核苷酸结合和/或有助于其在高盐浓度和/或室温下的活性的修饰。蛋白质可进行修饰，使得其结合多核苷酸(即保持多核苷酸结合能力)但不充当解链酶(即当具备所有便于移动的必需组分(例如ATP和Mg2+)时不沿多核苷酸移动)。此类修饰是所属领域中已知的。例如，解旋酶中的Mg2+结合结构域的修饰通常产生不起解旋酶作用的变体。

酶可以共价附接至孔。可以使用任何方法将酶共价附接至孔。

在链测序中，多核苷酸顺着或逆着外加电位易位通过孔。在双链靶多核苷酸上逐渐或逐步起作用的核酸外切酶可以在孔的顺侧使用以在外加电位下供给剩余的单链，或在反侧使用以在反向电位下供给剩余的单链。同样，还可以以类似的方式使用使双链DNA解链的解旋酶。还可以使用聚合酶。需要逆着外加电位发生链易位的测序应用也是有可能的，但是DNA必须首先在相反电位或无电位下被酶“捕获”。随着电位随后在结合后转换，链将以顺式到反式的方式通过孔并且通过电流保持呈延长的构型。单链DNA核酸外切酶或单链DNA依赖性聚合酶可充当分子马达，以将最近易位的单链以受控的逐步方式逆着外加电位从反式到顺式从孔中拉回来。

可以在本发明中使用任何解旋酶。解旋酶可以两种模式对孔起作用。首先，优选使用解旋酶来进行所述方法，使得在由外加电压造成的场的作用下，所述解旋酶使多核苷酸移动通过孔。在这种模式中，多核苷酸的5’端首先被捕获在孔中，并且解旋酶使多核苷酸移动到孔中，使其在场的作用下通过孔，直到其最终易位通过，到达膜的反侧为止。或者，优选这样进行所述方法，解链酶使多核苷酸逆着由外加电压造成的场而移动通过孔。在这种模式中，多核苷酸的3’端首先被捕获在孔中，并且解链酶使多核苷酸移动通过孔，使得其逆着外加场被拉出孔，直到其最终被推回到膜的顺侧为止。

还可以沿相反的方向进行所述方法。多核苷酸的3’端可以首先被捕获在孔中，并且解链酶可以使多核苷酸移动到孔中，使得其在场的作用下通过孔，直到其最终易位通过，到达膜的反侧为止。

当解链酶不具备便于移动的必需组分或被修饰成阻止或防止其移动时，所述解链酶可以与多核苷酸结合并且在多核苷酸被外加场拉入孔中时充当刹车以减慢多核苷酸的移动。在非活性模式中，多核苷酸的3’或5’是否被捕获不重要，在充当刹车的酶的作用下将多核苷酸朝向反侧拉入孔中的是外加场。当在非活性模式中时，解链酶对多核苷酸的移动的控制可以用多种方式来描述，包括齿合、滑动和制动。还可以用这种方式来使用缺乏解链酶活性的解链酶变体。

多核苷酸与多核苷酸结合蛋白(例如，多核苷酸解链酶)和孔可以按任何次序接触。优选的是，当使多核苷酸与如解旋酶的多核苷酸结合蛋白(例如，多核苷酸解链酶)和孔接触时，多核苷酸首先与多核苷酸结合蛋白(例如，多核苷酸解链酶)形成复合物。当跨孔施加电压时，多核苷酸/多核苷酸结合蛋白(例如，多核苷酸解链酶)复合物就会与孔形成复合物并且控制多核苷酸通过孔的移动。

使用多核苷酸结合蛋白(例如，多核苷酸解链酶)的方法中的任何步骤通常在游离核苷酸或游离核苷酸类似物和促进多核苷酸结合蛋白(例如，多核苷酸解链酶)的作用的酶辅因子存在下进行。游离核苷酸可以是任何单独的核苷酸中的一种或多种。游离核苷酸包括但不限于：单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、环单磷酸腺苷(cAMP)、环单磷酸鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)以及三磷酸脱氧胞苷(dCTP)。游离核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。游离核苷酸优选是三磷酸腺苷(ATP)。酶辅因子是允许构建体起作用的因子。酶辅因子优选是二价金属阳离子。二价金属阳离子优选是Mg2+、Mn2+、Ca2+或Co2+。酶辅因子最优选是Mg2+。

