KR20220011665A - 방법 - Google Patents

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KR20220011665A
KR20220011665A KR1020217041082A KR20217041082A KR20220011665A KR 20220011665 A KR20220011665 A KR 20220011665A KR 1020217041082 A KR1020217041082 A KR 1020217041082A KR 20217041082 A KR20217041082 A KR 20217041082A KR 20220011665 A KR20220011665 A KR 20220011665A
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앤드루 존 헤런
마크 존 브루스
레베카 빅토리아 보웬
루크 알렉산더 맥닐
사이먼 라파엘 비야레알
새뮤얼 존 마틴
레베카 앤 스태퍼드-앨런
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옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 피엘씨
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Abstract

본원에는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법이 제공된다. 또한 폴리뉴클레오타이드 어댑터 및 이러한 어댑터를 포함하는 키트가 제공된다. 어댑터는 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하는 방법에서 폴리뉴클레오타이드와 같은 분석물질을 특성평가하는 데 사용된다.

Description

방법
본 발명은 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법, 신규의 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 방법 및 신규의 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 관한 것이다.
나노기공 감지는 분석물질 분자와 이온 전도 채널 사이의 개개의 결합 또는 상호작용 사건의 관찰에 기초한 분석물질 검출 및 특성평가에 대한 접근법이다. 나노기공 센서는 전기 절연 막에 나노미터 치수의 단일 기공을 배치하는 것 및 분석물질 분자의 존재 하에 기공을 통한 전압 유도 이온 전류를 측정하는 것에 의해 생성될 수 있다. 나노기공 내부의 또는 근처의 분석물질의 존재는 기공을 통한 이온 흐름을 변경하여서 채널에 걸쳐 측정되는 변경된 이온 전류 또는 전기 전류를 생성할 것이다. 분석물질의 정체는 이의 독특한 전류 특징, 특히 전류 블록의 지속기간 및 정도 및 기공과의 이의 상호작용 시간 동안 전류 수준의 변동을 통해 밝혀졌다.
폴리뉴클레오타이드는 이러한 방식으로 감지하기 위한 중요한 분석물질이다. 폴리뉴클레오타이드 분석물질의 나노기공 감지는 정체를 밝히고 감지된 분석물질의 단일 분자 계수를 수행할 수 있지만, 이의 뉴클레오타이드 서열과 같은 이의 조성뿐만 아니라 염기 변형, 산화, 환원, 탈카복실화, 탈아미노화 및 더 많은 것과 같은 특성의 존재에 대한 정보를 또한 제공할 수 있다. 나노기공 감지는 신속하고 저렴한 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱을 허용할 가능성을 가져서 수십 내지 수만개의 염기 길이의 폴리뉴클레오타이드의 단일 분자 서열 리드를 제공한다.
나노기공 감지를 사용한 중합체 특성평가의 필수 성분의 2가지는 (1) 기공을 통한 중합체 이동의 제어 및 (2) 중합체가 기공을 통해 이동하면서 구성하는 빌딩 블록의 식별이다. 폴리뉴클레오타이드와 같은 분석물질의 나노기공 감지 동안, 기공과 관련된 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 것이 중요하다. 비제어된 이동은 폴리뉴클레오타이드의 정확한 특성평가를 방지하거나 지연시킬 수 있다. 예를 들어, 동종중합체 폴리뉴클레오타이드에서 각각의 뉴클레오타이드를 정확히 구별하는 것은 기공과 관련된 폴리뉴클레오타이드의 이동이 제어되지 않을 때 문제가 된다.
이 문제를 해결하기 위해, 폴리뉴클레오타이드와 같은 중합체가 특성평가되면서 이것의 이동을 제어하기 위해 운동 단백질을 사용하는 것이 공지되어 있다. 적합한 운동 단백질은 헬리카제, 엑소뉴클레아제, 토포아이소머라제 등과 같은 폴리뉴클레오타이드 취급 효소를 포함한다. 운동 단백질은 제어된 방식으로 폴리뉴클레오타이드를 가공한다. 이와 같이 운동 단백질은 기공과 관련된 폴리뉴클레오타이드와 같은 중합체의 이동을 제어하도록 사용될 수 있다.
운동 단백질의 사용에 의해 나노기공 감지에 의한 특성평가를 위한 폴리뉴클레오타이드의 가공에서 상당한 개선이 달성되었지만, 기술적 과제가 남아 있다. 하나의 쟁점은 결정하려는 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련된 운동 단백질이 특성평가의 시작 전에 정확한 위치에 있도록 보장하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 운동 단백질이 특성평가의 시작 전에 이미 폴리뉴클레오타이드를 가공하기 시작하면, 특성평가의 시작 전에 가공된 폴리뉴클레오타이드의 부분은 정확히 결정되지 않을 수 있다.
이를 해결하기 위해, 특성평가 전에 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 운동 단백질을 "정지(stall)"시키는 것이 공지되어 있다. 운동 단백질은 특성평가가 시작할 때까지 표적 폴리뉴클레오타이드를 가공하지 않는다. 이러한 방식으로, 표적 폴리뉴클레오타이드의 개선된 특성평가가 가능하다.
당업자에게 공지된 하나의 방법은 스페이서를 사용하여 분자 어댑터 상에 헬리카제와 같은 운동 단백질을 정지시키는 것이다. 스페이서는 특성평가되는 표적 폴리뉴클레오타이드로의 운동 단백질(예를 들어, 헬리카제)의 이동을 지연시키는 어댑터의 부분이다. 외부 힘의 부재 하에, 표적 폴리뉴클레오타이드로의 운동 단백질(헬리카제)의 이동이 방지된다. 그러나, 예를 들어 표적 폴리뉴클레오타이드를 나노기공을 통과시켜 제공될 수 있는 외부 힘의 영향 하에, 운동 단백질은 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하고 이로써 기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있다. 이러한 방법은 국제공개 WO 2014/135838호에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 인용되어 포함된다.
운동 단백질의 정지 방법이 상당한 이점으로 이어지지만, 정지된 운동 단백질에 의한 "연료" 분자("fuel" molecule)(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 가공에 필요한 보인자)의 변환(turnover)이 감소하면 이러한 시스템의 효율이 개선될 수 있다고 인식된다. 따라서, 이를 해결하는 분자 어댑터로 폴리뉴클레오타이드를 로딩하기 위한 개선된 방법의 필요성이 있다.
본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 운동 단백질과 접촉하여 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 한다. 차단 모이어티는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된다. 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다. 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 것은 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드에 결합될 때와 비교하여 운동 단백질이 연료 분자를 변환시키는 속도를 감소시키는 것과 같은 유리한 효과를 가질 수 있다.
따라서, 본원에는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법이 제공되고, 이 방법은
i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계; 및
iii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 단계를 포함하고;
폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
일부 실시형태에서, 이 방법은
i) 스페이서 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계; 및
iii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 단계를 포함하고;
차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
따라서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법이 또한 제공되고, 이 방법은
i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계;
iii) 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 단계; 및
iv) 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
일 실시형태에서, 이 방법은
i) 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
ii) 로딩 부위를 운동 단백질과 접촉시키는 단계;
iii) 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 하는 단계; 및
iv) 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 로딩 부위로 이동하는 것을 방지한다.
일 실시형태에서, 이 방법의 단계 (ii)는 로딩 부위를 운동 단백질과 접촉시키는 단계(여기서, 운동 단백질은 로딩 부위와 맞물림)를 포함하고; 이 방법의 단계 (iv)는 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계 -여기서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하고 로딩 부위와 재맞물리는 것을 방지함 -를 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서, 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것은 운동 단백질에 물리적 힘 또는 화학적 힘을 가하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것은 운동 단백질을 하나 이상의 연료 분자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고; 운동 단백질은 제1 운동 단백질이고, 제1 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 하는 것은 로딩 부위에 제2 운동 단백질을 로딩하는 것 및 제2 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서 쪽으로 진행하게 하는 것을 포함하고, 제2 운동 단백질은 제1 운동 단백질을 스페이서 상으로 민다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질을 스페이서 상으로 민다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 로딩 부위에 결합한다. 일 실시형태에서, 로딩 부위는 스페이서와 인접하고, 차단 모이어티는 스페이서에 바로 인접한 로딩 부위에 결합한다.
일 실시형태에서, 단계 (iii)은 스페이서가 운동 단백질의 활성 부위를 점유하도록 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 로딩 부위는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 물리적 차단 모이어티 또는 화학적 차단 모이어티이다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 입체적으로 방지한다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 화학 기를 도입한다.
일부 실시형태에서, (i) 로딩 모이어티는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 차단 모이어티는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; (ii) 로딩 부위에 차단 모이어티를 결합하는 것은 차단 모이어티를 로딩 부위에 혼성화하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스페이서는
i) 하나 이상의 니트로인돌, 하나 이상의 이노신, 하나 이상의 아크리딘, 하나 이상의 2-아미노푸린, 하나 이상의 2-6-디아미노푸린, 하나 이상의 5-브로모-데옥시우리딘, 하나 이상의 인버티드 티미딘(인버티드 dT), 하나 이상의 인버티드 디데옥시-티미딘(ddT), 하나 이상의 디데옥시-시티딘(ddC), 하나 이상의 5-메틸시티딘, 하나 이상의 5-하이드록시메틸시티딘, 하나 이상의 2'-O-메틸 RNA 염기, 하나 이상의 이소-데옥시시티딘(이소-dC), 하나 이상의 이소-데옥시구아노신(이소-dG), 하나 이상의 C3 (OC3H6OPO3) 기, 하나 이상의 광 절단성(PC) [OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3] 기, 하나 이상의 헥산디올 기, 하나 이상의 스페이서 9(iSp9) [(OCH2CH2)3OPO3] 기 또는 하나 이상의 스페이서 18(iSp18) [(OCH2CH2)6OPO3] 기;
ii) 하나 이상의 티올 연결;
iii) 하나 이상의 탈염기성 뉴클레오타이드;
iv) 로딩 부위에 대한 상이한 골격 구조의 하나 이상의 뉴클레오타이드;
v) 하나 이상의 운동 단백질이 정지되게 하는 하나 이상의 화학 기; 및/또는
vi) 중합체를 포함하고, 선택적으로 상기 중합체는 폴리펩타이드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고, 바람직하게는 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오타이드 섬(nucleotide island)을 포함한다.
일부 실시형태에서,
i) 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 하나 이상의 뉴클레오타이드 섬을 포함하는 스페이서; 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하고;
ii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 것은 운동 단백질을 스페이서와 접촉시키는 것 및 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 운동 단백질을 변형시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서 스페이서는 -S-N-S-N-S-N-S-; -S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-;-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; -N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-;-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-:-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-; 및 -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함하고;
각각의 S는 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 운동 단백질은 헬리카제, 중합효소, 엑소뉴클레아제, 토포아이소머라제, 또는 이들의 변이체이다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상의 운동 단백질은 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 변형된다. 일 실시형태에서, 각각의 운동 단백질은 Hel308 헬리카제, RecD 헬리카제, TraI 헬리카제, TrwC 헬리카제, XPD 헬리카제 및 Dda 헬리카제, 또는 이들의 변이체로부터 독립적으로 선택된 헬리카제이다.
일 실시형태에서, 이 방법은 스페이서 상에 배치되지 않은 과량의 운동 단백질 분자를 제거하는 (v)의 단계를 추가로 포함한다.
또한 막관통 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 방법이 제공되고, 이 방법은
i) (A) 표적 폴리뉴클레오타이드; (B) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터; 및 (C) 운동 단백질을 제공하는 단계;
ii) 본원에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법을 수행하여 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시키는 단계;
iii) 표적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상의 정지된 운동 단백질을 나노기공과 접촉시키는 단계; 및
iv) 막관통 나노기공에 걸쳐 전위를 가하여 운동 단백질이 스페이서를 지나 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하게 하여 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되기 전에 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지된다. 다른 실시형태에서, 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지되기 전에 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착된다.
또한 막관통 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 방법이 제공되고, 이 방법은
i) 표적 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
ii) 스페이서를 포함하고 그 위에 운동 단백질이 정지된 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계이되, 상기 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 본원에 개시된 방법에 따라 수득되는 단계;
iii) 표적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 나노기공과 접촉시키는 단계; 및
iv) 막관통 나노기공에 걸쳐 전위를 가하여 운동 단백질이 스페이서를 지나 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하게 하여 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 취하는 단계 -여기서, 하나 이상의 측정은 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄 -, 및 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 (i) 스페이서; (ii) 스페이서 상에 정지된 운동 단백질 -여기서, 운동 단백질의 활성 부위는 스페이서에 의해 점유됨 -; 및 (iii) 어댑터에 결합된 차단 모이어티- 여기서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지함 -를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 제공된다.
일 실시형태에서, (i) 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 로딩 부위에 결합되고; (ii) 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것을 방지한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는
i) 5' 내지 3' 방향의 {LB-S-D}n 또는 {D-S-LB}n- 여기서, LB는 차단된 로딩 부위이고; S는 스페이서이고; D는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; n은 정수, 선택적으로 1 내지 약 20의 정수임 -; 및
ii) 스페이서(S) 상에 정지된 하나 이상의 운동 단백질을 포함하고;
각각의 LB 모이어티는 각각의 운동 단백질이 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(D)로부터 먼 방향으로 스페이서(S)로부터 이동하는 것을 방지한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는
i) 5' 내지 3' 방향의 {LB-S-D}n 또는 {D-S-LB}n- 여기서, LB는 제1 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; S는 스페이서이고; D는 제2 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; n은 정수, 선택적으로 1 내지 약 20의 정수이고; 제1 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(LB)는 스페이서(S)와 인접하고, 스페이서(S)는 제2 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(D)와 인접함 -; 및
ii) 스페이서(S) 상에 정지된 하나 이상의 운동 단백질을 포함한다.
또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형하기 위한 키트가 제공되고, 이 키트는
i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터;
ii) 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있는 운동 단백질; 및
iii) 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 배치되고 운동 단백질의 폴리뉴클레오타이드 비권치 부위가 스페이서에 의해 점유될 때 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있는 차단 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있다.
또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형하기 위한 키트가 제공되고, 이 키트는
i) 스페이서 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터; 및
ii) 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있는 운동 단백질을 포함하고;
차단 모이어티는 운동 단백질이 어댑터에 결합될 때 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
일부 실시형태에서, 이전의 실시형태에 따른 폴리뉴클레오타이드 어댑터 또는 키트는 각각 독립적으로 이전의 실시형태 중 어느 하나에 정의된 것처럼 로딩 부위, 차단 모이어티, 스페이서 및/또는 운동 단백질을 포함하다.
도 1. 무용한 변환은 본원에 개시된 방법을 사용하여 감소한다. 도 1의 (A)는 이중 가닥 DNA, 이어서 스페이서(4 x Sp18 스페이서 기), 이어서 추가의 이중 가닥 DNA를 포함하는 작제물의 개략적 표시를 제공한다. 스페이서는 스페이서의 어느 한 말단에서 접근 가능한 단일 가닥 DNA가 없도록 이중 가닥 DNA에 의해 플랭킹(flank)된다. Dda 헬리카제는 스페이서 상에 정지된다. 도 1의 (B)는 스페이서가 이중 가닥 DNA에 의해 플랭킹되지 않고 하부 가닥이 10개의 잔기가 결여된 유사한 작제물을 보여준다. 작제물은 이와 같이 스페이서의 5' 말단을 플랭킹하는 단일 가닥 DNA를 포함한다. 도 1의 (C)는 각각 도 1의 (A) 및 도 1의 (B)의 작제물 상에 정지된 Dda 헬리카제 효소에 의한 ATP 변환의 촉매 속도를 비교하는 막대 그래프를 보여준다. 이 데이터는 실시예 1에 기술되어 있다.
도 2. 본원에 정의된 것과 같은 스페이서를 포함하는 어댑터 상의 운동 단백질의 효과적인 정지를 보여주는 로딩 적정의 결과. 이 데이터는 실시예 3에 기술되어 있다.
도 3. 본원에 기재된 방법에 따른 예시적인 어댑터가 본원에 기재된 것과 같은 스페이서가 결여된 어댑터와 비교하여 DNA 시퀀싱 시스템에 시험될 때 얻은 증가된 효율을 보여주는 결과. 이 데이터는 실시예 4에 기술되어 있다.
본 발명은 특정 실시형태와 관련하여 그리고 소정의 도면을 참조하여 기재될 것이지만, 본 발명은 이들에 제한되지 않고 오로지 청구항에 의해 제한된다. 청구항에서의 임의의 참조 기호는 제한 범위로 해석되지 않아야 한다. 물론, 본 발명의 임의의 특정 실시형태에 따라 모든 양태 또는 이점이 반드시 달성될 수 없다는 것이 이해되어야 한다. 이와 같이, 예를 들어 당업자는 본 발명이 본원에 교시되거나 제시될 수 있는 것처럼 다른 양태 또는 이점을 반드시 달성하지 않으면서 본원에 교시된 것과 같은 하나의 이점 또는 이점의 그룹을 달성하거나 최적화하는 방식으로 구현되거나 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 특징 및 이점과 함께 조작의 체계화 및 방법 둘 다에 관해서 본 발명은 동반된 도면과 함께 읽을 때 하기 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 수 있다. 본 발명의 양태 및 이점은 이하에 기재된 실시형태(들)로부터 명확하고 이와 관련하여 설명될 것이다. 본 명세서에 걸쳐 "하나의 실시형태" 또는 "일 실시형태"의 언급은 실시형태와 연결되어 기재된 특정 특징, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 이와 같이, 본 명세서에 걸쳐 다양한 위치에서의 "하나의 실시형태에서" 또는 "일 실시형태에서"의 구절의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭하지 않지만, 그럴 수 있다. 유사하게, 본 발명의 예시적인 실시형태의 설명에서 본 발명의 다양한 특징이 때때로 본 개시내용을 간소화하고 다양한 본 발명의 양태 중 하나 이상을 이해하는 것을 도울 목적을 위해 이의 단일 실시형태, 도면 또는 설명에서 함께 그룹화되는 것으로 이해되어야 한다. 그러나, 본 개시내용의 이 방법은 청구된 발명이 각각의 청구항에 명확히 인용된 것보다 더 많은 특징을 요한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 하기 청구항이 반영하는 것처럼, 본 발명의 양태는 단일 상기 개시된 실시형태의 모두보다 적은 특징에 있다.
본 개시내용의 "실시형태"가 문맥이 달리 표시되지 않는 한 구체적으로 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. (문맥에 의해 달리 암시되지 않는 한) 모든 개시된 실시형태의 특정 조합은 청구된 발명의 추가로 개시된 실시형태이다.
게다가, 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 것처럼, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 이와 같이, 예를 들어, "폴리뉴클레오타이드"의 언급은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, "운동 단백질"의 언급은 2개 이상의 이러한 단백질을 포함하고, "헬리카제"의 언급은 2개 이상의 헬리카제를 포함하고, "단량체"의 언급은 2개 이상의 단량체를 지칭하고, "기공"의 언급은 2개 이상의 기공을 포함하고, 기타 등등이다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 상기이든 또는 하기이든 본원에 의해 그 전체가 인용되어 포함된다.
정의
부정관사 또는 정관사가 단수 명사, 예를 들어 "일" 또는 "하나", "이"를 지칭할 때 사용되는 경우, 이것은 다른 것이 구체적으로 기술되지 않는 한 그 명사의 복수를 포함한다. "포함하는"이라는 용어가 본 설명 및 청구항에 사용되는 경우, 이것은 다른 부재 또는 단계를 배제하지 않는다. 더욱이, 설명 및 청구항에서 제1, 제2, 제3 등의 용어는 유사한 부재 사이를 구별하는 데 사용되고, 순차적 순서 또는 연대적 순서를 기술하기 위해 반드시 사용되지는 않는다. 이렇게 사용된 용어가 적절한 상황 하에 교환가능 하고 본원에 기재된 본 발명의 실시형태가 본원에 기재되거나 예시된 것과 다른 서열에서 조작할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 용어 또는 정의는 오로지 본 발명을 이해하는 것을 돕도록 제공된다. 본원에 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어는 본 발명의 당업자에게 그런 것과 동일한 의미를 갖는다. 실행자는 당분야의 정의 및 용어를 위해 특히 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 114), John Wiley & Sons, New York (2016)]에 관련된다. 본원에 제공된 정의는 당업자에 의해 이해되는 것보다 적은 범위를 갖도록 해석되지 않아야 한다.
본원에 사용된 "약"은 양, 시간 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 개시된 방법을 수행하기 위해 기재된 값에서 ± 20% 또는 ± 10%, 더 바람직하게는 ± 5%, 더욱 더 바람직하게는 ± 1% 및 훨씬 더 바람직하게는 ± 0.1%의 변동이 적절하므로 이 변동을 포함하도록 의도된다.
본원에 사용된 "뉴클레오타이드 서열", "DNA 서열" 또는 "핵산 분자(들)"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭하다. 이 용어는 오직 분자의 일차 구조를 지칭한다. 이와 같이, 이 용어는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, 및 RNA를 포함한다. 본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는 각각의 뉴클레오타이드 상의 3' 말단 및 5' 말단이 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 또는 이중 가닥의 공유 연결된 서열이다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드 염기 또는 리보뉴클레오타이드 염기로 이루어질 수 있다. 핵산은 시험관내 합성으로 제조되거나 자연 원천으로부터 단리될 수 있다. 핵산은 변형된 DNA 또는 RNA, 예를 들어 메틸화된 DNA 또는 RNA, 또는 번역후 변형, 예를 들어 7-메틸구아노신에 의한 5'-캡핑, 3'-가공, 예컨대 절단 및 폴리아데닐화 및 스플라이싱으로 처리된 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 또한 합성 핵산(XNA), 예컨대 헥시톨 핵산(HNA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리세롤 핵산(GNA), 잠금 핵산(LNA) 및 펩타이드 핵산(PNA)을 포함할 수 있다. 본원에 "폴리뉴클레오타이드"라고도 칭하는 핵산의 크기는 통상적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대해서는 염기 쌍(bp)의 수로서 표현되거나, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 경우에는 뉴클레오타이드(nt)의 수로서 표현된다. 1000 bp 또는 nt는 킬로염기(kb)와 동등하다. 대략 40개 미만의 뉴클레오타이드 길이의 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 "올리고뉴클레오타이드"라고 칭해지고, 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 DNA의 조작에서 사용하기 위한 프라이머를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서 "아미노산"이라는 용어는 이의 광의로 사용되고, 각각의 아미노산에 특이적인 측쇄 (예를 들어, R 기)를 따라 아민(NH2) 및 카복실(COOH) 작용기를 함유하는 유기 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 자연 발생 L α-아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 자연 발생 아미노산에 대한 흔히 사용된 것 및 1문자 및 3문자 약어가 본원에 사용된다: A = Ala; C = Cys; D = Asp; E = Glu; F = Phe; G = Gly; H = His; I = Ile; K = Lys; L = Leu; M = Met; N = Asn; P = Pro; Q = Gln; R = Arg; S = Ser; T = Thr; V = Val; W = Trp; 및 Y = Tyr(문헌[Lehninger, A. L., (1975) Biochemistry, 2d ed., pp. 71-92, Worth Publishers, New York]). "아미노산"이라는 일반 용어는 D-아미노산, 레트로-인버소 아미노산뿐만 아니라 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 노르류신과 같은 단백질로 보통 혼입되지 않는 자연 발생 아미노산 및 β-아미노산과 같은 아미노산의 특징인 것으로 당해 분야에 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 펩타이드 화합물의 동일한 입체형태 제한이 천연 Phe 또는 Pro가 하는 것처럼 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체는 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본원에서 각각의 아미노산의 "기능적 균등물"이라 칭해진다. 아미노산의 다른 예는 문헌[Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, eds., Vol. 5 p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983]에 의해 열거되어 있는데, 이는 본원에 인용되어 포함된다.
"폴리펩타이드" 및 "펩타이드"라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하도록 본원에 상호교환 가능하게 사용된다. 이와 같이, 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비천연 발생 아미노산, 예컨대 상응하는 천연 발생 아미노산의 화학 유사체뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체인 아미노산 중합체에 적용된다. 폴리펩타이드는 비제한적인 예로서 글리코실화, 단백분해 절단, 지질화, 신호 펩타이드 절단, 프로펩타이드 절단, 인산화 및 기타를 포함할 수 있는 성숙 또는 번역후 변형 과정을 또한 겪을 수 있다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 합성 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 재조합 기법을 사용하여 펩타이드가 제조될 수 있다. 통상적으로 배양 배지가 실질적으로 없는 재조합으로 제조된 펩타이드, 예를 들어, 배양 배지는 단백질 제제의 약 20% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만 및 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 부피를 나타낸다.
