CN114269947A - 方法 - Google Patents

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S·R·维拉里尔
S·J·马丁
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Abstract

本文提供了一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法。还提供了多核苷酸衔接子和包含此类衔接子的试剂盒。所述衔接子可用于在多核苷酸相对于纳米孔移动的方法中表征分析物例如多核苷酸。

Description

方法
技术领域
本发明涉及将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法、使用该新颖方法表征多核苷酸的方法、以及新颖的多核苷酸衔接子。
背景技术
纳米孔感测是一种依赖于对分析物分子与离子传导通道之间的个别结合或相互作用事件的观察的分析物检测和表征方法。可以通过在电绝缘膜中放置纳米尺寸的单孔和测量在存在分析物分子的情况下通过孔的电压驱动的离子电流来产生纳米孔传感器。纳米孔内部或附近的分析物的存在将改变通过孔的离子流，从而引起在通道上测量的离子或电流改变。分析物的同一性通过其独特的电流特征揭露，尤其是电流块的持续时间和程度以及与孔相互作用期间电流电平的变化。
多核苷酸是用于以这种方式进行感测的重要分析物。多核苷酸分析物的纳米孔感测可以揭示所感测的分析物的身份并对其执行单分子计数，但也可以提供有关其组成的信息，例如其核苷酸序列，以及例如碱基修饰、氧化、还原、脱羧、脱氨基等特征的存在。纳米孔感测可能允许快速且廉价的多核苷酸测序，从而提供数十到数万个碱基长度的多核苷酸的单分子序列读段。
使用纳米孔感测的聚合物表征的基本组成部分中的两个组成部分是：(1)控制聚合物移动通过孔；以及(2)在聚合物移动通过孔时区分构成的构建块。在分析物(例如多核苷酸)的纳米孔感测期间，重要的是控制多核苷酸相对于孔的运动。不受控制的运动可阻止或阻碍多核苷酸的准确表征。例如，当不控制多核苷酸相对于孔的运动时，准确区分均聚多核苷酸中的每个核苷酸是成问题的。
为了解决这个问题，已知使用马达蛋白来控制聚合物如多核苷酸的运动，同时对所述聚合物进行表征。合适的马达蛋白包括多核苷酸处理酶，例如解旋酶、外切核酸酶、拓扑异构酶等。马达蛋白以受控方式处理多核苷酸。因此，马达蛋白可用于控制聚合物如多核苷酸相对于孔的运动。
虽然使用马达蛋白已经允许在加工多核苷酸以通过纳米孔感测表征中实现显著改进，但技术挑战仍然存在。一个问题涉及确保马达蛋白相对于要在表征开始前确定的多核苷酸序列处于正确位置。例如，如果马达蛋白在表征开始之前已经开始加工多核苷酸，则多核苷酸的在表征开始之前已经加工的部分可能无法准确确定。
为了解决这个问题，已知在表征之前将马达蛋白“停滞”在多核苷酸衔接子上。在表征开始之前，马达蛋白不加工靶多核苷酸。以此方式，靶多核苷酸的改进表征是可能的。
本领域已知的一种方法是使用间隔区将马达蛋白例如解旋酶停滞在分子衔接子上。间隔区是衔接子的一部分，其阻止马达蛋白(例如解旋酶)移动到待表征的靶多核苷酸上。在没有外力的情况下，马达蛋白(解旋酶)到靶多核苷酸上的运动被阻止。然而，在外力(例如可以通过使靶多核苷酸穿过纳米孔而提供的外力)的影响下，马达蛋白可以移动到靶多核苷酸上，从而控制靶多核苷酸相对于孔的运动。此类方法描述于WO 2014/135838中，该专利的全部内容以引用方式并入。
虽然使马达蛋白停滞的方法带来了显著的益处，但人们已经认识到，如果能够减少由停滞的马达蛋白引起的“燃料”分子(例如多核苷酸加工所需的辅因子)的转换，则可以提高此类系统的效率。因此，需要用于将多核苷酸加载到分子衔接子上的改进方法来解决这个问题。
发明内容
本公开涉及一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法。所述方法包括提供包含间隔区的多核苷酸衔接子。多核苷酸衔接子与马达蛋白接触，导致马达蛋白前进到间隔区上。封闭部分与多核苷酸衔接子结合。使封闭部分与多核苷酸衔接子结合可防止马达蛋白从间隔区移开。防止马达蛋白从间隔区移开可具有有益效应，例如与马达蛋白与多核苷酸结合时相比，降低马达蛋白转换燃料分子的速率。
因此，本文提供了一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法，该方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；以及
iii)将马达蛋白定位在间隔区上；
其中与多核苷酸衔接子结合的封闭部分防止了马达蛋白从间隔区移开。
在一些实施方式中，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子和与多核苷酸衔接子结合的封闭部分；
ii)使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；以及
iii)将马达蛋白定位在间隔区上；
其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。
还提供了一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；
iii)使马达蛋白前进到间隔区上；以及
iv)使封闭部分多核苷酸衔接子结合，其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。
在一个实施方式中，所述方法包括：
i)提供包含连接至间隔区的加载位点的多核苷酸衔接子；
ii)使加载位点与马达蛋白接触；
iii)使马达蛋白从加载位点前进到间隔区上；以及
iv)使封闭部分与多核苷酸衔接子结合，其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开并移到加载位点上。
在一个实施方式中，该方法的步骤(ii)包括使加载位点与马达蛋白接触，其中马达蛋白与加载位点接合；并且该方法的步骤(iv)包括使封闭部分与多核苷酸衔接子结合，其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开并与加载位点重接合。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点，并且其中马达蛋白与多核苷酸衔接子的加载位点结合。
在一些实施方式中，使马达蛋白前进到间隔区上包括向马达蛋白施加物理或化学力。在一个实施方式中，使马达蛋白前进到间隔区上可包括使马达蛋白与一个或多个燃料分子接触。在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点；马达蛋白是第一马达蛋白，并且使第一马达蛋白从加载位点前进到间隔区上包括将第二马达蛋白加载到加载位点上，以及使第二马达蛋白从加载位点朝向间隔区前进，其中第二马达蛋白迫使第一马达蛋白到间隔区上。在一个实施方式中，使封闭部分与多核苷酸衔接子结合迫使马达蛋白到间隔区上。
在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点，并且封闭部分与加载位点结合。在一个实施方式中，加载位点与间隔区邻接并且封闭部分与紧邻间隔区的加载位点结合。
在一个实施方式中，步骤(iii)包括使马达蛋白前进到间隔区上，使得间隔区占据马达蛋白的活性位点。
在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点并且加载位点包含单链或非杂交的多核苷酸。在一个实施方式中，加载位点包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。
在一些实施方式中，封闭部分是物理或化学封闭部分。在一个实施方式中，使封闭部分与多核苷酸衔接子结合在空间上防止马达蛋白从间隔区移开。在一个实施方式中，使封闭部分与多核苷酸衔接子结合引入了化学基团，所述化学基团防止马达蛋白从间隔区移开。
在一些实施方式中，(i)加载部分包含单链或非杂交多核苷酸并且封闭部分包含单链或非杂交多核苷酸；并且(ii)将封闭部分与加载位点结合包括将封闭部分与加载位点杂交。在一个实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区包括：
i)一个或多个硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿苷、一个或多个反向胸苷(反向dT)、一个或多个反向双脱氧胸苷(ddT)、一个或多个双脱氧胞苷(ddC)、一个或多个5-甲基胞苷、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2’-O-甲基RNA碱基、一个或多个异脱氧胞苷(Iso-dC)、一个或多个异脱氧鸟苷(Iso-dG)、一个或多个C3(OC3H6OPO3)基团、一个或多个可光分解(PC)[OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3]基团、一个或多个己二醇基团、一个或多个间隔区9(iSp9)[(OCH2CH2)3OPO3]基团、一个或多个间隔区18(iSp18)[(OCH2CH2)6OPO3]基团；
ii)一个或多个硫醇连接；
iii)一个或多个无碱基核苷酸；
iv)一个或多个具有与加载位点不同的骨架结构的核苷酸；
v)一个或多个化学基团，所述一个或多个化学基团导致一个或多个马达蛋白停滞；和/或
vi)聚合物，任选地其中所述聚合物是多肽或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方式中，间隔区包含一个或多个核苷酸，优选地其中间隔区包含一个或多个核苷酸岛。
在一些实施方式中：
i)多核苷酸衔接子包含间隔区，所述间隔区包含一个或多个核苷酸，优选地一个或多个核苷酸岛；以及与多核苷酸衔接子结合的封闭部分；并且
ii)将马达蛋白定位在间隔区上包括使马达蛋白与间隔区接触并修饰马达蛋白以防止马达蛋白从间隔区脱离。
在一些实施方式中，间隔区包含一个或多个选自以下的部分：
-S-N-S-N-S-N-S-；-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；和-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；
其中每个S是间隔区单元，并且每个N是核苷酸。
在一些实施方式中，马达蛋白是解旋酶、聚合酶、外切核酸酶、拓扑异构酶、或它们的变体。在一个实施方式中，修饰多核苷酸衔接子的间隔区上的马达蛋白以防止马达蛋白从间隔区脱离。在一个实施方式中，所述或每个马达蛋白是独立地选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、TraI解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和Dda解旋酶或它们的变体的解旋酶。
在一个实施方式中，所述方法还包括去除不位于间隔区上的过量马达蛋白分子的步骤(v)。
还提供了一种控制靶多核苷酸相对于跨膜纳米孔的移动的方法，所述方法包括：
i)提供(A)靶多核苷酸；(B)包含间隔区的多核苷酸衔接子；和(C)马达蛋白；
ii)进行根据上述实施方式中的任一实施方式的方法，从而使马达蛋白在多核苷酸衔接子的间隔区上停滞；
iii)使靶多核苷酸和多核苷酸衔接子的间隔区上停滞的马达蛋白与纳米孔接触；以及
iv)在跨膜纳米孔上施加电位，从而使马达蛋白移动越过间隔区到达靶多核苷酸上，从而控制靶多核苷酸相对于纳米孔的运动。
在一个实施方式中，在多核苷酸衔接子附接至靶多核苷酸之前，马达蛋白停滞在多核苷酸衔接子上。在另一个实施方式中，在马达蛋白停滞在多核苷酸衔接子上之前，多核苷酸衔接子附接至靶多核苷酸。
还提供了一种控制靶多核苷酸相对于跨膜纳米孔的移动的方法，所述方法包括：
i)提供靶多核苷酸；
ii)提供包含间隔区并且其上停滞有马达蛋白的多核苷酸衔接子，其中所述多核苷酸衔接子是根据本文所公开的方法获得的；
iii)使靶多核苷酸和多核苷酸衔接子与纳米孔接触；以及
iv)在跨膜纳米孔上施加电位，从而使马达蛋白移动越过间隔区到达靶多核苷酸上，从而控制靶多核苷酸相对于纳米孔的运动。
在一些实施方式中，所述方法还包括在靶多核苷酸相对于纳米孔移动时进行一次或多次测量，其中该一次或多次测量指示靶多核苷酸的一个或多个特征，从而在靶多核苷酸相对于纳米孔移动时表征靶多核苷酸。
还提供了一种多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含(i)间隔区；(ii)停滞在间隔区上的马达蛋白，其中马达蛋白的活性位点被间隔区占据；以及(iii)与衔接子结合的封闭部分，其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。
在一个实施方式中，(i)衔接子包含连接至间隔区的加载位点并且封闭部分与加载位点结合；并且(ii)封闭部分阻止马达蛋白与加载位点接合。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含：
i)在5'到3'方向上的{LB-S-D}n或{D-S-LB}n；其中LB是经封闭的加载位点；S是间隔区；D是双链多核苷酸；并且n是整数，可选地1至约20的整数；以及
ii)停滞在间隔区(S)上的一个或多个马达蛋白；
其中该或每个LB部分防止该或每个马达蛋白在远离双链多核苷酸(D)的方向上从间隔区(S)移开。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含：
i)在5'到3'方向上的{LB-S-D}n或{D-S-LB}n；其中LB是第一双链多核苷酸；S是间隔区；D是第二双链多核苷酸；并且n是整数，可选地1至约20的整数；并且其中第一双链多核苷酸(LB)与间隔区(S)邻接并且间隔区(S)与第二双链多核苷酸(D)邻接；以及
ii)停滞在间隔区(S)上的一个或多个马达蛋白。
还提供了一种用于修饰靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)能够控制靶多核苷酸运动的马达蛋白；以及
iii)封闭部分，所述封闭部分能够与多核苷酸衔接子结合，使得当马达蛋白位于多核苷酸衔接子的间隔区上并且马达蛋白的多核苷酸解旋位点被间隔区占据时，防止马达蛋白从间隔区移开
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含加载位点并且封闭部分能够与多核苷酸衔接子结合，从而防止马达蛋白与加载位点接合。
还提供了一种用于修饰靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)包含间隔区的多核苷酸衔接子和与多核苷酸衔接子结合的封闭部分；和
ii)能够控制靶多核苷酸的运动的马达蛋白；
其中当马达蛋白与衔接子结合时，封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。
在一些实施方式中，根据前述实施方式的多核苷酸衔接子或试剂盒包含各自独立地如前述实施方式中的任一实施方式中所定义的加载位点、封闭部分、间隔区和/或马达蛋白。
附图说明
图1.使用本文所公开的方法减少无用转换。图1(A)示出了包含双链DNA、之后是间隔区(4×Sp18间隔区基团)以及之后是进一步的双链DNA的构建体的示意图。间隔区侧接有双链DNA，使得在间隔区的任一端都没有单链DNA可接触。Dda解旋酶停滞在间隔区上。图1(B)示出了类似的构建体，其中间隔区不侧接有双链DNA并且下部链缺失10个残基。因此，该构建体包含位于间隔区的5'端侧翼的单链DNA。图1(C)图示了条形图，所述条形图比较了分别在图1(A)和图1(B)的构建体上停滞的Dda解旋酶对ATP转换的催化速率。该数据在实施例1中讨论。
图2.加载滴定结果显示有效使马达蛋白在包含如本文所定义的间隔区的衔接子上停滞。该数据在实施例3中讨论。
图3.结果显示，与缺少如本文所述的间隔区的衔接子相比，当将根据本文所述的方法的示例性衔接子在DNA测序系统中测试时获得了提高的效率。该数据在实施例4中讨论。
具体实施方式
本发明将相对于具体实施方式并参考某些附图来说明，但本发明并不受限于此而只受权利要求限制。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。当然，应当理解的是，不一定所有方面或优点可以根据本发明的任何特定实施方式来实现。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化如本文所教导的一个优点或一组优点的方式体现或执行，而不必实现如本文可以教导或建议的其他方面或优点。
当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本发明(关于组织和操作方法两者)以及其特征和优点。本发明的各方面和优点将根据下文描述的一个或多个实施方式而变得显而易见，并且将参考所述实施方式进行阐述。在整个本说明书中对“一个实施方式”或“实施方式”的提及意味着结合实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方式中。因此，在整个本说明书中各个地方出现的短语“在一个实施方式中(in one embodiment)”或“在实施方式中(in an embodiment)”不一定都是指同一个实施方式，但是可以指代同一个实施方式。类似地，应理解，在本发明的示例性实施方式的描述中，出于简单化本公开并且帮助理解各种发明性方面中的一个或多个的目的，本发明的各种特征有时被一起分组在单个实施方式、附图或其描述中。然而，本公开的方法不应被解释为反映所要求保护的发明需要的特征比在每个权利要求中明确地叙述的更多的意图。相反，如以下权利要求书所反映，发明性方面在于比单个前述公开的实施方式的所有特征更少。
应当理解，除非上下文另有说明，否则本公开的“实施方式”可以具体地组合在一起。所有公开的实施方式的特定组合(除非上下文另有暗示)是要求保护的发明的进一步公开的实施方式。
另外，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另外明确指明，否则单数形式的“一种(a)”、“一个(an)”以及“所述(the)”均包括复数对象。因此，例如，对“多核苷酸”的提及包含两个或更多个多核苷酸；对“马达蛋白”的提及包含两个或更多个此类蛋白质；对“解旋酶”的提及包含两个或更多个解旋酶；对“单体”的提及是指两个或更多个单体；对“孔”的提及包含两个或更多个孔等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。
定义
当提及单数名词(例如“一个(a)”或“一种(an)”、“所述(the)”)时使用不定冠词或定冠词时，除非另有具体说明，否则这包含所述名词的复数形式。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括(comprising)”时，其并不排除其他要素或步骤。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分相似要素，而不一定用于描述顺序或时间次序。应该理解的是，如此使用的术语在适当情况下是可互换的，并且在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述或说明的其他顺序操作。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文另有具体定义，否则在本文中使用的所有术语具有对本发明所属领域的技术人员来说相同的含义。针对本领域的定义和术语，执业医师特别参照Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,第4版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),纽约普莱恩维尤(2012)；和Ausubel等人,《分子生物学最新方案(Current Protocols in Molecular Biology)》(副刊114),约翰威利父子出版社(John Wiley&Sons),纽约(2016)。本文提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
当提及如量、持续时间等可测量的值时，本文所使用的术语“约”意味着涵盖与指定值的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，以及还更优选±0.1％的偏差，因为此类偏差适合于执行所公开的方法。
本文所使用的术语“核苷酸序列”、“DNA序列”或“一个或多个核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。此术语仅指分子的一级结构。因此，此术语包含双链和单链DNA，以及RNA。本文所使用的术语“核酸”是单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3'和5'端通过磷酸二酯键连接。多核苷酸可以由脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基构成。核酸可以在体外合成制造，或者从天然来源中分离。核酸可以进一步包含经修饰的DNA或RNA，例如已经被甲基化的DNA或RNA，或已经经受翻译后修饰的RNA，所述翻译后修饰例如是采用7-甲基鸟苷的5'封端、如裂解和聚腺苷酸化等3'加工以及剪接。核酸还可以包含合成核酸(XNA)，如己糖醇核酸(HNA)、环己烯核酸(CeNA)、苏糖核酸(TNA)、甘油核酸(GNA)、锁核酸(LNA)和肽核酸(PNA)。核酸(在本文中也称为“多核苷酸”)的大小通常表示为双链多核苷酸的碱基对(bp)的数量，或在单链多核苷酸的情况下，表示为核苷酸(nt)的数量。一千bp或nt等于千碱基(kb)。长度小于约40个核苷酸的多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”，并且可以包括用于如通过聚合酶链反应(PCR)操纵DNA的引物。
在本公开的上下文中，术语“氨基酸”以其最广泛的意义使用，并且意指包含含有胺(NH2)和羧基(COOH)官能团以及对每种氨基酸具有特异性的侧链(例如R基团)的有机化合物。在一些实施方式中，氨基酸是指天然存在的Lα-氨基酸或残基。本文中使用天然存在的氨基酸的一个和三个常用的字母缩写：A＝Ala；C＝Cys；D＝Asp；E＝Glu；F＝Phe；G＝Gly；H＝His；I＝Ile；K＝Lys；L＝Leu；M＝Met；N＝Asn；P＝Pro；Q＝Gln；R＝Arg；S＝Ser；T＝Thr；V＝Val；W＝Trp；以及Y＝Tyr(Lehninger,A.L.,(1975)《生物化学(Biochemistry)》,第2版,第71-92页,沃思出版社(Worth Publishers),纽约)。一般术语“氨基酸”进一步包含D-氨基酸、逆反式氨基酸以及化学修饰的氨基酸，如氨基酸类似物、通常不并入到蛋白质中的天然存在的氨基酸(如正亮氨酸)以及具有本领域已知为氨基酸特性的性质的化学合成的化合物(如β-氨基酸)。例如，允许肽化合物具有与天然Phe或Pro相同的构象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物包含在氨基酸的定义中。此类类似物和模拟物在本文中被称为相应氨基酸的“功能等同物”。氨基酸的其他示例由Roberts和Vellaccio,《肽：分析、合成、生物学(The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology)》,Gross和Meiehofer编辑,第5期第341页,学术出版社(Academic Press,Inc.),纽约1983列出，所述文献通过引用并入本文。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，如对应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。多肽还可以经历成熟或翻译后修饰过程，所述过程可以包含但不限于：糖基化、蛋白水解裂解、脂化、信号肽裂解、前肽裂解、磷酸化等。“可以使用重组技术例如通过表达重组或合成的多核苷酸来制备肽。重组产生的肽通常基本上不含培养基，例如培养基占蛋白质制品体积的小于约20％，更优选小于约10％，最优选小于约5％。
术语“蛋白质”用于描述具有二级或三级结构的折叠多肽。蛋白质可以由单个多肽构成，或者可以包括组装形成多聚体的多个多肽。多聚体可以是同源寡聚体或异源寡聚体。蛋白质可以是天然存在的或野生型蛋白质，或者是经修饰的或非天然存在的蛋白质。蛋白质可以例如通过一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失而不同于野生型蛋白质。
蛋白质的“变体”涵盖肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未经修饰的或野生型蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有与其所衍生的未经修饰的蛋白质类似的生物和功能活性。如本文所用，术语“氨基酸同一性”是指序列在氨基酸对氨基酸的基础上在比较窗口上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过以下来计算：在比较窗口上比较两个经过最佳比对的序列，确定相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