膜

可根据本发明使用任何膜。合适的膜被本领域中所熟知。所述膜优选地为两亲性层。两亲性层是由具有亲水性和亲脂性的两亲性分子(例如磷脂)形成的层。两亲分子可为合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在本领域中已知，包括，例如，嵌段共聚物(Gonzalez-Perez et al.,Langmuir,2009,25,10447-10450)。嵌段共聚物是聚合材料，其中两种或多种单体亚单位聚合在一起以产生单个的聚合物链。嵌段共聚物通常具有由每种单体亚单位提供的特性。然而，嵌段共聚物可具有由单独亚单位形成的聚合物所不具有的独特性质。可将嵌段共聚物设计成这样：一种单体亚单位是疏水性的(即亲脂性的)，而其他的一种或多种亚单位在水性介质中时是亲水性的。在这种情况下，嵌段共聚物可具有两亲性质，并可形成模拟生物膜的结构。嵌段共聚物可为二嵌段(由两种单体亚单位组成)，但还可由多于两种单体亚单位构成，以形成更复杂的表现为两亲物的排列。所述共聚物可为三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。

古细菌双极性四醚脂质是天然存在的脂质，其被构造为使所述脂质形成单层膜。这些脂质通常被发现于在恶劣的生物环境中生存的嗜极生物、嗜热生物、嗜盐生物和嗜酸生物中。认为它们的稳定性来自最终双层的融合性质。很容易通过产生具有通用基序亲水-疏水-亲水的三嵌段聚合物，来构建模拟这些生物实体的嵌段共聚物材料。该材料可形成表现与脂双层相似且具有一系列从囊泡到层膜的相状态的单体膜。由这些三嵌段共聚物形成的膜具有一些优于生物脂质膜的优势。因为所述三嵌段共聚物是合成的，可仔细地控制所述精确构建，以提供形成膜以及与孔和其他蛋白质相互作用所需的正确的链长度和性质。

还可由不被分类为脂质亚材料的亚单位构建嵌段共聚物；例如疏水性聚合物可由硅氧烷或其他基于非烃化合物的单体制成。嵌段共聚物亲水性的亚部分还可具有低的蛋白质结合性质，这使得能够产生在暴露于未加工的生物样品时具有高度抵抗力的膜。

与生物脂质膜相比，三嵌段共聚物膜还具有增强的机械稳定性和环境稳定性，例如高得多的操作温度或pH范围。所述嵌段共聚物的合成性质提供了定制基于聚合物的膜用于大量应用的平台。

可化学修饰或功能化所述两亲性分子以促进分析物的偶联。

两亲性层可为单层或双层。两亲性层通常为平面的。两亲性层可为非平面的例如弯曲的。

两亲性层通常为脂双层。脂双层是细胞膜的模型，并为一系列的实验性研究充当极好的平台。例如，脂双层可用于使用单通道记录的膜蛋白的体外研究。或者，脂双层可用作生物传感器来检测一系列物质的存在。所述脂双层可为任何脂双层。合适的脂双层包括但不限于平面的脂双层、支撑的双层或脂质体。脂双层优选地为平面的脂双层。

用于形成脂双层的方法是本领域中已知的。合适的方法在实施例中有公开。脂双层通常通过Montal和Mueller的方法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.，1972；69:3561-3566)形成，其中脂单层被携载在水溶液/空气界面上，并通过与该界面垂直的孔的某一侧。

Montal和Mueller的方法之所以流行是因为，它是一种形成适合于蛋白孔插入的高品质脂双层的方法，该方法具有成本效益且相对容易。其他常用的形成双层的方法包括头部浸渍(tip-dipping)、涂布双层(paintingbilayer)和脂质体双层的膜片钳。

在另一个优选实施方案中，所述膜是固态层。固态层不是生物来源的。换言之，固态层不衍生自或者分离自生物环境，例如生物体或细胞，或者合成制造形式的生物学可用结构。固态层可以用有机或无机材料形成，包括但不限于，微电子材料，绝缘材料如Si3N4、Al2O3、和SiO2，有机和无机聚合物如聚酰胺，塑料如或弹性体如双组分加成型硅橡胶(two-component addition-cure silicone rubber)和玻璃。固态层可以用石墨烯形成。