"단백질"이라는 용어는 2차 구조 또는 3차 구조를 갖는 폴딩된 폴리펩타이드를 기재하도록 사용된다. 단백질은 단일 폴리펩타이드로 이루어질 수 있거나, 다합체를 형성하도록 조립된 다수의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다합체는 동종올리고머 또는 이종올리고머일 수 있다. 단백질은 자연 발생 단백질 또는 야생형 단백질, 또는 변형된 단백질 또는 비자연 발생 단백질일 수 있다. 단백질은 예를 들어 하나 이상의 아미노산의 부가, 치환 또는 결실에 의해 야생형 단백질과 상이할 수 있다.
단백질의 "변이체"는 해당 비변형된 단백질 또는 야생형 단백질과 관련하여 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖고, 이것이 유래된 비변형된 단백질과 유사한 생물학적 활성 및 기능적 활성을 갖는 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 효소를 포함한다. 본원에 사용된 "아미노산 동일성"이라는 용어는 서열이 비교창에 걸쳐 아미노산별로 동일한 정도를 지칭한다. 이와 같이, 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 일치된 위치의 수를 생성하도록 서열 둘 다에서 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 비교창에서의 위치의 총 수(즉, 창 크기)에 의해 일치된 위치의 수를 나누고, 서열 동일성의 백분율을 생성하도록 100에 의해 그 결과를 곱하여 "서열 동일성의 동일성"이 계산된다.
본 발명의 모든 양태 및 실시형태에 대해, "변이체"는 상응하는 야생형 단백질의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 완전한 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성은 또한 전체 길이 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 단편 또는 일부일 수 있다. 그러므로, 서열은 전체 길이 기준 서열과 불과 50%의 전체 서열 동일성을 가질 수 있지만, 특정 영역, 도메인 또는 하위단위의 서열은 기준 서열과 80%, 90% 또는 99%만큼 많은 서열 동일성을 공유할 수 있었다.
"야생형"이라는 용어는 자연 발생 원천으로부터 단리된 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 자주 발견되는 것이고, 이와 같이 유전자의 "일반" 형태 또는 "야생형" 형태가 임의로 설계되었다. 그에 반해서, "변형된", "돌연변이체" 또는 "변이체"라는 용어는 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때 서열의 변형(예를 들어, 치환, 절두 또는 삽입), 번역후 변형 및/또는 기능적 특성(예를 들어, 변경된 특징)을 나타내는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다. 자연 발생 돌연변이체가 단리될 수 있다는 것에 유의하고, 이들은 야생형 유전자 또는 유전자 산물과 비교할 때 변경된 특징을 갖는다는 사실에 의해 확인된다. 자연 발생 아미노산을 도입하거나 치환하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 돌연변이체 단량체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에서 관련 위치에서 아르기닌에 대한 코돈(CGT)에 의해 메티오닌에 대한 코돈(ATG)을 대체하여 메티오닌(M)은 아르기닌(R)으로 치환될 수 있다. 비자연 발생 아미노산을 도입하거나 치환하는 방법은 당해 분야에 또한 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 비자연 발생 아미노산은 돌연변이체 단량체를 발현하도록 사용된 IVTT 시스템에서 합성 아미노아실-tRNA를 포함함으로써 도입될 수 있다. 대안적으로, 이들은 이 특정 아미노산의 합성(즉, 비자연 발생) 유사체의 존재 하에 특이적 아미노산에 대해 영양요구성인 이. 콜라이에서 돌연변이체 단량체를 발현시킴으로써 도입될 수 있다. 돌연변이체 단량체가 부분 펩타이드 합성을 사용하여 제조되면 이들은 네이키드 결찰에 의해 또한 제조될 수 있다. 보존적 치환은 유사한 화학 구조, 유사한 화학 특성 또는 유사한 측쇄 부피의 다른 아미노산으로 아미노산을 대체한다. 도입된 아미노산은 이들이 대체하는 아미노산과 유사한 극성, 친수화도, 소수화도, 염기성, 산성, 중성 또는 전하를 가질 수 있다. 대안적으로, 보존적 치환은 이미 존재하는 방향족 아미노산 또는 지방족 아미노산 대신에 방향족 또는 지방족인 다른 아미노산을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 변경은 당해 분야에 잘 공지되어 있고, 하기 표 1에 정의된 것처럼 20개의 주요 아미노산의 특성에 따라 선택될 수 있다. 아미노산이 유사한 극성을 가지는 경우, 이는 표 2에서 아미노산 측쇄에 대해 소수성친수성지표 척도를 참조하여 또한 결정될 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
돌연변이체 또는 변형된 단백질, 단량체 또는 펩타이드는 임의의 방식으로 임의의 부위에서 또한 화학적으로 변형될 수 있다. 돌연변이체 또는 변형된 단량체 또는 펩타이드는 바람직하게는 하나 이상의 시스테인에 대한 분자의 부착(시스테인 연결), 하나 이상의 리신에 대한 분자의 부착, 하나 이상의 비천연 아미노산에 대한 분자의 부착, 에피토프의 효소 변형 또는 말단의 변형에 의해 화학적으로 변형된다. 이러한 변형을 수행하기에 적합한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 변형된 단백질, 단량체 또는 펩타이드의 돌연변이체는 임의의 분자의 부착에 의해 화학적으로 변형된다. 예를 들어, 변형된 단백질, 단량체 또는 펩타이드의 돌연변이체는 염료 또는 형광단의 부착에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
운동 단백질의 정지
본 개시내용은 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법에 관한 것이고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다. 하기 더 자세히 설명된 것처럼, 이 방법은 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드에 결합될 때와 비교하여 운동 단백질이 연료 분자를 변환시키는 속도를 감소시킬 수 있다.
상기 기술된 것처럼, 표적 폴리뉴클레오타이드로의 운동 단백질의 이동을 제어하기 위한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 당해 분야에 공지된 하나의 방법은 스페이서를 사용하여 운동 단백질이 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하는 것을 방지하는 것을 수반한다. 이 방법은 스페이서에서 (예를 들어, 스페이서에 인접한) 운동 단백질을 보유하는 것을 수반한다. 운동 단백질은 이러한 방식으로 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 가닥에 대해 보유될 수 있다. 운동 단백질은 방향성일 수 있다(즉, 폴리뉴클레오타이드를 5'→3' 방향 또는 3'→5' 방향으로 가공함). 운동 단백질이 가공하는 방향으로 운동 단백질과 표적 폴리뉴클레오타이드 사이에 스페이서를 제공함으로써, 운동 단백질의 이동이 스페이서에 의해 구속될 수 있다. 한편, 표적 폴리뉴클레오타이드로의 운동 단백질의 이동은 스페이서에 의해 지연된다. 다른 한편, 운동 단백질의 이동은 또한 이의 방향성에 의해 구속되지 않는데, 이는 이것이 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 먼 방향으로 스페이서로부터 멀리 이동하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 방식으로, 운동 단백질은 (예를 들어, 스페이서에 접하며) 보유될 수 있는데, 스페이서 쪽으로의 "정방향" 또는 스페이서로부터의 "역방향" 중 어느 하나의 이의 이동이 구속되기 때문이다.
그러나, 이 공지된 방식으로 운동 단백질을 구속하는 것은 통상적으로 운동 단백질이 반응 조건에 존재할 수 있는 연료(예를 들어, 운동 단백질에 의한 폴리뉴클레오타이드 가공에 필요한 보인자)를 소모하는 것을 방지하지 않을 수 있다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 스페이서에서 운동 단백질을 정지시키는 것은 운동 단백질의 "미끄러짐"을 발생시키는 것으로 여겨진다. 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 로딩되고, 이것이 상기 기재된 방식으로 스페이서에 도달할 때까지 진행한다. 운동 단백질의 이동은 이것이 스페이서에 도달할 때 정지된다. 그러나, 운동 단백질은 스페이서에서 정지형으로 있지 않는다. 오히려, 운동 단백질은 스페이서에 인접한 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 대한 결합에서 주기적으로 이탈하는 것으로 여겨지는데, 이는 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 따라 뒤로 스페이서로부터 멀리 확산하게 한다. 이후, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터와 재맞물리고, 이것이 스페이서에 다시 도달할 때까지 진행하고, 이후 사이클이 반복된다. 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터로부터 연속적으로 이탈하는 것, 폴리뉴클레오타이드 어댑터와 재맞물리는 것 및 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 따라 스페이서로 진행하는 것은 운동 단백질의 전체적인 진행과 연관됨에도 불구하고 시스템에 존재하는 연료를 소모한다. 스페이서에서 정지된 운동 단백질에 의한 연료의 이 비생산적 소모는 무용한 변환이라 칭해진다.
무용한 변환은 바람직하지 않고, 시스템의 전체 효율을 감소시킨다. 예를 들어, 운동 단백질이 연장된 기간 동안 기재된 방식으로 스페이서에서 정지되면, 무용한 변환에서 운동 단백질이 소모한 연료는 상당한 양이될 수 있다. 이러한 비생산적 연료 사용은 예를 들어 저장에서 시스템의 수명을 상당히 제한할 수 있다. 연료의 감소는 예를 들어 또한 운동 단백질의 속도를 바람직하지 않게 감소시킬 수 있다. 무용한 변환은 이 바람직하지 않은 소모를 고려하도록 초기에 그리고 바람직하지 않게 증가되는 반응 시스템에서의 연료의 분량을 요할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드의 특성평가 동안 불순물에 의해 생긴 인공물을 피하기 위한 고순도 연료의 필요는 무용한 변환이 비용을 상당히 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다. 더욱이, 운동 단백질이 높은 농도의 소모된 연료 분자(즉, 운동 단백질, 예컨대 ADP에 의해 변환된 연료 분자)에 의해 부정적으로 영향을 받으면, 운동 단백질이 특성평가되는 표적 폴리뉴클레오타이드에 가하는 제어는 감소될 수 있고/있거나, 운동 단백질의 속도는 바람직하지 않게 감소할 수 있다.
이를 해결하려고 추구하면서 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시킴으로써 무용한 변환이 감소되거나 방지될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 특히, 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지함으로써, 무용한 변환이 감소한다. 바꾸어 말하면, 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드에 결합될 때와 비교하여 운동 단백질이 연료 분자를 변환시키는 속도가 감소한다. 적합한 스페이서는 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
현재 청구된 방법을 개발하는 데 있어서 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합시킴으로써 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 포함된 스페이서로부터 이동하는 것이 유리하게 방지될 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 차단 모이어티는 예를 들어 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 입체적으로 방지할 수 있다. 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 화학적으로 방지할 수 있다. 차단 모이어티는 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
따라서, 본원에는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법이 제공되고, 이 방법은
i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계; 및
iii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 단계를 포함하고;
폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
일 실시형태에서, 본원에는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법이 제공되고, 이 방법은
i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계;
iii) 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 단계; 및
iv) 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 로딩 부위는 운동 단백질과 접촉할 수 있다. 로딩 부위를 운동 단백질과 접촉시키는 것은 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 한다. 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 로딩 부위를 포함하는 실시형태에서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 통상적으로 운동 단백질이 스페이서로부터 로딩 부위로 이동하는 것을 방지한다. 로딩 부위는 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 제공된 방법은 (i) 로딩 부위를 운동 단백질과 접촉시키는 단계- 여기서, 운동 단백질은 로딩 부위와 맞물림 -; 및 (ii) 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하고 로딩 부위와 재맞물리는 것을 방지한다.
다른 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 로딩 부위를 포함하지 않는다. 이러한 실시형태에서, 운동 단백질은 통상적으로 예를 들어 스페이서에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터와 접촉하고, 즉 운동 단백질은 스페이서와 접촉할 수 있다. 운동 단백질은 스페이서 상에 배치된다. 운동 단백질은 임의의 적합한 수단에 의해 스페이서 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, 본원에 더 자세히 기재된 것처럼, 운동 단백질은 스페이서와 접촉할 수 있고, 후속하여 운동 단백질은 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 변형될 수 있다. 스페이서는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하도록 차단 모이어티에 의해 플랭킹될 수 있다. 스페이서는 일부 실시형태에서 스페이서 단위 이외에 천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이는 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 어댑터
제공된 방법은 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 단계를 포함한다. 국제공개 WO 2015/110813호는 표적 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 것을 기재하고, 본원에 그 전체가 인용되어 포함된다.
어댑터는 통상적으로 표적 폴리뉴클레오타이드의 말단에 부착될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 본원에 개시된 방법에 따른 특성평가를 목적으로 한다.
폴리뉴클레오타이드 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 말단들 둘 다에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 상이한 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 2개의 말단에 첨가될 수 있다. 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 단지 하나의 말단에 첨가될 수 있다. 어댑터를 폴리뉴클레오타이드에 첨가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 어댑터는 예를 들어 결찰, 클릭 화학, 태그화, 토포아이소머라제 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
일 실시형태에서, 어댑터는 합성 또는 인공이다. 통상적으로, 어댑터는 본원에 기재된 것과 같은 중합체를 포함한다. 어댑터는 본원에 기재된 것과 같은 스페이서를 포함한다. 하기 더 자세히 설명된 것처럼, 어댑터는 로딩 부위, 예를 들어 스페이서에 연결된 로딩 부위를 또한 포함할 수 있다. 로딩 부위는 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 어댑터는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 하기 설명된 것처럼, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 DNA, RNA, 변형된 DNA(예컨대, 염기성 DNA), RNA, PNA, LNA, BNA 및/또는 PEG를 포함할 수 있다. 보통, 어댑터는 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA를 포함한다.
일 실시형태에서, 어댑터는 Y 어댑터이다. Y 어댑터는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드 어댑터이다. Y 어댑터는 통상적으로 이중 가닥이고, (a) 일 말단에서 2개의 가닥이 함께 혼성화된 영역 및 (b) 다른 말단에서 2개의 가닥이 상보성이 아닌 영역을 포함한다. 가닥의 비상보성 부분은 오버행을 형성한다. Y 어댑터에서의 비상보성 영역의 존재는 어댑터가 Y 형상이 되게 하는데, 2개의 가닥이 통상적으로 이중 가닥 부분과 달리 서로에 혼성화하지 않기 때문이다. 하기 더 자세히 설명된 것처럼, 일 실시형태에서 운동 단백질은 Y 어댑터와 같은 어댑터의 오버행에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 운동 단백질은 이중 가닥 영역에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 운동 단백질은 어댑터의 단일 가닥 영역 및/또는 이중 가닥 영역에 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 운동 단백질은 이러한 어댑터의 단일 가닥 영역에 결합할 수 있고, 제2 운동 단백질은 어댑터의 이중 가닥 영역에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 어댑터는 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 막 앵커 또는 기공 앵커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 앵커는 핵산 취급 효소가 결합된 오버행에 상보성이고 이리하여 이것에 혼성화된 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
일부 실시형태에서, Y 어댑터와 같은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 비상보성 가닥의 하나는 리더 서열을 포함할 수 있고, 이는 막관통 기공과 접촉할 때 나노기공 안으로 트레딩(threading)될 수 있다. 일 실시형태에서, 리더 서열은 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 로딩 부위를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 리더 서열은 로딩 부위에 앞설 수 있다(즉, 로딩 부위가 리더 서열과 스페이서 사이에 배치되도록 어댑터는 로딩 부위에 연결된 리더 서열을 포함할 수 있다(로딩 부위는 스페이서에 연결됨)). 일 실시형태에서, 로딩 부위는 리더 서열에 앞설 수 있다(즉, 리더 서열이 로딩 부위와 스페이서 사이에 배치되도록 어댑터는 리더 서열에 연결된 로딩 부위를 포함할 수 있다(리더 서열은 스페이서에 연결됨)).
리더 서열은 통상적으로 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 변형된 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 탈염기성 DNA), PNA, LNA, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 리더 서열은 폴리 dT 구획과 같은 DNA의 단일 가닥을 포함한다. 리더 서열은 임의의 길이일 수 있지만, 통상적으로 10개 내지 150개의 뉴클레오타이드 길이, 예컨대 20개 내지 120개, 30개 내지 100개, 40개 내지 80개 또는 50개 내지 70개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 헤어핀 루프 어댑터이다. 헤어핀 루프 어댑터는 단일 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 어댑터이고, 폴리뉴클레오타이드 가닥의 말단은 서로에 혼성화할 수 있거나, 서로에 혼성화되고, 폴리뉴클레오타이드의 중간 구획은 루프를 형성한다. 적합한 헤어핀 루프 어댑터는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 설계될 수 있다.
하기 더 자세히 설명된 것처럼, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하기 위해 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
따라서 당업자는, 본원에 제공된 방법에서의 사용을 위해 기재된 어댑터가, 본원 기재의 차단 모이어티가 결여된 어댑터에 비해, 그 위에 정지된 운동 단백질에 의한 무용한 변환을 감소시킨다는 것을 이해할 것이다. 통상적으로, 본원에 제공된 방법에 사용하기 위해 기재된 어댑터는 본원에 제공된 것과 같은 차단 모이어티가 결여된 어댑터와 비교하여 연료 사용의 효율을 개선한다.
당업자는 또한, 어댑터가 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함할 때, 어댑터의 서열이 통상적으로 결정적이지 않고, 운동 단백질 및 다른 실험 조건, 예컨대 특성평가되는 임의의 폴리뉴클레오타이드에 따라 제어되거나 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 서열은 실시예에서 오로지 예시에 의해 제공된다. 예를 들어, 어댑터는 서열, 예컨대 서열 번호 13 또는 서열 번호 13과 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 어댑터는 서열, 예컨대 서열 번호 14 및 서열 번호 15, 또는 서열 번호 14 및 서열 번호 15와 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 유사성 또는 동일성을 독립적으로 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열에 제공된 것에 의해 플랭킹된 본원에 기재된 것과 같은 스페이서를 포함할 수 있다. 당업자는 서열 번호 14가 서열, 예컨대 서열 번호 15를 포함하고, 어댑터가 이와 같이 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열 번호 15 또는 서열 번호 15와 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 어댑터의 서열은 통상적으로 주어진 스페이서에 의해 제공된 무용한 변환의 감소에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다.
스페이서(들)
개시된 방법은 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 것을 포함한다. 하나 이상의 스페이서는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 존재할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 1개 내지 약 10개의 스페이서, 예를 들어 1개 내지 약 5개의 스페이서, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 스페이서를 포함할 수 있다. "스페이서" 및 "정지 부위"라는 용어는 상호교환 가능하게 사용될 수 있고, 운동 단백질을 정지시켜 통상적으로 상기 기재된 것처럼 무용한 변환을 방지하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 부분을 지칭한다. 스페이서(정지 부위)는 임의의 적합한 수의 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 적합한 스페이서 단위는 본원에 기재되어 있고, (하기 기재된) 탈염기성 뉴클레오타이드 및 스페이서 기, 예컨대 iSp9, iSp18 및 C3 기를 포함한다. 스페이서(정지 부위)는 스페이서 단위 이외에 뉴클레오타이드 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 더 자세히 기재된 것처럼, 스페이서(정지 부위)는 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 끼워진 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 스페이서(정지 부위)는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 플랭킹되거나 분리된 하나 이상의 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 이 개념은 때때로 "뉴클레오타이드 섬"이라 칭해지고, 하기에 추가로 기술된다.
하나 이상의 스페이서는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 포함된다. 통상적으로 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 가닥을 포함할 수 있고, 하나 이상의 스페이서는 폴리뉴클레오타이드 가닥에 포함될 수 있는데, 예를 들어 가닥을 차단하거나 하나의 가닥을 다른 가닥으로부터 분리한다. 예시적인 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 어댑터에서의 각각의 스페이서는 운동 단백질의 이동을 지연시키는 에너지 장벽을 제공한다. 예를 들어, 스페이서는 운동 단백질의 견인의 감소에 의해 운동 단백질을 정지시킬 수 있다. 예를 들어, 탈염기성 스페이서, 즉 폴리뉴클레오타이드 어댑터에서 하나 이상의 뉴클레오타이드로부터 염기가 제거된 스페이서를 사용하여 이것이 달성될 수 있다. 스페이서는 예를 들어 운동 단백질의 이동을 물리적으로 지연시키도록 벌키한 화학 기를 도입함으로써 운동 단백질의 이동을 물리적으로 차단할 수 있다.
스페이서는 하나 이상의 운동 단백질(들)을 정지시키는 임의의 분자 또는 분자의 조합을 포함할 수 있다. 스페이서는 운동 단백질이 표적 폴리뉴클레오타이드를 따라 이동하는 것을 방지하는 임의의 분자 또는 분자의 조합을 포함할 수 있다. 이는 운동 단백질이 스페이서에서 정지되는지 또는 아닌지를 결정하는 데 있어서 간단하다. 예를 들어, 이는 국제공개 WO 2014/135838호에 기술된 것처럼 분석될 수 있고, 이의 내용은 인용되어 포함된다 - 예를 들어, 스페이서를 지나 이동하고 DNA의 상보성 가닥을 변위시키는 운동 단백질의 능력은 PAGE에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 중합체와 같은 선형 분자를 포함할 수 있다. 통상적으로, 이러한 스페이서는 표적 폴리뉴클레오타이드와 상이한 구조를 갖는다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드가 DNA이면, 각각의 스페이서는 통상적으로 DNA를 포함하지 않는다. 특히, 표적 폴리뉴클레오타이드가 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)이면, 각각의 스페이서는 바람직하게는 펩타이드 핵산(PNA), 글리세롤 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 잠금 핵산(LNA), 브리징된 핵산(BNA) 또는 뉴클레오타이드 측쇄와의 합성 중합체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 니트로인돌, 하나 이상의 이노신, 하나 이상의 아크리딘, 하나 이상의 2-아미노푸린, 하나 이상의 2-6-디아미노푸린, 하나 이상의 5-브로모-데옥시우리딘, 하나 이상의 인버티드 티미딘(인버티드 dT), 하나 이상의 인버티드 디데옥시-티미딘(ddT), 하나 이상의 디데옥시-시티딘(ddC), 하나 이상의 5-메틸시티딘, 하나 이상의 5-하이드록시메틸시티딘, 하나 이상의 2'-O-메틸 RNA 염기, 하나 이상의 이소-데옥시시티딘(이소-dC), 하나 이상의 이소-데옥시구아노신(이소-dG), 하나 이상의 C3 (OC3H6OPO3) 기, 하나 이상의 광 절단성(PC) [OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3] 기, 하나 이상의 헥산디올 기, 하나 이상의 스페이서 9(iSp9) [(OCH2CH2)3OPO3] 기 또는 하나 이상의 스페이서 18(iSp18) [(OCH2CH2)6OPO3] 기; 또는 하나 이상의 티올 연결을 포함할 수 있다. 스페이서는 이들 기의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 많은 이들 기는 IDT®(Integrated DNA Technologies®)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, C3, iSp9 및 iSp18 스페이서는 모두 IDT®로부터 입수 가능하다.
스페이서는 스페이서 단위로서 임의의 수의 상기 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 2-아미노푸린, 2-6-디아미노푸린, 5-브로모-데옥시우리딘, 인버티드 dT, ddT, ddC, 5-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 2'-O-메틸 RNA 염기, 이소-dC, 이소-dG, iSpC3 기, PC 기, 헥산디올 기 및 티올 연결로부터 선택된 1개 내지 약 12개 이상(예를 들어, 약 1개 내지 약 8개, 예를 들어 1개 내지 약 6개, 예컨대 1개 내지 약 4개)의 스페이서를 포함할 수 있다. 스페이서는 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 이러한 기를 포함할 수 있다.
스페이서는 1개 내지 약 12개 이상(예를 들어, 약 1개 내지 약 8개, 예를 들어 1개 내지 약 6개, 예컨대 1개 내지 약 4개)의 C3 기를 포함할 수 있고; 예를 들어 스페이서는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 C3 기를 포함할 수 있다. C3 기는 통상적으로 -OC3H6OPO3- 기이다.
스페이서는 약 1개 내지 약 8개 이상(예를 들어, 약 1개 내지 약 6개, 예컨대 1개 내지 약 4개)의 iSp9 기를 포함할 수 있고; 예를 들어 스페이서는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 iSp9 기를 포함할 수 있다. iSp9 기는 통상적으로 -(OCH2CH2)3OPO3- 기이다.
스페이서는 약 1개 내지 약 8개 이상(예를 들어, 약 1개 내지 약 6개, 예컨대 1개 내지 약 4개)의 iSp18 기를 포함할 수 있고; 예를 들어 스페이서는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 iSp9 기를 포함할 수 있다. iSp18 기는 통상적으로 -(OCH2CH2)6OPO3- 기이다. 일 실시형태에서, 스페이서는 4 iSp18 기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 iSp18 기(들) 및/또는 하나 이상의 iSp9 기(들) 및/또는 하나 이상의 C3 기(들)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 운동 단백질이 정지되게 하는 하나 이상의 화학 기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 화학 기는 하나 이상의 펜던트 화학 기이다. 하나 이상의 화학 기는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에서 하나 이상의 핵염기에 부착될 수 있다. 하나 이상의 화학 기는 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 골격에 부착될 수 있다. 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과와 같은 임의의 수의 적절한 화학 기가 존재할 수 있다. 적합한 기는 형광단, 스트렙타비딘 및/또는 비오틴, 콜레스테롤, 메틸렌 블루, 디니트로페놀(DNP), 디옥시게닌 및/또는 항-디옥시게닌 및 디벤질사이클로옥틴 기를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 폴리펩타이드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인 중합체를 포함할 수 있다.