对于本发明的所有方面和实施方式，“变体”与对应的野生型蛋白质的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％完整序列同一性。序列同一性还可以是全长多核苷酸或多肽的片段或部分。因此，序列可以与全长参考序列具有仅50％的整体序列同一性，但是特定区域、结构域或亚基的序列可以与参考序列共享80％、90％或多达99％的序列同一性。
术语“野生型”是指与天然存在的来源分离的基因或基因产物。野生型基因是群体中最常观察到的基因，并且因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“经修饰的”、“突变体”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比显示序列的修饰(例如，取代、截短或插入)、翻译后修饰和/或功能特性质(例如，改变的特性)的基因或基因产物。注意，天然存在的突变体可以被分离；通过与野生型基因或基因产物相比其具有改变的特性这一事实来鉴定这些突变体。用于引入或取代天然存在的氨基酸的方法在本领域是众所周知的。举例来说，可通过在编码突变单体的多核苷酸中的相关位置处用精氨酸的密码子(CGT)置换甲硫氨酸的密码子(ATG)，而用精氨酸(R)来取代甲硫氨酸(M)。用于引入或取代非天然存在的氨基酸的方法在本领域也是众所周知的。举例来说，可以通过在用于表达突变单体的IVTT系统中包含合成氨基酰基-tRNA来引入非天然存在的氨基酸。可替代地，其可以通过在大肠杆菌中表达突变单体来引入，所述突变单体在存在那些特定氨基酸的合成(即非天然存在的)类似物的情况下对于特定氨基酸是营养缺陷型的。如果突变单体使用部分肽合成产生，则其还可以通过裸接合产生。保守取代用具有相似化学结构、相似化学特性或相似侧链体积的其他氨基酸代替氨基酸。引入的氨基酸可以具有与其替代的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。可替代地，保守取代可以引入芳香族或脂肪族的另一种氨基酸代替预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改变在本领域是众所周知的，并且可以根据如在下表1中限定的20种主要氨基酸的性质来进行选择。在氨基酸具有类似极性的情况下，还可以参考表2中的氨基酸侧链的亲水性尺度来确定这一点。
表1—氨基酸的化学性质
Figure BDA0003361348510000091
表2—亲水性标度
Figure BDA0003361348510000092
Figure BDA0003361348510000101
突变体或经修饰的蛋白质、单体或肽还可以以任何方式和在任何位点进行化学修饰。优选地通过将分子附接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)、将分子附接到一个或多个赖氨酸、将分子附接到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端的修饰对突变体或经修饰的单体进行化学修饰。用于进行此类修饰的合适方法在本领域是众所周知的。经修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过任何分子的附接进行化学修饰。举例来说，经修饰的蛋白质、单体或肽的突变体可以通过染料或荧光团的附接进行化学修饰。
使马达蛋白停滞
本公开涉及将马达蛋白加载到包含间隔区的多核苷酸衔接子上的方法，其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。如下文更详细解释，与马达蛋白与多核苷酸结合时相比，所述方法可降低马达蛋白转换燃料分子的速率。
如上所述，用于控制马达蛋白移动到靶多核苷酸上的运动的方法是本领域中已知的。本领域中已知的一种方法包括使用间隔区防止马达蛋白运动到靶多核苷酸上。所述方法包括将马达蛋白保持在间隔区处(例如邻接间隔区)。马达蛋白可以以这种方式保持在例如多核苷酸链上。马达蛋白可以是定向的(即在5'→3'或3'→5'方向上加工多核苷酸)。通过在马达蛋白与靶多核苷酸之间沿马达蛋白加工的方向提供间隔区，马达蛋白的运动可以受到间隔区的约束。一方面，马达蛋白到靶多核苷酸上的运动受到间隔区的阻碍。另一方面，马达蛋白的运动也受到其方向性的限制，这意味着它可能不会在远离靶多核苷酸的方向上移动远离间隔区。以此方式，马达蛋白可被保持在间隔区(例如邻接间隔区)，因为马达蛋白“向前”朝向间隔区或“向后”远离间隔区的运动受到约束。
然而，以这种已知方式约束马达蛋白通常不能防止马达蛋白消耗可能存在于反应条件中的燃料(例如马达蛋白加工多核苷酸所需的辅因子)。不受理论的束缚，据信使马达蛋白在间隔区处停滞会导致马达蛋白的“滑动”。马达蛋白被加载到多核苷酸衔接子上，并以上述方式前进直到它到达间隔区。当马达蛋白到达间隔区时，马达蛋白的运动就会停滞。然而，马达蛋白不会在间隔区处保持静止。相反，据信马达蛋白周期性地脱离与邻近间隔区的多核苷酸衔接子的结合，从而导致马达蛋白沿着多核苷酸衔接子向后扩散远离间隔区。然后马达蛋白与多核苷酸衔接子重接合并继续前进，直到其再次到达间隔区，在此之后重复循环。马达蛋白从多核苷酸衔接子连续脱离、与多核苷酸衔接子重接合以及马达蛋白沿多核苷酸衔接子前进到间隔区消耗了系统中存在的燃料，尽管与马达蛋白的整体前进无关。停滞在间隔区处的马达蛋白对燃料的这种非生产性消耗被称为无用的转换。
无用的转换是非期望的，并且会降低系统的整体效率。例如，如果马达蛋白以所描述的方式长时间段停滞在间隔区处，则马达蛋白在无用的转换中消耗的燃料量可能是显著的。这种非生产性的燃料使用可显著限制系统的寿命，例如在存储中。例如，燃料的减少也可能不合需要地降低马达蛋白的速度。无用的转换可能需要反应系统中的燃料量最初并且不期望地增加以考虑到这种非期望的消耗。为了避免在靶多核苷酸表征期间由杂质引起的假象而对高纯度燃料的需求意味着无用的转换可显著增加成本。此外，如果马达蛋白受到高浓度的被消耗的燃料分子(即已被马达蛋白转换的燃料分子，例如ADP)的负面影响，则马达蛋白对被表征的靶多核苷酸施加的控制可被降低和/或马达蛋白的速度可能会非期望地降低。
在寻求解决这个问题时，已经令人惊讶地发现可以通过使马达蛋白停滞在间隔区上来减少或防止无用的转换。特别地，通过防止马达蛋白从间隔区移开，可以减少无用的转换。换句话说，与马达蛋白与多核苷酸结合时相比，马达蛋白转换燃料分子的速率降低。在本文中更详细描述了合适的间隔区。
在开发目前要求保护的方法时，已经令人惊讶地发现，通过将封闭部分与多核苷酸衔接子结合，可以有利地防止马达蛋白从包含在多核苷酸衔接子中的间隔区移开。封闭部分可以例如在空间上防止马达蛋白从间隔区移开。封闭部分可以化学地防止马达蛋白从间隔区移开。在本文中更详细描述了封闭部分。
因此，本文提供了一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；以及
iii)将马达蛋白定位在间隔区上；
其中与多核苷酸衔接子结合的封闭部分防止了马达蛋白从间隔区移开。
在一个实施方式中，本文提供了一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；
iii)使马达蛋白前进到间隔区上；以及
iv)使封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合，其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
在一些实施方式中，多核苷酸包含连接至间隔区的加载位点。在一些实施方式中，加载位点可以与马达蛋白接触。将加载位点与马达蛋白接触会导致马达蛋白从加载位点前进到间隔区上。在多核苷酸衔接子包含加载位点的实施方式中，将封闭部分与多核苷酸衔接子结合通常防止马达蛋白从间隔区移开并移动到加载位点上。在本文中更详细描述了加载位点。
因此，在一些实施方式中，所提供的方法包括：(i)使加载位点与马达蛋白接触，其中所述马达蛋白与加载位点接合；以及(ii)将封闭部分与多核苷酸衔接子结合，其中封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开并与加载位点重接合。
在其他实施方式中，多核苷酸衔接子不包含加载位点。在此类实施方式中，马达蛋白通常与多核苷酸衔接子接触，例如在间隔区处接触；即马达蛋白可以与间隔区接触。马达蛋白位于间隔区上。马达蛋白可以通过任何合适的方式定位在间隔区上。例如，如本文更详细地描述的，马达蛋白可以与间隔区接触并且随后可以修饰马达蛋白以防止马达蛋白从间隔区脱离。间隔区可侧接有封闭部分以防止马达蛋白从间隔区移开。在一些实施方式中，除了间隔区单元之外，间隔区还可包含天然核苷酸。这在本文中进行了更详细的描述。
多核苷酸衔接子
所提供的方法包括将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上。WO 2015/110813描述了将马达蛋白加载到靶多核苷酸例如衔接子上，并且据此其全部内容以引用方式并入。
衔接子通常包含能够附接至靶多核苷酸的末端的多核苷酸链。靶多核苷酸通常旨在用于根据本文所公开的方法进行表征。
多核苷酸衔接子可以添加到靶多核苷酸的两端。另选地，可以将不同的衔接子添加至靶多核苷酸的两端。可以将衔接子添加到靶多核苷酸的仅一端。向多核苷酸添加衔接子的方法是本领域已知的。衔接子可以例如通过连接，通过点击化学，通过标记，通过拓扑异构化或通过任何其他合适的方法附连至多核苷酸。
在一个实施方式中，衔接子是合成的或人造的。通常，衔接子包括如本文所述的聚合物。衔接子包括如本文所述的间隔区。如下文更详细解释，衔接子还可包括加载位点，例如连接至间隔区的加载位点。在本文中更详细描述了加载位点。
在一些实施方式中，衔接子包含多核苷酸。例如，如下所述，加载位点可包含单链多核苷酸链。多核苷酸衔接子可包含DNA、RNA、修饰的DNA(诸如碱性DNA)、RNA、PNA、LNA、BNA和/或PEG。通常，衔接子包含单链和/或双链DNA或RNA。
在一个实施方式中，衔接子是Y衔接子。Y衔接子通常是多核苷酸衔接子。Y衔接子通常是双链的，并且包括(a)在一端，两条链杂交在一起的区域，和(b)在另一端，两条链不互补的区域。链的非互补部分形成突出端。由于两条链通常不像双链部分那样彼此不杂交，所以在Y衔接子中非互补区域的存在使衔接子具有Y形状。如下文更详细解释的，在一个实施方式中，马达蛋白可以结合诸如Y衔接子的衔接子的突出端。在另一个实施方式中，马达蛋白可以与双链区结合。在其他实施方式中，马达蛋白可以与衔接子的单链和/或双链区结合。在其他实施方式中，第一马达蛋白可以与这种衔接子的单链区结合，而第二马达蛋白可以与衔接子的双链区结合。
在一个实施方式中，衔接子包含如本文更详细描述的膜锚或孔锚。在一些实施方式中，锚可以附连至与核酸操作酶结合的突出端互补并因此与其杂交的多核苷酸。
在一些实施方式中，多核苷酸衔接子例如Y衔接子的非互补链之一可包含前导序列，所述前导序列当与跨膜孔接触时能够穿入纳米孔中。在一个实施方式中，前导序列可以包含如本文更详细描述的加载位点。在一个实施方式中，前导序列可以在加载位点之前(即衔接子可包含连接至加载位点的前导序列，加载位点连接至间隔区，使得加载位点位于前导序列与间隔区之间)。在一个实施方式中，加载位点可以在前导序列之前(即衔接子可以包括连接至前导序列的加载位点，前导序列连接到间隔区，使得前导序列位于加载位点和间隔区之间)。
前导序列通常包含聚合物，例如多核苷酸，例如DNA或RNA、修饰的多核苷酸(例如无碱基DNA)、PNA、LNA、聚乙二醇(PEG)或多肽。在一些实施方式中，前导序列包含DNA的单链，例如聚dT区段。前导序列可以是任何长度，但是通常长度为10至150个核苷酸，诸如长度为20至120、30至100、40至80或50至70个核苷酸。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子是发夹环衔接子。发夹环衔接子是包括单个多核苷酸链的衔接子，其中多核苷酸链的端能够彼此杂交或被杂交至彼此，并且其中多核苷酸的中间段形成环。可以使用本领域已知的方法设计合适的发夹环衔接子。
如下文更详细解释的，多核苷酸衔接子可以附接至靶多核苷酸以表征靶多核苷酸。
本领域技术人员将理解，与缺乏本文所述的封闭部分的衔接子相比，用于本文所提供的方法中的所述衔接子因此减少了由停滞在衔接子上的马达蛋白引起的无效转换。通常，与本文所提供的缺少封闭部分的衔接子相比，用于本文所提供的方法中的所述衔接子提高了燃料使用效率。
本领域技术人员还将理解，当衔接子包含多核苷酸链时，衔接子的序列通常不是决定性的并且可以根据马达蛋白和其他实验条件例如待表征的任何多核苷酸来控制或选择。在实施例中仅以说明的方式提供了示例性序列。例如，衔接子可包含诸如SEQ ID NO:13的序列或与SEQ ID NO:13具有至少20％，例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列相似性或同一性的多核苷酸序列。衔接子可包含如本文所述的间隔区，所述间隔区侧接有序列，例如在SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15中提供的序列，或独立地与SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15具有至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列相似性或同一性的多核苷酸序列。本领域技术人员应理解SEQ ID NO:14包含序列例如SEQ ID NO:15，并且衔接子因此可包含多核苷酸序列例如SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15具有至少20％、例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列相似性或同一性的多核苷酸序列。衔接子的顺序通常可以改变，而不会负面地影响减少由给定间隔区提供的无效转换。
间隔区
所公开的方法包括将马达蛋白加载到包含间隔区的多核苷酸衔接子上。多核苷酸衔接子中可存在一个或多个间隔区。例如，多核苷酸衔接子可包含1个至约10个间隔区，例如1个至约5个间隔区，例如1个、2个、3个、4个或5个间隔区。术语“间隔区”和“停滞位点”可以互换使用，并且是指多核苷酸衔接子的使马达蛋白停滞的部分，其通常防止如上所述的无效转换。间隔区(停滞位点)可包括任何合适数量的间隔区单元。合适的间隔区单元在本文中描述并且包括无碱基核苷酸和间隔区基团例如iSp9、iSp18和C3基团(如下所述)。除了间隔区单元之外，间隔区(停滞位点)还可包含核苷酸单元。例如，如本文更详细地描述的，间隔区(停滞位点)可包含间隔一个或多个核苷酸的间隔区单元。间隔区(停滞位点)可包含一个或多个间隔区单元，该一个或多个间隔区单元侧接有或由一个或多个核苷酸单元(例如一个或多个多核苷酸)分隔。这个概念有时被称为“核苷酸岛”并在下面进一步讨论。
一个或多个间隔区包含在多核苷酸衔接子中。通常，多核苷酸衔接子可包含单链和/或双链多核苷酸的链，并且一个或多个间隔区可包含在多核苷酸链中，例如中断链或将一条链与另一条链分开。在本文中更详细描述了示例性多核苷酸衔接子。
多核苷酸衔接子中的每个间隔区都提供了阻碍马达蛋白运动的能量屏障。例如，间隔区可以通过减少马达蛋白的牵引力来使马达蛋白停滞。这可以例如通过使用无碱基间隔区，即其中从多核苷酸衔接子中的一个或多个核苷酸去除了碱基的间隔区来实现。间隔区可以物理地阻止马达蛋白的运动，例如通过引入庞大的化学基团以物理地阻碍马达蛋白的运动。
间隔区可包含使一个或多个马达蛋白停滞的任何分子或分子组合。间隔区可包含阻止马达蛋白沿着靶多核苷酸移动的任何分子或分子组合。确定马达蛋白是否停滞在间隔区处很简单。例如，这可以如WO 2014/135838中所讨论的进行测定，该专利的内容以引用方式并入—例如，马达蛋白移动越过间隔区并置换DNA的互补链的能力可以通过PAGE测量。
在一些实施方式中，间隔区可包括线性分子，例如聚合物。通常，此类间隔区具有与靶多核苷酸不同的结构。例如，如果靶多核苷酸是DNA，则该间隔区或每个间隔区通常不包含DNA。特别地，如果靶多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，则该或每个间隔区优选地包括肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)或带有核苷酸侧链的合成聚合物。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿苷、一个或多个反向胸苷(反向dT)、一个或多个反向双脱氧胸苷(ddT)、一个或多个双脱氧胞苷(ddC)、一个或多个5-甲基胞苷、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2’-O-甲基RNA碱基、一个或多个异脱氧胞苷(Iso-dC)、一个或多个异脱氧鸟苷(Iso-dG)、一个或多个C3(OC3H6OPO3)基团、一个或多个可光分解(PC)[OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3]基团、一个或多个己二醇基团、一个或多个间隔区9(iSp9)[(OCH2CH2)3OPO3]基团、一个或多个间隔区18(iSp18)[(OCH2CH2)6OPO3]基团；或一个或多个巯基连接。间隔区可以包含这些基团的任何组合。这些基团中的许多可以从
Figure BDA0003361348510000141
(Integrated DNA
Figure BDA0003361348510000142
)商购获得。例如，C3、iSp9和iSp18均可从
Figure BDA0003361348510000143
获得。
间隔区可以包含任意数量的上述基团作为间隔区单元。例如，间隔区可包含1至约12个或更多(例如约1至约8个、例如1至约6个、例如1至约4个)选自2-氨基嘌呤、2-6-二氨基嘌呤、5-溴-脱氧尿苷、反向dT、ddT、ddC、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、2'-O-甲基RNA碱基、Iso-dC、Iso-dG、iSpC3基团、PC基团、己二醇基团和巯基连接的间隔区。间隔区可以例如包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个此类基团。
间隔区可包含1个至约12个或更多(例如约1至约8个、例如1至约6个、例如1至约4个)C3基团；例如，间隔区可包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个C3基团。C3基团通常是-OC3H6OPO3-基团。
间隔区可包含约1至约8个或更多(例如约1至约6个、例如1至约4个)iSp9基团；例如，间隔区可包含2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个iSp9基团。iSp9基团通常是-(OCH2CH2)3OPO3-基团。
间隔区可包含约1至约8个或更多(例如约1至约6个、例如1至约4个)iSp18基团；例如，间隔区可包含2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个iSp9基团。iSp18基团通常是-(OCH2CH2)6OPO3-基团。在一个实施方式中，间隔区包含4个iSp18基团。
在一些实施方式中，间隔区包含一个或多个iSp18基团和/或一个或多个iSp9基团和/或一个或多个C3基团。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个导致马达蛋白停滞的化学基团。在一些实施方式中，合适的化学基团是一个或多个化学侧基。一个或多个化学基团可附接至聚核苷酸中的一个或多个核碱基。一个或多个化学基团可附接至多核苷酸衔接子的主链。可以存在任何数目的合适化学基团，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多。合适的基团包括(但不限于)荧光团、抗生蛋白链菌素和/或生物素、胆固醇、亚甲基蓝、二硝基苯酚(DNP)、地高辛和/或抗地高辛和二苯基环辛炔基团。
在一些实施方式中，间隔区可包含聚合物。在一些实施方式中，间隔区可包含聚合物，该聚合物是多肽或聚乙二醇(PEG)。
当间隔区包含多肽时，该多肽可包含任何数量的氨基酸。例如，多肽可包含约1个至约12个或更多(例如约1至约8个、例如1至约6个例如1至约4个)氨基酸；例如间隔区可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸。
当间隔区包含诸如PEG(聚乙二醇)的聚合物时，该聚合物可包含任何数量的单体单元。例如，聚合物可包含约1至约12个或更多(例如约1至约8个、例如1至约6个例如1至约4个)单体单元；例如，间隔区可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个单体(例如PEG)单元。
间隔区可包含一个或多个无碱基核苷酸(即，缺少核碱基的核苷酸)，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个无碱基核苷酸。在无碱基核苷酸中，核碱基可被-H(idSp)或-OH置换。通过从一个或多个相邻核苷酸中去除碱基，可以将无碱基间隔区插入到靶多核苷酸中。例如，可以将多核苷酸修饰为包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1,N6-亚乙烯基腺嘌呤肌苷或次黄嘌呤，并且可以使用人烷基腺嘌呤DNA糖苷酶(hAAG)从这些核苷酸中去除核碱基。替代地，可以将多核苷酸修饰成包括尿嘧啶，并且用尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)去除核碱基。在一个实施方式中，一个或多个间隔区不包括任何无碱基核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个核苷酸单元，也称为核苷酸岛。间隔区通常不包含足够长以完全占据马达蛋白的活性位点的多核苷酸链。例如，在间隔区包含一个或多个核苷酸单元的实施方式中，间隔区通常包含1个至3个核苷酸，更经常地包含1个至2个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区在存在于间隔区中的该或每个核苷酸岛中包含1个至3个连续核苷酸。在一些实施方式中，间隔区可包含1个至5个核苷酸岛，例如1个、2个或3个核苷酸岛，每个岛包含1个至3个连续核苷酸。本领域技术人员将认识到，马达蛋白的活性位点(多核苷酸结合裂缝)的大小通常对应于约8个核苷酸单位。因此，在间隔区包含1个至3个，例如1个至2个核苷酸间隔区单元的实施方式中，核苷酸间隔区单元不完全占据马达蛋白的活性位点。在一些实施方式中，包含1个至3个，例如1个至2个核苷酸的示例性间隔区(停滞位点)通常包含一个或多个选自-[(S)x-(N)y-(S)z]w-的部分，其中每个S是间隔区单元(例如本文所述的间隔区单元)；每个N是核苷酸；x是1到7的整数；y是1至3，通常是1或2的整数；z是1至7的整数并且w是1至3的整数；其中每个S是相同或不同的，并且每个N是相同或不同的。在此类实施方式中，更常见的是，每个S是独立地选自C3、iSp9和iSp18间隔区单元的间隔区单元；每个N独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶；x是1到7的整数；y是1或2；z是1到4的整数，并且w是1到3的整数。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个核苷酸岛，并且在马达蛋白与衔接子接触之前，衔接子可具有与其结合的如本文定义的封闭部分。在此类实施方式中，马达蛋白因此可以直接加载到间隔区上。马达蛋白可以加载到包含在间隔区内的核苷酸岛上。马达蛋白可以加载到间隔区中包含的核苷酸岛上，然后被修饰以防止马达蛋白离开间隔区，例如通过从间隔区解离离开间隔区。本文更详细地描述了马达蛋白的修饰。在一些实施方式中，马达蛋白可以加载到核苷酸岛上，然后前进到包含在间隔区中的间隔区单元上。在一些实施方式中，马达蛋白可保持位于间隔区中的核苷酸岛处，直到施加力以将马达蛋白从岛移开为止。在一些实施方式中，力由如本文所述的纳米孔提供。