跨膜孔

跨膜孔是允许外加电势驱动的水合离子从膜的一侧流动到膜的另一侧的结构。

跨膜孔优选地为跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔为允许水合离子(例如分析物)从膜的一侧流动到膜的另一侧的多肽或多肽的集合。在本发明中，跨膜蛋白孔能够形成允许外加电势驱动的水合离子从膜的一侧流动到另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选地允许分析物(例如核苷酸)从膜(例如脂双层)的一侧流动到另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸(例如DNA或RNA)移动通过所述孔。

跨膜蛋白孔可为单体或寡聚体。所述孔优选地由数个重复亚基(例如6、7或8个亚基)构成。所述孔更优选地为七聚体或八聚体孔。

跨膜蛋白孔通常包含桶状体或通道，所述离子可通过所述桶状体或通道流动。所述孔的亚基通常围绕中心轴并且为跨膜β桶状体或通道或者跨膜α-螺旋束状体或通道提供链。

跨膜蛋白孔的桶状体或通道通常包含促进与分析物(例如核苷酸、多核苷酸或核酸)的相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选地位于所述桶状体或通道的缩窄处附近。跨膜蛋白孔通常包含一个或多个带正电的氨基酸(例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸)或者芳香族氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)。这些氨基酸通常促进所述孔与核苷酸或多核苷酸或核酸之间的相互作用。

可用于本发明的跨膜蛋白孔可衍生自β-桶状体孔或α-螺旋束状体孔，β-桶状体孔包含由β-链形成的桶状体或通道。合适的β-桶状体孔包括但不局限于β-毒素，例如α-溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白(porin)，例如包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)(例如MspA)、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束状体孔包含由α-螺旋形成的桶状体或通道。合适的α-螺旋束状体孔包括但不局限于内膜蛋白和α-外膜蛋白，例如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可衍生自Msp或α-溶血素(α-HL)。

跨膜蛋白孔优选地衍生自Msp，优选衍生自MspA。这类孔是低聚体，并且通常包含7、8、9或10个衍生自Msp的单体。所述孔可为衍生自Msp的包含相同单体的同低聚体(homo-oligomeric)孔。或者，所述孔可为衍生自Msp的含有至少一个与其他单体不同的单体的异寡聚体(hetero-oligomeric)孔。所述孔还可包含一个或多个构建体，所述构建体包含两个或多个共价连接的衍生自Msp的单体。

跨膜蛋白孔还优选地衍生自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由7个相同的单体或亚基形成(即其为七聚体)。

在一些实施方案中，所述跨膜蛋白孔被化学修饰。可用任何方式在任何位点化学修饰所述孔。优选地通过分子与一个或多个半胱氨酸的结合(半胱氨酸连接)、分子与一个或多个赖氨酸的结合、分子与一个或多个非天然氨基酸的结合、表位的酶修饰或者末端的修饰，对跨膜蛋白孔进行化学修饰。进行这类修饰的合适方法在本领域中是熟知的。可通过结合任何分子来化学修饰所述跨膜蛋白孔。例如，可通过结合染料或荧光团来化学修饰所述孔。

可化学修饰所述孔中任意数量的单体。优选地，如上所述化学修饰一个或多个例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个所述单体。

移动

在本发明的方法中，使所述靶多核苷酸移动通过所述跨膜孔并被测序。使靶多核苷酸移动通过所述跨膜孔是指使所述多核苷酸从所述孔的一侧移动到另一侧。所述靶多核苷酸通过所述孔的移动可受电势或酶促作用或电位和酶促作用驱动或控制。所述移动可以是单向的，或可允许向后和向前移动。

优选地使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸移动通过所述孔。

多核苷酸表征

所述表征方法可以包括测量靶多核苷酸的一个、两个、三个、四个或五个或更多个特征。所述特征优选选自(i)多核苷酸的长度，(ii)多核苷酸的同一性，(iii)多核苷酸的序列，(iv)多核苷酸的二级结构，以及(v)多核苷酸是否被修饰。