스페이서가 폴리펩타이드를 포함할 때, 폴리펩타이드는 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 약 1개 내지 약 12개 이상(예를 들어, 약 1개 내지 약 8개, 예를 들어 1개 내지 약 6개, 예컨대 1개 내지 약 4개)의 아미노산을 포함할 수 있고; 예를 들어 스페이서는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 아미노산을 포함할 수 있다.
스페이서가 PEG(폴리에틸렌 글리콜)와 같은 중합체를 포함할 때, 중합체는 임의의 수의 단량체 단위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 약 1개 내지 약 12개 이상(예를 들어, 약 1개 내지 약 8개, 예를 들어 1개 내지 약 6개, 예컨대 1개 내지 약 4개)의 단량체 단위를 포함할 수 있고; 예를 들어 스페이서는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 단량체(예를 들어, PEG) 단위를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 탈염기성 뉴클레오타이드(즉, 핵염기가 결여된 뉴클레오타이드), 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 이것 초과의 탈염기성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 핵염기는 탈염기성 뉴클레오타이드에서 -H(idSp) 또는 -OH에 의해 대체될 수 있다. 탈염기성 스페이서는 하나 이상의 인접한 뉴클레오타이드로부터 핵염기를 제거함으로써 표적 폴리뉴클레오타이드로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 3-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 1,N6-에테노아데닌 이노신 또는 하이폭산틴을 포함하도록 변형될 수 있고, 핵염기는 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라제(hAAG)를 사용하여 이 뉴클레오타이드로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 우라실을 포함하도록 변형될 수 있고, 핵염기는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)에 의해 제거된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서는 임의의 탈염기성 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 뉴클레오타이드 섬이라고도 칭하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위를 포함할 수 있다. 스페이서는 통상적으로 운동 단백질의 활성 부위를 완전히 점유하기에 충분히 긴 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하지 않는다. 예를 들어, 스페이서가 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위를 포함하는 실시형태에서, 스페이서는 통상적으로 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드, 더 자주 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 스페이서에 존재하는 각각의 뉴클레오타이드 섬에서 1개 내지 3개의 인접한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 1개 내지 3개의 인접한 뉴클레오타이드를 각각 포함하는 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드 섬, 예를 들어 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드 섬을 포함할 수 있다. 당업자는 운동 단백질의 활성 부위(폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트)가 통상적으로 대략 8개의 뉴클레오타이드 단위에 상응하는 길이라는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 스페이서가 1개 내지 3개, 예를 들어 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드 스페이서 단위를 포함하는 실시형태에서, 뉴클레오타이드 스페이서 단위는 운동 단백질의 활성 부위를 완전히 점유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 1개 내지 3개, 예를 들어 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드를 포함하는 예시적인 스페이서(정지 부위)는 통상적으로 -[(S) x -(N) y -(S) z ] w -로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함하고, 각각의 S는 스페이서 단위(예를 들어, 본원에 기재된 스페이서 단위)이고; 각각의 N은 뉴클레오타이드이고; x는 1 내지 7의 정수이고; y는 1 내지 3, 통상적으로 1 또는 2의 정수이고; z는 1 내지 7의 정수이고, w는 1 내지 3의 정수이고; 각각의 S는 동일하거나 상이하고, 각각의 N은 동일하거나 상이하다. 보다 대개 이러한 실시형태에서, 각각의 S는 C3, iSp9 및 iSp18 스페이서 단위로부터 독립적으로 선택된 스페이서 단위이고; 각각의 N은 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민으로부터 독립적으로 선택되고; x는 1 내지 7의 정수이고; y는 1 또는 2이고; z는 1 내지 4의 정수이고, w는 1 내지 3의 정수이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오타이드 섬을 포함할 수 있고, 어댑터는 운동 단백질과 어댑터의 접촉 전에 여기에 결합된 본원에 정의된 것과 같은 차단 모이어티를 가질 수 있다. 이러한 실시형태에서, 운동 단백질은 이와 같이 스페이서에 직접 로딩할 수 있다. 운동 단백질은 스페이서 내에 포함된 뉴클레오타이드 섬에 로딩될 수 있다. 운동 단백질은 스페이서에 포함된 뉴클레오타이드 섬에 로딩될 수 있고, 이후 예를 들어 스페이서로부터 분리함으로써 운동 단백질이 스페이서를 떠나는 것을 방지하도록 변형될 수 있다. 운동 단백질의 변형은 본원에 더 자세히 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질은 뉴클레오타이드 섬에 로딩되고, 이후 스페이서에 포함된 스페이서 단위로 진행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서 내 뉴클레오타이드 섬으로부터 운동 단백질을 이동시키도록 힘이 가해질 때까지 운동 단백질은 섬(들)에 배치된 채 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 힘은 본원에 기재된 것과 같은 나노기공에 의해 제공된다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -S-N-N-S-S-; -S-N-S-N-S-; -S-S-N-N-S-; -S-S-N-S-S-; -N-N-S-N-N-S-; -S-S-N-N-S-S-; -S-N-N-S-N-N-S-; -S-N-S-N-S-N-S-; -S-S-S-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-; -S-S-N-N-N-S-N-N-S-; -S-S-N-N-S-N-N-N-S-; -S-S-N-N-S-N-N-S-S-; -S-S-S-N-N-N-S-N-S-; -S-S-S-N-S-N-N-N-S-; -S-S-S-S-N-N-S-N-S-; -S-S-S-S-N-S-N-N-S-; -S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-; -N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-; -N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -N-N-S-S-S-N-N-S-S-S-S-; -N-N-S-S-S-S-N-N-S-S-S-; -N-N-S-S-S-S-S-N-N-S-S-; -N-N-S-S-S-S-S-S-N-N-S-; -S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-S-N-N-S-S-S-; -S-N-N-S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-N-N-S-S-S-S-S-N-N-S-; -S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-N-N-S-S-S-N-N-S-S-; -S-S-N-N-S-S-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-S-S-; 등으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 각각의 S는 본원에 기재된 것과 같은 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -S-N-S-N-S-N-S-; -S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-;-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; -N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-;-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-:-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; 등으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 각각의 S는 본원에 기재된 것과 같은 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-;-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-: -S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; 등으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 각각의 S는 본원에 기재된 것과 같은 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; 등으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 각각의 S는 본원에 기재된 것과 같은 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -S-S-N-N-S-S-; -S-N-S-N-S-N-S; -S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; 및 -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; 등으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 각각의 S는 본원에 기재된 것과 같은 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 각각의 S는 동일한 스페이서 단위이다. 일부 실시형태에서, S 기는 상이한 스페이서 단위이다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 뉴클레오타이드 기반 스페이서 단위(예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 2'-O-메틸 RNA 염기) 및 비뉴클레오타이드 기반 스페이서 단위(예컨대, iSp18, iSp9 및 C3 스페이서 단위) 둘 다를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 S는 iSp18 기, iSp9 기, 2'-O-메틸 우리딘 및 C3 기로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 S는 iSp18 기, iSp9 기 및 C3 기로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 S는 독립적으로 iSp18 기, 2'-O-메틸 우리딘 및 C3 기로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 S는 독립적으로 iSp18 기 및 C3 기로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 N은 동일한 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 상기 모이어티에서의 N 기는 상이하다. 일부 실시형태에서, 각각의 N 기는 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 N 기는 사이토신 및 티민으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시형태에서, 각각의 N 기는 티민 기이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -8-T-T-9-T-T-8-; -8-T-8-T-8-T-8-; -8-T-T-8-T-T-8-T-T-8-; -3-3-8-8-T-T-8-8-; -3-3-3-3-8-8-T-T-8-8-; -3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-8-; -3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-T-T-8-; -3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-T-T-8-; -3-3-3-T-T-8-T-T-8-T-T-8-; -3-3-3-T-T-8-T-T-8-; -3-T-T-8-T-T-8-T-T-8-; -T-T-3-3-T-T-3-3-3-3-8-; -3-T-T-3-3-T-T-3-3-3-8-; -3-3-T-T-3-3-T-T-3-3-8-; -3-3-3-3-T-T-3-3-T-T-8-; -T-T-3-3-3-T-T-3-3-3-8-; -T-T-8-T-T-3-3-3-3-3-8-; -3-T-T-8-T-T-3-3-3-3-8-; -3-3-T-T-8-T-T-3-3-3-8-; -3-3-3-T-T-8-T-T-3-3-8-; -3-3-3-3-T-T-8-T-T-3-8-; -3-3-3-T-T-3-3-T-T-9-; -3-3-3-T-T-mU-mU-mU-T-T-8-; -3-3-3-T-T-mU-mU-T-T-8-로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 3은 제1 스페이서이고, 8은 제2 스페이서이고, 9는 제3 스페이서이고, mU는 제4 스페이서이고; 통상적으로 3은 본원에 정의된 것과 같은 C3 스페이서이고, 8은 본원에 정의된 것과 같은 iSp18 스페이서이고, 9는 본원에 정의된 것과 같은 iSp9 스페이서이고, mU는 2'-O-메틸 우리딘이고; 각각의 N은 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 티민이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -8-8-N-N-8-8-; -8-N-8-N-8-N-8; -8-N-N-8-N-N-8-N-N-8-; -3-3-8-8-N-N-8-8-; -3-3-3-3-8-8-N-N-8-8-; -3-3-8-N-N-8-N-N-8-N-N-8-; -3-3-3-3-8-N-N-8-N-N-8-N-N-8-; 3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-8-; -3-3-3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-8-; -3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-N-N-8-; 및 -3-3-3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-N-N-8-로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 3은 제1 스페이서이고, 8은 제2 스페이서이고; 통상적으로 3은 본원에 정의된 것과 같은 C3 스페이서이고, 8은 본원에 정의된 것과 같은 iSp18 또는 iSp9 스페이서이고, 통상적으로 8은 본원에 정의된 것과 같은 iSp18 스페이서이고; 각각의 N은 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민으로부터 독립적으로 선택되고; 바람직하게는 티민이다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 88TTT88; 88mUmUmU88; 88/iBNA-T//iBNA-T//iBNA-T/88; 88T88; 8TT88; 88TT8; 8T8T8; 99TT9TT99; 8TT9TT8; 8TT3TT8; 8T8T8T8; 8TT8TT8TT8; 3388TT88; 333388TT88; 338TT8TT8TT8; 33338TT8TT8TT8; 338TT8TT838; 33338TT8TT838; 338TT8TT83TT8; 33338TT8TT83TT8; 8TT8TT8; TT8TT8; 3TT8TT8; 333TT8TT8TT8; 333TT8TT8; 3TT8TT8TT8; 33TT8TT8; 333TT8TT838; 33338TT8TT8; 333TT333333TT8; 333TT99TT8; 333TT9TT8; 333TT3TT8; 9TT8TT8; 99TT8TT8; 3333T8TT8; 3333TT8T8; 333T8TTT8; 333TTT8T8; 33TTT8TT8; 33TT8TTT8; 9TT99TT99; 333TT8TT9999; 333TT8TT999; 333TT8TT99; 333TT8TT9; TT3TT333338; 3TT3TT33338; 33TT3TT3338; 333TT3TT338; 3333TT3TT38; 33333TT3TT8; TT33TT33338; 3TT33TT3338; 33TT33TT338; 333TT33TT38; 3333TT33TT8; TT333TT3338; 3TT333TT338; 33TT333TT38; 333TT333TT8; TT3333TT338; 3TT3333TT38; 33TT3333TT8; TT33333TT38; 3TT33333TT8; TT333333TT8; TT8TT333338; 3TT8TT33338; 33TT8TT3338; 333TT8TT338; 3333TT8TT38; 33333TT8TT8; 333TT33TT8; 333TT33TT9; 333TTmUmUmUTT8; 333TTSpSpTT8; 333TTSpTT8; 9TT33TT99; 333TTmUmUTT8; 333TTrUTT8; 333TTrUrUTT8; 333TTrUrUrUTT8; 333TTrUrUrUrUTT8; 333TT33TTC12; 333TT33TTC6; mUmUmUTTmUmUTT8; mUmUmUTT33TT8; 333TT33TT88; 333TT33TT888; 333TT33TT8888; 333TT33TT99; 333TT33TT999; 333TT33TT9999; 333TT33TT333; 333TT33TT3333; 333TT33TT33333; 333TT33TT333333; 333TT33TT3333333; 및 333TT33TT33333333으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 88mUmUmU88; 88/iBNA-T//iBNA-T//iBNA-T/88; 88T88; 88TT88; 8TT88; 88TT8; 8T8T8; 8TT9TT8; 8TT3TT8; 8T8T8T8; 8TT8TT8TT8; 3388TT88; 333388TT88; 33338TT8TT838; 338TT8TT83TT8; 33338TT8TT83TT8; 8TT8TT8; TT8TT8; 3TT8TT8; 333TT8TT8TT8; 333TT8TT8; 3TT8TT8TT8; TT3TT333338; 3TT3TT33338; 33TT3TT3338; 333TT3TT338; 3333TT3TT38; 33333TT3TT8; TT33TT33338; 3TT33TT3338; 33TT33TT338; 3333TT33TT8; TT333TT3338; 3TT333TT338; 33TT333TT38; TT3333TT338; 3TT3333TT38; 33TT3333TT8; TT33333TT38; 3TT33333TT8; TT333333TT8; TT8TT333338; 3TT8TT33338; 33TT8TT3338; 333TT8TT338; 3333TT8TT38; 33333TT8TT8; 333TT33TT9; 333TTmUmUmUTT8; 333TTSpSpTT8; 333TTSpTT8; 333TTmUmUTT8; 및 333TT33TT8로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 -8-8-T-T-8-8-; -8-T-8-T-8-T-8; -8-T-T-8-T-T-8-T-T-8-; -3-3-8-8-T-T-8-8-; -3-3-3-3-8-8-T-T-8-8-; -3-3-8-T-T-8-T-T-8-T-T-8-; -3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-T-T-8-; 3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-8-; -3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-8-; -3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-T-T-8-; 및 -3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-T-T-8-로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있고; 3은 제1 스페이서이고, 8은 제2 스페이서이고; 통상적으로 3은 본원에 정의된 것과 같은 C3 스페이서이고, 8은 본원에 정의된 것과 같은 iSp18 또는 iSp9 스페이서이고, 통상적으로 8은 본원에 정의된 것과 같은 iSp18 스페이서이고; 각각의 T는 티민이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 하나 초과의 스페이서를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 2개 이상의 스페이서는 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 하나의 스페이서는 본원에 기술된 선형 분자 중 하나를 포함할 수 있고, 다른 스페이서는 하나 이상의 운동 단백질이 물리적으로 정지되게 하는 하나 이상의 화학 기를 포함할 수 있다. 스페이서는 본원에 기술된 임의의 선형 분자 및 하나 이상의 탈염기물 및 형광단과 같은 하나 이상의 운동 단백질이 물리적으로 정지하게 하는 하나 이상의 화학 기를 포함할 수 있다.
적합한 스페이서는 폴리뉴클레오타이드 어댑터, 운동 단백질 및 이 방법이 수행되는 조건의 성질에 따라 설계되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, 많은 운동 단백질은 DNA를 생체내 가공하고, 이러한 운동 단백질은 DNA이 아닌 어떤 것을 사용하여 통상적으로 정지될 수 있다.
유리 뉴클레오타이드 및/또는 연료 분자(운동 단백질에 대한 보인자)의 존재 하에 표적 폴리뉴클레오타이드의 특성평가가 대개 수행된다. 개시된 방법에서, 운동 단백질은 통상적으로 유리 뉴클레오타이드 및/또는 연료 분자(운동 단백질에 대한 보인자)의 존재 하에 스페이서로부터 이동하는 것이 방지된다. 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 유리 뉴클레오타이드 및/또는 연료 분자의 존재를 수반하지 않는 방법에 사용되면, 운동 단백질은 통상적으로 유리 뉴클레오타이드 및/또는 연료 분자의 부재 하에 스페이서로부터 이동하는 것이 방지된다. 이 실시형태에 상이한 스페이서가 사용될 수 있다. 예를 들어, 유리 뉴클레오타이드 및/또는 연료 분자가 존재하는 실시형태에서, 유리 뉴클레오타이드 및/또는 연료 분자가 존재하지 않는 실시형태와 비교하여 더 긴 스페이서가 유리하게 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 반응 조건에 존재하는 염 농도에 따라 개시된 방법에 따라 사용하기 위한 적합한 스페이서를 설계하거나 선택하는 것이 유리하다. 예를 들어, 나노기공과 관련된 폴리뉴클레오타이드 가닥의 이동에 의한 표적 폴리뉴클레오타이드 가닥의 특성평가를 포함하는 방법은 대개 비교적 높은 염 농도의 사용을 수반한다. 염 농도는 하나 이상의 운동 단백질을 정지시키는 하나 이상의 스페이서의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 사용된 염 농도가 더 높을수록, 통상적으로 사용된 하나 이상의 스페이서가 더 짧고, 그 반대도 같다.
특징들의 일부 특정 조합이 하기 표 1에 기재되어 있다.
Figure pct00003
다수의 운동 단백질의 사용을 수반하는 실시형태에서, 더 긴 스페이서가 유리할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은2개의 운동 단백질의 사용을 수반하는 실시형태에서, 적합한 스페이서는 약 1개 내지 약 25개의 상기 언급된 스페이서(예를 들어, iSp18 기, iSp9 기 및 C3 기로부터 선택된 약 1개 내지 약 25개의 기)를 포함할 수 있다.
차단 모이어티
일부 실시형태에서, 개시된 방법은 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것을 수반한다. 차단 모이어티는 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
차단 모이어티는 통상적으로 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드를 자연적으로 가공하는 것과 반대의 방향으로의 운동 단백질의 이동을 방지하는 모이어티이다. 예를 들어, 운동 단백질이 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 가닥을 자연적으로 가공하면, 적합한 차단 모이어티는 일부 실시형태에서 운동 단백질이 3'에서 5' 방향으로 이동하는 것을 방지하는 모이어티이다. 유사하게, 운동 단백질이 3'에서 5' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 가닥을 자연적으로 가공하면, 적합한 차단 모이어티는 일부 실시형태에서 운동 단백질이 5'에서 3' 방향으로 이동하는 것을 방지하는 모이어티이다.
개시된 방법에서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된다. 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 것은 운동 단백질의 이동을 물리적으로 방지하도록 입체 블록을 제공함으로써 달성될 수 있다. 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 것은 운동 단백질이 화학 차단 모이어티 위로 또는 이를 지나 이동할 수 없는 화학 차단 모이어티를 사용함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 본원에 기술된 스페이서 기의 하나 이상을 포함한다. 다른 실시형태에서, 차단 모이어티는 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함할 수 있다. 이는 하기에 더 자세히 기술된다.
개시된 방법에서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티를 스페이서에 인접한 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합함으로써 이것이 달성된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서와 인접한 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 차단 모이어티는 스페이서에 인접한 폴리뉴클레오타이드 가닥에 결합할 수 있다. 예를 들어, 차단 모이어티는 스페이서에 인접한 20개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 결합할 수 있다. 차단 모이어티는 스페이서에 인접한 10개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 결합할 수 있다. 차단 모이어티는 스페이서에 인접한 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 결합할 수 있다. 차단 모이어티는 스페이서에 인접한 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 다에 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티는 스페이서에 인접한 말단 뉴클레오타이드에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 스페이서와의 관계에서의 차단 기의 위치는 운동 단백질이 스페이서로부터 차단 모이어티가 결합된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 부분으로 이동할 수 없게 되는 것이다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 본원에 기재된 로딩 부위에 결합한다.
일부 실시형태에서 차단 모이어티는 단백질, 예컨대 단일 가닥 결합 단백질(SSB), 예컨대 이. 콜라이 단일 가닥 결합 단백질이다. 단백질은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합한다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 인터칼레이터(intercalator)이다. 임의의 적합한 인터칼레이터를 사용할 수 있다. 인터칼레이터는 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 폴리뉴클레오타이드 가닥을 삽입하고, 이에 따라 인터칼레이터를 지나는 운동 단백질의 이동을 방지한다. 일부 실시형태에서, 스페이서에 가깝게 인터칼레이터를 배치하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지할 수 있다. 일 실시형태에서, 인터칼레이터는 스페이서에 인접한 20개 중 2개의 뉴클레오타이드 사이에 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 인터칼레이터는 스페이서에 인접한 10개 중 2개의 뉴클레오타이드 사이에 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 인터칼레이터는 스페이서에 인접한 5개 중 2개의 뉴클레오타이드 사이에 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 인터칼레이터는 스페이서에 인접한 말단의 2개의 뉴클레오타이드 사이에 도입될 수 있다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 폴리뉴클레오타이드 가닥의 2차 구조를 포함한다. 예를 들어, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하기 위한 유사매듭과 같은 2차 구조를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 화학 태그를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학 태그는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드와 같은 기에 부착될 수 있다. 적합한 태그의 예는 비오틴, 선택 가능한 폴리뉴클레오타이드 서열, 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 ScSv, 항원, 폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 폴리 히스티딘 꼬리 및 GST 태그를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비오틴은 스트렙타비딘과 같은 아비딘에 특이적으로 결합한다. 스트렙타비딘과 같은 아비딘에 결합된 비오틴 기는 운동 단백질의 이동을 방지할 것이다. 일부 실시형태에서, 스트렙타비딘과 같은 아비딘에 결합된 비오틴 기는 당해 비오틴 기를 지나는 운동 단백질의 이동을 방지할 것이다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 혼성화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 20개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 30개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 1개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 1개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위; 예컨대 약 1개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 단위; 예를 들어 약 1개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 1개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 2개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위; 예컨대 약 2개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 단위; 예를 들어 약 2개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 2개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
당업자는 차단 모이어티가 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 때 차단 모이어티 폴리뉴클레오타이드의 서열이 통상적으로 결정적이지 않고 어댑터 및 운동 단백질 및 다른 실험 조건에 따라 제어되거나 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 서열은 실시예에서 오로지 예시에 의해 제공된다. 예를 들어, 차단 모이어티는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열 번호 19 또는 서열 번호 19와 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 차단 모이어티는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열 번호 10 또는 서열 번호 10과 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 차단 모이어티는 서열 번호 10 또는 서열 번호 19에 상응하고 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개의 뉴클레오타이드 치환을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 당업자는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 데 있어서 차단 모이어티의 기능이 어댑터의 서열과 적합하도록 선택된 차단 모이어티에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 차단 모이어티의 구조가 변경될 수 있고, 단 차단 모이어티는 (예를 들어, 혼성화에 의해) 어댑터에 부착하고 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지할 수 있다.
때때로, 차단 모이어티 폴리뉴클레오타이드가 스페이서의 영역에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 혼성화하고 이에 따라 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지할 수 있도록 차단 모이어티 어댑터는 (예를 들어, 스페이서의 약 20개의 뉴클레오타이드 내에, 예컨대 스페이서의 약 10개의 뉴클레오타이드 내에, 예를 들어 스페이서의 약 5개의 뉴클레오타이드 내에, 예컨대 스페이서의 2개, 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드 내에) 스페이서의 영역에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 서열에 상보성인 서열을 갖는다.
폴리뉴클레오타이드 어댑터에 예를 들어 혼성화에 의해 부착할 수 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 차단 모이어티는 또한 "트랩 가닥"으로 지칭될 수 있다. 트랩 가닥은 스페이서 상에 운동 단백질을 포획한다. 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 대한 트랩 가닥의 부착은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 서열, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서에 가깝거나 인접한 서열에 대한 예를 들어 혼성화에 의해 트랩 가닥을 부착하는 것을 포함할 수 있다.
차단 모이어티를 포함하는 생성된 어댑터가 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드일 수 있도록 통상적으로 차단 모이어티 또는 트랩 가닥이 예를 들어 혼성화에 의해 부착하는 서열은 단일 가닥 서열이다. 당업자는 이와 같이 어댑터가 스페이서에 부착된 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 영역을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이고; 이러한 실시형태에서 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 차단하고, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 하나의 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 하나의 가닥의 부분은 트랩 가닥을 포함한다. 이는 실시예에 더 기술된다.