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-S-N-N-S-S-；-S-N-S-N-S-；-S-S-N-N-S-；-S-S-N-S-S-；-N-N-S-N-N-S-；-S-S-N-N-S-S-；-S-N-N-S-N-N-S-；-S-N-S-N-S-N-S-；-S-S-S-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-；-S-S-N-N-N-S-N-N-S-；-S-S-N-N-S-N-N-N-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；-S-S-S-N-N-N-S-N-S-；-S-S-S-N-S-N-N-N-S-；-S-S-S-S-N-N-S-N-S-；-S-S-S-S-N-S-N-N-S-；-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-；-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-；-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-N-N-S-S-S-N-N-S-S-S-S-；-N-N-S-S-S-S-N-N-S-S-S-；-N-N-S-S-S-S-S-N-N-S-S-；-N-N-S-S-S-S-S-S-N-N-S-；-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-S-N-N-S-S-S-；-S-N-N-S-S-S-S-N-N-S-S-；-S-N-N-S-S-S-S-S-N-N-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-N-N-S-S-S-N-N-S-S-；-S-S-N-N-S-S-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-S-S-S-等；其中每个S是本文所述的间隔区单元并且每个N是核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-S-N-S-N-S-N-S-；-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-等；其中每个S是本文所述的间隔区单元并且每个N是核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-等；其中每个S是本文所述的间隔区单元并且每个N是核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-等；其中每个S是本文所述的间隔区单元并且每个N是核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-S-S-N-N-S-S-；-S-N-S-N-S-N-S；-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-；-S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；和-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-等；其中每个S是本文所述的间隔区单元并且每个N是核苷酸。在一些实施方式中，每个S是相同的间隔区单元。在一些实施方式中，S基团是不同的间隔区单元。在一些实施方式中，间隔区可包含基于核苷酸的间隔区单元(例如修饰的核苷酸，例如2'-O-甲基RNA碱基)和非基于核苷酸的间隔区单元(例如iSp18、iSp9和C3间隔区单元)。在一些实施方式中，每个S独立地选自iSp18基团、iSp9基团、2'-O-甲基尿苷和C3基团。在一些实施方式中，每个S独立地选自iSp18基团、iSp9基团和C3基团。在一些实施方式中，每个S独立地选自iSp18基团、2'-O-甲基尿苷和C3基团。在一些实施方式中，每个S独立地选自iSp18基团和C3基团。在一些实施方式中，每个N是相同的核苷酸。在一些实施方式中，上述部分中的N基团不同。在一些实施方式中，每个N基团独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶。在一些实施方式中，每个N基团独立地选自胞嘧啶和胸腺嘧啶。在一些实施方式中，每个N基团是胸腺嘧啶基团。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-8-T-T-9-T-T-8-；-8-T-8-T-8-T-8-；-8-T-T-8-T-T-8-T-T-8-；-3-3-8-8-T-T-8-8-；-3-3-3-3-8-8-T-T-8-8-；-3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-8-；-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-T-T-8-；-3-3-3-3-8-T-T-8-T-T-8-3-T-T-8-；-3-3-3-T-T-8-T-T-8-T-T-8-；-3-3-3-T-T-8-T-T-8-；-3-T-T-8-T-T-8-T-T-8-；-T-T-3-3-T-T-3-3-3-3-8-；-3-T-T-3-3-T-T-3-3-3-8-；-3-3-T-T-3-3-T-T-3-3-8-；-3-3-3-3-T-T-3-3-T-T-8-；-T-T-3-3-3-T-T-3-3-3-8-；-T-T-8-T-T-3-3-3-3-3-8-；-3-T-T-8-T-T-3-3-3-3-8-；-3-3-T-T-8-T-T-3-3-3-8-；-3-3-3-T-T-8-T-T-3-3-8-；-3-3-3-3-T-T-8-T-T-3-8-；-3-3-3-T-T-3-3-T-T-9-；-3-3-3-T-T-mU-mU-mU-T-T-8-；-3-3-3-T-T-mU-mU-T-T-8-；其中3是第一间隔区，8是第二间隔区，9是第三间隔区，并且mU是第四间隔区；通常其中3是如本文定义的C3间隔区并且8是如本文定义的iSp18间隔区并且9是如本文定义的iSp9间隔区并且mU是2'-O-甲基尿苷；并且每个N独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶；优选地胸腺嘧啶。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-8-8-N-N-8-8-；-8-N-8-N-8-N-8；-8-N-N-8-N-N-8-N-N-8-；-3-3-8-8-N-N-8-8-；-3-3-3-3-8-8-N-N-8-8-；-3-3-8-N-N-8-N-N-8-N-N-8-；-3-3-3-3-8-N-N-8-N-N-8-N-N-8-；3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-8-；-3-3-3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-8-；-3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-N-N-8-；和-3-3-3-3-8-N-N-8-N-N-8-3-N-N-8-；其中3是第一间隔区，并且8是第二间隔区；通常其中3是如本文定义的C3间隔区并且8是如本文定义的iSp18或iSp9间隔区，通常8是如本文定义的iSp18间隔区；每个N独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶；优选地胸腺嘧啶。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：88TTT88；88mUmUmU88；88/iBNA-T//iBNA-T//iBNA-T/88；88T88；8TT88；88TT8；8T8T8；99TT9TT99；8TT9TT8；8TT3TT8；8T8T8T8；8TT8TT8TT8；3388TT88；333388TT88；338TT8TT8TT8；33338TT8TT8TT8；338TT8TT838；33338TT8TT838；338TT8TT83TT8；33338TT8TT83TT8；8TT8TT8；TT8TT8；3TT8TT8；333TT8TT8TT8；333TT8TT8；3TT8TT8TT8；33TT8TT8；333TT8TT838；33338TT8TT8；333TT333333TT8；333TT99TT8；333TT9TT8；333TT3TT8；9TT8TT8；99TT8TT8；3333T8TT8；3333TT8T8；333T8TTT8；333TTT8T8；33TTT8TT8；33TT8TTT8；9TT99TT99；333TT8TT9999；333TT8TT999；333TT8TT99；333TT8TT9；TT3TT333338；3TT3TT33338；33TT3TT3338；333TT3TT338；3333TT3TT38；33333TT3TT8；TT33TT33338；3TT33TT3338；33TT33TT338；333TT33TT38；3333TT33TT8；TT333TT3338；3TT333TT338；33TT333TT38；333TT333TT8；TT3333TT338；3TT3333TT38；33TT3333TT8；TT33333TT38；3TT33333TT8；TT333333TT8；TT8TT333338；3TT8TT33338；33TT8TT3338；333TT8TT338；3333TT8TT38；33333TT8TT8；333TT33TT8；333TT33TT9；333TTmUmUmUTT8；333TTSpSpTT8；333TTSpTT8；9TT33TT99；333TTmUmUTT8；333TTrUTT8；333TTrUrUTT8；333TTrUrUrUTT8；333TTrUrUrUrUTT8；333TT33TTC12；333TT33TTC6；mUmUmUTTmUmUTT8；mUmUmUTT33TT8；333TT33TT88；333TT33TT888；333TT33TT8888；333TT33TT99；333TT33TT999；333TT33TT9999；333TT33TT333；333TT33TT3333；333TT33TT33333；333TT33TT333333；333TT33TT3333333；和333TT33TT33333333。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：88mUmUmU88；88/iBNA-T//iBNA-T//iBNA-T/88；88T88；88TT88；8TT88；88TT8；8T8T8；8TT9TT8；8TT3TT8；8T8T8T8；8TT8TT8TT8；3388TT88；333388TT88；33338TT8TT838；338TT8TT83TT8；33338TT8TT83TT8；8TT8TT8；TT8TT8；3TT8TT8；333TT8TT8TT8；333TT8TT8；3TT8TT8TT8；TT3TT333338；3TT3TT33338；33TT3TT3338；333TT3TT338；3333TT3TT38；33333TT3TT8；TT33TT33338；3TT33TT3338；33TT33TT338；3333TT33TT8；TT333TT3338；3TT333TT338；33TT333TT38；TT3333TT338；3TT3333TT38；33TT3333TT8；TT33333TT38；3TT33333TT8；TT333333TT8；TT8TT333338；3TT8TT33338；33TT8TT3338；333TT8TT338；3333TT8TT38；33333TT8TT8；333TT33TT9；333TTmUmUmUTT8；333TTSpSpTT8；333TTSpTT8；333TTmUmUTT8；和333TT33TT8。
在一些实施方式中，间隔区可包含一个或多个选自以下的部分：-8-8-TT-8-8-；-8-T-8-T-8-T-8；-8-TT-8-TT-8-TT-8-；-3-3-8-8-TT-8-8-；-3-3-3-3-8-8-TT-8-8-；-3-3-8-TT-8-TT-8-TT-8-；-3-3-3-3-8-TT-8-TT-8-TT-8-；3-3-8-TT-8-TT-8-3-8-；-3-3-3-3-8-TT-8-TT-8-3-8-；-3-3-8-TT-8-TT-8-3-TT-8-；和-3-3-3-3-8-TT-8-TT-8-3-TT-8-；其中3是第一间隔区，并且8是第二间隔区；通常其中3是如本文定义的C3间隔区并且8是如本文定义的iSp18或iSp9间隔区，通常8是如本文定义的iSp18间隔区；并且每个T是胸腺嘧啶。
在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含多于一个间隔区。在此类实施方式中，两个或更多个单体可以相同或不同。举例来说，一个间隔区可包含本文所论述的线性分子中的一个线性分子，且另一间隔区可包含物理地引起一个或多个马达蛋白停滞的一个或多个化学基团。间隔区可包含本文所论述的线性分子中的任何线性分子和物理地引起一个或多个马达蛋白停滞的一个或多个化学基团(例如一个或多个无碱基基团和荧光团)。
可以根据多核苷酸衔接子的性质、马达蛋白和进行该方法的条件来设计或选择合适的间隔区。例如，许多马达蛋白在体内加工DNA，并且通常可使用任何非DNA的物质来停滞此类马达蛋白。
靶多核苷酸的表征通常在游离核苷酸和/或燃料分子(马达蛋白的辅因子)存在下进行。在所公开的方法中，在游离核苷酸和/或燃料分子(马达蛋白的辅因子)存在的情况下，马达蛋白通常被阻止从间隔区移开。如果在不涉及游离核苷酸和/或燃料分子存在的方法中使用多核苷酸衔接子，则通常在不存在游离核苷酸和/或燃料分子的情况下阻止马达蛋白从间隔区移开。在这些实施方式中可以使用不同的间隔区。例如，与不存在游离核苷酸和/或燃料分子的实施方式相比，在存在游离核苷酸和/或燃料分子的实施方式中可以有利地使用更长的间隔区。
在一些实施方式中，根据反应条件中存在的盐浓度设计或选择合适的间隔区以根据所公开的方法使用是有益的。例如，包括通过相对于纳米孔移动多核苷酸链来表征靶多核苷酸链的方法通常涉及使用相对高的盐浓度。盐浓度还影响一个或多个间隔区使一个或多个马达蛋白停滞的能力。通常，在本发明的方法中所用的盐浓度越高，通常使用的一或多个间隔区越短，且反之亦然。
一些特定的特征组合显示于下表1中。
Figure BDA0003361348510000191
在涉及使用多种马达蛋白的实施方式中，更长的间隔区可能是有益的。例如，在涉及使用如本文所述的两种马达蛋白的实施方式中，合适的间隔区可包含约1个至约25个上述间隔区(例如，选自iSp18基团、iSp9基团和C3基团的约1至约25个基团)。
封闭部分
在一些实施方式中，所公开的方法涉及使封闭部分与多核苷酸衔接子结合。封闭部分防止马达蛋白从多核苷酸衔接子的间隔区移开。
封闭部分通常是阻止马达蛋白沿与马达蛋白天然加工多核苷酸的方向相反的方向运动的部分。例如，如果马达蛋白在5'到3'方向上天然加工多核苷酸链，则在一些实施方式中合适的封闭部分是防止马达蛋白沿3'到5'方向移动的部分。类似地，如果马达蛋白在3'到5'方向上天然加工多核苷酸链，则在一些实施方式中合适的封闭部分是防止马达蛋白沿5'到3'方向移动的部分。
在所公开的方法中，封闭部分与多核苷酸衔接子结合以防止马达蛋白从间隔区移开。可以通过提供空间阻滞以物理方式阻止马达蛋白的运动来防止马达蛋白从间隔区移开。可以通过使用化学封闭部分来防止马达蛋白从间隔区移开，马达蛋白不能在其上方或通过该化学封闭部分。在一些实施方式中，封闭部分包含一个或多个本文所讨论的间隔区基团。在其他实施方式中，封闭部分可包含多核苷酸链。这在下文中进行了更详细的讨论。
在所公开的方法中，封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。在一个实施方式中，这是通过将封闭部分与同间隔区相邻的多核苷酸衔接子结合来实现的。
例如，在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含与间隔区邻接的多核苷酸链。在此类实施方式中，封闭部分可结合在与间隔区相邻的多核苷酸链上。例如，封闭部分可以与同间隔区相邻的20个核苷酸中的一个或多个核苷酸结合。封闭部分可以与同间隔区相邻的10个核苷酸中的一个或多个核苷酸结合。封闭部分可以与同间隔区相邻的5个核苷酸中的一个或多个核苷酸结合。封闭部分可以与同间隔区相邻的2、3或4个核苷酸中的一个或两个核苷酸结合。在一个实施方式中，封闭部分与同间隔区相邻的末端核苷酸结合。在此类实施方式中，封闭基团相对于间隔区的位置使得马达蛋白不能从间隔区移到多核苷酸衔接子的与封闭部分结合的部分上。在一些实施方式中，封闭部分与本文所述的加载位点结合。
在一些实施方式中，封闭部分是蛋白质，例如单链结合蛋白(SSB)，例如大肠杆菌(E.coli)单链结合蛋白。蛋白质与多核苷酸衔接子结合以防止马达蛋白质从间隔区移开。
在一些实施方式中，封闭部分是嵌入剂。可以使用任何合适的嵌入剂。嵌入剂嵌入多核苷酸衔接子的多核苷酸链，并由此防止马达蛋白移动通过嵌入剂。在一些实施方式中，将嵌入剂靠近间隔区定位可以防止马达蛋白从间隔区移开。在一个实施方式中，可以在与间隔区相邻的20个核苷酸中的两个核苷酸之间引入嵌入剂。在一个实施方式中，可以在与间隔区相邻的10个核苷酸中的两个核苷酸之间引入嵌入剂。在一个实施方式中，可以在与间隔区相邻的5个核苷酸中的两个核苷酸之间引入嵌入剂。在一个实施方式中，可以在与间隔区相邻的末端两个核苷酸之间引入嵌入剂。
在一些实施方式中，封闭部分包含多核苷酸链的二级结构。例如，封闭部分可包含二级结构，例如假结，以用于防止马达蛋白从间隔区移开。
在一些实施方式中，封闭部分可包含化学标签。例如，化学标签可以附接至例如可以与多核苷酸衔接子结合的多核苷酸的基团。合适的标签的示例包括但不限于生物素、可选择的多核苷酸序列、抗体、抗体片段诸如Fab和ScSv、抗原、多核苷酸结合蛋白、聚组氨酸尾和GST标签。生物素特异性结合亲和素，例如链霉亲和素。与亲和素(例如链霉亲和素)结合的生物素基团将阻止马达蛋白的运动。在一些实施方式中，与亲和素如链霉亲和素结合的生物素基团将阻止马达蛋白移动通过生物素基团。
在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。封闭部分可以与多核苷酸衔接子杂交，以防止马达蛋白从间隔区移开。
在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约500个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约10个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约20个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约30个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约1个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约90个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约70个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约30个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约20个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约10个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约90个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约70个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约30个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约20个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约10个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。
本领域技术人员将理解，当封闭部分包含单链或非杂交多核苷酸时，封闭部分多核苷酸的序列通常不是决定性的，并且可以根据衔接子和马达蛋白以及其他实验条件进行控制或选择。在实施例中仅以说明的方式提供了示例性序列。例如，封闭部分可包含例如SEQ ID NO:19的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:19具有至少20％，例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列相似性或同一性的多核苷酸序列。例如，封闭部分可包含例如SEQ ID NO:10的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少20％，例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列相似性或同一性的多核苷酸序列。封闭部分可以包含对应于SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:19的多核苷酸序列，并且包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个核苷酸取代。不受理论束缚，本领域技术人员将理解，封闭部分在防止马达蛋白从间隔区移开方面的功能可以通过选择与衔接子的序列相容的封闭部分来实现。封闭部分的结构可以改变，前提条件是封闭部分可以附接至衔接子(例如通过杂交)并防止马达蛋白从间隔区移开。
有时，封闭部分衔接子在间隔区的区域(例如在间隔区的约20个核苷酸内、例如在间隔区的约10个核苷酸内、例如在间隔区的约5个核苷酸内、例如在间隔区的2个、3个或4个核苷酸内)中具有与多核苷酸衔接子的序列互补的序列，以便封闭部分多核苷酸可以与间隔区区域中的多核苷酸衔接子杂交，从而防止马达蛋白从间隔区移开。
包含单链或非杂交多核苷酸的封闭部分也可称为“捕获链”，其可例如通过杂交附接至多核苷酸衔接子。捕获链将马达蛋白捕获在间隔区上。将捕获链附接至多核苷酸衔接子可包括(例如通过杂交)将捕获链附接至多核苷酸衔接子的序列，例如靠近或邻近多核苷酸衔接子的间隔区的序列。
通常，封闭部分或捕获链例如通过杂交附接至的序列是单链序列，使得包含封闭部分的所得衔接子可以是双链多核苷酸。因此，本领域技术人员将理解，衔接子可包含双链多核苷酸的附接至间隔区的区域；在此类实施方式中，双链多核苷酸阻止马达蛋白从间隔区移开，并且双链多核苷酸的一条链或双链多核苷酸的一条链的一部分包含捕获链。这将在实施例中进行更多讨论。
如此处更详细解释的，在一些实施方式中，一旦马达蛋白已定位在间隔区部分上，则封闭部分(如果存在的话)与衔接子结合。在一些实施方式中，在马达蛋白已经定位在间隔区单元上之前，封闭部分(如果存在的话)与衔接子结合。在一些实施方式中，在马达蛋白定位在包含一个或多个如本文所述的核苷酸岛的间隔区单元上之前，封闭部分与衔接子结合。
加载位点
如上所述，在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接到间隔区的加载位点。加载位点是用于将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的位点。
在一个实施方式中，加载位点是线性分子，例如聚合物。在一些实施方式中，加载位点可包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的合成聚合物。加载位点可包含聚合物，例如PEG。
在一些实施方式中，马达蛋白与多核苷酸衔接子的加载位点接合。如果马达蛋白接触多核苷酸衔接子(例如多核苷酸衔接子的加载位点)并与多核苷酸衔接子缔合合，则马达蛋白可以与多核苷酸衔接子(例如，与多核苷酸衔接子的加载位点)接合。例如，马达蛋白可以通过与多核苷酸衔接子结合，或通过在其接合至的多核苷酸衔接子部分周围形成复合物但不与多核苷酸衔接子结合来与多核苷酸衔接子(例如加载位点)缔合。因此，例如，如果马达蛋白是DNA加工酶并且加载位点包含不是DNA的线性分子(例如加载位点包含RNA、PNA、GNA、TNA、LNA或PEG等)，则马达蛋白质可与加载位点缔合(接合)而不与加载位点结合。另一方面，如果加载位点包含DNA，则马达蛋白可以通过与加载位点结合而与加载位点接合。类似地，如果马达蛋白是RNA加工酶并且加载位点包含不是RNA的线性分子(例如加载位点包含DNA、PNA、GNA、TNA、LNA或PEG等)，则马达蛋白可以与加载位点缔合(接合)而不是与加载位点结合。另一方面，如果加载位点包含RNA，则马达蛋白可以通过与加载位点结合而与加载位点接合。当然，在一些实施方式中，马达蛋白可以与不包含马达蛋白的天然底物的加载位点结合(例如，在一些实施方式中，DNA结合酶可以与包含除DNA之外的线性分子的加载位点结合，等等)。
因此，在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接到间隔区的加载位点并且马达蛋白与多核苷酸衔接子的加载位点结合。
在所公开方法的一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接到间隔区的加载位点并且本文所述的封闭部分与加载位点结合。如此处更详细的解释，如果封闭部分与加载位点结合，则封闭部分会阻止马达蛋白从间隔区移开。在一些实施方式中，封闭部分可防止马达蛋白从间隔区移开到加载位点上。
在一些实施方式中，加载位点与间隔区邻接。换言之，加载位点可以直接附接至间隔区。在一些实施方式中，加载位点与间隔区邻接并且封闭部分与紧邻间隔区的加载位点结合。显而易见的是，在一些实施方式中，使封闭部分与紧邻间隔区的加载位点结合可防止马达蛋白从间隔区移开到多核苷酸衔接子上。在一些实施方式中，将封闭部分与紧邻间隔区的加载位点结合防止马达蛋白从间隔区移开到加载位点上。
例如，多核苷酸衔接子可以包含连接到间隔区的加载位点，其中加载位点包含单链或非杂交的多核苷酸。在一些实施方式中，马达蛋白可以在加载位点处与多核苷酸衔接子结合并从加载位点前进到间隔区上。封闭部分可以与加载位点(例如如上所述)结合，使封闭部分与加载位点结合可以防止马达蛋白移回到单链或非杂交多核苷酸上。