本发明的方法包含移动所述单链多核苷酸通过所述跨膜孔，使得所述单链多核苷酸的一部分核苷酸与所述孔相互作用。

所述方法可使用如上所述的任何合适的膜进行，优选脂双层系统，其中孔被插入脂双层中。所述方法通常使用如下膜进行：(i)包含孔的人造双层，(ii)分离的天然存在的含孔脂双层，或(iii)有孔插入其中的细胞。所述方法优选地使用人造脂双层进行。除了所述孔之外，所述双层可包含其他跨膜蛋白和/或膜内蛋白以及其他分子。下文参考本发明的测序实施方案详述了合适的装置和条件。本发明的方法通常在体外进行。

对于(i)，多核苷酸的长度例如可以通过确定所述目标多核苷酸和所述孔的相互作用数量，以及目标多核苷酸与所述孔相互作用之间的持续时间来测定。

对于(ii)，所述多核苷酸的同一性可以通过多种方式测定。多核苷酸的同一性可以联合目标多核苷酸的序列的测定，或不联合目标多核苷酸的序列的测定进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以以几种方式来完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(而无需测定该多核苷酸的其余序列)。或者，方法中测定的特定的电和/或光信号可鉴定来自特定来源的目标多核苷酸。

对于(iii)，多核苷酸的序列可以如前所述确定。合适的测序方法，特别是那些使用电测量的方法，描述于StoddartD etal.,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KRetal,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO2000/28312中。

对于(iv)，所述二级结构可以以多种方式测量。例如，如果该方法包含电测量，二级结构可以利用穿过孔的停留时间的改变或电流变化进行测量。这使得单链和双链多核苷酸的区域能够得到识别。

对于(v)，可以测定任何存在或不存在修饰。该方法优选包括确定所述目标多核苷酸是否通过甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物，标签或间隔区进行了修饰。特异性修饰将导致与孔的特异性相互作用，其可以使用下面描述的方法来测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过孔的电流，识别胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。

试剂盒

本发明还提供了用于制备用于表征靶多核苷酸的试剂盒。所述试剂盒包含(a)本发明的接头，(b)多核苷酸结合蛋白，(c)跨膜孔。

所述试剂盒优选地还包含一个或多个与跨膜孔相互作用时产生特征性电流的标志物。这类标志物为本领域技术人员已知。所述试剂盒优选还包含将所述靶多核苷酸偶联到膜上的工具(means)，所述偶联的工具优选地包含反应基团。合适的基团包括但不限于巯基、胆固醇、脂质和生物素基团。所述试剂盒还可包含膜的组分，例如形成脂双层所需的磷脂。

本申请实施例的纳米孔测序用测序接头、构建方法及应用，通过对测序接头的引导序列进行特殊设计，省去了无碱基的空间子，大大降低了测序接头合成的成本，提高了测序效率。

附图说明

图1：本申请第一个实施例中接头部分结构示意图。A)接头部分含有段i-motif序列；B)接头部分含有两端i-motif序列。

图2：本申请第一个实施例的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；第1-3条带，含有一个人端粒i-motif序列的样品；第4-6条带，含有两个人端粒i-motif序列的样品。

图3：本申请第二个实施例的纳米孔测序过孔信号图。

图4：本申请第三个实施例中测序接头的结构示意图。

图5：本申请第三个实施例的纳米孔测序过孔信号图

实施例

实施例1：含i-motif结构的构建体的制备

本实施例描述了包含pH诱导的i-motif核酸二级结构核酸单链区段的构建体制备

(1)含有i-motif结构的DNA的合成

以第一单链(SEQ ID NO:1，2)及第二单链(SEQ ID NO:3)为引物，以lambdaDNA(NEB)为模板，进行PCR反应，获得含有i-motif结构的DNA，如图1所示。

(2)解旋酶与DNA的复合物的制备

将步骤(1)获得的DNA与来自肠道菌噬菌体T4(Enterobacteriaphage T4)的T4Dda解旋酶(具有SEQ ID NO:4所示的序列，含突变位点(M1G1G2/E94C/C109A/C136A/A360C)以1：1(体积/体积)的比例在50mM的HEPES pH值8.0、100mM的氯化钾，或者50mM的MES pH值6.0、100mM的氯化钾中混合，T4 Dda解旋酶和类发夹结构DNA的最终浓度分别为3000nM和100nM。在室温下T4Dda解旋酶与构建体DNA反应1小时，随后通过磁珠纯化方式纯化，得到解旋酶与DNA的复合物。