여기에 더 자세히 설명된 것처럼, 일부 실시형태에서 운동 단백질이 스페이서 모이어티 상에 배치되면 차단 모이어티는 존재한다면 어댑터에 결합된다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 존재한다면 운동 단백질이 스페이서 단위 상에 배치되기 전에 어댑터에 결합된다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질이 본원에 기재된 것과 같은 하나 이상의 뉴클레오타이드 섬을 포함하는 스페이서 단위 상에 배치되기 전에 차단 모이어티는 어댑터에 결합된다.
로딩 부위
상기 기술된 것처럼, 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함한다. 로딩 부위는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하기 위한 부위이다.
일 실시형태에서, 로딩 부위는 중합체와 같은 선형 분자이다. 일부 실시형태에서, 로딩 부위는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), 글리세롤 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 잠금 핵산(LNA) 또는 뉴클레오타이드 측쇄와의 합성 중합체를 포함할 수 있다. 로딩 부위는 PEG와 같은 중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위와 맞물린다. 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위)와 접촉하고 폴리뉴클레오타이드 어댑터와 회합하면, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위)와 맞물릴 수 있다. 예를 들어, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합함으로써, 또는 이것이 맞물리는 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 부분 주위에 복합체를 형성하지만 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하지 않음으로써 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 로딩 부위)에 회합할 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 운동 단백질이 DNA 가공 효소이고 로딩 부위가 DNA가 아닌 선형 분자를 포함하면(예를 들어, 로딩 부위는 RNA, PNA, GNA, TNA, LNA 또는 PEG 등을 포함함), 운동 단백질은 로딩 부위에 결합하지 않으면서 이것과 회합할 수 있다(이것과 맞물릴 수 있다). 다른 한편, 로딩 부위가 DNA를 포함하면, 운동 단백질은 로딩 부위에 결합함으로써 로딩 부위와 맞물릴 수 있다. 유사하게, 운동 단백질이 RNA 가공 효소이고 로딩 부위가 RNA가 아닌 선형 분자를 포함하면(예를 들어, 로딩 부위는 DNA, PNA, GNA, TNA, LNA 또는 PEG 등을 포함함), 운동 단백질은 로딩 부위에 결합하지 않으면서 이것과 회합할 수 있다(이것과 맞물릴 수 있다). 다른 한편, 로딩 부위가 RNA를 포함하면, 운동 단백질은 로딩 부위에 결합함으로써 로딩 부위와 맞물릴 수 있다. 물론, 일부 실시형태에서 운동 단백질은 운동 단백질에 대한 자연 기질을 포함하지 않는 로딩 부위에 결합할 수 있다(예를 들어, DNA 결합 효소는 일부 실시형태에서 DNA 이외의 선형 분자 등을 포함하는 로딩 부위에 결합할 수 있다).
따라서, 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위에 결합한다.
개시된 방법의 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 본원에 기재된 차단 모이어티는 로딩 부위에 결합한다. 여기에 더 자세히 설명된 것처럼, 차단 모이어티가 로딩 부위에 결합하면, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 로딩 부위로 이동하는 것을 방지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 로딩 부위는 스페이서와 인접하다. 바꾸어 말하면, 로딩 부위는 스페이서에 직접 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 로딩 부위는 스페이서와 인접하고, 차단 모이어티는 스페이서에 바로 인접한 로딩 부위에 결합한다. 명확한 것처럼, 일부 실시형태에서 차단 모이어티를 스페이서에 바로 인접한 로딩 부위에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 폴리뉴클레오타이드 어댑터로 이동하는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티를 스페이서에 바로 인접한 로딩 부위에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 로딩 부위로 이동하는 것을 방지한다.
예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함할 수 있고, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질은 로딩 부위에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하고, 로딩 부위로부터 스페이서로 진행할 수 있다. 차단 모이어티는 (예를 들어, 상기 기재된 것처럼) 로딩 부위에 결합할 수 있다. 차단 모이어티를 로딩 부위에 결합하는 것은 운동 단백질이 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드로 다시 이동하는 것을 방지할 수 있다.
일부 실시형태에서, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 가닥은 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 가닥의 오버행 영역을 포함할 수 있다. 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드는 상기 더 자세히 기재된 것처럼 예를 들어 Y형상 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 차단 모이어티는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; (ii) 차단 모이어티를 로딩 부위에 결합하는 것은 차단 모이어티를 로딩 부위에 혼성화하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 로딩 부위는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서 로딩 부위는 길이가 약 2개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 20개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 30개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서 로딩 부위는 길이가 약 1개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 1개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위; 예컨대 약 1개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 단위; 예를 들어 약 1개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 1개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서 로딩 부위는 길이가 약 2개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 2개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위; 예컨대 약 2개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 단위; 예를 들어 약 2개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 2개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 단위의 길이인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 20개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 30개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 1개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 1개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 1개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위; 예컨대 약 1개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 단위; 예를 들어 약 1개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 1개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 2개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 70개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 2개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위; 예컨대 약 2개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 단위; 예를 들어 약 2개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 2개 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 로딩 부위는 차단 모이어티의 서열에 상보성인 서열을 갖는다.
당업자는 로딩 부위의 서열이 통상적으로 결정적이 아니고 어댑터 및 운동 단백질 및 다른 실험 조건에 따라 제어되거나 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 서열은 실시예에서 오로지 예시에 의해 제공된다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 당업자는 운동 단백질을 스페이서에 로딩하는 것을 촉진하는 데 있어서의 로딩 부위의 기능이 이 방법에서 사용된 어댑터 및 운동 단백질과 적합하도록 선택된 로딩 부위에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같이, 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행할 수 있다는 조건에서, 로딩 부위의 서열을 변경할 수 있다.
일부 실시형태에서, 로딩 부위 및 차단 모이어티의 골격은 동일하다(예를 들어, 로딩 부위 및 차단 모이어티 둘 다는 DNA 골격, RNA 골격 등을 갖는다). 다른 실시형태에서, 로딩 부위 및 차단 모이어티의 골격은 상이하다(예를 들어, 로딩 부위는 DNA 골격을 가질 수 있고, 차단 모이어티는 RNA 골격을 갖거나, 로딩 부위는 RNA 골격을 가질 수 있고, 차단 모이어티는 DNA 골격 등을 갖는다).
일부 실시형태에서, 차단 모이어티를 로딩 부위에 혼성화하는 것은 스페이서에 인접한 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 영역을 생성한다. 이러한 영역은 통상적으로 운동 단백질이 스페이서로부터 차단 모이어티에 혼성화된 로딩 부위의 영역으로 이동하는 것을 방지한다. 예를 들어, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 차단 모이어티는 스페이서와 인접한 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 영역을 생성하도록 스페이서와 인접한 말단 뉴클레오타이드에서 결합할 수 있다.
로딩 가닥
일부 실시형태에서, 운동 단백질은 로딩 가닥을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 로딩된다. 일부 실시형태에서, 특히 오직 하나의 운동 단백질이 단일 어댑터에 로딩되는 것이 바람직한 본원에 제공된 방법의 실시형태에서 로딩 가닥은 운동 단백질 로딩의 효율을 개선한다. 일부 실시형태에서, 로딩 가닥은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서에 인접한(또는 이의 근처의, 예컨대 이의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 내의) 어댑터의 서열에 상보성인 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 로딩 가닥은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 서열에 상보성이 아닌 부분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 로딩 가닥은 어댑터의 서열에 상보성이고 이와 같이 스페이서의 근처의(예를 들어, 이에 인접한) 어댑터에 혼성화하는 부분; 및 어댑터 서열에 상보성이 아닌, 따라서 어댑터에 혼성화하지 않는 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 어댑터에 혼성화하지 않는 부분은 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 것이 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질은 혼성화된 로딩 가닥/어댑터 복합체를 가공하고, 이렇게 하는 데 있어서 스페이서로 가공하도록 된다. 일부 실시형태에서, 스페이서로의 운동 단백질의 가공은 폴리뉴클레오타이드 어댑터로부터의 로딩 가닥을 변위시킨다. 일부 실시형태에서, 어댑터로부터의 로딩 가닥의 변위는 후속하는 어댑터로의 운동 단백질의 로딩을 방지한다.
일부 실시형태에서, 로딩 가닥은 길이가 약 2개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 5 및 약 100개의 뉴클레오타이드 단위, 예컨대 약 10개 내지 약 60개의 뉴클레오타이드 단위, 예를 들어 약 20개 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 단위이다.
당업자는 로딩 가닥의 서열이 통상적으로 결정적이 아니고 어댑터 및 운동 단백질 및 다른 실험 조건에 따라 제어되거나 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예시적인 서열은 실시예에서 오로지 예시로만 제공된다. 예를 들어, 로딩 가닥은 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열 번호 18 또는 서열 번호 18과 적어도 20%, 예컨대 적어도 30%, 예를 들어 적어도 40%, 예컨대 적어도 50%, 예를 들어 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 당업자는 운동 단백질을 스페이서에 로딩하는 것을 촉진하는 데 있어서의 로딩 가닥의 기능이 이 방법에서 사용된 어댑터 및 운동 단백질과 적합하도록 선택된 로딩 가닥에 의해 달성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같이, 운동 단백질이 로딩 가닥으로부터 스페이서로 진행할 수 있다는 조건에서, 로딩 가닥의 서열을 변경할 수 있다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 변위된 로딩 가닥 대신에 스페이서의 근처의(예를 들어, 스페이서에 인접한) 어댑터에 부착된다. 차단 모이어티는 변위된 로딩 가닥 대신에 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 예를 들어 혼성화에 의해 부착할 수 있는 예를 들어 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드(즉, 차단 가닥)일 수 있다.
운동 단백질이 스페이서로 진행하도록 로딩 가닥이 사용되고 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하도록 차단 가닥이 사용된 일부 실시형태에서, 차단 가닥은 로딩 가닥보다 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 더 강하게 결합할 수 있다. 예를 들어, 차단 가닥은 로딩 가닥보다 긴 길이를 가질 수 있고, 따라서 로딩 가닥보다 더 강하게 혼성화한다. 일부 실시형태에서, 차단 가닥은 과량의 로딩 가닥에서의 농도로 제공된다. 과량의 차단 가닥을 제공함으로써 변위된 로딩 가닥의 재어닐링이 감소되거나 방지되어서 폴리뉴클레오타이드 어댑터에서의 운동 단백질의 수가 제어되게 한다. 예를 들어, 차단 가닥은 로딩 가닥의 적어도 2x, 예컨대 적어도 5x, 예를 들어 적어도 10x, 예컨대 적어도 20x, 예를 들어 적어도 50x 또는 적어도 100x 농도의 농도로 존재할 수 있다.
운동 단백질의 스페이서로의 진행
본원에 더 자세히 기술된 것처럼, 본원에 제공된 방법은 어댑터에 포함된 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 것을 포함한다.
본원에 더 자세히 기술된 것처럼, 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 것은 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서로 진행하게 한다.
일부 실시형태에서, 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 하는 것은 로딩 부위로부터 스페이서로 통과시키는 추동력을 운동 단백질에 제공하는 것을 포함한다. 임의의 적합한 추동력을 사용할 수 있다.
통상적으로 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 로딩 부위)로부터 스페이서로 진행하게 하는 에너지 장벽이 있다. 에너지 장벽은 선형 분자의 화학 조성의 변경으로부터 생길 수 있으며, 이 선형 분자를 따라 운동 단백질이 진행한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 변경은 로딩 부위의 폴리뉴클레오타이드 골격에서 스페이서의 비폴리뉴클레오타이드 골격으로일 수 있다. 다른 실시형태에서, 에너지 장벽은 로딩 부위의 DNA 또는 RNA 골격에서 탈염기성 스페이서로의 변경으로부터 생길 수 있다. 에너지 장벽의 통상적인 존재는 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 로딩 부위)로부터 스페이서로 진행하게 하는 데 추동력이 대개 필요하다는 것을 의미한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것은 운동 단백질에 물리적 힘 또는 화학적 힘을 가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것은 운동 단백질을 하나 이상의 연료 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질을 스페이서 상으로 "떠미는(push)" 제2 운동 단백질에 의해 힘이 가해진다. 바꾸어 말하면, 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고; 운동 단백질은 제1 운동 단백질이고, 제1 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 하는 것은 로딩 부위에 제2 운동 단백질을 로딩하는 것 및 제2 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서 쪽으로 진행하게 하는 것을 포함하고, 제2 운동 단백질은 제1 운동 단백질을 스페이서 상으로 민다.
다른 실시형태에서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질을 스페이서 상으로 민다. 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 로딩 부위)에 결합하는 것은 운동 단백질을 스페이서 상으로 미는 에너지 장벽을 극복하기에 충분히 양호할 수 있다.
다른 실시형태에서, 운동 단백질은 차단 모이어티가 어댑터에 결합되기 전에 또는 결합된 후에 스페이서 상에 배치된다. 예를 들어, 운동 단백질은 스페이서 상에 배치될 수 있고, 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질은 스페이서 및 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하는 어댑터 상에 배치될 수 있다. 운동 단백질은 임의의 적합한 수단에 의해 어댑터 상에 배치될 수 있다. 예를 들어, 운동 단백질은 스페이서 내의 소정의 위치에서 우선적으로 국재화할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 운동 단백질은 스페이서 내의 뉴클레오타이드 섬에 결합할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 것은 운동 단백질을 스페이서에 포함된 뉴클레오타이드 섬과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
이러한 실시형태에서, 운동 단백질은 예를 들어 스페이서로부터 이동함으로써 이것이 스페이서로부터 분리하는 것을 방지하기 위해 통상적으로 변형된다. 운동 단백질은 스페이서 상에 배치되기 전에 또는 배치된 후에 변형될 수 있다. 통상적으로 운동 단백질은 스페이서 상에 배치된 후 변형된다. 운동 단백질의 변형은 본원에 더 자세히 기재되어 있다.
개시된 방법의 일부 실시형태가 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터로부터 스페이서로 진행하게 하는 것을 수반한다는 것이 상기 기술로부터 명확할 것이다.
일부 실시형태에서, 운동 단백질이 스페이서 상에 있을 때 스페이서는 운동 단백질의 활성 부위를 점유한다. 일부 실시형태에서, 활성 부위는 스페이서에 의해 부분적으로 점유된다. 다른 실시형태에서, 활성 부위는 스페이서에 의해 전부 점유된다. 활성 부위는 운동 단백질에 의한 연료 분자의 변환에 영향을 미치기에 충분한 정도로 점유될 수 있다. 통상적으로, 본원에 사용된 것처럼, 운동 단백질의 활성 부위는 운동 단백질에서의 폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트를 지칭한다. 당업자는 운동 단백질의 ATP 결합 부위가 폴리뉴클레오타이드 어댑터와 구별될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이와 같이, 일부 실시형태에서, 운동 단백질의 폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트는 스페이서에 의해 점유되고, 운동 단백질의 ATP 결합 부위는 스페이서에 의해 점유되지 않는다. 다른 실시형태에서, 운동 단백질의 폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트 및 ATP 결합 부위 둘 다는 스페이서에 의해 점유된다. 이와 같이, 운동 단백질의 폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트는 스페이서에 의해 점유될 수 있고, 운동 단백질의 ATP 결합 부위는 스페이서에 의해 폐색되거나 차단될 수 있거나, ATP에 접근 가능할 수 있다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 운동 단백질은 스페이서 상에 여전히 정지될 수 있고, ATP 결합 부위가 접근 가능하더라도 무용한 변환에서 맞물리지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 ATP 가수분해는 운동 단백질의 폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트에 대한 폴리뉴클레오타이드 결합에 의해 유도된 운동 단백질에서의 입체형태 변화를 요한다. 폴리뉴클레오타이드 결합 클레프트가 폴리뉴클레오타이드에 접근 불가능하도록 스페이서 상에 정지될 때, 이러한 입체형태 변화가 발생하지 않고, 무용한 변환이 감소되거나 제거된다.
일부 실시형태에서, 스페이서는 운동 단백질의 풋프린트의 전체 또는 일부에 걸친다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 운동 단백질의 전체 풋프린트에 걸치고, 운동 단백질의 활성 부위를 점유한다. 바꾸어 말하면, 일부 실시형태에서 운동 단백질은 스페이서 상에 전체로 있도록 스페이서로 진행한다.
당업자는 본원에 정의된 것과 같이 스페이서 상에 정지된 운동 단백질과 단순히 스페이서에 가깝게, 예를 들어 스페이서에 인접하게 정지된 운동 단백질 사이에 상당한 차이가 있다는 것을 이해할 것이다. 운동 단백질이 단지 스페이서에 인접하거나 오직 적은 양에 의해 스페이서에 결치면 무용한 변환이 반드시 방지되지는 않을 것이다. 운동 단백질이 스페이서로부터 이 정도로 이동하게 하는 것은 운동 단백질이 본 청구항에 정의된 것과 같이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 것에 상응하지 않는다. 운동 단백질과 스페이서 사이의 약간의 중첩으로 인해 스페이서 "상에" 있지만 이것이 폴리뉴클레오타이드에 결합될 때와 실질적으로 동일한 속도로 연료 분자를 변환시키는 것이 방지되지 않는 운동 단백질은 본원에 사용된 것과 같이 스페이서에 있지 않다.
따라서, 일부 실시형태에서, 스페이서가 운동 단백질의 활성 부위를 점유할 때 운동 단백질에 의한 연료 분자의 변환이 감소한다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질에 의한 연료 분자의 변환은 제거된다.
운동 단백질
당업자가 이해하는 것처럼, 임의의 적합한 운동 단백질은 본원에 제공된 방법 및 생성물에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드에 결합하고 나노기공과 관련된, 예를 들어 기공을 통한 이의 이동을 제어할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다.
일 실시형태에서, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 취급 효소이거나 이로부터 유래된다. 폴리뉴클레오타이드 취급 효소는 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하고 이의 적어도 하나의 특성을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드이다. 효소는 개별 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 더 짧은 사슬, 예컨대 디뉴클레오타이드 또는 트리뉴클레오타이드를 형성하도록 폴리뉴클레오타이드를 절단함으로써 이를 변형시킬 수 있다. 효소는 이것을 배향함으로써 또는 이것을 특정 위치로 이동시킴으로써 폴리뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있다.
일 실시형태에서, 운동 단백질은 임의의 효소 분류(EC) 그룹 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 및 3.1.31의 구성원으로부터 유래된다.
통상적으로, 운동 단백질은 헬리카제, 중합효소, 엑소뉴클레아제, 토포아이소머라제, 또는 이들의 변이체이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상의 운동 단백질은 운동 단백질이 (스페이서의 말단으로부터 통과하는 것 이외에) 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 변형된다. 운동 단백질은 임의의 적합한 방식으로 적응될 수 있다. 예를 들어, 운동 단백질은 어댑터에 로딩되고, 이후 이것이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 운동 단백질은 이것이 어댑터에 로딩되기 전에 이것이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 변형될 수 있다. 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하기 위한 운동 단백질의 변형은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 국제공개 WO 2014/013260호에 기술된 것을 사용하여 헬리카제와 같은 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 가닥과 이탈하는 것을 방지하기 위해 운동 단백질의 변형을 기술하는 문장과 특별히 관련하여 달성될 수 있고, 이는 본원에 의해 그 전체가 인용되어 포함된다. 예를 들어, 운동 단백질은 테트라메틸아조디카복사미드(TMAD)에 의해 처리하여 변형될 수 있다.
예를 들어, 운동 단백질은 운동 단백질이 가닥로부터 이탈할 때 폴리뉴클레오타이드 가닥이 통과할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구; 예를 들어 공동, 클레프트 또는 보이드를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구는 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈할 때 스페이서가 통과할 수 있는 개구이다. 일부 실시형태에서, 주어진 운동 단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구는 이의 구조와 관련하여, 예를 들어 이의 X선 결정 구조와 관련하여 결정될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 기질의 존재 및/또는 부재 하에 X선 결정 구조를 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 주어진 운동 단백질에서의 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구의 위치는 당해 분야에 공지된 표준 패키지를 사용하여 분자 모델링에 의해 추정되거나 확인될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구는 하나 이상의 부분, 예를 들어 운동 단백질의 하나 이상의 도메인의 이동에 의해 일시적으로 제조될 수 있다.
운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구를 폐쇄하여 변형될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구의 폐쇄는 따라서 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지할 수 있다. 예를 들어, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 비결합 개구를 공유 폐쇄하여 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 방식으로 해결하기 위한 바람직한 운동 단백질은 헬리카제이다.
일 실시형태에서, 운동 단백질은 엑소뉴클레아제이다. 적합한 효소는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I(서열 번호 1), 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소(서열 번호 2), 티. 써모필루스로부터의 RecJ(서열 번호 3) 및 박테리오파지 람다엑소뉴클레아제(서열 번호 4), TatD 엑소뉴클레아제 및 이들의 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 서열 번호 3에 기재된 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 3개의 하위단위는 삼합체 엑소뉴클레아제를 형성하도록 상호작용한다.
일 실시형태에서, 운동 단백질은 중합효소이다. 중합효소는 PyroPhage® 3173 DNA 중합효소(Lucigen® Corporation으로부터 상업적으로 입수 가능), SD 중합효소(Bioron®으로부터 상업적으로 입수 가능), NEB로부터의 Klenow 또는 이들의 변이체일 수 있다. 일 실시형태에서, 효소는 Phi29 DNA 중합효소(서열 번호 5) 또는 이의 변이체이다. 본 발명에 사용될 수 있는 Phi29 중합효소의 변형된 버전은 미국 특허 제5,576,204호에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 운동 단백질은 토포아이소머라제이다. 일 실시형태에서, 토포아이소머라제는 임의의 모이어티 분류(EC) 그룹 5.99.1.2 및 5.99.1.3의 구성원이다. 토포아이소머라제는 RNA 주형으로부터 cDNA의 형성을 촉매화할 수 있는 효소인 역전사효소일 수 있다. 이들은 예를 들어 New England Biolabs® 및 Invitrogen®으로부터 상업적으로 입수 가능하다.
일 실시형태에서, 운동 단백질은 헬리카제이다. 임의의 적합한 헬리카제는 본원에 제공된 방법에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용데 따라 사용된 각각의 운동 단백질은 Hel308 헬리카제, RecD 헬리카제, TraI 헬리카제, TrwC 헬리카제, XPD 헬리카제 및 Dda 헬리카제, 또는 이들의 변이체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 단량체 헬리카제는 함께 부착된 몇몇 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, TraI 헬리카제 및 TraI sub그룹 헬리카제는 렐락사제 도메인 및 C 말단 도메인인 2개의 RecD 헬리카제 도메인을 함유할 수 있다. 도메인은 통상적으로 올리고머를 형성함이 없이 작용할 수 있는 단량체 헬리카제를 형성한다. 적합한 헬리카제의 특정 예는 Hel308, NS3, Dda, UvrD, Rep, PcrA, Pif1 및 TraI를 포함한다. 이 헬리카제는 통상적으로 단일 가닥 DNA에서 작용한다. 이중 가닥 DNA의 가닥 둘 다를 따라 이동할 수 있는 헬리카제의 예는 FtfK 및 육합체 효소 복합체, 또는 다중하위단위 복합체, 예컨대 RecBCD를 포함한다.
Hel308 헬리카제는 국제공개 WO 2013/057495호와 같은 공보에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 인용되어 포함된다. RecD 헬리카제는 국제공개 WO 2013/098562호와 같은 공보에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 인용되어 포함된다. XPD 헬리카제는 국제공개 WO 2013/098561호와 같은 공보에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 인용되어 포함된다. Dda 헬리카제는 국제공개 WO 2015/055981호 및 국제공개 WO 2016/055777호와 같은 공보에 기재되어 있고, 이들의 각각의 전체 내용은 인용되어 포함된다.
일 실시형태에서, 헬리카제는 서열 번호 6에 기재된 서열(Trwc Cba) 또는 이의 변이체, 서열 번호 7에 기재된 서열(Hel308 Mbu) 또는 이의 변이체 또는 서열 번호 8에 기재된 서열(Dda) 또는 이의 변이체를 포함한다. 변이체는 본원에 기술된 임의의 방식으로 자연적 서열과 다를 수 있다. 서열 번호 8의 예시적인 변이체는 E94C/A360C를 포함한다. 서열 번호 8의 추가의 예시적인 변이체는 E94C/A360C 및 이후 (ΔM1)G1G2(즉, M1의 결실 및 이후 G1 및 G2의 부가)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 운동 단백질(예를 들어, 헬리카제)은 적어도 2개의 조작 활성 방식(운동 단백질에 이동을 용이하게 하는 모든 필요한 성분, 예를 들어 연료 및 보인자, 예컨대 본원에 기술된 ATP 및 Mg2+가 제공될 때) 및 하나의 조작 불활성 방식(운동 단백질에 이동을 용이하게 하는 필요한 성분이 제공되지 않을 때)으로 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있다.