在一些实施方式中，加载位点包含单链或非杂交多核苷酸。单链多核苷酸链可包含双链多核苷酸链的突出端区域。非杂交多核苷酸可包含例如如上文更详细描述的Y形多核苷酸。
在一些优选的实施方式中，加载位点包含单链或非杂交多核苷酸并且封闭部分包含单链或非杂交多核苷酸；并且(ii)将封闭部分与加载位点结合包括将封闭部分与加载位点杂交。
在一些实施方式中，加载位点包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，加载位点包含长度介于约2个核苷酸单位与约500个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约10个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约20个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约30个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，加载位点包含长度介于约1个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约90个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约70个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约30个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约20个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约10个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，加载位点包含长度介于约2个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约90个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约70个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约30个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约20个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约10个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约500个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约10个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约20个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约30个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约1个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约90个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约70个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约30个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约20个核苷酸单位之间、例如介于约1个核苷酸单位与约10个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。在一些实施方式中，封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约90个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约80个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约70个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约50个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约30个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约20个核苷酸单位之间、例如介于约2个核苷酸单位与约10个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。
在一些实施方式中，加载位点具有与封闭部分的序列互补的序列。
本领域技术人员将理解加载位点的序列通常不是决定性的并且可以根据衔接子和马达蛋白以及其他实验条件来控制或选择。在实施例中仅以说明的方式提供了示例性序列。不受理论束缚，本领域技术人员将理解，加载位点在促进马达蛋白加载到间隔区上方面的功能可以通过加载位点来实现，该加载位点被选择为与用于该方法的衔接子和马达蛋白相容。加载位点的序列因此可以改变，前提条件是马达蛋白可以从加载位点前进到间隔区上，如本文所述。
在一些实施方式中，加载位点和封闭部分的主链是相同的(例如加载位点和封闭部分都具有DNA主链、RNA主链等)。在其他实施方式中，加载位点和封闭部分的主链不同(例如加载位点可以具有DNA主链并且封闭部分具有RNA主链，或者加载位点可以具有RNA主链并且封闭部分具有DNA主链，等等)。
在一些实施方式中，封闭部分与加载位点的杂交产生与间隔区相邻的双链多核苷酸区域。此类区域通常防止马达蛋白从间隔区移开到与封闭部分杂交的加载位点区域上。例如，加载位点可包含单链多核苷酸，并且封闭部分可以在与间隔区邻接的末端核苷酸处结合以产生与间隔区相邻的双链多核苷酸区域。
加载链
在一些实施方式中，马达蛋白被加载到包含加载链的多核苷酸衔接子上。在一些实施方式中，加载链提高马达蛋白加载的效率，特别是在本文提供的方法的实施方式中，其中期望仅一种马达蛋白加载到单个衔接子上。在一些实施方式中，加载链包含与多核苷酸衔接子的间隔区相邻(或在其附近，例如在其1、2、3、4或5个核苷酸内)的衔接子序列互补的部分。在一些实施方式中，加载链还包含与多核苷酸衔接子的序列不互补的部分。在一些实施方式中，加载链包含与衔接子的序列互补并因此在间隔区附近(例如邻近间隔区)与衔接子杂交的部分；和不与衔接子序列互补并因此不与衔接子杂交的部分。在一些实施方式中，不与衔接子杂交的部分有利于将马达蛋白加载到衔接子上。在一些实施方式中，马达蛋白加工杂交的加载链/衔接子复合物，并在这样做时被加工到间隔区上。在一些实施方式中，将马达蛋白加工到间隔区上从多核苷酸衔接子上置换了加载链。在一些实施方式中，使加载链从衔接子上置换防止了后续马达蛋白加载到衔接子上。
在一些实施方式中，加载链的长度介于约2个核苷酸单位与约500个核苷酸单位之间、例如介于约5个核苷酸单位与约100个核苷酸单位之间、例如介于约10个核苷酸单位与约60个核苷酸单位之间、例如介于约20个核苷酸单位与约40个核苷酸单位之间。
本领域技术人员将理解加载链的序列通常不是决定性的并且可以根据衔接子和马达蛋白以及其他实验条件来控制或选择。在实施例中仅以说明的方式提供了示例性序列。例如，加载链可包含例如SEQ ID NO:18的多核苷酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少20％，例如至少30％、例如至少40％、例如至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％、例如至少95％的序列相似性或同一性的多核苷酸序列。不受理论束缚，本领域技术人员将理解，加载链在促进马达蛋白加载到间隔区上方面的功能可以通过加载位点来实现，该加载链被选择为与用于该方法的衔接子和马达蛋白相容。加载链的序列因此可以改变，前提条件是马达蛋白可以从加载链前进到间隔区上，如本文所述。
在一些实施方式中，封闭部分在间隔区附近(例如，邻近间隔区)附接至衔接子以代替置换的加载链。封闭部分可以是例如单链或非杂交的多核苷酸(即封闭链)，其可以例如通过杂交附接至多核苷酸衔接子上代替置换的加载链。
在使用加载链使马达蛋白前进到间隔区上并且使用封闭链来防止马达蛋白从间隔区移开的一些实施方式中，封闭链可以比加载链更强烈地与多核苷酸衔接子结合。例如，封闭链的长度可以大于加载链，因此杂交比加载链更强。在一些实施方式中，以超过加载链的浓度提供封闭链。通过提供过量的封闭链，减少或防止了置换的加载链的重新退火，从而允许控制多核苷酸衔接子上的马达蛋白的数量。例如，封闭链可以以加载链浓度的至少2x、例如至少5x、例如至少10x、例如至少20x、例如至少50x、或至少100x的浓度存在。
使马达蛋白前进至间隔区
如本文更详细讨论的，本文所提供的方法包括将马达蛋白定位在包含在衔接子中的间隔区上。
如本文更详细讨论的，在一些实施方式中，使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触导致马达蛋白前进到多核苷酸衔衔接子的间隔区上。
在一些实施方式中，使马达蛋白从加载位点前进到间隔区上包括为马达蛋白提供从加载位点传递到间隔区上的动力。可以使用任何合适的推动力。
通常，存在马达蛋白从多核苷酸衔接子(例如从加载位点)前进到间隔区上的能量屏障。能量屏障可能是由马达蛋白前进所沿的线性分子的化学组成的变化引起的。例如，在一些实施方式中，变化可以是从加载位点的多核苷酸主链到间隔区的非多核苷酸主链。在其他实施方式中，能量屏障可以由从加载位点的DNA或RNA骨架到无碱基间隔区的变化产生。能量屏障的典型存在意味着通常需要推动力来促使马达蛋白从多核苷酸衔接子(例如从加载位点)前进到间隔区上。
例如，在一些实施方式中，使马达蛋白前进到间隔区上包括向马达蛋白施加物理或化学力。在一些实施方式中，使马达蛋白前进到间隔区上包括使马达蛋白与一种或多种燃料分子接触。在一些实施方式中，力由第二马达蛋白施加，所述力将马达蛋白“推”到间隔区上。换言之，在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点；马达蛋白是第一马达蛋白并且使第一马达蛋白从加载位点前进到间隔区上包括将第二马达蛋白加载到加载位点上并且使第二马达蛋白从加载位点朝向间隔区前进，其中第二马达蛋白迫使第一马达蛋白到间隔区上。
在其他实施方式中，使封闭部分与多核苷酸衔接子结合迫使马达蛋白到间隔区上。封闭部分与多核苷酸衔接子(例如与加载位点)的结合可以足够有利以克服能量屏障以迫使马达蛋白到间隔区上。
在其他实施方式中，在封闭部分与衔接子结合之前或之后，马达蛋白位于间隔区上。例如，马达蛋白可以位于间隔区上并且与多核苷酸衔接子结合的封闭部分可以防止马达蛋白从间隔区移开。在一些实施方式中，马达蛋白可以位于包含间隔区的衔接子和与衔接子结合的封闭部分上。马达蛋白可以通过任何合适的方式定位在衔接子上。例如，马达蛋白可以优先定位在间隔内的某些位置。例如，在一些实施方式中，马达蛋白可以与间隔区内的核苷酸岛结合。因此，在一些实施方式中，使多核苷酸衔接子与马达蛋白接触可包括使马达蛋白与包含在间隔区中的核苷酸岛接触。
在此类实施方式中，马达蛋白通常被修饰以防止它与间隔区分离，例如通过从间隔区移开与间隔区分离。马达蛋白可以在定位于间隔区之前或之后被修饰。通常，马达蛋白在定位在间隔区上后被修饰。本文更详细地描述了马达蛋白的修饰。
从上述讨论中显而易见的是，所公开方法的一些实施方式涉及使马达蛋白从多核苷酸衔接子前进到间隔区上。
在一些实施方式中，当马达蛋白在间隔区上时，间隔区占据马达蛋白的活性位点。在一些实施方式中，活性位点被间隔区部分占据。在其他实施方式中，活性位点完全被间隔区占据。活性位点可能被占据到足以影响马达蛋白对燃料分子的转换的程度。通常，如本文所用，马达蛋白的活性位点是指马达蛋白中的多核苷酸结合裂缝。本领域技术人员将理解，马达蛋白的ATP结合位点可能不同于多核苷酸衔接子。因此，在一些实施方式中，马达蛋白的多核苷酸结合裂缝被间隔区占据并且马达蛋白的ATP结合位点不被间隔区占据。在其他实施方式中，马达蛋白的多核苷酸结合裂缝和ATP结合位点都被间隔区占据。因此，马达蛋白的多核苷酸结合裂缝可以被间隔区占据并且马达蛋白的ATP结合位点可以被间隔区封闭或阻断，或者可以被ATP接近。不受理论的束缚，即使可接近ATP结合位点，马达蛋白仍可能停滞在间隔区上并且不会参与无用的转换。例如，在一些实施方式中，ATP水解需要马达蛋白中的构象变化，这是由多核苷酸结合到马达蛋白的多核苷酸结合裂缝诱导的。当停在间隔区上使得多核苷酸无法接近多核苷酸结合裂缝时，不会发生这种构象变化并且减少或消除无用的转换。
在一些实施方式中，间隔区跨越马达蛋白的占地面积的全部或部分。在一些实施方式中，间隔区跨越马达蛋白的整个占地面积并占据马达蛋白的活性位点。换句话说，在一些实施方式中，马达蛋白前进到间隔区上，使得马达蛋白完全在间隔区上。
本领域技术人员将理解，在如本文所定义的间隔区上停滞的马达蛋白与仅靠近间隔区例如与间隔区相邻而停滞的马达蛋白之间存在显著差异。如果马达蛋白仅与间隔区相邻或仅以微不足道的量跨越间隔区，则不一定能防止无用的转换。允许马达蛋白从间隔区移开到这种程度并不对应于阻止马达蛋白从如本权利要求中定义的间隔区移开。由于马达蛋白和间隔区之间的轻微重叠而“在”间隔区上但未被阻止以其与多核苷酸结合时基本上相同的速率转换燃料分子的马达蛋白不在如本文所用的间隔区上。
因此，在一些实施方式中，当间隔区占据马达蛋白的活性位点时，马达蛋白对燃料分子的转换减少。在一些实施方式中，消除了马达蛋白对燃料分子的转换。
马达蛋白
如本领域技术人员将理解的，任何合适的马达蛋白均可用于本文提供的方法和产品中。在一个实施方式中，马达蛋白可以是能够与多核苷酸结合并控制其相对于纳米孔(例如通过孔)的运动的任何蛋白质。
在一个实施方式中，马达蛋白是或源自多核苷酸处理酶。多核苷酸处理酶是能够与多核苷酸相互作用并且修饰其的至少一个性质的多肽。酶可以通过切割多核苷酸以形成单独的核苷酸或较短核苷酸链如二核苷酸或三核苷酸来对多核苷酸进行修饰。所述酶可以通过将多核苷酸朝向或使其移动到特定位置来对多核苷酸进行修饰。
在一个实施方式中，马达蛋白源自任何酶分类(EC)组的成员：3.1.11、3.1.13、3.1.14、3.1.15、3.1.16、3.1.21、3.1.22、3.1.25、3.1.26、3.1.27、3.1.30和3.1.31。
通常，马达蛋白是解旋酶、聚合酶、外切核酸酶、拓扑异构酶或其变体。
在一些实施方式中，修饰多核苷酸衔接子的间隔区上的马达蛋白以防止马达蛋白从间隔区脱离(除了通过从间隔区的末端脱离)。马达蛋白可以以任何合适的方式进行调整。例如，马达蛋白可以加载到衔接子上，然后进行修饰以防止它从间隔区脱离。或者，可以对马达蛋白进行修饰，以防止它在加载到衔接子上之前从间隔区脱离。可以使用本领域已知的方法，例如在WO 2014/013260中讨论的方法并特别参考描述修饰马达蛋白(例如解旋酶)以防止它们与多核苷酸链脱离的段落来实现马达蛋白的修饰以防止其从间隔区脱离，WO 2014/013260据此全部内容以引用方式并入。例如，可以通过用四甲基偶氮二甲酰胺(TMAD)处理来修饰马达蛋白。
例如，马达蛋白可以具有多核苷酸解旋开口；例如，当马达蛋白从链上脱离时，多核苷酸链可以通过的空腔、裂缝或空隙。在一些实施方式中，多核苷酸解旋开口是当马达蛋白从间隔区脱离时间隔区可以穿过的开口。在一些实施方式中，给定马达蛋白的多核苷酸解旋开口可以通过参考其结构，例如参考其X射线晶体结构来确定。X射线晶体结构可以在多核苷酸底物存在和/或不存在下获得。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的标准包通过分子建模来推断或证实给定马达蛋白中多核苷酸解旋开口的位置。在一些实施方式中，多核苷酸解旋开口可以通过马达蛋白的一个或多个部分例如一个或多个结构域的移动而瞬时产生。
可以通过关闭多核苷酸解旋开口来修饰马达蛋白。因此，关闭多核苷酸解旋开口可以防止马达蛋白从间隔区脱离。例如，可以通过共价关闭多核苷酸未结合开口来修饰马达蛋白。在一些实施方式中，用于以这种方式寻址的优选马达蛋白是解旋酶。
在一个实施方式中，马达蛋白是外切核酸酶。合适酶包括(但不限于)来自大肠杆菌的核酸外切酶I(SEQ ID NO:1)、来自大肠杆菌的核酸外切酶III(SEQ ID NO:2)、来自嗜热栖热菌的RecJ(SEQ ID NO:3)和噬菌体λ核酸外切酶(SEQ ID NO:4)、TatD核酸外切酶和它们的变体。包括SEQ ID NO:3中所示序列的三个亚基或其变体相互作用以形成三聚体核酸外切酶。
在一个实施方式中，马达蛋白是聚合酶。聚合酶可以是
Figure BDA0003361348510000271
3173DNA聚合酶(其可购自
Figure BDA0003361348510000272
公司)、SD聚合酶(可购自
Figure BDA0003361348510000273
)、来自NEB的Klenow、或它们的变体。在一个实施方式中，酶是
Figure BDA0003361348510000276
DNA聚合酶(SEQ ID NO:5)或其变体。可用于本发明的Phi29聚合酶的修饰形式公开于美国专利No.5,576,204中。
在一个实施方式中，马达蛋白是拓扑异构酶。在一个实施方式中，拓扑异构酶是部分分类(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3中的任一个的成员。拓扑异构酶可以是逆转录酶，其是能够催化从RNA模板形成cDNA的酶。它们可从例如New England
Figure BDA0003361348510000274
和
Figure BDA0003361348510000275
商购获得。
在一个实施方式中，马达蛋白是解旋酶。可以根据本文提供的方法使用任何合适的解旋酶。例如，根据本公开使用的所述或每个马达蛋白可以独立地选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、TraI解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和Dda解旋酶，或其变体。单聚解旋酶可以包含附接在一起的若干结构域。例如，TraI解旋酶和TraI亚组解旋酶可以含有两个RecD解旋酶结构域、释放酶结构域和C末端结构域。这些结构域通常形成能够起作用而不会形成寡聚体的单聚解旋酶。合适的解旋酶的具体示例包括Hel308、NS3、Dda、UvrD、Rep、PcrA、Pif1和TraI。这些解旋酶通常作用于单链DNA。可以沿着双链DNA的两条链移动的解旋酶的示例包括FtfK和六聚酶复合物，或多亚基复合物，诸如RecBCD。
Hel308解旋酶在出版物如WO 2013/057495中有所描述，其全部内容通过引用并入。RecD解旋酶在诸如WO 2013/098562的出版物中有描述，其全部内容通过引用并入。XPD解旋酶在诸如WO 2013/098561的出版物中有所描述，其全部内容通过引用并入。Dda解旋酶在诸如WO 2015/055981和WO 2016/055777的出版物中有所描述，它们各自的全部内容通过引用并入。
在一个实施方式中，解旋酶包括SEQ ID NO:6中所示的序列(Trwc Cba)或其变体、SEQ ID NO:7中所示的序列(Hel308 Mbu)或其变体、或SEQ ID NO:8中所示的序列(Dda)或其变体。变体可以以下文论述的方式中的任何方式与天然序列不同。SEQ ID NO:8的示例变体包含E94C/A360C。SEQ ID NO：8的另一个示例变体包含E94C/A360C，然后是(ΔM1)G1G2(即M1的缺失，然后是G1和G2的添加)。
在一些实施方式中，马达蛋白(例如解旋酶)可以以至少两种活性操作模式(当马达蛋白具有促进运动的所有必要组分，例如本文所讨论的燃料和辅因子，例如ATP和Mg2+)和一种非活性操作模式(当马达蛋白没有促进运动的必要组分时)控制多核苷酸的运动。
当提供所有必要的组分以促进运动(即在活性模式下)时，马达蛋白(例如解旋酶)在5'到3'或3'到5'方向(取决于马达蛋白)上沿着多核苷酸移动。在其中使用马达蛋白来控制多核苷酸链相对于纳米孔的运动的实施方式中，马达蛋白可用于将多核苷酸移动远离(例如移出)孔(例如对抗外加的场)或将多核苷酸朝向(例如进入)孔移动(例如使用外加的场)。例如，当马达蛋白向其移动的多核苷酸末端被孔捕获时，马达蛋白逆着由施加的电势产生的场的方向起作用并将带螺纹的多核苷酸拉出孔(例如进入顺式室)。然而，当马达蛋白移动远离的末端被捕获在孔中时，马达蛋白以由施加的电位产生的场的方向工作并将经穿孔的多核苷酸推入孔中(例如进入反式室)。
当马达蛋白(例如解旋酶)没有提供促进运动的必要组分(即处于非活性模式)时，它可以与多核苷酸结合并作为制动器，当它相对于纳米孔运动时减慢多核苷酸的运动，例如通过由施加的电势产生的场拉入孔中。在非活性模式下，多核苷酸的哪一端被捕获并不重要，所施加的场决定了多核苷酸相对于孔的运动，并且马达蛋白充当制动器。当在非活性模式中时，通过马达蛋白对多核苷酸的移动控制可以多种方式(包括棘轮、滑动和制动)描述。
如上所述，本文公开的方法可以减少无用转换的概念。转换是由马达蛋白对燃料分子进行的化学(酶促)转化。
燃料通常是游离核苷酸或游离核苷酸类似物。游离核苷酸可以是但不限于腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、环腺苷一磷酸(cAMP)、环鸟苷一磷酸(cGMP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧胞苷一磷酸(dCMP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。游离核苷酸通常选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。游离核苷酸通常是三磷酸腺苷(ATP)。
马达蛋白的辅因子是允许马达蛋白发挥功能的因子。辅因子优选地是二价金属阳离子。二价金属阳离子优选地为Mg2+、Mn2+、Ca2+或Co2+。辅因子最优选是Mg2+。
去除过量的马达蛋白
在一些实施方式中，所提供的方法进一步包括去除不在间隔区上的过量马达蛋白分子的步骤。去除过量的马达蛋白可以称为胁迫步骤。胁迫步骤可用于从多核苷酸衔接子中去除错误结合的马达蛋白。在所提供的包括修饰马达蛋白以防止其从间隔区脱离的方法的实施方式中，胁迫步骤可用于去除未正确修饰的马达蛋白。
去除过量的马达蛋白有利于减少或排除未在本文所述的多核苷酸衔接子上停滞的未结合马达蛋白的存在。未停滞的马达蛋白可能与多核苷酸链结合和/或可能消耗存在的燃料分子，即可能参与无用的转换。去除过量的马达蛋白会减少或防止来自未停滞的马达蛋白的这种无用转换，从而减少燃料分子的非生产性消耗。
可以以任何合适的方式去除未结合的马达蛋白(例如在胁迫步骤中)。例如，可以通过洗涤或过滤去除未结合的马达蛋白。可以使用高盐洗涤缓冲液去除未结合的马达蛋白。可以使用促进其去除的特定pH或温度条件去除未结合的马达蛋白。例如，压力条件可以包括例如在诸如ATP的燃料存在下的高盐浓度。
使马达蛋白脱离间隔区
如本文更详细讨论的，在一些实施方式中，衔接子可用于在马达蛋白用于控制靶多核苷酸的运动之前使马达蛋白停滞。例如，在一些实施方式中，所公开的衔接子提供用于控制靶多核苷酸相对于纳米孔的运动的马达蛋白。在一些实施方式中，靶多核苷酸相对于纳米孔的运动可用于表征靶多核苷酸。
如本文更详细地讨论的，所公开的方法涉及使马达蛋白在间隔区上停滞。封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开到多核苷酸衔接子上，例如从间隔区移到多核苷酸衔接子的加载位点上。
通常，马达蛋白从间隔区进入靶多核苷酸存在能量屏障，以控制靶多核苷酸的运动。能量屏障可能是由马达蛋白前进所沿的线性分子的化学组成的变化引起的。例如，在一些实施方式中，改变可以是从间隔区的非多核苷酸主链到靶多核苷酸的多核苷酸主链。在其他实施方式中，能量屏障可以由靶多核苷酸的从基本间隔区至DNA或RNA骨架的变化产生。能量屏障的典型存在意味着通常需要推动力来促使马达蛋白从多核苷酸衔接子(例如从间隔区)进展到靶多核苷酸上。
在一些实施方式中，使马达蛋白从间隔区前进到靶多核苷酸上因此包括为马达蛋白提供从间隔区传递到靶多核苷酸上的推动力。可以使用任何合适的推动力。
例如，在一些实施方式中，可以通过使多核苷酸衔接子与纳米孔接触来提供推动力。例如，在一些实施方式中，纳米孔与多核苷酸衔接子接合并迫使马达蛋白到达靶多核苷酸上。
更详细地，在一些实施方式中，在使多核苷酸衔接子附接至靶多核苷酸的条件下，使具有在其间隔区上停滞的马达蛋白的多核苷酸衔接子与靶多核苷酸接触。例如，如本文更详细地描述的，多核苷酸衔接子可以连接至靶多核苷酸衔接子，例如连接至靶多核苷酸的末端。多核苷酸衔接子-靶多核苷酸缀合物可以与纳米孔接触，使得多核苷酸衔接子与纳米孔接合。例如，多核苷酸衔接子可以穿过纳米孔。多核苷酸衔接子相对于纳米孔的运动(例如穿过纳米孔)可以对停滞在多核苷酸衔接子的间隔区上的马达蛋白提供力。例如，在多核苷酸衔接子在施加电位的影响下穿过纳米孔的实施方式中，当纳米孔接近或接触纳米孔时由纳米孔施加在马达蛋白上的力足以迫使马达蛋白到达靶多核苷酸上。在此类实施方式中，纳米孔可以被认为是将马达蛋白从间隔区“推”到靶多核苷酸衔接子上。此类实施方式特别适合(但不限于)本公开的实施方式，其中多核苷酸衔接子包含位于(i)加载位点与(ii)多核苷酸链之间的间隔区，该多核苷酸链可以连接或以其他方式附接至靶多核苷酸上.