(3)对i-motif结构的DNA构建体进行的凝胶测定

将以上步骤(1)和(2)的样品分别上样到4-20％PAGE凝胶上，并在160V电压下电泳2小时，然后将该凝胶用Gold view染色以观察DNA条带，如图2所示。

图2中：泳道1显示步骤(2)制得的含有(SEQ ID NO:1)i-motif结构的DNA构建体；

泳道2显示步骤(3)的在HEPES缓冲液(pH8.0)中混合的T4 Dda解旋酶与含有(SEQIDNO:1)i-motif结构的DNA的复合物；

泳道3显示步骤(3)的在MES缓冲液(pH6.0)中混合的T4 Dda解旋酶与含有(SEQIDNO:1)i-motif结构的DNA的复合物；

泳道4显示步骤(2)制得的含有(SEQ ID NO:2)i-motif结构的DNA构建体；

泳道5显示步骤(3)的在HEPES缓冲液(pH8.0)中混合的T4 Dda解旋酶与含有(SEQIDNO:2)i-motif结构的DNA的复合物；

泳道6显示步骤(3)的在MES缓冲液(pH6.0)中混合的T4 Dda解旋酶与含有(SEQIDNO:2)i-motif结构的DNA的复合物；

如图2所示，泳道2和5显示，在pH 8.0环境里，含有i-motif序列的单链区域能够结合多个Dda解旋酶，而泳道3和6显示，在pH 6.0环境下，则只能结合一个Dda解旋酶。

实施例2：对含i-motif序列的构建体进行纳米孔测序

材料和方法：

在缓冲液(600mMKCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM HEPES，pH8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的MspA纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM HEPES，pH8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将预孵育的样品(图2，泳道5)、ATP(终浓度2mM)和MgCl2(终浓度10mM)一起流入到单个纳米孔实验系统(总体积100μL)，在+180mV的恒定电压下测量信号6h(包括潜在的2s的-180mV电压反转)。

如附图3所示，可以观察含有i-motif到DNA构建体可以顺利通过纳米孔，从电流信号的分析可以推测只有一个Dda解旋酶在控制DNA在纳米孔中的移动。

实施例3：含i-motif单链区段的接头复合物制备及在纳米孔测序应用

材料和方法

(1)包含i-motif单链区段的接头复合物制备(如图4所示)。

实验过程中，首先将SEQ ID NO:5分别与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7按照摩尔比为1:1:1的比例混合，在50mM HEPES pH 8.0和100mM KCl条件下退火，分别得到DNA杂交链样品。将DNA杂交链样品与来自肠道菌噬菌体T4(Enterobacteriaphage T4)的T4 Dda解旋酶(具有SEQ ID NO:4所示的序列，含突变位点M1G/E94C/C109A/C136A/A360C)在50mM HEPES、pH 6.0、100mM的KCl溶液中进行孵育。孵育温度为30℃，孵育时间为1小时。在孵育体系中，T4 Dda解旋酶、TMAD和DNA的终浓度分别为150μM、100μM和5μM。孵育完成之后，通过磁珠纯化或者柱纯化，最终得到包含i-motif单链区段的接头复合物。

(2)构建体的制备

将所述约531bp的片段先后经过末修加dA尾(NEB Cat#E7442)，连接上步骤(1)制备的载酶的接头复合物，得到含有本发明的i-motif结构的构建体。最后的产物是通过磁珠纯化来分离，并且通过荧光来定量。

(3)对步骤(2)获得的构建体进行纳米孔测序

在缓冲液(600mMKCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM HEPES，pH8.0)中，由嵌入到DPhPC磷脂双分子层的MspA纳米孔获得电信号测量值。在实现单孔插入磷脂双分子层后，用2ml缓冲液(600mM KCl，75mM K3[Fe(CN)6，25mM K4[Fe(CN)6]·3H2O，100mM HEPES，pH8.0)流过系统以除去残留的过量纳米孔。然后将步骤(2)获得的样品、ATP(终浓度2mM)和MgCl₂(终浓度10mM)一起流入到单个纳米孔实验系统(总体积100μL)，在+180mV的恒定电压下测量信号6h(包括潜在的2s的-180mV电压反转)。