(즉, 활성 방식의) 이동을 용이하게 하도록 모든 필요한 성분이 제공될 때, 운동 단백질(예를 들어, 헬리카제)은 (운동 단백질에 따라) 5'에서 3'으로 또는 3'에서 5' 방향으로 폴리뉴클레오타이드를 따라 이동한다. 운동 단백질이 나노기공과 관련된 폴리뉴클레오타이드 가닥의 이동을 제어하도록 사용된 실시형태에서, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드를 (예를 들어, 인가된 장에 대항하여) 기공에서 멀리(예를 들어, 기공으로부터) 또는 (예를 들어, 인가된 장에 의해) 기공을 향해(예를 들어, 기공으로) 이동시키도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 운동 단백질이 이동하는 폴리뉴클레오타이드의 말단이 기공에 의해 포획될 때, 운동 단백질은 인가된 전위로부터 생긴 장의 방향에 대항하여 작용하고, 트레딩된 폴리뉴클레오타이드를 기공으로부터(예를 들어, 시스 챔버로) 당긴다. 그러나, 운동 단백질이 이동하는 말단이 기공에 포획될 때, 운동 단백질은 인가된 전위로부터 생긴 장의 방향에 따라 작용하고 트레딩된 폴리뉴클레오타이드를 기공 안으로(예를 들어, 트랜스 챔버로) 떠민다.
운동 단백질(예를 들어, 헬리카제)에 이동을 용이하게 하는 필요한 성분이 제공되지 않을 때(즉, 불활성 방식), 이것은 폴리뉴클레오타이드에 결합하고, 예를 들어 인가된 전위로부터 생긴 장에 의해 기공으로 밀림으로써 나노기공과 관련하여 폴리뉴클레오타이드가 이동될 때 이것의 이동을 느리게 하는 브레이크로서 작용할 수 있다. 불활성 방식에서, 이것은 폴리뉴클레오타이드의 말단이 포획된 물질이 아니고, 이것은 기공과 관련된 폴리뉴클레오타이드의 이동을 결정하는 인가된 장이고, 운동 단백질은 브레이크로서 작용한다. 운동 단백질에 의한 폴리뉴클레오타이드의 이동 제어는 불활성 모드에 있을 때 라체팅, 슬라이딩 및 브레이킹을 포함하는 다수의 방식으로 기재될 수 있다.
상기 기술된 것처럼, 본원에 개시된 방법은 무용한 변환의 개념을 감소시킬 수 있다. 변환은 운동 단백질에 의한 연료 분자의 화학(효소) 전환이다.
연료는 통상적으로 뉴클레오타이드가 없거나 뉴클레오타이드 유사체가 없다. 유리 뉴클레오타이드는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP), 데옥시시티딘 모노포스페이트(dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트(dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP) 중 하나 이상일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유리 뉴클레오타이드는 보통 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다. 유리 뉴클레오타이드는 통상적으로 아데노신 트리포스페이트(ATP)이다.
운동 단백질에 대한 보인자는 운동 단백질이 기능하게 하는 인자이다. 보인자는 바람직하게는 2가 금속 양이온이다. 2가 금속 양이온은 바람직하게는 Mg2+, Mn2+, Ca2+ 또는 Co2+이다. 보인자는 가장 바람직하게는 Mg2+이다.
과량의 운동 단백질의 제거
일부 실시형태에서, 제공된 방법은 스페이서 상에 배치되지 않은 과량의 운동 단백질 분자를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 과량의 운동 단백질의 제거는 스트레스 단계라 칭해질 수 있다. 스트레스 단계는 폴리뉴클레오타이드 어댑터로부터 부정확하게 결합된 운동 단백질을 제거하도록 사용될 수 있다. 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하기 위해 운동 단백질을 변형시키는 것을 포함하는 제공된 방법의 실시형태에서, 스트레스 단계는 정확하게 변형되지 않은 운동 단백질을 제거하도록 사용될 수 있다.
본원에 기재된 것과 같은 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지되지 않은 비결합된 운동 단백질의 존재를 감소시키거나 배제하기 위해 과량의 운동 단백질의 제거가 유리하다. 비정지된 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 가닥과 맞물릴 수 있고/있거나 존재하는 연료 분자를 소모할 수 있고, 즉 무용한 변환에서 맞물릴 수 있다. 과량의 운동 단백질의 제거는 비정지된 운동 단백질에서 이 무용한 변환을 감소시키거나 방지하고 따라서 연료 분자의 비생산적 소모를 감소시킨다.
비결합된 운동 단백질은 임의의 적합한 방식으로 (예를 들어, 스트레스 단계에서) 제거될 수 있다. 예를 들어, 비결합된 운동 단백질은 세척 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 비결합된 운동 단백질은 고염 세척 완충액을 사용하여 제거될 수 있다. 비결합된 운동 단백질은 이의 제거를 촉진하는 특정 pH 또는 온도 조건을 사용하여 제거될 수 있다. 예를 들어, 스트레스 조건은 ATP와 같은 연료의 존재 하에 예를 들어 고염 농도를 포함할 수 있다.
운동 단백질의 스페이서로부터의 진행
본원에 더 자세히 기술된 것처럼, 일부 실시형태에서 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하기 위한 이의 사용 전에 운동 단백질을 정지시키는 데 유용하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 개시된 어댑터는 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하기 위한 운동 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동은 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 데 유용하다.
본원에 더 자세히 기술된 것처럼, 개시된 방법은 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시키는 것을 수반한다. 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 폴리뉴클레오타이드 어댑터로 이동하는 것, 예를 들어 스페이서로부터 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위로 이동하는 것을 방지한다.
통상적으로, 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하도록, 운동 단백질이 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하기 위한 에너지 장벽이 있다. 에너지 장벽은 선형 분자의 화학 조성의 변경으로부터 생길 수 있으며, 이 선형 분자를 따라 운동 단백질이 진행한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 변경은 스페이서의 비폴리뉴클레오타이드 골격에서 표적 폴리뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드 골격으로일 수 있다. 다른 실시형태에서, 에너지 장벽은 염기성 스페이서에서 표적 폴리뉴클레오타이드의 DNA 또는 RNA 골격으로의 변경으로부터 생길 수 있다. 에너지 장벽의 통상적인 존재는 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터(예를 들어, 스페이서)로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하게 하는 데 추동력이 대개 필요하다는 것을 의미한다.
따라서 일부 실시형태에서, 운동 단백질이 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하게 하는 것은, 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드 상으로 통과하는 추동력을 운동 단백질에 제공하는 것을 포함한다. 임의의 적합한 추동력을 사용할 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 추동력은 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 나노기공과 접촉시켜 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 나노기공은 폴리뉴클레오타이드 어댑터와 맞물리고, 운동 단백질을 표적 폴리뉴클레오타이드 상으로 민다.
더 자세히, 일부 실시형태에서 운동 단백질이 이의 스페이서 상에 정지된 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되게 하는 조건 하에 표적 폴리뉴클레오타이드와 접촉한다. 예를 들어, 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드 어댑터, 예를 들어 표적 폴리뉴클레오타이드의 말단에 결찰될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 나노기공과 맞물리도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터-표적 폴리뉴클레오타이드 접합체는 나노기공과 접촉할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 나노기공을 통해 트레딩될 수 있다. 나노기공과 관련된(예를 들어, 나노기공을 통한) 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 이동은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 정지된 운동 단백질에 힘을 제공할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 인가된 전위의 영향 하에 나노기공을 통해 트레딩된 실시형태에서, 운동 단백질이 나노기공에 접근하거나 이것과 접촉하면서 운동 단백질 상의 나노기공에 의해 인가된 힘은 운동 단백질을 표적 폴리뉴클레오타이드 상으로 밀기에 충분하다. 이러한 실시형태에서, 나노기공은 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상으로 운동 단백질을 "떠미는" 것으로 간주될 수 있다. 이러한 실시형태는 (비제한적인 예로서) 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 (i) 로딩 부위와 (ii) 표적 폴리뉴클레오타이드에 결찰되거나 달리 부착될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 가닥 사이에 배치된 스페이서를 포함하는 본 개시내용의 실시형태에 특히 적합하다.
다른 실시형태에서, 운동 단백질을 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하게 하는 데 필요한 힘은 물리적 힘 또는 화학적 힘을 운동 단백질에 가하여 제공된다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질이 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하게 하는 것은 운동 단백질을 하나 이상의 연료 분자와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 운동 단백질을 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드 상으로 "떠미는" 제2 운동 단백질에 의해 힘이 가해진다. 바꾸어 말하면, 일부 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서를 포함하고, 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되고; 운동 단백질은 제1 운동 단백질이고, 제1 운동 단백질이 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하게 하는 것은 제2 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 것 및 제2 운동 단백질이 표적 폴리뉴클레오타이드 쪽으로 진행하게 하는 것을 포함하고, 제2 운동 단백질은 제1 운동 단백질을 스페이서 상으로 민다. 이러한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 통상적으로 표적 폴리뉴클레오타이드(표적 폴리뉴클레오타이드이거나 이것에 부착된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 말단)으로부터 스페이서의 말단에 연결된 로딩 부위를 포함한다.
이러한 실시형태에서, 운동 단백질을 스페이서로부터 표적 폴리뉴클레오타이드로 진행하게 하기 위해 차단 모이어티를 제거하는 것이 통상적으로 필요하지 않다고 이해될 것이다. 그러나, 일부 실시형태에서, 이 방법은 차단 모이어티를 변위시키는 것을 수반한다. 예를 들어, 차단 모이어티는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 나노기공과 접촉시켜 제거되거나 변위될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터로부터의 차단 모이어티의 제거는 운동 단백질이 스페이서로부터 폴리뉴클레오타이드 어댑터 및/또는 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하도록 한다.
일부 실시형태에서, 차단 모이어티는 표적 폴리뉴클레오타이드(즉, 표적 폴리뉴클레오타이드이거나 이것에 부착된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 말단)로부터 멀리 스페이서의 측면 상의 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 통상적으로 표적 폴리뉴클레오타이드(표적 폴리뉴클레오타이드이거나 이것에 부착된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 말단)로부터 멀리 스페이서의 말단에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 로딩 부위와 스페이서 사이의 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합한다.
다른 실시형태에서, 차단 모이어티는 스페이서와 표적 폴리뉴클레오타이드 사이의 (표적 폴리뉴클레오타이드이거나 이것에 부착된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 말단을 향해) 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합한다. 이러한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 통상적으로 표적 폴리뉴클레오타이드(표적 폴리뉴클레오타이드이거나 이것에 부착된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 말단)로부터 멀리 스페이서의 말단에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 표적 폴리뉴클레오타이드이거나 이것에 부착된 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 말단을 향해 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합한다.
이동 제어 및 특성평가
본원에는 막관통 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 방법이 또한 제공되고, 이 방법은
i) (A) 표적 폴리뉴클레오타이드; (B) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터; 및 (C) 운동 단백질을 제공하는 단계;
ii) 본원에 개시된 것과 같은 방법을 수행하여 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시키는 단계;
iii) 표적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상의 정지된 운동 단백질을 나노기공과 접촉시키는 단계; 및
iv) 막관통 나노기공에 걸쳐 전위를 가하여 운동 단백질이 스페이서를 지나 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하게 하여 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 실시형태에서의 임의의 방법은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시키도록 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된다. 일 실시형태에서, 단계 (iii)은 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되기 전에 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지된다. 다른 실시형태에서, 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지되기 전에 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착된다.
본원에는 막관통 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 방법이 또한 제공되고, 이 방법은
i) 표적 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
ii) 스페이서를 포함하고 그 위에 운동 단백질이 정지된 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계이되, 상기 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 따라 수득되는 단계;
iii) 표적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 나노기공과 접촉시키는 단계; 및
iv) 막관통 나노기공에 걸쳐 전위를 가하여 운동 단백질이 스페이서를 지나 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하게 하여 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 실시형태에서의 임의의 방법은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시키도록 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된다. 일 실시형태에서, 단계 (iii)은 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 것을 포함한다.
개시된 방법에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 임의의 방식으로 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 어댑터는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오타이드에 공유 부착된다. 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드에 결찰될 수 있다. 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 어느 한 말단, 즉 5' 말단 또는 3' 말단에 또는 표적 폴리뉴클레오타이드의 양 말단, 즉 5' 말단 및 3' 말단에 결찰될 수 있다. 어댑터는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 표적 폴리뉴클레오타이드에 결찰될 수 있다. 어댑터는 ATP의 부재 하에 또는 ATP 대신에 감마-S-ATP(ATPγS)를 사용하여 표적 폴리뉴클레오타이드에 결찰될 수 있다. 보통, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착될 때 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지되면, 어댑터는 ATP의 부재 하에 표적 폴리뉴클레오타이드에 결찰된다. 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제, 이. 콜라이 DNA 리가제, Taq DNA 리가제, Tma DNA 리가제 및 9oN DNA 리가제를 사용하여 어댑터를 결찰할 수 있다. 리가제는 이 방법의 단계 (iii) 전에 샘플로부터 제거될 수 있다. 토포아이소머라제를 사용하여 어댑터를 부착할 수 있다. 토포아이소머라제는 예를 들어 임의의 모이어티 분류 (EC) 그룹 5.99.1.2 및 5.99.1.3의 구성원일 수 있다.
또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 방법이 제공되고, 이 방법은
i) 상기 개시된 방법 중 하나를 수행하는 단계; 및
ii) 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 취하는 단계- 여기서, 하나 이상의 측정은 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타냄 - 및 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 단계를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 어댑터
또한 스페이서를 포함하고 운동 단백질이 스페이서 상에 정지된 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 제공된다. 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 본원 및 상기 기술된 방법의 실시형태에 적용될 수 있다고 이해될 것이다.
일 실시형태에서, 본원에는 (i) 스페이서; (ii) 스페이서 상에 정지된 운동 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터- 여기서, 운동 단백질의 활성 부위는 스페이서에 의해 점유됨 -; 및 (iii) 어댑터에 결합된 차단 모이어티- 여기서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지함 -가 제공된다.
일부 실시형태에서, 스페이서, 운동 단백질 및 차단 모이어티는 본원에 자세히 기재된 것과 같다.
일 실시형태에서, (i) 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 로딩 부위에 결합되고; (ii) 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것을 방지한다. 일부 실시형태에서, 로딩 부위는 본원에 기재된 것과 같다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 제공되고, 이 어댑터는
i) 5' 내지 3' 방향의 {LB-S-D}n 또는 {D-S-LB}n- 여기서, LB는 차단된 로딩 부위이고; S는 스페이서이고; D는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; n은 정수, 선택적으로 1 내지 약 20의 정수임 -; 및
ii) 스페이서(S) 상에 정지된 하나 이상의 운동 단백질을 포함하고;
각각의 LB 모이어티는 각각의 운동 단백질이 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(D)로부터 먼 방향으로 스페이서(S)로부터 이동하는 것을 방지한다.
일부 실시형태에서, 로딩 부위(들), 스페이서(들) 및 운동 단백질(들)은 본원에 기재된 것과 같다.
일부 실시형태에서, n은 1 내지 약 10, 예를 들어 1 내지 약 5, 예컨대 1, 2, 3 또는 4, 대개 1 또는 2의 정수이다. 일부 실시형태에서, n은 1 초과이고, 다수의 운동 단백질은 다수의 스페이서(S) 상에 정지될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 길이가 약 1개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드는 길이가 약 5개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 10개 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 약 20개 내지 약 80개의 뉴클레오타이드, 예컨대 약 30개 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, LB는 D와 동일한 유형의 폴리뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나, D와 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. LB 및/또는 D는 어댑터가 부착될 수 있는 표적 폴리뉴클레오타이드와 동일한 유형의 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나, 표적 폴리뉴클레오타이드와 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, LB는 이중 가닥 DNA일 수 있고, D는 이중 가닥 DNA일 수 있고, 어댑터는 이중 가닥 DNA인 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착하기에 적합할 수 있다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 제공되고, 이 어댑터는
i) 5' 내지 3' 방향의 {LB-S-D}n 또는 {D-S-LB}n- 여기서, LB는 제1 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; S는 스페이서이고; D는 제2 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; n은 정수, 선택적으로 1 내지 약 20의 정수이고; 제1 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(LB)는 스페이서(S)와 인접하고, 스페이서(S)는 제2 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(D)와 인접함 -; 및
ii) 스페이서(S) 상에 정지된 하나 이상의 운동 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 스페이서(들) 및 운동 단백질(들)은 본원에 기재된 것과 같다.
일부 실시형태에서, n은 1 내지 약 10, 예를 들어 1 내지 약 5, 예컨대 1, 2, 3 또는 4, 대개 1 또는 2의 정수이다.
일부 실시형태에서, LB는 D와 동일한 유형의 폴리뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나, D와 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. LB 및/또는 D는 어댑터가 부착될 수 있는 표적 폴리뉴클레오타이드와 동일한 유형의 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나, 표적 폴리뉴클레오타이드와 상이한 유형의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, LB는 이중 가닥 DNA일 수 있고, D는 이중 가닥 DNA일 수 있고, 어댑터는 이중 가닥 DNA인 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착하기에 적합할 수 있다.
키트
또한 폴리뉴클레오타이드 어댑터 및 운동 단백질을 포함하는 키트가 제공된다. 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 본원 및 상기 기술된 키트의 실시형태에 적용될 수 있다고 이해될 것이다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형하기 위한 키트가 제공되고, 이 키트는
i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터;
ii) 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있는 운동 단백질; 및
iii) 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 배치되고 운동 단백질의 활성 부위가 스페이서에 의해 점유될 때, 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있는 차단 모이어티를 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 폴리뉴클레오타이드 어댑터이다. 일 실시형태에서, 운동 단백질은 본원에 기재된 것과 같은 운동 단백질이다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티는 본원에 기재된 것과 같은 차단 모이어티이다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 로딩 부위를 포함한다. 로딩 부위는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 로딩 부위일 수 있다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있다.
또한 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형하기 위한 키트가 제공되고, 이 키트는
i) 스페이서 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터; 및
ii) 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있는 운동 단백질을 포함하고;
차단 모이어티는 운동 단백질이 어댑터에 결합될 때 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지한다.
폴리뉴클레오타이드 어댑터, 스페이서, 차단 모이어티 및 운동 단백질은 통상적으로 본원에 더 자세히 정의된 것과 같다.
시스템
또한 폴리뉴클레오타이드 어댑터, 운동 단백질 및 나노기공을 포함하는 시스템이 제공된다. 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 본원 및 상기 기술된 시스템의 실시형태에 적용될 수 있다고 이해될 것이다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하기 위한 시스템이 제공되고, 이 시스템은
- 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터;
- 운동 단백질- 여기서, 운동 단백질의 활성 부위는 스페이서에 의해 점유됨 -;
- 어댑터에 결합된 차단 모이어티- 여기서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지함 -;
- 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하기 위한 나노기공을 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 폴리뉴클레오타이드 어댑터이다. 일 실시형태에서, 운동 단백질은 본원에 기재된 것과 같은 운동 단백질이다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티는 본원에 기재된 것과 같은 차단 모이어티이다. 일 실시형태에서, 나노기공은 본원에 기재된 것과 같은 나노기공이다. 이 시스템은 본원에 정의된 것과 같은 막; 제어 설비 등을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 로딩 부위를 포함한다. 로딩 부위는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 로딩 부위일 수 있다. 일 실시형태에서, 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 이 시스템은 표적 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 것과 같은 표적 폴리뉴클레오타이드이다.
표적 폴리뉴클레오타이드
표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 것에 관한 본 개시내용의 실시형태에서, 표적 분석물질은 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 막관통 나노기공과 관련하여, 예컨대 이것 안으로 또는 이것을 통해 이동한다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징이 결정된다. 이 방법은 적어도 하나의 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하기 위한 것일 수 있다. 이 방법은 2개 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 것에 관한 것일 수 있다. 이 방법은 임의의 수의 표적 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 100개 또는 이것 초과의 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재, 부재 또는 하나 이상의 특징을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 1개, 2개, 3개, 4개, 5, 10개 또는 이것 초과의 특징과 같은 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드의 임의의 수의 특징이 결정될 수 있다.
기공의 채널에서의 분자(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드)의 결합은 기공을 통한 개방 채널 이온 흐름에 효과를 가질 것이고, 이는 기공 채널의 "분자 감지"의 본질이다. 개방 채널 이온 흐름의 변동은 전기 전류의 변경에 의해 적합한 측정 기법을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, 국제공개 WO 2000/28312호 및 문헌[D. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2010, 106, 7702-7] 또는 국제공개 WO 2009/077734호). 전기 전류 감소에 의해 측정된 것과 같은 이온 흐름 감소의 정도는 기공 내에 또는 그 근처의 장애물의 크기와 관련된다. 기공에서의 또는 기공 근처의 관심 분자(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드)의 결합은 따라서 검출 가능하고 측정 가능한 사건을 제공하여서 "생물학적 센서"의 기초를 형성한다. 생물학적 분자의 존재의 검출은 개인화된 약물 개발, 의학, 진단법, 생명 과학 조사, 환경 모니터링 및 보안 및/또는 방어 산업에서의 분야를 발견한다.
세포로부터 표적 폴리뉴클레오타이드가 분비될 수 있다. 대안적으로, 이 방법이 수행될 수 있기 전에 분석물질이 세포로부터 추출되어야 하도록 표적 분석물질은 세포 내에 존재하는 분석물질일 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 핵산이다. 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자로서 정의된다. DNA 및 RNA에서의 자연 발생 핵산 염기는 이의 물리적 크기에 의해 구별될 수 있다. 핵산 분자 또는 개별 염기가 나노기공의 채널을 통과하면서, 염기 사이의 크기 차이는 채널을 통한 이온 흐름의 직접적으로 상관된 감소를 야기한다. 이온 흐름의 변동이 기록될 수 있다. 이온 흐름 변동을 기록하기 위한 적합한 전기 측정 기법은 예를 들어 국제공개 WO 2000/28312호 및 문헌[D. Stoddart et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2010, 106, pp 7702-7](단일 채널 기록 장비); 및 예를 들어 국제공개 WO 2009/077734호(다중채널 기록 기법)에 기재되어 있다. 적합한 보정을 통해, 실시간으로 특정 뉴클레오타이드 및 채널을 횡단하는 연관된 염기를 확인하기 위해 특징적인 이온 흐름 감소를 사용할 수 있다. 통상적인 나노기공 핵산 시퀀싱에서, 관심 핵산 서열의 개별 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드에 의한 채널의 부분 차단으로 인해 나노기공의 채널을 통해 연속하여 통과하면서 개방 채널 이온 흐름이 감소된다. 이 이온 흐름 감소는 상기 기재된 적합한 기록 기법을 사용하여 측정된다. 이온 흐름 감소는 채널을 통한 주지의 뉴클레오타이드에 대한 측정된 이온 흐름의 감소에 의해 보정될 수 있어서 어떤 뉴클레오타이드가 채널을 통과하는지를 결정하기 위한 수단, 및 따라서, 연속하여 수행될 때, 나노기공을 통과하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방식을 생성시킨다. 개별 뉴클레오타이드의 정확한 결정을 위해, 이것은 협착부(또는 "리딩 헤드")를 통과하는 개별 뉴클레오타이드의 크기에 직접적으로 상관되는 채널을 통한 이온 흐름의 감소에 통상적으로 필요하다. 예를 들어, 중합효소 또는 헬리카제와 같은 연관된 운동 단백질의 작용을 통해 기공에 걸쳐 '트레딩'된 온전한 핵산 중합체에 대해 시퀀싱이 수행될 수 있다고 이해될 것이다. 대안적으로, 서열은 기공과 근접한 표적 핵산으로부터 연속하여 제거된 뉴클레오타이드 트리포스페이트 염기의 통과에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 국제공개 WO 2014/187924호 참조).
폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 임의의 뉴클레오타이드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 자연 발생 또는 인공일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 산화되거나 메틸화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 손상될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 피리미딘 이합체를 포함할 수 있다. 이러한 이합체는 통상적으로 자외선에 의한 손상과 연관되고, 피부 흑색종의 주원인이다. 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 예를 들어 라벨 또는 태그에 의해 변형될 수 있고, 이에 대한 적합한 예는 당업자에 의해 공지되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 통상적으로 핵염기, 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기 및 당은 뉴클레오사이드를 형성한다. 핵염기는 통상적으로 헤테로사이클릭이다. 핵염기는 푸린 및 피리미딘 및 더 구체적으로는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 우라실(U) 및 사이토신(C)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 당은 통상적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오타이드 당은 리보스 및 데옥시리보스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 당은 바람직하게는 데옥시리보스이다. 폴리뉴클레오타이드 바람직하게는 하기 뉴클레오사이드를 포함한다: 데옥시아데노신(dA), 데옥시우리딘(dU) 및/또는 티미딘(dT), 데옥시구아노신(dG) 및 데옥시시티딘(dC). 뉴클레오타이드는 통상적으로 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드이다. 뉴클레오타이드는 통상적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 뉴클레오타이드는 3개 초과의 포스페이트, 예컨대 4개 또는 5개의 포스페이트를 포함할 수 있다. 포스페이트는 뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 측에 부착될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드는 임의의 방식으로 서로에 부착될 수 있다. 뉴클레오타이드는 통상적으로 핵산에서처럼 이의 당 및 포스페이트 기에 의해 부착된다. 뉴클레오타이드는 피리미딘 이합체에서처럼 이의 핵염기를 통해 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부는 바람직하게는 이중 가닥이다. 폴리뉴클레오타이드는 가장 바람직하게는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA)이다. 특히, 분석물질로서 폴리뉴클레오타이드를 사용한 상기 방법은 대안적으로 (i) 폴리뉴클레오타이드의 길이, (ii) 폴리뉴클레오타이드의 정체, (iii) 폴리뉴클레오타이드의 서열, (iv) 폴리뉴클레오타이드의 2차 구조 및 (v) 폴리뉴클레오타이드가 변형되는지 또는 아닌지로부터 선택된 하나 이상의 특징을 결정하는 것을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 임의의 길이(i)일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 1000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍, 5000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍 길이, 또는 100000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 임의의 수의 폴리뉴클레오타이드가 조사될 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 20개, 30개, 50개, 100개 또는 이것 초과의 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 것에 관한 것일 수 있다. 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 특성평가되면, 이들은 상이한 폴리뉴클레오타이드 또는 동일한 폴리뉴클레오타이드의 두가지 경우일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 자연 발생 또는 인공일 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 제조된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 검증하도록 사용될 수 있다. 이 방법은 통상적으로 시험관내 수행된다.
뉴클레오타이드는 임의의 정체(ii)를 가질 수 잇고, 아데노신 모노포스페이트(AMP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 5-메틸시티딘 모노포스페이트, 5-하이드록시메틸시티딘 모노포스페이트, 시티딘 모노포스페이트(CMP), 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP), 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시시티딘 모노포스페이트(dCMP) 및 데옥시메틸시티딘 모노포스페이트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 뉴클레오타이드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP, dCMP 및 dUMP로부터 선택된다. 뉴클레오타이드는 탈염기성일 수 있다(즉, 핵염기가 결여됨). 뉴클레오타이드는 또한 핵염기 및 당이 결여될 수 있다(즉, C3 스페이서임). 뉴클레오타이드의 서열(iii)은 가닥의 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 가닥에 걸쳐 서로에 부착된 하기 뉴클레오타이드의 연속적 정체에 의해 결정된다.
표적 폴리뉴클레오타이드는 PCR 반응의 생성물, 게놈 DNA, 엔도뉴클레아제 분해 및/또는 DNA 라이브러리의 생성물을 포함할 수 있다. 임의의 유기체 또는 미생물로부터 표적 폴리뉴클레오타이드를 얻거나 추출할 수 있다. 인간 또는 동물로부터, 예를 들어 뇨, 림프, 타액, 점액, 정액 또는 양수로부터 또는 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 표적 폴리뉴클레오타이드를 대개 얻는다. 식물, 예를 들어 곡류, 협과, 과일 또는 야채로부터 표적 폴리뉴클레오타이드를 얻을 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 게놈 DNA는 단편화될 수 있다. DNA는 임의의 적합한 방법에 의해 단편화될 수 있다. 예를 들어, DNA를 단편화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 트랜스포사제, 예컨대 MuA 트랜스포사제를 사용할 수 있다. 대개 게놈 DNA는 단편화되지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 및/또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다.
나노기공
나노기공에 관한 본 발명의 실시형태에서, 임의의 적합한 나노기공을 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 나노기공은 막관통 기공이다.
막관통 기공은 일부 정도로 막을 횡단하는 구조이다. 이것은 인가된 전위에 의해 추동된 수화된 이온이 막에 걸쳐 또는 막 내에 흐르게 한다. 수화된 이온이 막의 일 측으로부터 막의 다른 측으로 흐를 수 있도록 막관통 기공은 통상적으로 전체 막을 횡단한다. 그러나, 막관통 기공은 막을 횡단할 필요는 없다. 이것은 일 말단에서 폐쇄될 수 있다. 예를 들어, 기공은 막에서의 웰, 갭, 채널, 트렌치 또는 슬릿일 수 있으며, 이 막을 따라 또는 막 안으로 수화된 이온이 흐를 수 있다.
본원에 제공된 방법에서 임의의 막관통 기공을 사용할 수 있다. 기공은 생물학적 또는 인공일 수 있다. 적합한 기공은 단백질 기공, 폴리뉴클레오타이드 기공 및 고체 상태 기공을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 기공은 DNA 오리가미 기공일 수 있다(문헌[Langecker et al., Science, 2012; 338: 932-936]). 적합한 DNA 오리가미 기공은 국제공개 WO 2013/083983호에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 나노기공은 막관통 단백질 기공이다. 막관통 단백질 기공은 수화된 이온, 예컨대 폴리뉴클레오타이드가 막의 일 측으로부터 막의 다른 측으로 흐르게 하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 집합이다. 본원에 제공된 방법에서, 막관통 단백질 기공은 기공을 형성할 수 있고, 이는 수화된 이온이 막의 일 면으로부터 다른 면으로 흐르는 인가된 전위에 의해 추동되게 한다. 막관통 단백질 기공은 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드가 막, 예컨대 삼중블록 공중합체 막의 일 측으로부터 다른 측으로 흐르게 한다. 막관통 단백질 기공은 폴리뉴클레오타이드가 기공을 통해 이동되게 한다.
일 실시형태에서, 나노기공은 단량체 또는 올리고머인 막관통 단백질 기공이다. 기공은 바람직하게는 여러 반복 하위단위, 예컨대 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개 또는 적어도 16개의 하위단위로 이루어진다. 기공은 바람직하게는 육합체, 칠합체, 팔합체 또는 나노미터 기공이다. 기공은 동종올리고머 또는 이종올리고머일 수 있다.
일 실시형태에서, 막관통 단백질 기공은 이온이 흐를 수 있는 바렐 또는 채널을 포함한다. 기공의 하위단위는 통상적으로 중앙 축을 둘러싸고, 가닥을 막관통 β-바렐 또는 채널 또는 막관통 α-헬릭스 번들 또는 채널에 준다.
통상적으로, 막관통 단백질 기공의 바렐 또는 채널은 분석물질, 예컨대 (본원에 기재된 것과 같은) 표적 폴리뉴클레오타이드와의 상호작용을 용이하게 하는 아미노산을 포함한다. 이 아미노산은 바람직하게는 바렐 또는 채널의 협착부 근처에 배치된다. 막관통 단백질 기공은 통상적으로 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신 또는 히스티딘, 또는 방향족 아미노산, 예컨대 티로신 또는 트립토판을 포함한다. 이 아미노산은 통상적으로 기공과 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 사이의 상호작용이 용이하게 한다.
일 실시형태에서, 나노기공은 β-바렐 기공 또는 α-헬릭스 번들 기공으로부터 유래된 막관통 단백질 기공이다. β-바렐 기공은 β 가닥으로부터 형성된 바렐 또는 채널을 포함한다. 적합한 β-바렐 기공은 β-독소, 예컨대 α-헤몰리신, 탄저병 독소 및 류코시딘, 및 박테리아의 외막 단백질/포린, 예컨대 마이코박테륨 스메그마티스 포린(Msp), 예를 들어 MspA, MspB, MspC 또는 MspD, CsgG, 외막 포린 F(OmpF), 외막 포린 G(OmpG), 외막 포스포리파제 A 및 나이세리아 자동수송체 지단백(NalP) 및 다른 기공, 예컨대 리세닌을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. α-헬릭스 번들 기공은 α-나선으로부터 형성된 바렐 또는 채널을 포함한다. 적합한 α-헬릭스 번들 기공은 내막 단백질 및 α 외막 단백질, 예컨대 WZA 및 ClyA 독소를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 나노기공은 Msp, α-헤몰리신(α-HL), 리세닌, CsgG, ClyA, Sp1 또는 용혈성 단백질 프라가세아톡신 C(FraC)로부터 유래되거나 이에 기초한 막관통 기공이다.
일 실시형태에서, 나노기공은 CsgG, 예를 들어 이. 콜라이 기질 K-12 기질 MC4100으로부터의 CsgG로부터 유래된 막관통 단백질 기공이다. 이러한 기공은 올리고머이고, 통상적으로 CsgG로부터 유래된 7개, 8개, 9개 또는 10개의 단량체를 포함한다. 기공은 동일한 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 동종올리고머 기공일 수 있다. 대안적으로, 기공은 다른 것과 상이한 적어도 하나의 단량체를 포함하는 CsgG로부터 유래된 이종올리고머 기공일 수 있다. CsgG로부터 유래된 적합한 기공의 예는 국제공개 WO 2016/034591호에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 나노기공은 리세닌으로부터 유래된 막관통 기공이다. 리세닌으로부터 유래된 적합한 기공의 예는 국제공개 WO 2013/153359호에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 나노기공은 α-헤몰리신(α-HL)으로부터 유래되거나 이에 기초한 막관통 기공이다. 야생형 α-헤몰리신 기공은 7개 동일한 단량체 또는 하위단위로부터 형성된다(즉, 이것은 칠합체임). α-헤몰리신 기공은 α-헤몰리신-NN 또는 이의 변이체일 수 있다. 변이체는 바람직하게는 E111 및 K147 위치에서의 N 잔기를 포함한다.
일 실시형태에서, 나노기공은 Msp, 예를 들어 MspA로부터 유래된 막관통 단백질 기공이다. MspA로부터 유래된 적합한 기공의 예는 국제공개 WO 2012/107778호에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 나노기공은 ClyA로부터 유래되거나 이에 기초한 막관통 기공이다.
막
막관통 나노기공의 사용을 포함하는 본 발명의 실시형태에서, 막관통 나노기공은 통상적으로 막에 존재한다. 이 시스템에서 임의의 적합한 막을 사용할 수 있다.
막은 바람직하게는 양극성 층이다. 양극성 층은 양극성 분자, 예컨대 친수성 특성 및 친유성 특성 둘 다를 갖는 인지질로부터 형성된 층이다. 양극성 분자는 합성 또는 자연 발생일 수 있다. 비자연 발생 양극성 및 단일층을 형성하는 양극성은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 블록 공중합체를 형성한다(문헌[Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450]). 블록 공중합체는 2개 이상의 단량체 하위단위가 단일 중합체 사슬을 생성하도록 함께 중합된 중합체 재료이다. 블록 공중합체는 통상적으로 각각의 단량체 하위단위에 의해 기여된 특성을 갖는다. 그러나, 블록 공중합체는 개별 하위단위로부터 형성된 중합체가 보유하지 않는 고유한 특성을 가질 수 있다. 단량체 하위단위 중 하나가 소수성(즉, 친유성)이지만, 다른 하위단위(들)가 수성 매질에 있으면서 친수성이도록 블록 공중합체가 조작될 수 있다. 이 경우에, 블록 공중합체는 양극성 특성을 보유할 수 있고, 생물학적 막을 모방하는 구조를 형성할 수 있다. 블록 공중합체는 (2개의 단량체 하위단위로 이루어진) 이중블록일 수 있지만, 양극성으로서 거동하는 더 복잡한 배열을 형성하도록 2개 초과의 단량체 하위단위로부터 또한 작제될 수 있다. 공중합체는 삼중블록 공중합체, 사중블록 공중합체 또는 오중블록 공중합체일 수 있다. 막은 바람직하게는 삼중블록 공중합체 막이다.
고세균 이극성 테트라에테르 지질은 지질이 단일층 막을 형성하도록 작제된 자연 발생 지질이다. 이 지질은 가혹한 생물학적 환경에서 생존하는 극한환경 생물, 호열성 생물, 호염성 생물 및 호산성 생물에서 일반적으로 발견된다. 이의 안정성은 최종 이중층의 융합 성질로부터 유래한다고 여겨진다. 일반 모티프 친수성-소수성-친수성을 갖는 삼중블록 중합체를 생성함으로써 이 생물학적 집합체를 모방하는 블록 공중합체 재료를 작제하는 것이 단순하다. 이 재료는 지질 이중층과 유사하게 거동하고 베시클로부터 라미나 막에 걸쳐 상 거동의 범위를 포함하는 단량체 막을 형성할 수 있다. 이 삼중블록 공중합체로부터 형성된 막은 생물학적 지질 막에 걸쳐 여러 이점을 보유하다. 삼중블록 공중합체가 합성되므로, 정확한 사슬 길이 및 막을 형성하고 기공 및 다른 단백질과 상호작용하는 데 필요한 특성을 제공하도록 정확한 작제는 조심스럽게 제어될 수 있다.
블록 공중합체는 지질 하위재료로 분류되지 않는 하위단위로부터 작제될 수도 있고, 예를 들어 소수성 중합체는 실록산 또는 다른 비탄화수소계 단량체로부터 제조될 수 있다. 블록 공중합체의 친수성 하위분절은 낮은 단백질 결합 특성을 또한 보유할 수 있고, 이는 원료 생물학적 샘플에 노출될 때 고도로 저항적인 막의 생성을 허용한다. 이 헤드 기 단위는 또한 비전통적 지질 헤드 기로부터 유래될 수 있다.
삼중블록 공중합체 막은 또한 생물학적 지질 막과 비교하여 증가된 기계적 안정성 및 환경적 안정성, 예를 들어 훨씬 더 높은 조작 온도 또는 pH 범위를 갖는다. 블록 공중합체의 합성 성질은 넓은 범위의 분야에 대해 중합체 기반 막을 맞춤화하기 위한 플랫폼을 제공한다.
일부 실시형태에서, 막은 국제출원 WO 2014/064443호 또는 국제출원 WO 2014/064444호에 개시된 막 중 하나이다.
양극성 분자는 폴리뉴클레오타이드의 커플링을 용이하게 하도록 화학적으로 변형되거나 기능화될 수 있다. 양극성 층은 단일층 또는 이중층일 수 있다. 양극성 층은 통상적으로 평면이다. 양극성 층은 곡선일 수 있다. 양극성 층은 지지될 수 있다.
양극성 막은 통상적으로 자연적으로 이동성이어서 대략 10-8 cm s-1의 지질 확산 속도로 2차원 유체로서 본질적으로 작용한다. 이는 기공 및 커플링된 폴리뉴클레오타이드가 통상적으로 양극성 막 내에 이동할 수 있다는 것을 의미한다.
막은 지질 이중층일 수 있다. 지질 이중층은 세포 막의 모델이고, 일련의 실험 연구에 대해 훌륭한 플랫폼으로서 작용한다. 예를 들어, 지질 이중층은 단일 채널 기록에 의해 막 단백질의 시험관내 조사에 사용될 수 있다. 대안적으로, 지질 이중층은 기질의 범위의 존재를 검출하는 바이오센서로서 사용될 수 있다. 지질 이중층은 임의의 지질 이중층일 수 있다. 적합한 지질 이중층은 평면 지질 이중층, 지지된 이중층 또는 리포솜을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 지질 이중층은 바람직하게는 평면 지질 이중층이다. 적합한 지질 이중층은 국제공개 WO 2008/102121호, 국제공개 WO 2009/077734호 및 국제공개 WO 2006/100484호에 개시되어 있다.
지질 이중층을 형성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 지질 이중층은 Montal 및 Mueller의 방법(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566])에 의해 흔히 형성되고, 여기서 그 계면에 수직인 어퍼쳐의 어느 한 측을 지나 수용액/공기 계면에서 지질 단일층이 운반된다. 처음에 지질을 유기 용매에 용해하고 이후 용매의 방울이 어퍼쳐의 어느 한 측에서 수용액의 표면에서 증발하게 하여 지질이 보통 수성 전해질 용액의 표면에 첨가된다. 유기 용매가 증발되면, 어퍼쳐의 어느 한 측에서의 용액/공기 계면은 이중층이 형성될 때까지 어퍼쳐를 지나 위아래로 물리적으로 이동한다. 평면 지질 이중층은 막에서의 어퍼쳐에 걸쳐 또는 개구에 걸쳐 리세스로 형성될 수 있다.
Montal 및 Mueller의 방법은 인기가 있는데, 왜냐하면 이것이 단백질 기공 삽입을 위해 적합한 우수 품질 지질 이중층을 형성하는 비용 효과적이고 비교적 단순한 방법이기 때문이다. 이중층 형성의 다른 흔한 방법은 선단 디핑, 이중층의 페인팅 및 리포솜 이중층의 패치 클램핑을 포함한다.
선단 디핑 이중층 형성은 지질의 단일층을 운반하는 시험 용액의 표면에 어퍼쳐 표면(예를 들어, 피펫 선단)을 터치하는 것을 수반한다. 다시, 유기 용매에 용해된 지질의 방울이 용액 표면에서 증발하게 함으로써 용액/공기 계면에서 지질 단일층이 처음에 생성된다. 이후, 이중층은 Langmuir-Schaefer 공정에 의해 형성되고, 용액 표면에 대해 개구를 이동하도록 기계적 자동화를 요한다.
인쇄된 이중층에 대해, 유기 용매에 용해된 지질의 방울을 어퍼쳐에 바로 적용하고, 이를 수성 시험 용액에 액침한다. 지질 용액은 페인트브러시 또는 균등물을 사용하여 어퍼쳐 위로 얇게 분산된다. 용매가 묽어지면 지질 이중층이 형성된다. 그러나, 이중층으로부터의 용매의 완벽한 제거는 어렵고, 그 결과 이 방법에 의해 형성된 이중층은 전기화학 측정 동안 덜 안정하고 더 잡음에 민감하다.
생물학적 세포 막의 연구에서 패치-클램핑이 흔히 사용된다. 세포 막은 흡인에 의해 피펫의 말단에 클램프되고, 막의 패치는 개구 위로 부착된다. 이 방법은 리포솜을 클램핑하여 지질 이중층을 생성하기 위해 채택되는데, 이 리포솜은 이후 터져서 피펫의 어퍼쳐 위에 지질 이중층 실링을 남긴다. 이 방법은 안정하고 크고 단일층인 리포솜 및 유리 표면을 갖는 재료에서 작은 어퍼쳐의 제작을 요한다.
리포솜은 음파처리, 압출 또는 Mozafari 방법에 의해 형성될 수 있다(문헌[Colas et al. (2007) Micron 38:841-847]).
일부 실시형태에서, 지질 이중층은 국제출원 WO 2009/077734호에 기재되어 있는 것처럼 형성된다. 유리하게는, 이 방법에서 지질 이중층은 건조된 지질로부터 형성된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 지질 이중층은 국제출원 WO 2009/077734호에 기재된 것처럼 개구에 걸쳐 형성된다.
지질 이중층은 지질의 2개의 대향하는 층으로부터 형성된다. 이의 소수성 꼬리 기가 소수성 내부를 형성하도록 서로를 향해 마주보도록 지질의 2개의 층이 배열된다. 지질의 친수성 헤드 기는 이중층의 각각의 측에서 수성 환경을 향해 외부로 향한다. 이중층은 비제한적인 예로서 액체 규칙 상(유체 라멜라), 액체 규칙 상, 고체 규칙 상(라멜라 겔 상, 맞물린 겔 상) 및 평면 이중층 결정(라멜라 하위겔 상, 라멜라 결정질 상)을 포함하는 다수의 지질 상에 존재할 수 있다.
지질 이중층을 형성하는 임의의 지질 조성물을 사용할 수 있다. 필요한 특성, 이러한 표면 전하, 막 단백질을 지지하는 능력, 패킹 밀도 또는 기계적 특성을 갖는 지질 이중층이 형성되도록 지질 조성물이 선택된다. 지질 조성물은 하나 이상의 상이한 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 조성물은 100개 이하의 지질을 함유할 수 있다. 지질 조성물은 바람직하게는 1개 내지 10개의 지질을 함유한다. 지질 조성물은 자연 발생 지질 및/또는 인공 지질을 포함할 수 있다.
지질은 통상적으로 꼬리 기, 계면 모이어티 및 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 소수성 꼬리 기를 포함한다. 적합한 헤드 기는 중성 헤드 기, 예컨대 디아실글리세라이드(DG) 및 세라마이드(CM); 양극성 헤드 기, 예컨대 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE) 및 스핑고미엘린(SM); 음으로 하전된 헤드 기, 예컨대 포스파티딜글리세롤(PG); 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파트산(PA) 및 카디오리핀(CA); 및 양으로 하전된 헤드 기, 예컨대 트리메틸암모늄-프로판(TAP)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 계면 모이어티는 자연 발생 계면 모이어티, 예컨대 글리세롤 기반 모이어티 또는 세라마이드 기반 모이어티를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 소수성 꼬리 기는 포화 탄화수소 사슬, 예컨대 라우르산(n-도데칸산), 미리스트산(n-테트라데칸산), 팔미트산(n-헥사데칸산), 스테아르산(n-옥타데칸산) 및 아라키드산(n-에이코산산); 불포화 탄화수소 사슬, 예컨대 올레산(시스-9-옥타데칸산); 및 분지형 탄화수소 사슬, 예컨대 피타노일을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 불포화 탄화수소 사슬의 사슬의 길이 및 이중 결합의 위치 및 수가 변할 수 있다. 분지형 탄화수소 사슬에서의 사슬의 길이 및 메틸 기와 같은 분지의 위치 및 수가 변할 수 있다. 소수성 꼬리 기는 에테르 또는 에스테르로서 계면 모이어티에 연결될 수 있다. 지질은 마이콜산일 수 있다.
지질은 또한 화학적으로 변형될 수 있다. 지질의 헤드 기 또는 꼬리 기는 화학적으로 변형될 수 있다. 헤드 기가 화학적으로 변형된 적합한 지질은 PEG-변형된 지질, 예컨대 1,2-디아실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N -[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]; 작용기화된 PEG 지질, 예컨대 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3 포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌 글리콜)2000]; 및 접합을 위해 변형된 지질, 예컨대 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(숙시닐) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(비오티닐)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 꼬리 기가 화학적으로 변형된 적합한 지질은 중합 가능한 지질, 예컨대 1,2-비스(10,12-트리코사디이노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; 플루오르화된 지질, 예컨대 1-팔미토일-2-(16-플루오로팔미토일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; 중수소화된 지질, 예컨대 1,2-디팔미토일-D62-sn-글리세로-3-포스포콜린; 및 에테르 연결된 지질, 예컨대 1,2-디-O-피타닐-sn-글리세로-3-포스포콜린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 지질은 폴리뉴클레오타이드의 커플링을 용이하게 하도록 화학적으로 변형되거나 기능화될 수 있다.
양극성 층, 예를 들어 지질 조성물은 통상적으로 층의 특성에 영향을 미치는 하나 이상의 첨가제를 포함한다. 적합한 첨가제는 지방 산, 예컨대 팔미트산, 미리스트산 및 올레산; 지방 알코올, 예컨대 팔미트산 알코올, 미리스트산 알코올 및 올레산 알코올; 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 에르고스테롤, 라노스테롤, 시토스테롤 및 스티그마스테롤; 리소인지질, 예컨대 1-아실-2-하이드록시-sn- 글리세로-3-포스포콜린; 및 세라마이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 실시형태에서, 막은 고체 상태 층을 포함한다. 고체 상태 층은 유기 재료 및 비제한적인 예로서 마이크로전자 재료, 절연 재료, 예컨대 Si3N4, A12O3 및 SiO, 유기 중합체 및 무기 중합체, 예컨대 폴리아미드, 플라스틱, 예컨대 Teflon® 또는 엘라스토머, 예컨대 2성분 부가-경화 실리콘 고무 및 유리를 포함하는 무기 재료 둘 다로부터 형성될 수 있다. 고체 상태 층은 그래핀으로부터 형성될 수 있다. 적합한 그래핀 층은 국제공개 WO 2009/035647호에 개시되어 있다. 막이 고체 상태 층을 포함하면, 기공은 통상적으로 고체 상태 층 내에, 예를 들어 고체 상태 층 내의 홀, 웰, 갭, 채널, 트렌치 또는 슬릿 내에 함유된 양극성 막 또는 층에 존재한다. 숙련자는 적합한 고체 상태/양극성 하이브리드 시스템을 제조할 수 있다. 적합한 시스템은 국제공개 WO 2009/020682 및 국제공개 WO 2012/005857호에 개시되어 있다. 상기 기술된 임의의 양극성 막 또는 층이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 (i) 기공을 포함하는 인공 양극성 층, (ii) 기공을 포함하는 단리된 자연 발생 지질 이중층, 또는 (iii) 기공이 내부에 삽입된 세포를 사용하여 통상적으로 수행된다. 이 방법은 인공 양극성 층, 예컨대 인공 삼중블록 공중합체 층을 사용하여 통상적으로 수행된다. 층은 기공 이외에 다른 막관통 및/또는 막내 단백질뿐만 아니라 다른 분자를 포함할 수 있다. 적합한 장치 및 조건은 하기 기술되어 있다. 본 발명의 방법은 통상적으로 시험관내 수행된다.