在其他实施方式中，将马达蛋白从间隔区推进到靶多核苷酸上所需的力是通过向马达蛋白施加物理或化学力来提供。在一些实施方式中，使马达蛋白从间隔区前进到靶多核苷酸上包括使马达蛋白与一种或多种燃料分子接触。在一些实施方式中，力由第二马达蛋白施加，所述力将马达蛋白从间隔区“推”到靶多核苷酸上。换句话说，在一些实施方式中，多核苷酸衔接子包含间隔区并附接至靶多核苷酸；马达蛋白是第一马达蛋白并且使第一马达蛋白从间隔区前进到靶多核苷酸上包括将第二马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上并使第二马达蛋白朝向靶多核苷酸前进，其中第二马达蛋白蛋白质迫使第一马达蛋白质到间隔区上。在此类实施方式中，多核苷酸衔接子通常包含连接至远离靶多核苷酸(远离附接至或将附接至靶多核苷酸的多核苷酸衔衔接子的末端)的间隔区末端的加载位点。
应当理解，在此类实施方式中，为了使马达蛋白从间隔区前进到靶多核苷酸上，通常不需要去除封闭部分。然而，在一些实施方式中，该方法涉及置换封闭部分。例如，可以通过使多核苷酸衔接子与纳米孔接触来去除或置换封闭部分。在一些实施方式中，从多核苷酸衔接子上去除封闭部分允许将马达蛋白从间隔区移开到多核苷酸衔接子上和/或到靶多核苷酸上。
在一些实施方式中，封闭部分在间隔区远离靶多核苷酸的一侧(即远离附接至或将附接至靶多核苷酸的多核苷酸衔接子的末端)与多核苷酸衔接子结合。在此类实施方式中，多核苷酸衔接子通常包含连接到远离靶多核苷酸的间隔区末端(远离附接至或将附接至靶多核苷酸的多核苷酸衔接子的末端)的加载位点，并且封闭部分与在加载位点与间隔区之间的多核苷酸衔接子结合。
在其他实施方式中，封闭部分与在间隔区与靶多核苷酸之间的多核苷酸衔接子结合(朝向附接至或将附接至靶多核苷酸的多核苷酸衔接子的末端)。在此类实施方式中，多核苷酸衔接子通常包含连接到远离靶多核苷酸的间隔区末端(远离附接至或将附接至靶多核苷酸的多核苷酸衔接子的末端)的加载位点，并且封闭部分与朝向附接至或将附接至靶多核苷酸的多核苷酸衔接子的末端的多核苷酸衔接子结合。
控制运动和表征
本文还提供了一种控制靶多核苷酸相对于跨膜纳米孔移动的方法，所述方法包括：
i)提供(A)靶多核苷酸；(B)包含间隔区的多核苷酸衔接子；和(C)马达蛋白；
ii)进行如本文所公开的方法，从而使马达蛋白在多核苷酸衔接子的间隔区上停滞；
iii)使靶多核苷酸和多核苷酸衔接子的间隔区上停滞的马达蛋白与纳米孔接触；以及
iv)在跨膜纳米孔上施加电位，从而使马达蛋白移动越过间隔区到达靶多核苷酸上，从而控制靶多核苷酸相对于纳米孔的运动。
本文公开的实施方式中的方法中的任何方法可用于使马达蛋白在多核苷酸衔接子的间隔区上停滞。
在一个实施方式中，靶多核苷酸与多核苷酸衔接子结合。在一个实施方式中，步骤(iii)包括将多核苷酸衔接子与靶多核苷酸结合。
在一个实施方式中，在多核苷酸衔接子附接至靶多核苷酸之前，马达蛋白停滞在多核苷酸衔接子上。在另一个实施方式中，在马达蛋白停滞在多核苷酸衔接子上之前，多核苷酸衔接子附接至靶多核苷酸。
本文还提供了一种控制靶多核苷酸相对于跨膜纳米孔移动的方法，所述方法包括：
i)提供靶多核苷酸；
ii)提供包含间隔区并且其上停滞有马达蛋白的多核苷酸衔接子，其中所述多核苷酸衔接子是根据本文所公开的方法中的任何方法获得的；
iii)使靶多核苷酸和多核苷酸衔接子与纳米孔接触；以及
iv)在跨膜纳米孔上施加电位，从而使马达蛋白移动越过间隔区到达靶多核苷酸上，从而控制靶多核苷酸相对于纳米孔的运动。
本文公开的实施方式中的方法中的任何方法可用于使马达蛋白在多核苷酸衔接子的间隔区上停滞。
在一个实施方式中，靶多核苷酸与多核苷酸衔接子结合。在一个实施方式中，步骤(iii)包括将多核苷酸衔接子与靶多核苷酸结合。
在所公开的方法中，多核苷酸衔接子可以任何方式附接至靶多核苷酸。衔接子优选共价连接于靶多核苷酸。衔接子可以接合至靶多核苷酸。衔接子可以连接至靶多核苷酸的任一端，即5’或3’端，或连接至靶多核苷酸的两端，即至5’端和至3’端。可以使用本领域已知的任何方法将衔接子连接至靶多核苷酸。可以在不存在ATP的情况下或使用γ-S-ATP(ATPγS)代替ATP将衔接子连接至靶多核苷酸。通常，如果当多核苷酸衔接子附接至靶多核苷酸时马达蛋白在多核苷酸衔接子上停滞，则在不存在ATP的情况下将衔接子连接到靶多核苷酸。可以使用连接酶，诸如T4 DNA连接酶、大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Tma DNA连接酶和9°N DNA连接酶来连接衔接子。在方法的步骤(iii)之前，可以从样品中去除连接酶。可以使用拓扑异构酶附连衔接子。拓扑异构酶可以是例如MoietyClassification(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3的成员。
还提供了一种表征靶多核苷酸的方法，所述方法包括：
i)进行上述公开的方法之一；和
ii)在所述靶多核苷酸相对于所述纳米孔移动时进行一次或多次测量，其中所述一次或多次测量指示所述靶多核苷酸的一个或多个特征，从而在所述靶多核苷酸相对于所述纳米孔移动时表征所述靶多核苷酸。
多核苷酸衔接子
还提供了多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含间隔区并且具有停滞在间隔区上的马达蛋白。应当理解的是，本文公开的任何多核苷酸衔接子都可以应用于本文和上文讨论的方法的实施方式中。
在一个实施方式中，本文提供了一种多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含(i)间隔区；(ii)停滞在所述间隔区上的马达蛋白，其中所述马达蛋白的活性位点被所述间隔区占据；以及(iii)与所述衔接子结合的封闭部分，其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
在一些实施方式中，间隔区、马达蛋白和封闭部分如本文中详细描述的。
在一个实施方式中，(i)衔接子包含连接至间隔区的加载位点并且封闭部分与加载位点结合；并且(ii)封闭部分阻止马达蛋白与加载位点接合。在一些实施方式中，加载位点如本文所述。
在一个实施方式中，提供了一种多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含：
i)在5'到3'方向上的{LB-S-D}n或{D-S-LB}n；其中LB是经封闭的加载位点；S是间隔区；D是双链多核苷酸；并且n是整数，可选地1至约20的整数；以及
ii)停滞在间隔区(S)上的一个或多个马达蛋白；
其中该或每个LB部分防止该或每个马达蛋白在远离双链多核苷酸(D)的方向上从间隔区(S)移开。
在一些实施方式中，加载位点、间隔区和马达蛋白如本文所述。
在一些实施方式中，n是1至约10的整数，例如1至约5，例如1、2、3或4，通常为1或2。在一些实施方式中，n大于1，并且多个马达蛋白可以停滞在多个间隔区S上。
在一些实施方式中，双链多核苷酸的长度介于约1个核苷酸与约1000个核苷酸之间。在一些实施方式中，双链多核苷酸的长度介于约5个核苷酸与约500个核苷酸之间、例如介于约10个核苷酸与约100个核苷酸之间、例如介于约20个核苷酸与约80个核苷酸之间、例如介于约30个核苷酸与约50个核苷酸之间。
在一些实施方式中，LB可以是多核苷酸，所述多核苷酸是作为D的相同类型的多核苷酸，或者可以是来自D的不同类型的多核苷酸。LB和/或D可以是与衔接子可以附接至的靶多核苷酸相同类型的多核苷酸，或可以是与所述靶多核苷酸不同类型的多核苷酸。例如，LB可以是双链DNA并且D可以是双链DNA并且衔接子可以适合于附接至靶多核苷酸，所述靶多核苷酸是双链DNA。
在一个实施方式中，提供了一种多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含：
i)在5'到3'方向上的{LB-S-D}n或{D-S-LB}n；其中LB是第一双链多核苷酸；S是间隔区；D是第二双链多核苷酸；并且n是整数，可选地1至约20的整数；并且其中所述第一双链多核苷酸(LB)与所述间隔区(S)邻接并且所述间隔区(S)与所述第二双链多核苷酸(D)邻接；以及
ii)停滞在间隔区(S)上的一个或多个马达蛋白。
在一些实施方式中，间隔区和马达蛋白如本文所述。
在一些实施方式中，n是1至约10的整数，例如1至约5，例如1、2、3或4，通常为1或2。
在一些实施方式中，LB可以是多核苷酸，所述多核苷酸是作为D的相同类型的多核苷酸，或者可以是来自D的不同类型的多核苷酸。LB和/或D可以是与衔接子可以附接至的靶多核苷酸相同类型的多核苷酸，或可以是与所述靶多核苷酸不同类型的多核苷酸。例如，LB可以是双链DNA并且D可以是双链DNA并且衔接子可以适合于附接至靶多核苷酸，所述靶多核苷酸是双链DNA。
试剂盒
还提供了包含多核苷酸衔接子和马达蛋白的试剂盒。应当理解的是，本文公开的任何多核苷酸衔接子都可以应用于本文和上文讨论的试剂盒的实施方式中。
在一个实施方式中，提供了一种用于修饰靶多核苷酸的试剂盒，包括：
i)包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)能够控制靶多核苷酸运动的马达蛋白；以及
iii)封闭部分，所述封闭部分能够与多核苷酸衔接子结合，使得当马达蛋白位于多核苷酸衔接子的间隔区上并且马达蛋白的活性位点被间隔区占据时，防止马达蛋白从间隔区移开。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子是如本文更详细描述的多核苷酸衔接子。在一个实施方式中，马达蛋白是如本文所述的马达蛋白。在一个实施方式中，封闭部分是如本文所述的封闭部分。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含加载位点。加载位点可以是如本文所述的任何加载位点。在一个实施方式中，封闭部分能够与多核苷酸衔接子结合，从而防止马达蛋白与加载位点接合。
还提供了一种用于修饰靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)包含间隔区的多核苷酸衔接子和与多核苷酸衔接子结合的封闭部分；和
ii)能够控制靶多核苷酸的运动的马达蛋白；
其中当马达蛋白与衔接子结合时，封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开。
多核苷酸衔接子、间隔区、封闭部分和马达蛋白通常如本文更详细地定义。
系统
还提供了包含多核苷酸衔接子、马达蛋白和纳米孔的系统。应当理解的是，本文公开的任何多核苷酸衔接子都可以应用于本文和上文讨论的系统的实施方式中。
在一个实施方式中，提供了一种用于表征靶多核苷酸的系统，所述系统包括：
-包含间隔区的多核苷酸衔接子；
-马达蛋白，其中所述马达蛋白的活性位点被间隔区占据；
-与衔接子结合的封闭部分，其中所述封闭部分防止马达蛋白从间隔区移开；
-纳米孔，所述纳米孔用于在靶多核苷酸相对于纳米孔移动时表征靶多核苷酸。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子是如本文更详细描述的多核苷酸衔接子。在一个实施方式中，马达蛋白是如本文所述的马达蛋白。在一个实施方式中，封闭部分是如本文所述的封闭部分。在一个实施方式中，纳米孔是如本文所述的纳米孔。所述系统还可包括如本文所定义的膜；控制设备；等。
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包含加载位点。加载位点可以是如本文所述的任何加载位点。在一个实施方式中，封闭部分能够与多核苷酸衔接子结合，从而防止马达蛋白与加载位点接合。
在一个实施方式中，所述系统还包含靶多核苷酸。在一个实施方式中，靶多核苷酸是如本文所述的靶多核苷酸。
靶多核苷酸
在涉及表征靶多核苷酸的本公开的实施方式中，靶分析物相对于例如进入或穿过如本文更详细描述的跨膜纳米孔移动。
在一个实施方式中，确定靶多核苷酸的存在、不存在或一个或多个特性。方法可以用于确定至少一种靶多核苷酸的存在、不存在或一个或多个特性。方法可以涉及确定两种或更多种靶多核苷酸的存在、不存在或一个或多个特性。方法可以包括确定任何数量的靶多核苷酸(如2种、5种、10种、15种、20种、30种、40种、50种、100种或更多种靶多核苷酸)的存在、不存在或一个或多个特性。可以确定一种或多种靶多核苷酸的任何数量的特性，如1种、2种、3种、4种、5种、10种或更多种特性。
分子(例如靶多核苷酸)在孔的通道中的结合将对通过孔的开放通道离子流产生影响，这是孔通道的“分子感测”的本质。可以使用合适的测量技术通过电流的变化来测量开放通道离子流的变化(例如，WO 2000/28312和D.Stoddart等人,《美国国家科学院院刊》,2010,106,7702-7或WO 2009/077734)。通过电流的减少测量的离子流的减少程度与孔内或孔附近的障碍物的大小有关。因此，孔中或孔附近的感兴趣的分子(例如靶多核苷酸)的结合提供了可检测和可测量的事件，从而形成了“生物传感器”的基础。检测生物分子的存在可应用于个性化药物开发、医学、诊断、生命科学研究、环境监测以及安全和/或国防工业。
靶多核苷酸可以从细胞分泌。可替代地，目标分析物可以是存在于细胞内部的分析物，使得在实施方法之前必须从细胞中提取分析物。
在一个实施方式中，靶多核苷酸是核酸。多核苷酸定义为包括两个或更多个核苷酸的大分子。DNA和RNA中天然存在的核酸碱基可以通过其物理大小来区分。当核酸分子或单独的碱基穿过纳米孔的通道时，碱基之间的大小差异会导致通过通道的离子流直接相关地减少。可以记录离子流的变化。用于记录离子流变化的合适的电测量技术描述于例如WO2000/28312和D.Stoddart等人,《美国国家科学院院刊》,2010,106,第7702-7页(单通道记录设备)；以及例如WO 2009/077734(多通道记录技术)中。通过适当的校准，离子流的特性减少可以用于实时鉴定穿过通道的特定核苷酸和相关碱基。在典型的纳米孔核酸测序中，由于通道被核苷酸部分堵塞，当所关注的核酸序列的单个核苷酸按顺序穿过纳米孔的通道时，开放通道离子流减少。使用上述合适的记录技术测量的正是这种离子流的减少。可以将离子流的减少校准为通过通道的已知核苷酸的测量离子流的减少，从而产生用于确定哪个核苷酸正在穿过通道的手段，并且因此，当按顺序进行时，产生确定穿过纳米孔的核酸的核苷酸序列的方式。为了准确地确定单独的核苷酸，通常需要使通过通道的离子流的减少与穿过收缩部(或“读取头”)的单独的核苷酸的大小直接相关。应当理解，例如，可以对完整的核酸聚合物执行测序，所述完整的核酸聚合物例如通过相关联的马达蛋白例如聚合酶或解旋酶的作用“穿过”孔。可替代地，可以通过使已经从邻近孔的靶核酸中按顺序去除的核苷酸三磷酸碱基的通路来确定序列(参见例如WO 2014/187924)。
多核苷酸或核酸可以包括任何核苷酸的任何组合。核苷酸可以是天然存在的或人工的。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以是氧化的或甲基化的。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以是受损的。例如，多核苷酸可以包括嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线损伤有关并且是皮肤黑色素瘤的主要病因。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以例如用标记或标签修饰，所述标记或标签的合适的示例是技术人员已知的。多核苷酸可以包括一或多个间隔区。核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基。核碱基和糖形成核苷。核碱基通常是杂环的。核碱基包括(但不限于)嘌呤和嘧啶，且更详细地说腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。糖通常是戊糖。核苷酸糖包括(但不限于)核糖和脱氧核糖。糖优选地是脱氧核糖。多核苷酸优选地包含以下核苷：脱氧腺苷(dA)、脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。核苷酸可以包括多于三个磷酸，如4个或5个磷酸。磷酸可以附接在核苷酸的5'或3'侧上。多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此附接。核苷酸通常通过其糖和磷酸基附接，如在核酸中那样。核苷酸可以通过其核碱基连接，如在嘧啶二聚体中那样。多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸的至少一部分优选地是双链的。多核苷酸最优选地是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。具体地，使用多核苷酸作为分析物的所述方法可替代地包括确定选自以下的一个或多个特性：(i)多核苷酸的长度；(ii)多核苷酸的同一性；(iii)多核苷酸的序列；(iv)多核苷酸的二级结构；和(v)多核苷酸是否被修饰。
多核苷酸可以是任何长度(i)。例如，多核苷酸的长度可以是至少10个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少500个核苷酸或核苷酸对。多核苷酸的长度可以是1000个或更多个核苷酸或核苷酸对、5000个或更多个核苷酸或核苷酸对、或长度是100000个或更多个核苷酸或核苷酸对。可以研究任何数量的多核苷酸。例如，方法可以涉及表征2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、50个、100个或更多个多核苷酸。如果表征两个或更多个多核苷酸，则其可以是不同的多核苷酸或同一多核苷酸的两个示例。多核苷酸可以是天然存在的或人工的。例如，方法可以用于验证所制造寡核苷酸的序列。方法通常在体外进行。
核苷酸可以具有任何同一性(ii)，并且包含但不限于单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、单磷酸5-甲基胞苷、单磷酸5-羟基甲基胞苷、单磷酸胞苷(CMP)、单磷酸环腺苷(cAMP)、单磷酸环鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)和单磷酸脱氧甲基胞苷。核苷酸优选地是选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。核苷酸可以无碱基(即缺乏核碱基)。核苷酸还可缺乏核碱基和糖(即，是C3间隔区)。核苷酸(iii)的序列由链的5'到3'方向上在整个多核苷酸菌株中彼此附接的以下核苷酸的连续同一性确定。
靶多核苷酸可以包括PCR反应的产物、基因组DNA、内切核酸酶消化的产物和/或DNA文库。靶多核苷酸可以从任何生物或微生物中获得或提取。靶多核苷酸通常获自人或动物，例如获自尿液、淋巴、唾液、粘液、精液或羊水，或获自全血、血浆或血清。靶多核苷酸可以获自植物，例如谷类、豆类、水果或蔬菜。靶多核苷酸可包含基因组DNA。可以使基因组DNA片段化。可以通过任何合适的方法使DNA片段化。例如，片段化DNA的方法是本领域已知的，这样的方法可以使用转座酶，诸如MuA转座酶。往往，不对基因组DNA进行片段化。在一些实施方式中，靶多核苷酸可以是DNA、RNA和/或DNA/RNA杂交体。
纳米孔
在涉及纳米孔的本发明实施方式中，可以使用任何合适的纳米孔。在一个实施方式中，纳米孔是跨膜孔。
跨膜孔是某种程度上跨膜的结构。它允许由施加的电势驱动的水合离子在膜上或膜内流动。跨膜孔通常穿过整个膜，使得水合离子可以从膜的一侧流向膜的另一侧。然而，跨膜孔不必要穿过膜。它可能在一端封闭。例如，孔可以是膜中的孔、间隙、通道、沟槽或狭缝，水合离子可以沿着膜流入或流入到膜中。
在本文提供的方法中可以使用任何跨膜孔。孔可以是生物的或人工的。合适的孔包括但不限于蛋白质孔、多核苷酸孔和固态孔。孔可以是DNA折纸孔(origami pore)(Langecker等人，科学(Science)，2012年；338:932-936)。WO2013/083983中公开了合适的DNA折纸孔。
在一个实施方式中，纳米孔是跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是允许水合离子(例如多核苷酸)从膜的一侧流向膜的另一侧的多肽或多肽集合。在本文提供的方法中，跨膜蛋白孔能够形成允许由施加的电势驱动的水合离子从膜的一侧流向另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选地允许多核苷酸从膜诸如三嵌段共聚物膜的一侧流到另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸移动通过孔。
在一个实施方式中，纳米孔是跨膜蛋白孔，其为单体或寡聚体。孔优选地由若干重复的亚基，诸如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个亚基组成。孔优选地是六聚体、七聚体、八聚体或非聚体的孔。孔可为同型寡聚物或异型寡聚物。
在一个实施方式中，跨膜蛋白孔包括离子可以通过其流动的桶或通道。孔的亚基通常围绕中心轴线并且为跨膜β-筒或通道或者跨膜α螺旋束或通道提供链。
通常，跨膜蛋白质孔的圆筒或通道包括促进与分析物(例如靶多核苷酸(如本文所述的))的相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选地位于桶或通道的缢痕附近。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸或组氨酸或芳香族氨基酸，诸如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸典型地促进孔与核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。
在一个实施方式中，纳米孔是源自β-桶孔或α-螺旋束孔的跨膜蛋白孔。β-桶孔包含由β-链形成的桶或通道。合适的β-桶孔包含但不限于β-毒素，诸如α-溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白，诸如耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)，例如MspA、MspB、MspC或MspD、CsgG、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟菌(Neisseria)自转运体脂蛋白(NalP)和其他孔，诸如lysenin。α螺旋束孔包括由α螺旋形成的圆筒或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于内膜蛋白和α外膜蛋白，如WZA和ClyA毒素。
在一个实施方式中，纳米孔是源自或基于Msp、α-溶血素(α-HL)、胞溶素、CsgG、ClyA、Sp1或溶血性蛋白质fragaceatoxin C(FraC)的跨膜孔。
在一个实施方式中，纳米孔是源自CsgG的跨膜蛋白孔，例如来自源自大肠杆菌菌株K-12亚株MC4100的CsgG。此类孔是寡聚的，并且通常包括衍生自CsgG的7、8、9或10个单体。孔可以是衍生自包括相同单体的CsgG的同质寡聚孔。替代地，孔可以是衍生自包括至少一种不同于其他单体的单体的CsgG的异质寡聚孔。在WO 2016/034591中公开了源自CsgG的合适的孔的示例。
在一个实施方式中，纳米孔是源自溶酶素的跨膜孔。WO 2013/153359中公开了源自胞溶素的合适的孔的示例。
在一个实施方式中，纳米孔是衍生自或基于的跨膜孔α-溶血素(α-HL)。野生型α-溶血素孔由7个相同的单体或亚基形成(即，它是七聚的)。α-溶血素孔可以是α-溶血素-NN或其变体。变体优选地包括在位置E111和K147处的N个残基。
在一个实施方式中，纳米孔是源自Msp，例如源自MspA的跨膜蛋白孔。在WO 2012/107778中公开了衍生自MspA的合适的孔的示例。
在一个实施方式中，纳米孔是源自或基于ClyA的跨膜孔。
膜
在包括使用跨膜纳米孔的本发明实施方式中，跨膜纳米孔通常存在于膜中。系统中可以使用任何合适的膜。
膜优选地是两亲层。两亲层是由如磷脂等两亲分子形成的层，其具有亲水性和亲脂性两者。两亲性分子可以是合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在所属领域中是已知的，且包括例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人,《朗缪尔(Langmuir)》,2009,25,10447-10450)。嵌段共聚物是聚合在一起的两个或更多个单体亚基产生单一聚合物链的聚合材料。嵌段共聚物通常具有通过每个单体亚基贡献的性质。然而，嵌段共聚物可具有由个别子单元形成的聚合物不拥有的独特特性。嵌段共聚物可进行工程改造，使得单体子单元中的一个在水性介质中是疏水性的(即亲脂性)，而其他子单元是亲水性的。在这种情况下，嵌段共聚物可拥有两亲特性，且可形成模拟生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段的(其由两个单体子单元组成)，但也可由超过两个的单体子单元来构建，形成表现为两亲物的更复杂的排列。共聚物可以是三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。膜优选地是三嵌段共聚物膜。
古细菌双极性四醚脂质是天然存在的脂质，其被构建成使得脂质形成单层膜。这些脂质一般发现于在苛刻生物环境中存活的嗜极生物、嗜热生物、嗜盐生物和嗜酸生物中。认为其稳定性是源于最终双层的融合性质。直接了当的做法是，通过产生具有一般基序亲水性-疏水性-亲水性的三嵌段聚合物来构建模拟这些生物实体的嵌段共聚物材料。这种材料可以形成表现类似于脂质双层并且涵盖从囊泡到层状膜的一系列阶段表现的单体膜。由这些三嵌段共聚物形成的膜在生物脂质膜上保持若干优势。因为合成三嵌段共聚物，所以可小心地控制准确的构建，以提供形成膜和与孔和其他蛋白质相互作用所需的正确链长度和特性。
还可以由不分类为脂质亚材料的子单元来构建嵌段共聚物；例如可由硅氧烷或其他非基于烃的单体来制成疏水性聚合物。嵌段共聚物的亲水性亚区段还可以具备低蛋白质结合特性，这允许产生当暴露于原始生物样品时具有高度抗性的膜。此头基单元还可来源于非经典的脂质头基。