如附图5所示，可以观察含有i-motif到DNA构建体可以顺利通过纳米孔，从电流信号的分析可以推测只有一个Dda解旋酶在控制DNA在纳米孔中的移动。

序列信息

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Claims (18)

1.一种用于表征靶多核苷酸的接头，所述接头含有四段区域：第一区段为用于引导待测核酸进入纳米孔的单链核苷酸区域，第二区段为多核苷酸结合蛋白结合区域，第三区段为阻滞多核苷酸结合蛋白前进的衔接子区域，第四区段为用于连接靶多核苷酸的区域，在所述第一区段，设有可形成i-motif二级结构的核酸片段，该片段可依赖pH值的不同，呈现单链或i-motif状态。

2.根据权利要求1所述的接头，其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为两个或多个。

3.根据权利要求2所述的接头，其中所述两个或多个可形成i-motif二级结构的核酸片段为简单的重复单元，或为不同片段的组合。

4.根据权利要求1-3任一所述的接头，其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为人端粒i-motif序。

5.根据权利要求1所述的接头，其中所述第二区段和第三区段为同一区段。

6.根据权利要求1或2所述的接头，其中所述第四区段为连接靶多核酸的双链区域。

7.根据权利要求1或2所述的接头，其中所述第四区段为连接靶多核酸的单链区域。

8.一种用于表征靶多核苷酸的构建体，其中，所述构建体包含靶多核苷酸和权利要求1-7任一项所述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

9.一种用于表征靶多核苷酸的复合物，其中，所述复合物包含多核苷酸结合蛋白，和权利要求1-7任一所述的接头或权利要求8所述的构建体；

所述多核苷酸结合蛋白选自聚合酶、解旋酶或核酸外切酶。

10.一种构建测序复合物的方法，所述方法包括：

1）构建含有可形成i-motif二级结构的核酸片段作为引导序列的接头；

2）将所述接头与待测核酸片段或靶核酸组装形成构建体；

3）任选在步骤2）之前或之后，在引导序列形成i-motif状态的条件下，将所述接头或构建体与多核苷酸结合蛋白结合形成复合物，所述形成i-motif状态的条件为弱酸性；

其中所述接头如权利要求1-7任一项所定义。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述复合物结合1个所述多核苷酸结合蛋白；

所述多核苷酸结合蛋白选自聚合酶、解旋酶或核酸外切酶。

12.一种控制靶多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法，所述方法包括：

(a)实施权利要求10或11所述的方法；

(b)在引导序列形成单链的条件下，将步骤(a)中提供的装载有所述多核苷酸结合蛋白的靶多核苷酸与所述跨膜孔接触，所述形成单链的条件为中性条件或弱碱性条件；

以及

(c)跨所述跨膜孔施加电势，使得所述多核苷酸结合蛋白移动穿过接头中阻滞多核苷酸结合蛋白前进的衔接子区域，并控制所述靶多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括提供系链用于使所述构建体靠近所述跨膜孔；所述系链包括捕获区和锚定区，所述捕获区用于捕获所述构建体的接头，所述锚定区用于与所述跨膜孔或所述跨膜孔所在的膜锚定结合。

14.一种表征靶多核苷酸的方法，所述方法包括：

(a)实施权利要求12或13所述的方法；以及

(b)随着所述靶多核苷酸相对于所述跨膜孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述靶多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述靶多核苷酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述跨膜孔是蛋白孔或固态孔；和/或，所述膜是两亲层或固态层。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述靶多核苷酸是完全双链多核苷酸、部分双链多核苷酸或单链多核苷酸。

17.一种用于控制靶多核苷酸移动的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)权利要求1至7任一项所述的接头，(b)多核苷酸结合蛋白，和/或(c)跨膜孔蛋白。

18.根据权利要求1至7任一项所述的接头、权利要求8所述的构建体、权利要求9所述的复合物、权利要求10-16中任一项所述方法、或权利要求17所述的试剂盒在制备用于表征靶多核苷酸的产品或在表征靶多核苷酸中的应用。