앵커
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 막 앵커 또는 어댑터에 부착된 막관통 기공 앵커를 포함한다. 일 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 표적 폴리뉴클레오타이드의 앵커 특성평가. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드를 막관통 기공과 접촉시키는 것을 포함하는 방법에서, 막 앵커 또는 막관통 기공 앵커는 막관통 기공 주위에 선택된 폴리뉴클레오타이드의 국재화를 촉진할 수 있다.
앵커는 막으로 삽입될 수 있는 폴리펩타이드 앵커 및/또는 소수성 앵커일 수 있다. 일 실시형태에서, 소수성 앵커는 지질, 지방 산, 스테롤, 탄소 나노튜브, 폴리펩타이드, 단백질 또는 아미노산, 예를 들어 콜레스테롤, 팔미테이트 또는 토코페롤이다. 앵커는 티올, 비오틴 또는 계면활성제를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 앵커는 (스트렙타비딘에 결합하기 위한) 비오틴, (말토스 결합 단백질 또는 융합 단백질에 결합하기 위한) 아밀로스, (폴리-히스티딘 또는 폴리-히스티딘 태그화 단백질에 결합하기 위한) Ni-NTA 또는 펩타이드(예컨대, 항원)일 수 있다.
일 실시형태에서, 앵커는 링커, 또는 2개, 3개, 4개 또는 이것 초과의 링커를 포함한다. 바람직한 링커는 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오타이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리사카라이드 및 폴리펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 링커는 선형, 분지형 또는 환형일 수 있다. 예를 들어, 링커는 환형 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 어댑터는 원형 폴리뉴클레오타이드 링커 상의 상보성 서열에 혼성화할 수 있다. 하나 이상의 앵커 또는 하나 이상의 링커는 절단되거나 파괴될 수 있는 성분, 예컨대 제한 부위 또는 광 불안정 기를 포함할 수 있다. 링커는 단백질에서 시스테인 잔기에 부착하도록 말레이미드 기로 작용기화될 수 있다. 적합한 링커는 국제공개 WO 2010/086602호에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 앵커는 콜레스테롤 또는 지방 아실 사슬이다. 예를 들어, 6개 내지 30개의 탄소 원자의 길이를 갖는 임의의 지방 아실 사슬, 예컨대 헥사데칸산을 사용할 수 있다. 적합한 앵커 및 앵커를 어댑터에 부착하는 방법의 예는 국제공개 WO 2012/164270호 및 국제공개 WO 2015/150786호에 개시되어 있다.
특성평가
표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 것에 관한 본 개시내용의 실시형태에서, 표적 분석물질은 본원에 더 자세히 기재된 것처럼 막관통 나노기공과 관련하여, 예컨대 이것 안으로 또는 이것을 통해 이동한다.
기공이 막에 삽입된 막/기공 시스템을 조사하기에 적합한 임의의 장치를 사용하여 특성평가 방법을 수행할 수 있다. 막관통 기공 감지에 적합한 임의의 장치를 사용하여 특성평가 방법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 이 장치는 수용액을 포함하는 챔버 및 챔버를 2개의 구획으로 분리하는 장벽을 포함할 수 있다. 장벽은 막관통 기공을 함유하는 막이 형성된 어퍼쳐를 가질 수 있다. 막관통 기공은 본원에 기재되어 있다.
특성평가 방법은 국제공개 WO 2008/102120호, 국제공개 WO 2010/122293호 또는 국제공개 WO 00/28312호에 기재된 장치를 사용하여 수행될 수 있다.
특성평가 방법은 통상적으로 전류의 측정에 의해 기공을 통한 이온 전류 흐름을 측정하는 것을 수반할 수 있다. 대안적으로, 기공을 통한 이온 흐름은 예컨대 문헌[Heron et al: J. Am. Chem. Soc. 9 Vol. 131, No. 5, 2009]에 개시된 것처럼 광학적으로 측정될 수 있다. 따라서, 이 장치는 또한 전위를 가하고 막 및 기공에 걸쳐 전기 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 포함할 수 있다. 패치 램프 또는 전압 펌프를 사용하여 특성평가 방법이 수행될 수 있다. 특성평가 방법은 바람직하게는 전압 클램프의 사용을 수반한다.
각각의 어레이가 128개, 256개, 512개, 1024개, 2000개, 3000개, 4000개, 6000개, 10000개, 12000개, 15000개 또는 이것 초과의 웰을 포함하는 웰의 실리콘 기반 어레이에서 특성평가 방법이 수행될 수 있다.
특성평가 방법은 기공을 통해 흐르는 전류의 측정을 수반할 수 있다. 막 및 기공에 걸쳐 인가된 전압에 의해 통상적으로 이 방법을 수행한다. 사용된 전압은 통상적으로 +2 V 내지 -2 V, 통상적으로 -400 mV 내지 +400mV이다. 사용된 전압은 바람직하게는 -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20mV 및 0 mV로부터 선택된 하한 및 +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV로부터 독립적으로 선택된 상한을 갖는 범위에 있다. 사용된 전압은 더 바람직하게는 100 mV 내지 240mV의 범위 및 가장 바람직하게는 120 mV 내지 220 mV의 범위이다. 증가된 인가된 전위를 사용하여 기공에 의해 상이한 뉴클레오타이드 사이의 구별을 증가시킬 수 있다.
임의의 전하 운반제, 예컨대 금속 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 할라이드 염, 예를 들어 클로라이드 염, 예컨대 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재 하에 특성평가 방법이 통상적으로 수행된다. 전하 운반제는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어 테트라메틸 암모늄 클로라이드, 트리메틸페닐 암모늄 클로라이드, 페닐트리메틸 암모늄 클로라이드 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸륨 클로라이드를 포함할 수 있다. 상기 기술된 예시적인 장치에서, 염은 챔버에서 수용액에 존재한다. 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl) 또는 염화세슘(CsCl)이 통상적으로 사용된다. KCl이 바람직하다. 염은 염화칼슘(CaCl2)과 같은 알칼리 토금속 염일 수 있다. 염 농도는 포화에 있을 수 있다. 염 농도는 3 M 이하일 수 있고, 통상적으로 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9 M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 염 농도는 바람직하게는 150 mM 내지 1 M이다. 적어도 0.3 M, 예컨대 적어도 0.4 M, 적어도 0.5 M, 적어도 0.6 M, 적어도 0.8 M, 적어도 1.0 M, 적어도 1.5 M, 적어도 2.0 M, 적어도 2.5 M 또는 적어도 3.0 M의 염 농도를 사용하여 바람직하게는 특성평가 방법이 수행된다. 고염 농도는 높은 신호 대 잡음 비를 제공하고, 결합/비결합을 나타내는 전류가 일반 전류 변동의 배경에 대해 확인되게 한다.
완충액의 존재 하에 특성평가 방법을 통상적으로 수행한다. 상기 기술된 예시적인 장치에서, 완충액은 챔버에서 수용액에 존재한다. 임의의 적합한 완충액을 사용할 수 있다. 통상적으로, 완충액은 HEPES이다. 다른 적합한 완충액은 Tris-HCl 완충액이다. 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 통상적으로 이 방법을 수행한다. 사용된 pH는 바람직하게는 약 7.5이다.
특성평가 방법은 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있다. 실온에서 특성평가 방법을 통상적으로 수행한다. 효소 기능을 지지하는 온도, 예컨대 약 37℃에서 특성평가 방법을 선택적으로 수행한다.
특정 실시형태, 특별 구성뿐만 아니라 재료 및/또는 분자가 본 발명에 따른 방법에 대해 본원에 기술되어 있지만, 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 형태 및 상세내용의 다양한 변경 또는 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기 실시예는 특정 실시형태를 더 잘 예시하도록 제공되고, 이들은 분야를 제한하는 것으로 여겨지지 않아야 한다. 그 분야는 오직 청구항에 의해 제한된다.
실시예
실시예 1
이 실시예는 운동 단백질이 스페이서에 인접하게 정지될 때와 비교하여 운동 단백질이 본원에 개시된 방법에 따라 스페이서 상에 정지될 때 무용한 변환이 감소된다는 것을 보여준다.
서열 번호 9의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하고 스페이서(4 iSp18 단위, IDT)를 포함하는 제1 DNA 작제물을 상보성 단일 가닥 DNA 가닥(서열 번호 10 및 서열 번호 11)에 혼성화하였다. 서열 번호 10은 서열 번호 9의 5' 말단과 스페이서의 5' 말단 사이의 서열 번호 9의 부분에 상보성이고, "시험" 가닥이라 칭해진다. 운동 단백질(폐쇄된 T4 Dda 헬리카제)는 스페이서 상에 정지되었다. 작제물은 도 1a에 개략적으로 도시된다.
스페이서 상에 로딩된 폐쇄된 T4 Dda 헬리카제에 의해 제2 DNA 작제물을 제조하였다. 제2 DNA 작제물은 서열 번호 10 대신에 서열 번호 12가 사용된다는 것을 제외하고는 제1 DNA 작제물과 동일하다. 서열 번호 12는 서열 번호 10의 5' 말단에서 말단 10개 뉴클레오타이드가 결여된다는 것을 제외하고는 서열 번호 10과 동일하다. 결론적으로, 서열 번호 12는 서열 번호 9에 혼성화하여 스페이서의 5' 말단에 10개의 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 DNA의 영역이 남는다. 따라서 서열 번호 12는 "시험 -10" 가닥이라 칭해진다. 작제물은 도 1b에 개략적으로 도시된다.
분광광도법적 검정은 각각 제1 DNA 작제물 및 제2 DNA 작제물 상에 정지된 운동 단백질(이 실시예에서 폐쇄된 T4 Dda 헬리카제)에 의해 연료 사용(ATP 변환)의 속도를 결정하도록 사용되었다. 간단히, 분광광도법적 검정은 커플링된 효소 시스템을 사용하여 운동 단백질에 의해 ATP 용법을 모니터링한다. 피루베이트 키나제(PK, 토끼 근육, 600 내지 1000 U/mL, Sigma)는 운동 단백질에 의해 형성된 ADP를 ATP로 전환한다. 이 반응은 피루베이트로의 포스포르(에놀)피루베이트(PEP, 포스포(에놀)피루브산 모노칼륨염, Sigma)의 하나의 분자의 전환을 요한다. 피루베이트는 락테이트 탈수소효소(LDH, 토끼 근육, 900 내지 1400 U/mL, Sigma)에 의해 락테이트로 전환되어 NADH 분자를 산화시킨다. NADH의 산화는 340 내지 380 nm에서의 흡광도의 감소로 인해 분광광도법적으로 따른다(흡광 계수는 380 nm에서 1210 M-1 cm-1이고 340 nm에서 6220 M-1 cm-1임). ATP로 전환된 ADP의 분자마다 NADH의 하나의 분자가 산화되므로, 흡광도 신호의 감소는 운동 단백질에 의한 ATP 가수분해의 정상 상태 속도에 비례한다.
도 1의 C는 각각 제1 DNA 작제물 및 제2 DNA 작제물 상에 정지될 때 폐쇄된 T4 Dda 헬리카제에 의한 ATP 변환의 계산된 속도를 보여준다. 폐쇄된 T4 Dda 헬리카제가 제1 작제물의 스페이서 상에 정지될 때 ATP 변환의 촉매 속도(k cat)는 약 115 s-1였다. 그에 반해서, 폐쇄된 T4 Dda 헬리카제가 스페이서에 인접한 제2 작제물 상에 정지될 때, ATP 변환의 속도는 이 속도의 대략 2배(k cat 약 235 s-1)였다. 따라서 폐쇄된 T4 Dda 헬리카제에 의한 무용한 변환의 속도는 대략 절반이었다.
실시예 2
이 실시예는 어댑터를 다양한 상이한 스페이서 설계와 비교하고, 운동 단백질이 본원에 제공된 방법에 따라 스페이서 상에 정지될 때 무용한 ATP 변환이 감소된다는 것을 입증한다.
하기 결과 표에 기재된 것과 같이 다수의 상이한 어댑터를 스페이서 설계에 의해 제조하였다. 시험된 어댑터는 다음의 폴리뉴클레오타이드 가닥을 포함하였다: (1) 상부 가닥, (2) 하부 가닥 및 (3) 차단 가닥. 상부 가닥은 어느 한 측에서 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 플랭킹된 시험되는 스페이서 설계를 포함하였다. 차단 가닥은 예컨대 본원에 기재된 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 차단 모이어티였다.
어댑터 서열
상부 가닥: 333333333333333333333333333333CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC/ [스페이서 서열] /CCACAACTTCGTTCAGTTACGTATTGCT (즉, 서열 번호 13; 스페이서 서열에 걸쳐 서열 번호 14 및 서열 번호 16을 포함. 서열 번호 14는 서열 번호 15를 포함함)
하부 가닥: 5phos/GCAATACGTAACTGAACGAAGTTGTGG (즉, 서열 번호 17)
로딩 가닥: GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCTTT(즉, 서열 번호 18)
차단 가닥: GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCAAAAAAAAGG/3Cy5Sp/ (즉, 서열 번호 19)
어댑터 준비 및 로딩
운동 단백질을 초기에 상부 가닥, 하부 가닥 및 로딩 가닥으로 이루어진 어댑터에 로딩하였다. 로딩 가닥의 사용은 다수의 운동 단백질이 단일 어댑터 상에 로딩된 어댑터의 비율을 감소시키는 것이 바람직한 운동 단백질 로딩의 효율을 개선할 수 있는 선택적인 특징이다. 운동 단백질은 본원에 제공된 방법에 따라 스페이서로 진행하게 되고, 이렇게 하여 운동 단백질은 어댑터로부터 로딩 가닥을 변위시킨다. 차단 가닥은 후속하여 스페이서 상에 정지되고 차단 가닥에 의해 이동이 방지된 운동 단백질에 의해 완전한 어댑터를 제조하도록 어댑터에 어닐링된다. 차단 가닥은 차단 가닥의 더 긴 길이로 인해 로딩 가닥과 비교하여 어댑터에 우선적으로 결합할 수 있고; 우선적 결합은 로딩 가닥보다 상당히 더 높은 농도로 제공되는 차단 가닥에 의해 추가로 보조된다.
어댑터 준비 프로토콜
하기 농도에서 아세트산칼륨 완충액(400 mM HEPES pH 8.0, 400mM 아세트산칼륨) 중에 가닥을 어닐링하여 어댑터 폴리뉴클레오타이드 가닥을 조립하였다:
Figure pct00004
운동 단백질(Dda 헬리카제)은 10분 내지 20분 동안 주위 조건 하에 50 내지 500 nM DNA의 최종 농도에서의 어닐링된 어댑터 및 적어도 7x 몰 과량 단백질과 조합될 수 있다. (상기처럼) 아세트산칼륨 완충액 중의 TMAD(100 μM)를 첨가하고, 35℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 염/ATP 완충액(최종 농도: 0.5 M NaCl, 1 mM ATP, 10 mM MgCl2)을 20x 상부 가닥 농도에서의 차단 가닥과 함께 첨가하고, 혼합물을 25분 내지 30분 동안 실온에서 항온처리하였다.
결합된 헬리카제를 갖는 어댑터를 SPRI 비드 정제 시스템을 사용하여 정제하고, TBE 겔을 사용하여 어댑터 생성을 검증하였다.
ATP 변환 및 안정성 시험
ATP 변환 및 안정성에 대해 각각의 어댑터를 시험하였다.
ATP 변환은 무용한 ATP 변환의 측정을 제공하지만, 어댑터는 임의의 시퀀싱 반응에 참여하지 않고; ATP 변환이 더 낮고, 무용한 ATP 용법이 더 낮고, 어댑터 연료 효율이 더 높다.
어댑터 안정성을 통상적으로 나노기공 시퀀싱 반응에서 발견된 조건 하에 시험하고, 얼마나 긴 소정의 어댑터가 이러한 환경에서 기능하는 것으로 예상될 수 있는 지의 표시를 제공한다. 상이한 조건 하에, 예를 들어 더 낮은 염 농도 또는 감소된 온도에서 수행된 시퀀싱 반응이 증가된 어댑터 안정성을 제공할 수 있다는 것이 주목되어야 한다.
시험된 어댑터는 B1 내지 B52(하기 결과 표 참조)에 걸쳐 명명되었다. 결과를 운동 단백질(본원에서 어댑터 "AA"라 칭함)을 포함하는 상업적으로 입수 가능한 Oxford 나노기공 시퀀싱 어댑터와 비교하였다.
ATPase 검정 프로토콜
시험을 위한 어댑터 샘플을 SPRI 용리 완충액(50 m Tris pH 8, 20nM NaCl) 중의 10 nM의 농도로 희석하였다.
10 μL의 각각의 10nM 어댑터 샘플을 384웰 플레이트에 첨가하였다.
2.2 μL의 40 U/mL 락테이트 탈수소효소/피루베이트 키나제, 33.3 μL의 1.33x 시퀀싱 완충액, 3.3 μL의 3.33 mM NADH, 0.7 μL의 5.33mM 피루브산 및 10.4 μL의 무-뉴클레아제 수를 함유하는 NADH 마스터 믹스를 제조하였다.
NADH 마스터 믹스를 용액 중의 임의의 유리 ADP를 변환하도록 실온에서 10분 동안 항온처리하였다.
30 μL의 NADH 마스터 믹스를 384웰 플레이트의 각각의 웰에서 10 μL의 어댑터 샘플에 첨가하고 혼합하였다.
플레이트를 UV-흡광도 플레이트 리더에 첨가하고, 흡광도를 34℃에서 120회 사이클 동안 380 nm에서 측정하였다.
kcat 및 ATP 변환 값을 결정하도록 생성된 데이터를 분석하였다.
안정성 검정 프로토콜
7.8 μL의 무-뉴클레아제 수, 10 μL의 2x 시퀀싱 완충액 및 0.2 μL의 B-OTG를 함유하는 검정 마스터 믹스를 제조하였다.
PCR 관 내에서 2 μL의 125 nM 어댑터를 18 μL의 검정 마스터 믹스 +/- ATP를 첨가하여 시험에 대한 샘플을 제조하였다.
24시간 동안 45℃의 커버 온도를 갖는 34℃에서의 유전자증폭기에서 각각의 샘플을 항온처리하였다.
항온처리 후, 5% TBE 겔, 160 mV, 30분, 또는 4% 내지 20% TBE 겔, 180 mV, 45분에서 샘플을 실행하였다.
겔을 10분 동안 SYBR Gold에 의해 염색하고, Cy3 설정을 사용하여 Amersham Typhoon 스캐너에 영상화하였다.
결합 어댑터 및 비결합 어댑터의 비율을 결정하도록 농도계 분석을 수행하였다.
결과
ATP 변환에 대한 결과는 기준선으로 작용하는 비교 어댑터 AA에 의해 보인 변환의 백분율로서 기재된다. 따라서, 100% 미만의 ATP 변환 백분율 값은 모두 기준선과 비교하여 무용한 ATP 변환의 감소 및 개선된 연료 효율을 나타낸다. 결과 표에 기재된 모든 시험된 어댑터는 어댑터 AA와 비교하여 ATP 변환이 감소하고, 따라서 연료 효율이 개선되었다.
어댑터의 안정성이 또한 시험되었고, 결과는 24시간의 기간에 걸쳐 운동 단백질에 비결합된 어댑터 폴리뉴클레오타이드의 백분율의 증가로 표시된다. 결과는 로딩된 운동 단백질을 갖는 안정한 어댑터가 제조된다는 것을 입증한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 3
이 실시예는 차단 모이어티("차단 가닥")가 이미 제자리에 있을 때 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서에 직접 로딩될 수 있다는 것을 입증한다.
상기에 실시예 2에 기재된 것처럼 상부 가닥, 하부 가닥 및 차단 가닥 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제조하였다. 상부 가닥은 본원에 기재된 다수의 뉴클레오타이드 섬을 포함하는 스페이서 서열을 포함하였다.
하기 농도에서 아세트산칼륨 완충액(400 mM HEPES pH 8.0, 400mM 아세트산칼륨) 중에 가닥을 어닐링하여 어댑터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥을 조립하였다:
Figure pct00007
운동 단백질(Dda 헬리카제)은 10분 내지 20분 동안 주위 조건 하에 50 내지 500 nM DNA의 최종 농도에서의 어닐링된 어댑터 및 변하는 정도의 몰 과량 단백질과 조합될 수 있다. (상기처럼) 아세트산칼륨 완충액 중의 TMAD(100 μM)를 첨가하고, 35℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 염/ATP 완충액(최종 농도: 0.5M NaCl, 1mM ATP, 10mM MgCl2)을 첨가하고, 혼합물을 25분 내지 30분 동안 실온에서 항온처리하였다.
결합된 헬리카제를 갖는 어댑터는 HPLC 정제를 겪었고, TBE 겔을 사용하여 어댑터 제조를 검증하였다.
1x, 2x, 5x, 10x, 15x, 20x 및 30x에서의 과량의 운동 단백질에 의해 제조된 샘플을 겔에서 실행하고, 결과는 도 2에 도시되어 있다. 염/ATP 완충액의 첨가의 단계 전("폐쇄") 및 후("염/ATP") 둘 다로부터 샘플을 얻었다.
레인(lane)은 하기가 얻어진다는 것을 보여준다: 유리 DNA(로딩된 운동 단백질이 없는 어댑터); 정확히 로딩된 운동 단백질을 나타내는 1:1의 비의 운동 단백질 및 어댑터 DNA; 및 1:1 초과의 비의 소량의 운동 단백질 및 어댑터 DNA- 여기서, 다수의 운동 단백질은 초기에 단일 어댑터에 로딩됨 -. DNA 어댑터에 대한 과량의 운동 단백질이 더 많을수록, 더 높은 비율로 로딩된 어댑터(1:1 단백질:DNA)를 얻었다.
도 2에 제시된 결과는 따라서 운동 단백질이 본원에 기재된 것과 같은 DNA 섬을 포함하는 스페이서 구획에 직접 로딩될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4
이 실시예는 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 예시적인 어댑터가 DNA 시퀀싱 시스템에서 시험될 때 얻은 증가된 효율을 입증한다.
표준의 상업적으로 입수 가능한 시퀀싱 어댑터(AMX) 또는 시험 어댑터(B14, B21, C1로 본원에 명명된 어댑터) 중 어느 하나를 사용하여 상업적으로 입수 가능한 Oxford Nanopore 시퀀싱 키트(SQK-LSK109)에 의해 이중 가닥 440합체 라이브러리를 제조하였다.
시험 어댑터는 실시예 2에서 상기 기재되어 있고 이에 따라 제조되었다. 스페이서 서열은 하기와 같았다:
B14: 33338TT8TT838
B21: 333TT8TT8
C1: 333TT33TT8.
Oxford Nanopore MinION Mk1b 장치를 사용하여 MinION 유세포(FLO-MIN106)에서 440합체 라이브러리를 시퀀싱하였다. 기준선 LSK109 시퀀싱 프로토콜을 사용하여 MinKNOW 소프트웨어에 의해 데이터 수집을 수행하였다.
MiniKNOW 소프트웨어에 의해 제조된 벌크 Fast5 데이터를 분석하고, 개별 가닥 데이터를 추출하고, 후속하는 텍스트 파일에서 저장하였다. 가닥 데이터는 가닥에서의 사건의 수 및 가닥의 지속기간을 사용하여 DNA 전좌의 속도를 추정하도록 사용되었다.
도 3에 제시된 결과는 시험된 어댑터(B14, B20 및 C1)의 개선된 연료 효율에 의해, 상업적으로 입수 가능한 어댑터 AMX보다 더 빠른 속도로 장시간 시퀀싱이 계속될 수 있음을 보여준다. 결과는 또한 나노기공 시퀀싱 시스템에서의 시험된 어댑터의 안정성을 확인시켜준다.
서열 목록의 설명
서열 번호 1은 이. 콜라이로부터의 (헥사-히스티딘 태그화된) 엑소뉴클레아제 I(EcoExo I)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 2는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 3은 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소(TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 4는 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제의 아미노산 서열을 보여준다. 서열은 삼합체로 조립되는 3개의 동일한 하위단위 중 하나이다. (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp).