与生物脂质膜进行比较，三嵌段共聚物膜还具有增加的机械和环境稳定性，例如高许多的操作温度或pH范围。嵌段共聚物的合成性质提供定制用于广泛范围应用的基于聚合物的膜的平台。
在一些实施方式中，膜是国际申请号WO2014/064443或WO2014/064444中所公开的膜中的一个膜。
两亲性分子可进行化学修饰或官能化，以便于偶联聚核苷酸。两亲性层可以是单层或双层。两亲性层通常是平面的。两亲性层可以是弯曲的。两亲性层可以是支撑式的。
两亲膜通常天然地是可移动的，基本上以大致10-8cm s-1的脂质扩散速率充当二维液体。这意味着孔和偶联的多核苷酸可通常在两亲膜内移动。
膜可以是脂质双层。脂质双层是细胞膜的模型，且用作一系列实验研究的极佳平台。例如，脂质双层可用于通过单通道记录对膜蛋白的活体外研究。可替代地，脂质双层可以用作检测一系列物质的存在的生物传感器。脂质双层可以是任何脂质双层。合适的脂质双层包含但不限于平面脂质双层、支持双层或脂质体。脂质双层优选地是平坦脂质双层。合适脂质双层公开于WO 2008/102121、WO 2009/077734和WO 2006/100484中。
用于形成脂质双层的方法在所属领域中是已知的。脂质双层通常通过Montal和Mueller的方法(《美国国家科学学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》,1972；69:3561-3566)来形成，其中脂质单层携载于通过开孔两侧的水溶液/空气界面上，所述开孔垂直于所述界面。通常通过首先将脂质溶解在有机溶剂中，且接着使在开孔两侧上的水溶液的表面上蒸发一滴溶剂，来将脂质添加到水性电解质溶液的表面。一旦有机溶剂已蒸发，那么开孔两侧上的溶液/空气界面来回物理地移动通过开孔，直到形成双层为止。可跨越膜中的开孔或跨越凹槽中的开口形成平坦脂质双层。
Montal和Mueller的方法是常用的，这是因为是节约成本的，且是形成适合于蛋白孔插入的良好品质脂质双层的相对直接了当的方法。双层形成的其他常见方法包含脂质体双层的尖端浸没、双层涂刷和贴片夹持。
尖端浸没双层形成需要使开孔表面(例如移液管尖端)接触到携载脂质单层的测试溶液的表面。同样，通过将溶解于有机溶剂中的一滴脂质在溶液表面处蒸发来首先在溶液/空气界面处产生脂质单层。接着，通过朗缪尔-沙佛(Langmuir-Schaefer)过程形成双层，且需要机械自动以使开孔相对于溶液表面移动。
对于涂刷的双层，将溶解于有机溶剂中的一滴脂质直接应用于开孔，所述开孔浸没在水性测试溶液中。使用笔刷或等效物，使脂质溶液稀薄地扩散在开孔内。溶剂的稀化使得形成脂质双层。然而，从双层完全去除溶剂是非常困难的，且因此通过这种方法形成的双层较不稳定且更倾向于在电化学测量期间具有噪声。
贴片夹持是在生物细胞膜研究中常用的。通过抽汲将细胞膜夹持到移液管的末端，且膜贴片变为附接在开孔内。所述方法适用于通过夹持接着爆裂以离开密封在移液管的开孔内的脂质双层的脂质体来产生脂质双层。所述方法需要稳定的、巨大的且单层脂质体和在具有玻璃表面的材料中制造小开孔。
脂质体可以通过超声处理、挤出或Mozafari方法(Colas等人(2007)《微米(Micron)》38:841-847)来形成。
在一些实施方式中，如国际申请号WO 2009/077734中所描述形成脂质双层。在此方法中有利的是，由干燥脂质形成脂质双层。在最优选实施方式中，跨越开口形成脂质双层，如WO2009/077734中所描述。
由脂质的两个相对层形成脂质双层。两个脂质层被布置成使得其疏水尾部基团面朝彼此，形成疏水性的内部。脂质的亲水性头基朝外面向双层每侧上的水性环境。双层可存在于多种脂质阶段中，所述阶段包含但不限于液体无序阶段(液体片层)、液体有序阶段、固体有序阶段(片层凝胶阶段、交错结合的凝胶阶段)和平坦双层晶体(片层亚凝胶阶段、片层结晶阶段)。
可使用形成脂质双层的任何脂质组合物。选择脂质组合物，使得脂质双层具有所需的特性，例如表面电荷、支持膜蛋白的能力、充填密度或所形成的机械特性。脂质组合物可以包括一种或多种不同脂质。例如，脂质组合物可以含有至多100种脂质。脂质组合物优选地含有1到10种脂质。脂质组合物可以包括天然存在的脂质和/或人工脂质。
脂质通常包括头基、界面部分和可相同或不同的两个疏水尾部基团。合适的头基包含(但不限于)：中性头基，例如二酰基甘油酯(DG)和脑酰胺(CM)；两性离子头基，如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)；带负电荷的头基，如磷脂酰甘油(PG)；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)和心磷脂(CA)；以及带正电荷的头基，如三甲基铵丙烷(TAP)。合适界面部分包含但不限于天然存在的界面部分，例如基于甘油或基于脑酰胺的部分。合适的疏水尾部基团包含但不限于：饱和烃链，例如月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸)；不饱和烃链，如油酸(顺-9-十八烷酸)；和支链烃链，如植烷酰基。链的长度和不饱和烃链中的双键的位置与数量可变化。链的长度和分支链烃链中的分支(如甲基)的位置和数量可变化。疏水尾部基团可以作为醚或酯连接到界面部分。脂质可以是分枝菌酸。
脂质还可以进行化学修饰。脂质的头基或尾部基团可以进行化学修饰。头基已进行化学修饰的合适的脂质包含但不限于：经PEG修饰的脂质，如1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]；官能化PEG脂质，如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)2000]；以及针对缀合修饰的脂质，如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰基)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)。尾基已进行化学修饰的合适的脂质包含但不限于：可聚合脂质，如1,2-双(10,12-二十三碳二炔基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；氟化脂质，如1-软脂酰基-2-(16-氟软脂酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱；氘化脂质，如1,2-二棕榈酰基-D62-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及醚连接的脂质，如1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。脂质可以进行化学修饰或官能化，以便于偶联多核苷酸。
两亲性层，例如脂质组合物，通常包括将影响层的特性的一种或多种添加剂。合适的添加剂包含但不限于：脂肪酸，如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸；脂肪醇，如棕榈醇、肉豆蔻醇和油醇；甾醇，如胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇、谷甾醇和豆甾醇；溶血磷脂，如1-酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；以及神经酰胺。
在另一实施方式中，膜包括固态层。固态层可以由有机材料和无机材料两者形成，所述材料包含但不限于：微电子材料、绝缘材料(如Si3N4、A12O3和SiO)、有机和无机聚合物(如聚酰胺)、塑料(如
Figure BDA0003361348510000391
)或弹性体(如双组分加成固化硅橡胶)以及玻璃。固态层可由石墨烯形成。合适的石墨烯层公开于WO 2009/035647中。如果膜包括固态层，则孔通常存在于两亲膜或层中，所述两亲膜或层包含在固态层内，例如在固态层内的孔洞、孔、间隙、通道、沟槽或缝隙内。技术人员可以制备合适的固态/两亲性杂合系统。合适的系统公开于WO2009/020682和WO 2012/005857中。可以使用以上所论述的两亲膜或层中的任一个。
通常使用以下来实行本文公开的方法：(i)包括孔的人工两亲层，(ii)包括孔的分离的天然存在的脂质双层，或(iii)其中插入孔的细胞。通常使用人工两亲层(如人工三嵌段共聚物层)来实行方法。层可以包括其他跨膜和/或膜内蛋白质以及除孔以外的其他分子。以下论述了合适的设备和条件。通常在体外进行本发明的方法。
锚
在一个实施方式中，多核苷酸衔接子包括附接至衔接子的膜锚或跨膜孔锚。在一个实施方式中，根据本文公开的方法对靶多核苷酸进行锚表征。例如，在包括使靶多核苷酸与跨膜孔接触的方法中，膜锚或跨膜孔锚可以促进选择的多核苷酸在跨膜孔周围的定位。
锚可以是可插入到膜中的多肽锚和/或疏水锚。在一个实施方式中，疏水性锚是脂质、脂肪酸、固醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸，例如胆固醇、棕榈酸盐或生育酚。锚可以包括硫醇、生物素或表面活性剂。
一方面，锚可以是生物素(用于结合至链霉亲和素)、直链淀粉(用于结合至麦芽糖结合蛋白或融合蛋白)、Ni-NTA(用于结合至聚组氨酸或聚组氨酸标记的蛋白)或肽(诸如抗原)。
在一个实施方式中，锚可以包括接头，或2、3、4个或更多个接头。优选的接头包括但不限于聚合物，诸如多核苷酸、聚乙二醇(PEG)、多糖和多肽。这些接头可以是线性的、支化的或环状的。例如，接头可以是环状多核苷酸。接头可以与环状多核苷酸衔接子上的互补序列杂交。一个或多个锚或一个或多个接头可以包括可被切割或分解的组分，诸如限制性位点或光不稳定基团。接头可以用马来酰亚胺基团官能化以附连至蛋白质中的半胱氨酸残基上。合适的接头在WO 2010/086602中描述。
在一个实施方式中，锚是胆固醇或脂肪酰基链。例如，可以使用具有的长度为6至30个碳原子的任何脂肪酰基链，诸如十六烷酸。在WO 2012/164270和WO 2015/150786中公开了合适的锚的示例以及将锚附连到衔接子的方法。
表征
在涉及表征靶多核苷酸的本公开的实施方式中，靶分析物相对于例如进入或穿过如本文更详细描述的跨膜纳米孔移动。
表征方法可以使用适合于研究其中将孔插入到膜中的膜/孔系统的任何设备来进行。可以使用适合于跨膜孔感测的任何设备来进行表征方法。例如，该设备可以包括包括水溶液的室和将室分成两段的屏障。屏障可以具有孔径，在孔径中形成包含跨膜孔的膜。本文描述了跨膜孔。
可以使用在WO 2008/102120、WO 2010/122293或WO 00/28312中描述的设备进行表征方法。
表征方法可以包括通常通过测量电流来测量流经孔的离子电流。替代地，可以通过光学方法测量通过孔的离子流，诸如由Heron等人：美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.)第9卷131,第5号，2009所公开的。因此，该设备还可以包括能够施加电势并测量跨膜和孔的电信号的电路。可以使用膜片钳或电压钳来进行表征方法。表征方法优选地涉及电压钳的使用。
表征方法可以在基于硅的孔阵列上进行，其中每个阵列包括128、256、512、1024、2000、3000、4000、6000、10000、12000、15000或更多个孔。
表征方法可以包括测量流经孔的电流。该方法通常在跨膜和孔施加电压的情况下进行。使用的电压通常从+2V至-2V，通常为-400mV至+400mV。使用的电压优选地在具有选自以下的下限：-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV和独立地选自以下的上限：+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV的范围内。使用的电压更优选地在100mV至240mV的范围内，并且最优选地在120mV至220mV的范围内。通过使用增加的施加电位，可以通过孔增加不同核苷酸之间的区分度。
表征方法通常在任何载流子，诸如金属盐，例如碱金属盐、卤化物盐，例如氯化物盐，诸如碱金属氯化物盐的存在下进行。电荷载体可以包含离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑。在上文讨论的示例性设备中，盐存在于室内的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)。KCl是优选的。该盐可以是碱土金属盐，诸如氯化钙(CaCl2)。盐浓度可以处于饱和状态。盐浓度可以为3M或更低，通常为从0.1至2.5M、从0.3至1.9M、从0.5至1.8M、从0.7至1.7M、从0.9至1.6M或从1M至1.4M。盐浓度优选地为从150mM至1M。该表征方法优选地使用至少0.3M，诸如至少0.4M、至少0.5M、至少0.6M、至少0.8M、至少1.0M、至少1.5M、至少2.0M、至少2.5M或至少3.0M的盐浓度进行。高盐浓度提供高信噪比，并且允许在正常电流波动的背景下鉴别出指示结合/不结合的电流。
表征方法通常在缓冲液存在下进行。在上文讨论的示例性设备中，缓冲液存在于室内的水溶液中。可以使用任何合适的缓冲液。通常，缓冲液是HEPES。另一种合适的缓冲液是Tris-HCl缓冲液。通常在以下pH下进行方法：4.0到12.0、4.5到10.0、5.0到9.0、5.5到8.8、6.0到8.7、或7.0到8.8、或7.5到8.5。使用的pH优选地是约7.5。
表征方法可以在从0℃至100℃、从15℃至95℃、从16℃至90℃、从17℃至85℃、从18℃至80℃、19℃至70℃或从20℃至60℃下进行。表征方法通常在室温下进行。表征方法任选地在支持酶功能的温度，诸如约37℃下进行。
应理解尽管此处已经对根据本发明的方法论述特定实施方式、具体配置以及材料和/或分子，但可在不脱离本发明的范围和精神的情况下进行形式和细节中的不同改变或修改。提供以下实施例以更好地说明特定实施例，并且不应将其视为限制本申请。本申请仅由权利要求书限制。
实施例
实施例1
该实施例表明，与马达蛋白在间隔区附近停滞时相比，当马达蛋白根据本文公开的方法在间隔区上停滞时，无用的转换减少。
使包含SEQ ID NO:9的单链多核苷酸链并包含间隔区(4iSp18单位，IDT)的第一DNA构建体与互补的单链DNA链(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)杂交。SEQ ID NO:10与SEQID NO:9的介于SEQ ID NO:9的5'端与间隔区的5'端之间的部分互补并且被称为“测试”链。马达蛋白(封闭T4 Dda解旋酶)停滞在间隔区上。该构建体在图1A中示意性地描绘。
第二DNA构建体是用加载在间隔区上的封闭T4 Dda解旋酶产生的。第二DNA构建体与第一DNA构建体相同，区别在于使用SEQ ID NO:12代替SEQ ID NO:10。SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:10相同，区别在于其在SEQ ID NO:10的5'端缺少末端10个核苷酸。结果，SEQ IDNO:12与SEQ ID NO:9杂交以在至间隔区的5'末端留下长度为10个核苷酸的单链DNA区域。SEQ ID NO:12因此被称为“测试-10”链。该构建体在图1B中示意性地描绘。
使用分光光度测定来测定分别在第一和第二DNA构建体上停滞的马达蛋白(在本实施例中是封闭T4 Dda解旋酶)使用燃料的速率(ATP转换率)。简而言之，分光光度测定使用偶联酶系统监测马达蛋白对ATP的使用。丙酮酸激酶(PK，兔肌肉，600-1000U/mL，Sigma)将马达蛋白形成的ADP转化为ATP。该反应需要将一分子磷酸(烯醇)丙酮酸盐(PEP，磷酸(烯醇)丙酮酸单钾盐，Sigma)转化为丙酮酸盐。丙酮酸盐被乳酸脱氢酶(LDH，兔肌肉，900-1400U/mL，Sigma)转化为乳酸盐，导致NADH分子被氧化。由于在340-380nm处的吸光度降低(消光系数在380nm处为1210M-1cm-1，并且在340nm处为6220M-1cm-1)，因此分光光度地跟踪NADH的氧化。因为当在每分子ADP转化为ATP时一分子NADH被氧化，因此吸光度信号的降低与马达蛋白水解ATP的稳态速率成正比。
图1C示出了封闭T4 Dda解旋酶当分别停滞在第一和第二DNA构建体上时转换ATP的速率。当封闭T4 Dda解旋酶停滞在第一构建体的间隔区上时，ATP转换的催化速率(kcat)是约115s–1。相比之下，当封闭T4 Dda解旋酶停滞在与间隔区相邻的第二构建体上时，ATP转换速率是该速率(kcat是约235s–1)的约两倍。因此，封闭T4 Dda解旋酶的无效转换率大约减半。
实施例2
本实施例比较了具有各种不同间隔区设计的衔接子，并证明了当马达蛋白根据本文提供的方法停滞在间隔区上时，无效的ATP转换减少。
如以下结果表中所示，使用间隔区设计制备了多个不同的衔接子。所测试的衔接子包含如下多核苷酸链：(1)顶部链，(2)底部链，和(3)封闭链。顶部链包含正在测试的间隔区设计，所述间隔区设计的两侧侧接有多核苷酸序列。封闭链是如本文所述的单链多核苷酸封闭部分。
衔接子序列
顶部链：
333333333333333333333333333333CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC/[间隔区序列]/CCACAACTTCGTTCAGTTACGTATTGCT(即，SEQ ID NO:13；包含跨越间隔区序列的SEQID NO:14和SEQ ID NO:16。SEQ ID NO:14包含SEQ ID NO:15)
底部链：5phos/GCAATACGTAACTGAACGAAGTTGTGG(即，SEQ ID NO:17)
加载链：GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCTTT(即，SEQ ID NO:18)
封闭链：GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCAAAAAAAAGG/3Cy5Sp/(即，SEQ ID NO:19)
衔接子制备和加载
将马达蛋白被加载到最初包含顶部链、底部链和加载链的衔接子上。加载链的使用是可选特征，在需要减少在单个衔接子上加载有多个马达蛋白的衔接子的比例的情况下，所述可选特征可以提高马达蛋白加载的效率。根据本文提供的方法，使马达蛋白前进到间隔区上；在这样做时，马达蛋白从衔接子置换加载链。封闭链随后与衔接子退火以产生完整的衔接子，其中马达蛋白停滞在间隔区上并被封闭链阻止移开。由于封闭链的长度更长，所以与加载链相比，封闭链能够优先与衔接子结合；以显著高于加载链的浓度提供的封闭链进一步有助于优先结合。
衔接子制备方案
通过在以下浓度的醋酸钾缓冲液(400mM HEPES pH8.0，400mM醋酸钾)中使链退火来装配衔接子多核苷酸链：
Figure BDA0003361348510000421
Figure BDA0003361348510000431
将马达蛋白(Dda解旋酶)在环境条件下与终浓度为50-500nM DNA的退火衔接子和至少7倍摩尔过量的蛋白质混合10-20分钟。加入TMAD(100μM)在醋酸钾缓冲液(如上)中的溶液并在35℃孵育一小时。加入盐/ATP缓冲液(终浓度：0.5M NaCl、1mM ATP、10mM MgCl2)以及20x顶部链浓度的封闭链，并将混合物在室温下孵育25-30分钟。
使用SPRI珠粒纯化系统纯化具有结合的解旋酶的衔接子，并使用TBE凝胶验证衔接子生产。
ATP转换和稳定性测试
每个衔接子都经过了ATP转换和稳定性的测试。
当衔接子不参与任何测序反应时，ATP转换提供了对无效ATP转换的测量；ATP转换率越低，则无用的ATP使用越低，并且衔接子燃料效率越高。
在纳米孔测序反应中常见的条件下测试衔接子稳定性，并提供给定衔接子在这种设置中预期发挥作用的时间的指示。需要注意的是，在不同条件下(例如在较低的盐浓度或较低的温度下)进行的测序反应可以提供提高的衔接子稳定性。
测试的衔接子被命名为B1至B52(参见以下结果表)。将结果与市售的包含马达蛋白的牛津纳米孔测序衔接子(此处称为衔接子“AA”)进行比较。
ATP酶测定方案
用于测试的衔接子样品在SPRI洗脱缓冲液(50m Tris pH 8，20nM NaCl)中稀释至10nM的浓度。
将10μL的各10nM衔接子样品添加到384孔板中。
NADH反应混合物制备为包含2.2μL的40U/mL乳酸脱氢酶/丙酮酸激酶、33.3μL的1.33x测序缓冲液、3.3μL的3.33mM NADH、0.7μL的5.33mM丙酮酸、和10.4μL不含核酸酶的水。
将NADH反应混合物在室温下孵育10分钟，以转换溶液中的任何游离ADP。
将30μL NADH反应混合物添加到384孔板的每孔中的10μL衔接子样品中并混合。
将板加入紫外吸光度板酶标仪，并于34℃在380nm处测量吸光度，持续120个循环。
分析生成的数据以确定kcat和ATP转换值。
稳定性测定方案
测定反应混合物被制备为包含7.8μL的不含核酸酶的水、10μL的2x测序缓冲液和0.2μL的B-OTG。
通过将2μL 125nM衔接子添加到PCR管中的18μL测定反应混合物+/-ATP来制备用于测试的样品。
每个样品在热循环仪中于34℃和45℃的盖温度孵育24小时。
孵育后，将样品在5％TBE凝胶上160mV跑样30分钟，或在4-20％TBE凝胶上180mV跑样45分钟。
将凝胶用SYBR Gold染色10分钟，并在Amersham Typhoon扫描仪上使用Cy3设置成像。
执行光密度分析以确定结合和未结合的衔接子的比例。
结果
ATP转换的结果显示为使用比较衔接子AA看到的转换百分比，所述比较衔接子AA充当基线。因此，与基线相比，低于100％的ATP转换百分比值都表明无用的ATP转换减少和燃料效率提高。与衔接子AA相比，结果表中显示的所有测试衔接子都降低了ATP转换率，并由此提高了燃料效率。
还测试了衔接子的稳定性，结果显示为在24小时时段内未与马达蛋白结合的衔接子多核苷酸的百分比增加。结果表明产生了具有加载的马达蛋白的稳定衔接子。
结果表：
Figure BDA0003361348510000441
Figure BDA0003361348510000451
Figure BDA0003361348510000461
8＝间隔区18(iSp18)：[(OCH2CH2)6OPO3]
3＝C3：(OC3H6OPO3)
9＝间隔区9(iSp9)：[(OCH2CH2)3OPO3]
T＝胸苷
mU＝2'-O-甲基尿苷
iBNA-T＝带有胸苷碱基的BNA(桥接核酸)主链
rU＝带有尿苷碱基的RNA主链
Sp＝d-间隔区(DNA无碱基位点)
实施例3
本实施例表明，当封闭部分(“封闭链”)已经处于适当位置时，马达蛋白可以直接加载到多核苷酸衔接子的间隔区上。
如上文实施例2中所述，制备具有顶部链、底部链和封闭链序列的多核苷酸衔接子。顶部链包含间隔区序列，所述间隔区序列包含多个核苷酸岛，例如本文所述。
通过在以下浓度的醋酸钾缓冲液(400mM HEPES pH8.0，400mM醋酸钾)中使链退火来装配包含衔接子的多核苷酸链：
体积(μL) 最终浓度
顶部链 20 10μM
封闭链 22 11μM
底部链 22 11μM
1x KOAc缓冲液 100 0.5x
不含核酸酶的水 36 -
总计 200
将马达蛋白(Dda解旋酶)在环境条件下与终浓度为50-500nM DNA的退火衔接子和不同程度摩尔过量的蛋白质混合10-20分钟。加入TMAD(100μM)在醋酸钾缓冲液(如上)中的溶液并在35℃孵育一小时。加入盐/ATP缓冲液(终浓度：0.5M NaCl、1mM ATP、10mM MgCl2)，并将混合物在室温下孵育25-30分钟。
对具有结合的解旋酶的衔接子进行HPLC纯化，并使用TBE凝胶验证衔接子生产。
将用1x、2x、5x、10x、15x、20x和30x的过量马达蛋白制备的样品在凝胶上跑样，结果如图2所示。从添加盐/ATP缓冲液的步骤之前(“封闭”)和之后(“盐/ATP”)两者获得样品。
获得了显示以下物质的泳道：游离DNA(未加载马达蛋白的衔接子)；比率为1:1的马达蛋白和衔接子DNA，表明正确加载的马达蛋白；以及比率大于1:1的少量马达蛋白和衔接子DNA，其中多个马达蛋白最初加载到单个衔接子上。马达蛋白相对于DNA衔接子的过量程度越大，则获得的加载衔接子((1:1的蛋白质:DNA)的比例就越大。
因此，图2中呈现的结果表明马达蛋白可以直接加载到包含如本文所述的DNA岛的间隔区上。
实施例4
本实施例证明了当在DNA测序系统中测试根据本文所述方法制备的示例性衔接子时获得了提高的效率。
双链440聚体文库是用市售的牛津纳米孔测序试剂盒(SQK-LSK109)，使用标准的市售测序衔接子(AMX)或测试衔接子(衔接子在本文中命名为B14、B21、C1)制备的。
测试衔接子如上文实施例2中所述并相应地制备。间隔区序列如下：
B14：33338TT8TT838
B21：333TT8TT8
C1：333TT33TT8。
使用牛津纳米孔MinION Mk1b设备在MinION流通池(FLO-MIN106)上对440聚体文库进行测序。数据收集是通过MinKNOW软件使用基线LSK109测序方案执行的。
分析由MiniKNOW软件生成的批量Fast5数据，提取单独链数据并存储在后续文本文件中。链数据用于使用链中事件的数量和链的持续时间来估计DNA转位的速度。
图3中呈现的结果表明，与市售衔接子AMX相比，所测试的衔接子(B14、B20和C1)的提高的燃料效率使测序能够以更快的速度持续更长时间。结果还证实了所测试的衔接子在纳米孔测序系统中的稳定性。
序列表说明
SEQ ID NO:1显示来自大肠杆菌的(六聚组氨酸标记的)外切核酸酶I(EcoExo I)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示来自大肠杆菌的外切核酸酶III的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示嗜热栖热菌(T.thermophilus)的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示噬菌体λ外切核酸酶的氨基酸序列。此序列是组装成三聚体的三个相同的亚群中的一个。(http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp).