서열 번호 5는 바실러스 서브틸리스 파지 Phi29로부터의 Phi29 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 6은 Trwc Cba(시트로미크로븀 바쓰로마리늄) 헬리카제의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 7은 Hel308 Mbu(메타노코코이데스 부르토니) 헬리카제의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 8은 엔테로박테리아 파지 T4로부터의 Dda 헬리카제 1993의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 번호 9: 실시예 1에 기술된 폴리뉴클레오타이드 가닥의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 10: 실시예 1에 기술된 폴리뉴클레오타이드 가닥("시험" 가닥)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 11: 실시예 1에 기술된 폴리뉴클레오타이드 가닥의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 12: 실시예 1에 기술된 폴리뉴클레오타이드 가닥("시험 -10" 가닥)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 13은 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("상부 가닥")의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 14는 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("상부 가닥", 스페이서 단위 전의 부분)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 15는 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("상부 가닥", 스페이서 단위 전의 부분; 뉴클레오타이드 영역)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 16은 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("상부 가닥", 스페이서 단위 후의 부분)의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 17은 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("하부 가닥")의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 18은 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("로딩 가닥")의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 번호 19는 실시예 2에 기술된 폴리뉴클레오타이드 어댑터("차단 가닥")의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.
서열 목록
서열 번호 1 - 이. 콜라이 로부터의 엑소뉴클레아제 I
MMNDGKQQSTFLFHDYETFGTHPALDRPAQFAAIRTDSEFNVIGEPEVFYCKPADDYLPQ
PGAVLITGITPQEARAKGENEAAFAARIHSLFTVPKTCILGYNNVRFDDEVTRNIFYRNF
YDPYAWSWQHDNSRWDLLDVMRACYALRPEGINWPENDDGLPSFRLEHLTKANGIEHSNA
HDAMADVYATIAMAKLVKTRQPRLFDYLFTHRNKHKLMALIDVPQMKPLVHVSGMFGAWR
GNTSWVAPLAWHPENRNAVIMVDLAGDISPLLELDSDTLRERLYTAKTDLGDNAAVPVKL
VHINKCPVLAQANTLRPEDADRLGINRQHCLDNLKILRENPQVREKVVAIFAEAEPFTPS
DNVDAQLYNGFFSDADRAAMKIVLETEPRNLPALDITFVDKRIEKLLFNYRARNFPGTLD
YAEQQRWLEHRRQVFTPEFLQGYADELQMLVQQYADDKEKVALLKALWQYAEEIVSGSGH
HHHHH
서열 번호 2 - 이. 콜라이 로부터의 엑소뉴클레아제 III 효소
MKFVSFNINGLRARPHQLEAIVEKHQPDVIGLQETKVHDDMFPLEEVAKLGYNVFYHGQK
GHYGVALLTKETPIAVRRGFPGDDEEAQRRIIMAEIPSLLGNVTVINGYFPQGESRDHPI
KFPAKAQFYQNLQNYLETELKRDNPVLIMGDMNISPTDLDIGIGEENRKRWLRTGKCSFL
PEEREWMDRLMSWGLVDTFRHANPQTADRFSWFDYRSKGFDDNRGLRIDLLLASQPLAEC
CVETGIDYEIRSMEKPSDHAPVWATFRR
서열 번호 3 - 티. 써모필루스로부터의 RecJ 효소
MFRRKEDLDPPLALLPLKGLREAAALLEEALRQGKRIRVHGDYDADGLTGTAILVRGLAA
LGADVHPFIPHRLEEGYGVLMERVPEHLEASDLFLTVDCGITNHAELRELLENGVEVIVT
DHHTPGKTPPPGLVVHPALTPDLKEKPTGAGVAFLLLWALHERLGLPPPLEYADLAAVGT
IADVAPLWGWNRALVKEGLARIPASSWVGLRLLAEAVGYTGKAVEVAFRIAPRINAASRL
GEAEKALRLLLTDDAAEAQALVGELHRLNARRQTLEEAMLRKLLPQADPEAKAIVLLDPE
GHPGVMGIVASRILEATLRPVFLVAQGKGTVRSLAPISAVEALRSAEDLLLRYGGHKEAA
GFAMDEALFPAFKARVEAYAARFPDPVREVALLDLLPEPGLLPQVFRELALLEPYGEGNP
EPLFL
서열 번호 4 - 박테리오파지 람다 엑소뉴클레아제
MTPDIILQRTGIDVRAVEQGDDAWHKLRLGVITASEVHNVIAKPRSGKKWPDMKMSYFHT
LLAEVCTGVAPEVNAKALAWGKQYENDARTLFEFTSGVNVTESPIIYRDESMRTACSPDG
LCSDGNGLELKCPFTSRDFMKFRLGGFEAIKSAYMAQVQYSMWVTRKNAWYFANYDPRMK
REGLHYVVIERDEKYMASFDEIVPEFIEKMDEALAEIGFVFGEQWR
서열 번호 5 - Phi29 DNA 중합효소
MKHMPRKMYSCAFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYF
HNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIY
DSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQ
FKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEK
EIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIP
TIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLF
KDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEE
TKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKL
GYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKE
VTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKSGGSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSA
WSHPQFEK
서열 번호 6 - Trwc Cba 헬리카제
MLSVANVRSPSAAASYFASDNYYASADADRSGQWIGDGAKRLGLEGKVEARAFDALLRGE
LPDGSSVGNPGQAHRPGTDLTFSVPKSWSLLALVGKDERIIAAYREAVVEALHWAEKNAA
ETRVVEKGMVVTQATGNLAIGLFQHDTNRNQEPNLHFHAVIANVTQGKDGKWRTLKNDRL
WQLNTTLNSIAMARFRVAVEKLGYEPGPVLKHGNFEARGISREQVMAFSTRRKEVLEARR
GPGLDAGRIAALDTRASKEGIEDRATLSKQWSEAAQSIGLDLKPLVDRARTKALGQGMEA
TRIGSLVERGRAWLSRFAAHVRGDPADPLVPPSVLKQDRQTIAAAQAVASAVRHLSQREA
AFERTALYKAALDFGLPTTIADVEKRTRALVRSGDLIAGKGEHKGWLASRDAVVTEQRIL
SEVAAGKGDSSPAITPQKAAASVQAAALTGQGFRLNEGQLAAARLILISKDRTIAVQGIA
GAGKSSVLKPVAEVLRDEGHPVIGLAIQNTLVQMLERDTGIGSQTLARFLGGWNKLLDDP
GNVALRAEAQASLKDHVLVLDEASMVSNEDKEKLVRLANLAGVHRLVLIGDRKQLGAVDA
GKPFALLQRAGIARAEMATNLRARDPVVREAQAAAQAGDVRKALRHLKSHTVEARGDGAQ
VAAETWLALDKETRARTSIYASGRAIRSAVNAAVQQGLLASREIGPAKMKLEVLDRVNTT
REELRHLPAYRAGRVLEVSRKQQALGLFIGEYRVIGQDRKGKLVEVEDKRGKRFRFDPAR
IRAGKGDDNLTLLEPRKLEIHEGDRIRWTRNDHRRGLFNADQARVVEIANGKVTFETSKG
DLVELKKDDPMLKRIDLAYALNVHMAQGLTSDRGIAVMDSRERNLSNQKTFLVTVTRLRD
HLTLVVDSADKLGAAVARNKGEKASAIEVTGSVKPTATKGSGVDQPKSVEANKAEKELTR
SKSKTLDFGI
서열 번호 7 - Hel308 Mbu 헬리카제
MMIRELDIPRDIIGFYEDSGIKELYPPQAEAIEMGLLEKKNLLAAIPTASGKTLLAELAM
IKAIREGGKALYIVPLRALASEKFERFKELAPFGIKVGISTGDLDSRADWLGVNDIIVAT
SEKTDSLLRNGTSWMDEITTVVVDEIHLLDSKNRGPTLEVTITKLMRLNPDVQVVALSAT
VGNAREMADWLGAALVLSEWRPTDLHEGVLFGDAINFPGSQKKIDRLEKDDAVNLVLDTI
KAEGQCLVFESSRRNCAGFAKTASSKVAKILDNDIMIKLAGIAEEVESTGETDTAIVLAN
CIRKGVAFHHAGLNSNHRKLVENGFRQNLIKVISSTPTLAAGLNLPARRVIIRSYRRFDS
NFGMQPIPVLEYKQMAGRAGRPHLDPYGESVLLAKTYDEFAQLMENYVEADAEDIWSKLG
TENALRTHVLSTIVNGFASTRQELFDFFGATFFAYQQDKWMLEEVINDCLEFLIDKAMVS
ETEDIEDASKLFLRGTRLGSLVSMLYIDPLSGSKIVDGFKDIGKSTGGNMGSLEDDKGDD
ITVTDMTLLHLVCSTPDMRQLYLRNTDYTIVNEYIVAHSDEFHEIPDKLKETDYEWFMGE
VKTAMLLEEWVTEVSAEDITRHFNVGEGDIHALADTSEWLMHAAAKLAELLGVEYSSHAY
SLEKRIRYGSGLDLMELVGIRGVGRVRARKLYNAGFVSVAKLKGADISVLSKLVGPKVAY
NILSGIGVRVNDKHFNSAPISSNTLDTLLDKNQKTFNDFQ
서열 번호 8 - Dda 헬리카제
MTFDDLTEGQKNAFNIVMKAIKEKKHHVTINGPAGTGKTTLTKFIIEALISTGETGIILA
APTHAAKKILSKLSGKEASTIHSILKINPVTYEENVLFEQKEVPDLAKCRVLICDEVSMY
DRKLFKILLSTIPPWCTIIGIGDNKQIRPVDPGENTAYISPFFTHKDFYQCELTEVKRSN
APIIDVATDVRNGKWIYDKVVDGHGVRGFTGDTALRDFMVNYFSIVKSLDDLFENRVMAF
TNKSVDKLNSIIRKKIFETDKDFIVGEIIVMQEPLFKTYKIDGKPVSEIIFNNGQLVRII
EAEYTSTFVKARGVPGEYLIRHWDLTVETYGDDEYYREKIKIISSDEELYKFNLFLGKTA
ETYKNWNKGGKAPWSDFWDAKSQFSKVKALPASTFHKAQGMSVDRAFIYTPCIHYADVEL
AQQLLYVGVTRGRYDVFYV
서열 번호 9
/5Biosg/ CCTTTTTTTT GGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC /iSp18//iSp18//iSp18//iSp18/ /iBNA-C//iBNA-C//iBNA-A//iBNA-C//iBNA-A/ACTTCGTTCAGTTACGTATTGC /3Bio/
서열 번호 10
GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCAAAAAAAAGG
서열 번호 11/5phos/GCAATACGTAACTGAACGAAGT/iBNA-T//iBNA-G//iBNA-T//iBNA-G//iBNA-G/
서열 번호 12
CCAAGCAGACGCC AAAAAAAAGG
서열 번호 13
333333333333333333333333333333CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC/ [스페이서 서열] /CCACAACTTCGTTCAGTTACGTATTGCT
서열 번호 14
333333333333333333333333333333CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC
서열 번호 15
CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC
서열 번호 16
CCACAACTTCGTTCAGTTACGTATTGCT
서열 번호 17
5phos/GCAATACGTAACTGAACGAAGTTGTGG
서열 번호 18
GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCTTT
서열 번호 19
GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCAAAAAAAAGG/3Cy5Sp/
SEQUENCE LISTING <110> OXFORD NANOPORE TECHNOLOGIES LIMITED <120> METHOD <130> N416641WO <140> PCT/GB2020/051260 <141> 2020-05-22 <150> GB 1907244.6 <151> 2019-05-22 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 485 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala 20 25 30 Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val 35 40 45 Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val 50 55 60 Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn 65 70 75 80 Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys 85 90 95 Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr 100 105 110 Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp 115 120 125 Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys 130 135 140 Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly 145 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95 Leu Phe Glu Gln Lys Glu Val Pro Asp Leu Ala Lys Cys Arg Val Leu 100 105 110 Ile Cys Asp Glu Val Ser Met Tyr Asp Arg Lys Leu Phe Lys Ile Leu 115 120 125 Leu Ser Thr Ile Pro Pro Trp Cys Thr Ile Ile Gly Ile Gly Asp Asn 130 135 140 Lys Gln Ile Arg Pro Val Asp Pro Gly Glu Asn Thr Ala Tyr Ile Ser 145 150 155 160 Pro Phe Phe Thr His Lys Asp Phe Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Glu Val 165 170 175 Lys Arg Ser Asn Ala Pro Ile Ile Asp Val Ala Thr Asp Val Arg Asn 180 185 190 Gly Lys Trp Ile Tyr Asp Lys Val Val Asp Gly His Gly Val Arg Gly 195 200 205 Phe Thr Gly Asp Thr Ala Leu Arg Asp Phe Met Val Asn Tyr Phe Ser 210 215 220 Ile Val Lys Ser Leu Asp Asp Leu Phe Glu Asn Arg Val Met Ala Phe 225 230 235 240 Thr Asn Lys Ser Val Asp Lys Leu Asn Ser Ile Ile Arg Lys Lys Ile 245 250 255 Phe Glu Thr Asp Lys Asp Phe Ile Val Gly Glu Ile Ile Val Met Gln 260 265 270 Glu Pro Leu Phe Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu 275 280 285 Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gln Leu Val Arg Ile Ile Glu Ala Glu Tyr 290 295 300 Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile 305 310 315 320 Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr 325 330 335 Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe 340 345 350 Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Ala Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys 355 360 365 Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe 370 375 380 Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly 385 390 395 400 Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala 405 410 415 Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly 420 425 430 Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val 435 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide strand discussed in the example 1. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5Biosg <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> iSp18 <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> iSp18 <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> iSp18 <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> iSp18 <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> iBNA-C <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> iBNA-C <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> iBNA-A <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> iBNA-C <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> iBNA-A <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> 3Bio <400> 9 nccttttttt tggcgtctgc ttgggtgttt aaccnnnnnn nnnacttcgt tcagttacgt 60 attgcn 66 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide strand discussed in the example 1 ("Test" strand). <400> 10 ggttaaacac ccaagcagac gccaaaaaaa agg 33 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide strand discussed in the example 1. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5phos <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> iBNA-T <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> iBNA-G <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> iBNA-T <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> iBNA-G <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> iBNA-G <400> 11 ngcaatacgt aactgaacga agtnnnnn 28 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide strand discussed in the example 1 ("Test -10" strand). <400> 12 ccaagcagac gccaaaaaaa agg 23 <210> 13 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ( "top strand"). <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> spacer sequence <400> 13 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cctttttttt ggcgtctgct tgggtgttta 60 accnccacaa cttcgttcag ttacgtattg ct 92 <210> 14 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ("top strand", portion preceding the spacer unit). <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> 3 <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> 3 <400> 14 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cctttttttt ggcgtctgct tgggtgttta 60 acc 63 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ("top strand", portion preceding the spacer unit; nucleotide region). <400> 15 cctttttttt ggcgtctgct tgggtgttta acc 33 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ("top strand", portion following the spacer unit). <400> 16 ccacaacttc gttcagttac gtattgct 28 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ("bottom strand"). <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5phos <400> 17 ngcaatacgt aactgaacga agttgtgg 28 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ("loading strand"). <400> 18 ggttaaacac ccaagcagac gccttt 26 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of a polynucleotide adapter discussed in example 2 ("blocking strand"). <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> 3Cy5Sp <400> 19 ggttaaacac ccaagcagac gccaaaaaaa aggn 34

Claims (41)

  1. 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질(motor protein)을 로딩하는 방법으로서,
    i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
    ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    iii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 단계를 포함하고;
    폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    i) 스페이서 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
    ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    iii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 단계를 포함하고;
    차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는, 방법.
  3. 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 운동 단백질을 로딩하는 방법으로서,
    i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
    ii) 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 운동 단백질과 접촉시키는 단계;
    iii) 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 단계; 및
    iv) 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    i) 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계;
    ii) 로딩 부위를 운동 단백질과 접촉시키는 단계;
    iii) 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 하는 단계; 및
    iv) 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 단계를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 로딩 부위로 이동하는 것을 방지하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    - 단계 (ii)는 로딩 부위를 운동 단백질과 접촉시키는 것을 포함하고, 운동 단백질은 로딩 부위와 맞물리고;
    - 단계 (iv)는 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것을 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하고 로딩 부위와 재맞물리는 것을 방지하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 것은 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드에 결합될 때와 비교하여 운동 단백질이 연료 분자(fuel molecule)를 변환(turnover)시키는 속도를 감소시키는, 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 로딩 부위에 결합하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것은 운동 단백질에 물리적 힘 또는 화학적 힘을 가하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것은 운동 단백질을 하나 이상의 연료 분자와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고; 운동 단백질은 제1 운동 단백질이고, 제1 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서로 진행하게 하는 것은 로딩 부위에 제2 운동 단백질을 로딩하는 것 및 제2 운동 단백질이 로딩 부위로부터 스페이서 쪽으로 진행하게 하는 것을 포함하고, 제2 운동 단백질은 제1 운동 단백질을 스페이서 상으로 미는, 방법.
  11. 제1항 및 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질을 스페이서 상으로 미는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 로딩 부위에 결합하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 로딩 부위는 스페이서와 인접하고, 차단 모이어티는 스페이서에 바로 인접한 로딩 부위에 결합하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)은 스페이서가 운동 단백질의 활성 부위를 점유하도록 운동 단백질이 스페이서로 진행하게 하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 로딩 부위는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 로딩 부위는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 모이어티는 물리적 차단 모이어티 또는 화학적 차단 모이어티인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 입체적으로 방지하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 모이어티를 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합하는 것은 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 화학 기를 도입하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 로딩 모이어티는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 차단 모이어티는 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; (ii) 로딩 부위에 차단 모이어티를 결합하는 것은 차단 모이어티를 로딩 부위에 혼성화하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 모이어티는 길이가 약 2개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드 단위인 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 또는 비혼성화된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서는
    i) 하나 이상의 니트로인돌, 하나 이상의 이노신, 하나 이상의 아크리딘, 하나 이상의 2-아미노푸린, 하나 이상의 2-6-디아미노푸린, 하나 이상의 5-브로모-데옥시우리딘, 하나 이상의 인버티드 티미딘(인버티드 dT), 하나 이상의 인버티드 디데옥시-티미딘(ddT), 하나 이상의 디데옥시-시티딘(ddC), 하나 이상의 5-메틸시티딘, 하나 이상의 5-하이드록시메틸시티딘, 하나 이상의 2'-O-메틸 RNA 염기, 하나 이상의 이소-데옥시시티딘(이소-dC), 하나 이상의 이소-데옥시구아노신(이소-dG), 하나 이상의 C3 (OC3H6OPO3) 기, 하나 이상의 광 절단성(PC) [OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3] 기, 하나 이상의 헥산디올 기, 하나 이상의 스페이서 9(iSp9) [(OCH2CH2)3OPO3] 기 또는 하나 이상의 스페이서 18(iSp18) [(OCH2CH2)6OPO3] 기;
    ii) 하나 이상의 티올 연결;
    iii) 하나 이상의 탈염기성 뉴클레오타이드;
    iv) 로딩 부위에 대한 상이한 골격 구조의 하나 이상의 뉴클레오타이드;
    v) 하나 이상의 운동 단백질이 정지(stall)되게 하는 하나 이상의 화학 기; 및/또는
    vi) 중합체를 포함하고, 선택적으로 상기 중합체는 폴리펩타이드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하고, 바람직하게는 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오타이드 섬(nucleotide island)을 포함하는, 방법.
  24. 제1항, 제2항, 제6항 내지 제9항 및 제12항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    i) 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 하나 이상의 뉴클레오타이드 섬을 포함하는 스페이서; 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하고;
    ii) 스페이서 상에 운동 단백질을 배치하는 것은 운동 단백질을 스페이서와 접촉시키는 것 및 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 운동 단백질을 변형시키는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 스페이서는 -S-N-S-N-S-N-S-; -S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-; -N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-; -S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-; -N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-;-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-; -S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-; -S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-:-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-; 및 -S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-로부터 선택된 하나 이상의 모이어티를 포함하고;
    각각의 S는 스페이서 단위이고, 각각의 N은 뉴클레오타이드인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 운동 단백질은 헬리카제, 중합효소, 엑소뉴클레아제, 토포아이소머라제, 또는 이들의 변이체인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상의 운동 단백질은 운동 단백질이 스페이서로부터 이탈하는 것을 방지하도록 변형된, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 운동 단백질은 Hel308 헬리카제, RecD 헬리카제, TraI 헬리카제, TrwC 헬리카제, XPD 헬리카제 및 Dda 헬리카제, 또는 이들의 변이체로부터 독립적으로 선택된 헬리카제인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    v) 스페이서 상에 배치되지 않은 과량의 운동 단백질 분자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 막관통 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 방법으로서,
    i) (A) 표적 폴리뉴클레오타이드; (B) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터; 및 (C) 운동 단백질을 제공하는 단계;
    ii) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하여 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 운동 단백질을 정지시키는 단계;
    iii) 표적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상의 정지된 운동 단백질을 나노기공과 접촉시키는 단계; 및
    iv) 막관통 나노기공에 걸쳐 전위를 가하여 운동 단백질이 스페이서를 지나 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하게 하여 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 어댑터가 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되기 전에 운동 단백질은 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지되는, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터 상에 정지되기 전에 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되는, 방법.
  33. 막관통 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 방법으로서,
    i) 표적 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계;
    ii) 스페이서를 포함하고 그 위에 운동 단백질이 정지된 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 제공하는 단계이되, 상기 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되는 단계;
    iii) 표적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터를 나노기공과 접촉시키는 단계; 및
    iv) 막관통 나노기공에 걸쳐 전위를 가하여 운동 단백질이 스페이서를 지나 표적 폴리뉴클레오타이드로 이동하게 하여 나노기공과 관련된 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 방법으로서,
    i) 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계; 및
    ii) 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 하나 이상의 측정을 취하는 단계이되, 하나 이상의 측정은 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 특징을 나타내고, 이로써 표적 폴리뉴클레오타이드가 나노기공과 관련하여 이동하면서 표적 폴리뉴클레오타이드를 특성평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 폴리뉴클레오타이드 어댑터로서, (i) 스페이서; (ii) 스페이서 상에 정지된 운동 단백질이되, 운동 단백질의 활성 부위는 스페이서에 의해 점유된 운동 단백질; 및 (iii) 어댑터에 결합된 차단 모이어티이되, 차단 모이어티는 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는 차단 모이어티를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 어댑터.
  36. 제35항에 있어서, (i) 어댑터는 스페이서에 연결된 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 로딩 부위에 결합되고; (ii) 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것을 방지하는, 폴리뉴클레오타이드 어댑터.
  37. 제36항에 있어서,
    i) 5' 내지 3' 방향의 {LB-S-D}n 또는 {D-S-LB}n- 여기서, LB는 차단된 로딩 부위이고; S는 스페이서이고; D는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; n은 정수, 선택적으로 1 내지 약 20의 정수임 -; 및
    ii) 스페이서(S) 상에 정지된 하나 이상의 운동 단백질을 포함하고;
    각각의 LB 모이어티는 각각의 운동 단백질이 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(D)로부터 먼 방향으로 스페이서(S)로부터 이동하는 것을 방지하는, 폴리뉴클레오타이드 어댑터.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    i) 5' 내지 3' 방향의 {LB-S-D}n 또는 {D-S-LB}n- 여기서, LB는 제1 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; S는 스페이서이고; D는 제2 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드이고; n은 정수, 선택적으로 1 내지 약 20의 정수이고; 제1 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(LB)는 스페이서(S)와 인접하고, 스페이서(S)는 제2 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(D)와 인접함 -; 및
    ii) 스페이서(S) 상에 정지된 하나 이상의 운동 단백질을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 어댑터.
  39. 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형하기 위한 키트로서,
    i) 스페이서를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터;
    ii) 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있는 운동 단백질; 및
    iii) 운동 단백질이 폴리뉴클레오타이드 어댑터의 스페이서 상에 배치되고 운동 단백질의 활성 부위가 스페이서에 의해 점유될 때, 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있는 차단 모이어티를 포함하고;
    선택적으로 폴리뉴클레오타이드 어댑터는 로딩 부위를 포함하고, 차단 모이어티는 운동 단백질이 로딩 부위와 맞물리는 것이 방지되도록 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합할 수 있는, 키트.
  40. 표적 폴리뉴클레오타이드를 변형하기 위한 키트로서,
    i) 스페이서 및 폴리뉴클레오타이드 어댑터에 결합된 차단 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어댑터; 및
    ii) 표적 폴리뉴클레오타이드의 이동을 제어할 수 있는 운동 단백질을 포함하고;
    차단 모이어티는 운동 단백질이 어댑터에 결합될 때 운동 단백질이 스페이서로부터 이동하는 것을 방지하는, 키트.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 어댑터 또는 키트로서,
    - 로딩 부위, 차단 모이어티 및/또는 스페이서는 각각 독립적으로 제12항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같고/같거나;
    - 운동 단백질은 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은, 폴리뉴클레오타이드 어댑터 또는 키트.
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