SEQ ID NO:5显示来自枯草芽孢杆菌噬菌体
Figure BDA0003361348510000471
的
Figure BDA0003361348510000472
DNA聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示Trwc Cba(深洋柠檬色微菌)解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示Hel308 Mbu(伯顿氏拟甲烷球菌)解旋酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示来自噬菌体T4的Dda解旋酶1993的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示实施例1中讨论的多核苷酸链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10显示实施例1中讨论的多核苷酸链(“测试”链)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11显示实施例1中讨论的多核苷酸链的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12显示实施例1中讨论的多核苷酸链(“测试-10”链)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“顶部链”)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“顶部链”，间隔区单元之前的部分)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“顶部链”，间隔区单元之前的部分；核苷酸区域)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“顶部链”，间隔区单元之后的部分)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“底部链”)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“加载链”)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19显示实施例2中讨论的多核苷酸衔接子(“封闭链”)的核苷酸序列。
序列表
SEQ ID NO:1-来自大肠杆菌的外切核酸酶I
MMNDGKQQSTFLFHDYETFGTHPALDRPAQFAAIRTDSEFNVIGEPEVFYCKPADDYLPQPGAVLITGITPQEARAKGENEAAFAARIHSLFTVPKTCILGYNNVRFDDEVTRNIFYRNFYDPYAWSWQHDNSRWDLLDVMRACYALRPEGINWPENDDGLPSFRLEHLTKANGIEHSNAHDAMADVYATIAMAKLVKTRQPRLFDYLFTHRNKHKLMALIDVPQMKPLVHVSGMFGAWRGNTSWVAPLAWHPENRNAVIMVDLAGDISPLLELDSDTLRERLYTAKTDLGDNAAVPVKLVHINKCPVLAQANTLRPEDADRLGINRQHCLDNLKILRENPQVREKVVAIFAEAEPFTPSDNVDAQLYNGFFSDADRAAMKIVLETEPRNLPALDITFVDKRIEKLLFNYRARNFPGTLDYAEQQRWLEHRRQVFTPEFLQGYADELQMLVQQYADDKEKVALLKALWQYAEEIVSGSGHHHHHH
SEQ ID NO:2-来自大肠杆菌的外切核酸酶III
MKFVSFNINGLRARPHQLEAIVEKHQPDVIGLQETKVHDDMFPLEEVAKLGYNVFYHGQKGHYGVALLTKETPIAVRRGFPGDDEEAQRRIIMAEIPSLLGNVTVINGYFPQGESRDHPIKFPAKAQFYQNLQNYLETELKRDNPVLIMGDMNISPTDLDIGIGEENRKRWLRTGKCSFLPEEREWMDRLMSWGLVDTFRHANPQTADRFSWFDYRSKGFDDNRGLRIDLLLASQPLAECCVETGIDYEIRSMEKPSDHAPVWATFRR
SEQ ID NO:3-来自嗜热栖热菌的RecJ酶
MFRRKEDLDPPLALLPLKGLREAAALLEEALRQGKRIRVHGDYDADGLTGTAILVRGLAALGADVHPFIPHRLEEGYGVLMERVPEHLEASDLFLTVDCGITNHAELRELLENGVEVIVTDHHTPGKTPPPGLVVHPALTPDLKEKPTGAGVAFLLLWALHERLGLPPPLEYADLAAVGTIADVAPLWGWNRALVKEGLARIPASSWVGLRLLAEAVGYTGKAVEVAFRIAPRINAASRLGEAEKALRLLLTDDAAEAQALVGELHRLNARRQTLEEAMLRKLLPQADPEAKAIVLLDPEGHPGVMGIVASRILEATLRPVFLVAQGKGTVRSLAPISAVEALRSAEDLLLRYGGHKEAAGFAMDEALFPAFKARVEAYAARFPDPVREVALLDLLPEPGLLPQVFRELALLEPYGEGNPEPLFL
SEQ ID NO:4-噬菌体λ的外切核酸酶
MTPDIILQRTGIDVRAVEQGDDAWHKLRLGVITASEVHNVIAKPRSGKKWPDMKMSYFHTLLAEVCTGVAPEVNAKALAWGKQYENDARTLFEFTSGVNVTESPIIYRDESMRTACSPDGLCSDGNGLELKCPFTSRDFMKFRLGGFEAIKSAYMAQVQYSMWVTRKNAWYFANYDPRMKREGLHYVVIERDEKYMASFDEIVPEFIEKMDEALAEIGFVFGEQWR
SEQ ID NO:
Figure BDA0003361348510000491
DNA聚合酶
MKHMPRKMYSCAFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIKSGGSAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK
SEQ ID NO:6-Trwc Cba解旋酶
MLSVANVRSPSAAASYFASDNYYASADADRSGQWIGDGAKRLGLEGKVEARAFDALLRGELPDGSSVGNPGQAHRPGTDLTFSVPKSWSLLALVGKDERIIAAYREAVVEALHWAEKNAAETRVVEKGMVVTQATGNLAIGLFQHDTNRNQEPNLHFHAVIANVTQGKDGKWRTLKNDRLWQLNTTLNSIAMARFRVAVEKLGYEPGPVLKHGNFEARGISREQVMAFSTRRKEVLEARRGPGLDAGRIAALDTRASKEGIEDRATLSKQWSEAAQSIGLDLKPLVDRARTKALGQGMEATRIGSLVERGRAWLSRFAAHVRGDPADPLVPPSVLKQDRQTIAAAQAVASAVRHLSQREAAFERTALYKAALDFGLPTTIADVEKRTRALVRSGDLIAGKGEHKGWLASRDAVVTEQRILSEVAAGKGDSSPAITPQKAAASVQAAALTGQGFRLNEGQLAAARLILISKDRTIAVQGIAGAGKSSVLKPVAEVLRDEGHPVIGLAIQNTLVQMLERDTGIGSQTLARFLGGWNKLLDDPGNVALRAEAQASLKDHVLVLDEASMVSNEDKEKLVRLANLAGVHRLVLIGDRKQLGAVDAGKPFALLQRAGIARAEMATNLRARDPVVREAQAAAQAGDVRKALRHLKSHTVEARGDGAQVAAETWLALDKETRARTSIYASGRAIRSAVNAAVQQGLLASREIGPAKMKLEVLDRVNTTREELRHLPAYRAGRVLEVSRKQQALGLFIGEYRVIGQDRKGKLVEVEDKRGKRFRFDPARIRAGKGDDNLTLLEPRKLEIHEGDRIRWTRNDHRRGLFNADQARVVEIANGKVTFETSKGDLVELKKDDPMLKRIDLAYALNVHMAQGLTSDRGIAVMDSRERNLSNQKTFLVTVTRLRDHLTLVVDSADKLGAAVARNKGEKASAIEVTGSVKPTATKGSGVDQPKSVEANKAEKELTRSKSKTLDFGI
SEQ ID NO:7-Hel308 Mbu解旋酶
MMIRELDIPRDIIGFYEDSGIKELYPPQAEAIEMGLLEKKNLLAAIPTASGKTLLAELAMIKAIREGGKALYIVPLRALASEKFERFKELAPFGIKVGISTGDLDSRADWLGVNDIIVATSEKTDSLLRNGTSWMDEITTVVVDEIHLLDSKNRGPTLEVTITKLMRLNPDVQVVALSATVGNAREMADWLGAALVLSEWRPTDLHEGVLFGDAINFPGSQKKIDRLEKDDAVNLVLDTIKAEGQCLVFESSRRNCAGFAKTASSKVAKILDNDIMIKLAGIAEEVESTGETDTAIVLANCIRKGVAFHHAGLNSNHRKLVENGFRQNLIKVISSTPTLAAGLNLPARRVIIRSYRRFDSNFGMQPIPVLEYKQMAGRAGRPHLDPYGESVLLAKTYDEFAQLMENYVEADAEDIWSKLGTENALRTHVLSTIVNGFASTRQELFDFFGATFFAYQQDKWMLEEVINDCLEFLIDKAMVSETEDIEDASKLFLRGTRLGSLVSMLYIDPLSGSKIVDGFKDIGKSTGGNMGSLEDDKGDDITVTDMTLLHLVCSTPDMRQLYLRNTDYTIVNEYIVAHSDEFHEIPDKLKETDYEWFMGEVKTAMLLEEWVTEVSAEDITRHFNVGEGDIHALADTSEWLMHAAAKLAELLGVEYSSHAYSLEKRIRYGSGLDLMELVGIRGVGRVRARKLYNAGFVSVAKLKGADISVLSKLVGPKVAYNILSGIGVRVNDKHFNSAPISSNTLDTLLDKNQKTFNDFQ
SEQ ID NO:8-Dda解旋酶
MTFDDLTEGQKNAFNIVMKAIKEKKHHVTINGPAGTGKTTLTKFIIEALISTGETGIILAAPTHAAKKILSKLSGKEASTIHSILKINPVTYEENVLFEQKEVPDLAKCRVLICDEVSMYDRKLFKILLSTIPPWCTIIGIGDNKQIRPVDPGENTAYISPFFTHKDFYQCELTEVKRSNAPIIDVATDVRNGKWIYDKVVDGHGVRGFTGDTALRDFMVNYFSIVKSLDDLFENRVMAFTNKSVDKLNSIIRKKIFETDKDFIVGEIIVMQEPLFKTYKIDGKPVSEIIFNNGQLVRIIEAEYTSTFVKARGVPGEYLIRHWDLTVETYGDDEYYREKIKIISSDEELYKFNLFLGKTAETYKNWNKGGKAPWSDFWDAKSQFSKVKALPASTFHKAQGMSVDRAFIYTPCIHYADVELAQQLLYVGVTRGRYDVFYV
SEQ ID NO:9
/5Biosg/CCTTTTTTTT GGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC/iSp18//iSp18//iSp18//iSp18//iBNA-C//iBNA-C//iBNA-A//iBNA-C//iBNA-A/ACTTCGTTCAGTTACGTATTGC/3Bio/
SEQ ID NO:10
GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCAAAAAAAAGG
SEQ ID NO:11
/5phos/GCAATACGTAACTGAACGAAGT/iBNA-T//iBNA-G//iBNA-T//iBNA-G//iBNA-G/
SEQ ID NO:12
CCAAGCAGACGCC AAAAAAAAGG
SEQ ID NO:13
333333333333333333333333333333CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC/[间隔区序列]/CCACAACTTCGTTCAGTTACGTATTGCT
SEQ ID NO:14
333333333333333333333333333333CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC
SEQ ID NO:15
CCTTTTTTTTGGCGTCTGCTTGGGTGTTTAACC
SEQ ID NO:16
CCACAACTTCGTTCAGTTACGTATTGCT
SEQ ID NO:17
5phos/GCAATACGTAACTGAACGAAGTTGTGG
SEQ ID NO:18
GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCTTT
SEQ ID NO:19
GGTTAAACACCCAAGCAGACGCCAAAAAAAAGG/3Cy5Sp/。
序列表
<110> 牛津纳米孔科技公开有限公司
<120> 方法
<130> N416641WO
<140> PCT/GB2020/051260
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<211> 485
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 1
Met Met Asn Asp Gly Lys Gln Gln Ser Thr Phe Leu Phe His Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Thr Phe Gly Thr His Pro Ala Leu Asp Arg Pro Ala Gln Phe Ala
20 25 30
Ala Ile Arg Thr Asp Ser Glu Phe Asn Val Ile Gly Glu Pro Glu Val
35 40 45
Phe Tyr Cys Lys Pro Ala Asp Asp Tyr Leu Pro Gln Pro Gly Ala Val
50 55 60
Leu Ile Thr Gly Ile Thr Pro Gln Glu Ala Arg Ala Lys Gly Glu Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ala Phe Ala Ala Arg Ile His Ser Leu Phe Thr Val Pro Lys
85 90 95
Thr Cys Ile Leu Gly Tyr Asn Asn Val Arg Phe Asp Asp Glu Val Thr
100 105 110
Arg Asn Ile Phe Tyr Arg Asn Phe Tyr Asp Pro Tyr Ala Trp Ser Trp
115 120 125
Gln His Asp Asn Ser Arg Trp Asp Leu Leu Asp Val Met Arg Ala Cys
130 135 140
Tyr Ala Leu Arg Pro Glu Gly Ile Asn Trp Pro Glu Asn Asp Asp Gly
145 150 155 160
Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu
165 170 175
His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala
180 185 190
Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu
195 200 205
Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro
210 215 220
Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg
225 230 235 240
Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg
245 250 255
Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu
260 265 270
Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr
275 280 285
Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn
290 295 300
Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala
305 310 315 320
Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile
325 330 335
Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala
340 345 350
Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr
355 360 365
Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu
370 375 380
Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp
385 390 395 400
Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro
405 410 415
Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg
420 425 430
Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln
435 440 445
Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu
450 455 460
Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val Ser Gly Ser Gly His
465 470 475 480
His His His His His
485
<210> 2
<211> 268
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 2
Met Lys Phe Val Ser Phe Asn Ile Asn Gly Leu Arg Ala Arg Pro His
1 5 10 15
Gln Leu Glu Ala Ile Val Glu Lys His Gln Pro Asp Val Ile Gly Leu
20 25 30
Gln Glu Thr Lys Val His Asp Asp Met Phe Pro Leu Glu Glu Val Ala
35 40 45
Lys Leu Gly Tyr Asn Val Phe Tyr His Gly Gln Lys Gly His Tyr Gly
50 55 60
Val Ala Leu Leu Thr Lys Glu Thr Pro Ile Ala Val Arg Arg Gly Phe
65 70 75 80
Pro Gly Asp Asp Glu Glu Ala Gln Arg Arg Ile Ile Met Ala Glu Ile
85 90 95
Pro Ser Leu Leu Gly Asn Val Thr Val Ile Asn Gly Tyr Phe Pro Gln
100 105 110
Gly Glu Ser Arg Asp His Pro Ile Lys Phe Pro Ala Lys Ala Gln Phe
115 120 125
Tyr Gln Asn Leu Gln Asn Tyr Leu Glu Thr Glu Leu Lys Arg Asp Asn
130 135 140
Pro Val Leu Ile Met Gly Asp Met Asn Ile Ser Pro Thr Asp Leu Asp
145 150 155 160
Ile Gly Ile Gly Glu Glu Asn Arg Lys Arg Trp Leu Arg Thr Gly Lys
165 170 175
Cys Ser Phe Leu Pro Glu Glu Arg Glu Trp Met Asp Arg Leu Met Ser
180 185 190
Trp Gly Leu Val Asp Thr Phe Arg His Ala Asn Pro Gln Thr Ala Asp
195 200 205
Arg Phe Ser Trp Phe Asp Tyr Arg Ser Lys Gly Phe Asp Asp Asn Arg
210 215 220
Gly Leu Arg Ile Asp Leu Leu Leu Ala Ser Gln Pro Leu Ala Glu Cys
225 230 235 240
Cys Val Glu Thr Gly Ile Asp Tyr Glu Ile Arg Ser Met Glu Lys Pro
245 250 255
Ser Asp His Ala Pro Val Trp Ala Thr Phe Arg Arg
260 265
<210> 3
<211> 425
<212> PRT
<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）
<400> 3
Met Phe Arg Arg Lys Glu Asp Leu Asp Pro Pro Leu Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg
20 25 30
Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu
35 40 45
Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp
50 55 60
Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu
65 70 75 80
Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr
85 90 95
Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu
100 105 110
Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr
115 120 125
Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys
130 135 140
Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu
145 150 155 160
His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala
165 170 175
Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg
180 185 190
Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val
195 200 205
Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val
210 215 220
Glu Val Ala Phe Arg Ile Ala Pro Arg Ile Asn Ala Ala Ser Arg Leu
225 230 235 240
Gly Glu Ala Glu Lys Ala Leu Arg Leu Leu Leu Thr Asp Asp Ala Ala
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Leu Val Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ala Arg Arg
260 265 270
Gln Thr Leu Glu Glu Ala Met Leu Arg Lys Leu Leu Pro Gln Ala Asp
275 280 285
Pro Glu Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Asp Pro Glu Gly His Pro Gly
290 295 300
Val Met Gly Ile Val Ala Ser Arg Ile Leu Glu Ala Thr Leu Arg Pro
305 310 315 320
Val Phe Leu Val Ala Gln Gly Lys Gly Thr Val Arg Ser Leu Ala Pro
325 330 335
Ile Ser Ala Val Glu Ala Leu Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Leu Arg
340 345 350
Tyr Gly Gly His Lys Glu Ala Ala Gly Phe Ala Met Asp Glu Ala Leu
355 360 365
Phe Pro Ala Phe Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Pro
370 375 380
Asp Pro Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Gly
385 390 395 400
Leu Leu Pro Gln Val Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Glu Pro Tyr Gly
405 410 415
Glu Gly Asn Pro Glu Pro Leu Phe Leu
420 425
<210> 4
<211> 226
<212> PRT
<213> 噬菌体λ（Bacteriophage lambda）
<400> 4
Met Thr Pro Asp Ile Ile Leu Gln Arg Thr Gly Ile Asp Val Arg Ala
1 5 10 15
Val Glu Gln Gly Asp Asp Ala Trp His Lys Leu Arg Leu Gly Val Ile
20 25 30
Thr Ala Ser Glu Val His Asn Val Ile Ala Lys Pro Arg Ser Gly Lys
35 40 45
Lys Trp Pro Asp Met Lys Met Ser Tyr Phe His Thr Leu Leu Ala Glu
50 55 60
Val Cys Thr Gly Val Ala Pro Glu Val Asn Ala Lys Ala Leu Ala Trp
65 70 75 80
Gly Lys Gln Tyr Glu Asn Asp Ala Arg Thr Leu Phe Glu Phe Thr Ser
85 90 95
Gly Val Asn Val Thr Glu Ser Pro Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Ser Met
100 105 110
Arg Thr Ala Cys Ser Pro Asp Gly Leu Cys Ser Asp Gly Asn Gly Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Cys Pro Phe Thr Ser Arg Asp Phe Met Lys Phe Arg Leu
130 135 140
Gly Gly Phe Glu Ala Ile Lys Ser Ala Tyr Met Ala Gln Val Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Met Trp Val Thr Arg Lys Asn Ala Trp Tyr Phe Ala Asn Tyr Asp
165 170 175
Pro Arg Met Lys Arg Glu Gly Leu His Tyr Val Val Ile Glu Arg Asp
180 185 190
Glu Lys Tyr Met Ala Ser Phe Asp Glu Ile Val Pro Glu Phe Ile Glu
195 200 205
Lys Met Asp Glu Ala Leu Ala Glu Ile Gly Phe Val Phe Gly Glu Gln
210 215 220
Trp Arg
225
<210> 5
<211> 608
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌噬菌体φ 29（Bacillus subtilis phage Phi 29）
<400> 5
Met Lys His Met Pro Arg Lys Met Tyr Ser Cys Ala Phe Glu Thr Thr
1 5 10 15
Thr Lys Val Glu Asp Cys Arg Val Trp Ala Tyr Gly Tyr Met Asn Ile
20 25 30
Glu Asp His Ser Glu Tyr Lys Ile Gly Asn Ser Leu Asp Glu Phe Met
35 40 45
Ala Trp Val Leu Lys Val Gln Ala Asp Leu Tyr Phe His Asn Leu Lys
50 55 60
Phe Asp Gly Ala Phe Ile Ile Asn Trp Leu Glu Arg Asn Gly Phe Lys
65 70 75 80
Trp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Asn Thr Tyr Asn Thr Ile Ile Ser Arg
85 90 95
Met Gly Gln Trp Tyr Met Ile Asp Ile Cys Leu Gly Tyr Lys Gly Lys
100 105 110
Arg Lys Ile His Thr Val Ile Tyr Asp Ser Leu Lys Lys Leu Pro Phe
115 120 125
Pro Val Lys Lys Ile Ala Lys Asp Phe Lys Leu Thr Val Leu Lys Gly
130 135 140
Asp Ile Asp Tyr His Lys Glu Arg Pro Val Gly Tyr Lys Ile Thr Pro
145 150 155 160
Glu Glu Tyr Ala Tyr Ile Lys Asn Asp Ile Gln Ile Ile Ala Glu Ala
165 170 175
Leu Leu Ile Gln Phe Lys Gln Gly Leu Asp Arg Met Thr Ala Gly Ser
180 185 190
Asp Ser Leu Lys Gly Phe Lys Asp Ile Ile Thr Thr Lys Lys Phe Lys
195 200 205
Lys Val Phe Pro Thr Leu Ser Leu Gly Leu Asp Lys Glu Val Arg Tyr
210 215 220
Ala Tyr Arg Gly Gly Phe Thr Trp Leu Asn Asp Arg Phe Lys Glu Lys
225 230 235 240
Glu Ile Gly Glu Gly Met Val Phe Asp Val Asn Ser Leu Tyr Pro Ala
245 250 255
Gln Met Tyr Ser Arg Leu Leu Pro Tyr Gly Glu Pro Ile Val Phe Glu
260 265 270
Gly Lys Tyr Val Trp Asp Glu Asp Tyr Pro Leu His Ile Gln His Ile
275 280 285
Arg Cys Glu Phe Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Thr Ile Gln Ile
290 295 300
Lys Arg Ser Arg Phe Tyr Lys Gly Asn Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile Ala Asp Leu Trp Leu Ser Asn Val Asp Leu Glu Leu Met
325 330 335
Lys Glu His Tyr Asp Leu Tyr Asn Val Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Lys
340 345 350
Phe Lys Ala Thr Thr Gly Leu Phe Lys Asp Phe Ile Asp Lys Trp Thr
355 360 365
Tyr Ile Lys Thr Thr Ser Glu Gly Ala Ile Lys Gln Leu Ala Lys Leu
370 375 380
Met Leu Asn Ser Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Ser Asn Pro Asp Val Thr
385 390 395 400
Gly Lys Val Pro Tyr Leu Lys Glu Asn Gly Ala Leu Gly Phe Arg Leu
405 410 415
Gly Glu Glu Glu Thr Lys Asp Pro Val Tyr Thr Pro Met Gly Val Phe
420 425 430
Ile Thr Ala Trp Ala Arg Tyr Thr Thr Ile Thr Ala Ala Gln Ala Cys
435 440 445
Tyr Asp Arg Ile Ile Tyr Cys Asp Thr Asp Ser Ile His Leu Thr Gly
450 455 460
Thr Glu Ile Pro Asp Val Ile Lys Asp Ile Val Asp Pro Lys Lys Leu
465 470 475 480
Gly Tyr Trp Ala His Glu Ser Thr Phe Lys Arg Ala Lys Tyr Leu Arg
485 490 495
Gln Lys Thr Tyr Ile Gln Asp Ile Tyr Met Lys Glu Val Asp Gly Lys
500 505 510
Leu Val Glu Gly Ser Pro Asp Asp Tyr Thr Asp Ile Lys Phe Ser Val
515 520 525
Lys Cys Ala Gly Met Thr Asp Lys Ile Lys Lys Glu Val Thr Phe Glu
530 535 540
Asn Phe Lys Val Gly Phe Ser Arg Lys Met Lys Pro Lys Pro Val Gln
545 550 555 560
Val Pro Gly Gly Val Val Leu Val Asp Asp Thr Phe Thr Ile Lys Ser
565 570 575
Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
595 600 605
<210> 6
<211> 970
<212> PRT
<213> 深洋柠檬色微菌（Citromicrobium bathyomarinum）
<400> 6
Met Leu Ser Val Ala Asn Val Arg Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser Tyr
1 5 10 15
Phe Ala Ser Asp Asn Tyr Tyr Ala Ser Ala Asp Ala Asp Arg Ser Gly
20 25 30
Gln Trp Ile Gly Asp Gly Ala Lys Arg Leu Gly Leu Glu Gly Lys Val
35 40 45
Glu Ala Arg Ala Phe Asp Ala Leu Leu Arg Gly Glu Leu Pro Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Val Gly Asn Pro Gly Gln Ala His Arg Pro Gly Thr Asp Leu
65 70 75 80
Thr Phe Ser Val Pro Lys Ser Trp Ser Leu Leu Ala Leu Val Gly Lys
85 90 95
Asp Glu Arg Ile Ile Ala Ala Tyr Arg Glu Ala Val Val Glu Ala Leu
100 105 110
His Trp Ala Glu Lys Asn Ala Ala Glu Thr Arg Val Val Glu Lys Gly
115 120 125
Met Val Val Thr Gln Ala Thr Gly Asn Leu Ala Ile Gly Leu Phe Gln
130 135 140
His Asp Thr Asn Arg Asn Gln Glu Pro Asn Leu His Phe His Ala Val
145 150 155 160
Ile Ala Asn Val Thr Gln Gly Lys Asp Gly Lys Trp Arg Thr Leu Lys
165 170 175
Asn Asp Arg Leu Trp Gln Leu Asn Thr Thr Leu Asn Ser Ile Ala Met
180 185 190
Ala Arg Phe Arg Val Ala Val Glu Lys Leu Gly Tyr Glu Pro Gly Pro
195 200 205
Val Leu Lys His Gly Asn Phe Glu Ala Arg Gly Ile Ser Arg Glu Gln
210 215 220
Val Met Ala Phe Ser Thr Arg Arg Lys Glu Val Leu Glu Ala Arg Arg
225 230 235 240
Gly Pro Gly Leu Asp Ala Gly Arg Ile Ala Ala Leu Asp Thr Arg Ala
245 250 255
Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asp Arg Ala Thr Leu Ser Lys Gln Trp Ser
260 265 270
Glu Ala Ala Gln Ser Ile Gly Leu Asp Leu Lys Pro Leu Val Asp Arg
275 280 285
Ala Arg Thr Lys Ala Leu Gly Gln Gly Met Glu Ala Thr Arg Ile Gly
290 295 300
Ser Leu Val Glu Arg Gly Arg Ala Trp Leu Ser Arg Phe Ala Ala His
305 310 315 320
Val Arg Gly Asp Pro Ala Asp Pro Leu Val Pro Pro Ser Val Leu Lys
325 330 335
Gln Asp Arg Gln Thr Ile Ala Ala Ala Gln Ala Val Ala Ser Ala Val
340 345 350
Arg His Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Phe Glu Arg Thr Ala Leu Tyr
355 360 365
Lys Ala Ala Leu Asp Phe Gly Leu Pro Thr Thr Ile Ala Asp Val Glu
370 375 380
Lys Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Ser Gly Asp Leu Ile Ala Gly Lys
385 390 395 400
Gly Glu His Lys Gly Trp Leu Ala Ser Arg Asp Ala Val Val Thr Glu
405 410 415
Gln Arg Ile Leu Ser Glu Val Ala Ala Gly Lys Gly Asp Ser Ser Pro
420 425 430
Ala Ile Thr Pro Gln Lys Ala Ala Ala Ser Val Gln Ala Ala Ala Leu
435 440 445
Thr Gly Gln Gly Phe Arg Leu Asn Glu Gly Gln Leu Ala Ala Ala Arg
450 455 460
Leu Ile Leu Ile Ser Lys Asp Arg Thr Ile Ala Val Gln Gly Ile Ala
465 470 475 480
Gly Ala Gly Lys Ser Ser Val Leu Lys Pro Val Ala Glu Val Leu Arg
485 490 495
Asp Glu Gly His Pro Val Ile Gly Leu Ala Ile Gln Asn Thr Leu Val
500 505 510
Gln Met Leu Glu Arg Asp Thr Gly Ile Gly Ser Gln Thr Leu Ala Arg
515 520 525
Phe Leu Gly Gly Trp Asn Lys Leu Leu Asp Asp Pro Gly Asn Val Ala
530 535 540
Leu Arg Ala Glu Ala Gln Ala Ser Leu Lys Asp His Val Leu Val Leu
545 550 555 560
Asp Glu Ala Ser Met Val Ser Asn Glu Asp Lys Glu Lys Leu Val Arg
565 570 575
Leu Ala Asn Leu Ala Gly Val His Arg Leu Val Leu Ile Gly Asp Arg
580 585 590
Lys Gln Leu Gly Ala Val Asp Ala Gly Lys Pro Phe Ala Leu Leu Gln
595 600 605
Arg Ala Gly Ile Ala Arg Ala Glu Met Ala Thr Asn Leu Arg Ala Arg
610 615 620
Asp Pro Val Val Arg Glu Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Gly Asp Val
625 630 635 640
Arg Lys Ala Leu Arg His Leu Lys Ser His Thr Val Glu Ala Arg Gly
645 650 655
Asp Gly Ala Gln Val Ala Ala Glu Thr Trp Leu Ala Leu Asp Lys Glu
660 665 670
Thr Arg Ala Arg Thr Ser Ile Tyr Ala Ser Gly Arg Ala Ile Arg Ser
675 680 685
Ala Val Asn Ala Ala Val Gln Gln Gly Leu Leu Ala Ser Arg Glu Ile
690 695 700
Gly Pro Ala Lys Met Lys Leu Glu Val Leu Asp Arg Val Asn Thr Thr
705 710 715 720
Arg Glu Glu Leu Arg His Leu Pro Ala Tyr Arg Ala Gly Arg Val Leu
725 730 735
Glu Val Ser Arg Lys Gln Gln Ala Leu Gly Leu Phe Ile Gly Glu Tyr
740 745 750
Arg Val Ile Gly Gln Asp Arg Lys Gly Lys Leu Val Glu Val Glu Asp
755 760 765
Lys Arg Gly Lys Arg Phe Arg Phe Asp Pro Ala Arg Ile Arg Ala Gly
770 775 780
Lys Gly Asp Asp Asn Leu Thr Leu Leu Glu Pro Arg Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
His Glu Gly Asp Arg Ile Arg Trp Thr Arg Asn Asp His Arg Arg Gly
805 810 815
Leu Phe Asn Ala Asp Gln Ala Arg Val Val Glu Ile Ala Asn Gly Lys
820 825 830
Val Thr Phe Glu Thr Ser Lys Gly Asp Leu Val Glu Leu Lys Lys Asp
835 840 845
Asp Pro Met Leu Lys Arg Ile Asp Leu Ala Tyr Ala Leu Asn Val His
850 855 860
Met Ala Gln Gly Leu Thr Ser Asp Arg Gly Ile Ala Val Met Asp Ser
865 870 875 880
Arg Glu Arg Asn Leu Ser Asn Gln Lys Thr Phe Leu Val Thr Val Thr
885 890 895
Arg Leu Arg Asp His Leu Thr Leu Val Val Asp Ser Ala Asp Lys Leu
900 905 910
Gly Ala Ala Val Ala Arg Asn Lys Gly Glu Lys Ala Ser Ala Ile Glu
915 920 925
Val Thr Gly Ser Val Lys Pro Thr Ala Thr Lys Gly Ser Gly Val Asp
930 935 940
Gln Pro Lys Ser Val Glu Ala Asn Lys Ala Glu Lys Glu Leu Thr Arg
945 950 955 960
Ser Lys Ser Lys Thr Leu Asp Phe Gly Ile
965 970
<210> 7
<211> 760
<212> PRT
<213> 伯顿氏拟甲烷球菌（Methanococcoides burtonii）
<400> 7
Met Met Ile Arg Glu Leu Asp Ile Pro Arg Asp Ile Ile Gly Phe Tyr
1 5 10 15
Glu Asp Ser Gly Ile Lys Glu Leu Tyr Pro Pro Gln Ala Glu Ala Ile
20 25 30
Glu Met Gly Leu Leu Glu Lys Lys Asn Leu Leu Ala Ala Ile Pro Thr
35 40 45
Ala Ser Gly Lys Thr Leu Leu Ala Glu Leu Ala Met Ile Lys Ala Ile
50 55 60
Arg Glu Gly Gly Lys Ala Leu Tyr Ile Val Pro Leu Arg Ala Leu Ala
65 70 75 80
Ser Glu Lys Phe Glu Arg Phe Lys Glu Leu Ala Pro Phe Gly Ile Lys
85 90 95
Val Gly Ile Ser Thr Gly Asp Leu Asp Ser Arg Ala Asp Trp Leu Gly
100 105 110
Val Asn Asp Ile Ile Val Ala Thr Ser Glu Lys Thr Asp Ser Leu Leu
115 120 125
Arg Asn Gly Thr Ser Trp Met Asp Glu Ile Thr Thr Val Val Val Asp
130 135 140
Glu Ile His Leu Leu Asp Ser Lys Asn Arg Gly Pro Thr Leu Glu Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Lys Leu Met Arg Leu Asn Pro Asp Val Gln Val Val Ala
165 170 175
Leu Ser Ala Thr Val Gly Asn Ala Arg Glu Met Ala Asp Trp Leu Gly
180 185 190
Ala Ala Leu Val Leu Ser Glu Trp Arg Pro Thr Asp Leu His Glu Gly
195 200 205
Val Leu Phe Gly Asp Ala Ile Asn Phe Pro Gly Ser Gln Lys Lys Ile
210 215 220
Asp Arg Leu Glu Lys Asp Asp Ala Val Asn Leu Val Leu Asp Thr Ile
225 230 235 240
Lys Ala Glu Gly Gln Cys Leu Val Phe Glu Ser Ser Arg Arg Asn Cys
245 250 255
Ala Gly Phe Ala Lys Thr Ala Ser Ser Lys Val Ala Lys Ile Leu Asp
260 265 270
Asn Asp Ile Met Ile Lys Leu Ala Gly Ile Ala Glu Glu Val Glu Ser
275 280 285
Thr Gly Glu Thr Asp Thr Ala Ile Val Leu Ala Asn Cys Ile Arg Lys
290 295 300
Gly Val Ala Phe His His Ala Gly Leu Asn Ser Asn His Arg Lys Leu
305 310 315 320
Val Glu Asn Gly Phe Arg Gln Asn Leu Ile Lys Val Ile Ser Ser Thr
325 330 335
Pro Thr Leu Ala Ala Gly Leu Asn Leu Pro Ala Arg Arg Val Ile Ile
340 345 350
Arg Ser Tyr Arg Arg Phe Asp Ser Asn Phe Gly Met Gln Pro Ile Pro
355 360 365
Val Leu Glu Tyr Lys Gln Met Ala Gly Arg Ala Gly Arg Pro His Leu
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Glu Ser Val Leu Leu Ala Lys Thr Tyr Asp Glu Phe
385 390 395 400
Ala Gln Leu Met Glu Asn Tyr Val Glu Ala Asp Ala Glu Asp Ile Trp
405 410 415
Ser Lys Leu Gly Thr Glu Asn Ala Leu Arg Thr His Val Leu Ser Thr
420 425 430
Ile Val Asn Gly Phe Ala Ser Thr Arg Gln Glu Leu Phe Asp Phe Phe
435 440 445
Gly Ala Thr Phe Phe Ala Tyr Gln Gln Asp Lys Trp Met Leu Glu Glu
450 455 460
Val Ile Asn Asp Cys Leu Glu Phe Leu Ile Asp Lys Ala Met Val Ser
465 470 475 480
Glu Thr Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ser Lys Leu Phe Leu Arg Gly Thr
485 490 495
Arg Leu Gly Ser Leu Val Ser Met Leu Tyr Ile Asp Pro Leu Ser Gly
500 505 510
Ser Lys Ile Val Asp Gly Phe Lys Asp Ile Gly Lys Ser Thr Gly Gly
515 520 525
Asn Met Gly Ser Leu Glu Asp Asp Lys Gly Asp Asp Ile Thr Val Thr
530 535 540
Asp Met Thr Leu Leu His Leu Val Cys Ser Thr Pro Asp Met Arg Gln
545 550 555 560
Leu Tyr Leu Arg Asn Thr Asp Tyr Thr Ile Val Asn Glu Tyr Ile Val
565 570 575
Ala His Ser Asp Glu Phe His Glu Ile Pro Asp Lys Leu Lys Glu Thr
580 585 590
Asp Tyr Glu Trp Phe Met Gly Glu Val Lys Thr Ala Met Leu Leu Glu
595 600 605
Glu Trp Val Thr Glu Val Ser Ala Glu Asp Ile Thr Arg His Phe Asn
610 615 620
Val Gly Glu Gly Asp Ile His Ala Leu Ala Asp Thr Ser Glu Trp Leu
625 630 635 640
Met His Ala Ala Ala Lys Leu Ala Glu Leu Leu Gly Val Glu Tyr Ser
645 650 655
Ser His Ala Tyr Ser Leu Glu Lys Arg Ile Arg Tyr Gly Ser Gly Leu
660 665 670
Asp Leu Met Glu Leu Val Gly Ile Arg Gly Val Gly Arg Val Arg Ala
675 680 685
Arg Lys Leu Tyr Asn Ala Gly Phe Val Ser Val Ala Lys Leu Lys Gly
690 695 700
Ala Asp Ile Ser Val Leu Ser Lys Leu Val Gly Pro Lys Val Ala Tyr
705 710 715 720
Asn Ile Leu Ser Gly Ile Gly Val Arg Val Asn Asp Lys His Phe Asn
725 730 735
Ser Ala Pro Ile Ser Ser Asn Thr Leu Asp Thr Leu Leu Asp Lys Asn
740 745 750
Gln Lys Thr Phe Asn Asp Phe Gln
755 760
<210> 8
<211> 439
<212> PRT
<213> 肠杆菌噬菌体T4（Enterobacteria phage T4）
<400> 8
Met Thr Phe Asp Asp Leu Thr Glu Gly Gln Lys Asn Ala Phe Asn Ile
1 5 10 15
Val Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys His His Val Thr Ile Asn Gly
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Lys Phe Ile Ile Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ile Ile Leu Ala Ala Pro Thr His
50 55 60
Ala Ala Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Gly Lys Glu Ala Ser Thr
65 70 75 80
Ile His Ser Ile Leu Lys Ile Asn Pro Val Thr Tyr Glu Glu Asn Val
85 90 95
Leu Phe Glu Gln Lys Glu Val Pro Asp Leu Ala Lys Cys Arg Val Leu
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Val Ser Met Tyr Asp Arg Lys Leu Phe Lys Ile Leu
115 120 125
Leu Ser Thr Ile Pro Pro Trp Cys Thr Ile Ile Gly Ile Gly Asp Asn
130 135 140
Lys Gln Ile Arg Pro Val Asp Pro Gly Glu Asn Thr Ala Tyr Ile Ser
145 150 155 160
Pro Phe Phe Thr His Lys Asp Phe Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Glu Val
165 170 175
Lys Arg Ser Asn Ala Pro Ile Ile Asp Val Ala Thr Asp Val Arg Asn
180 185 190
Gly Lys Trp Ile Tyr Asp Lys Val Val Asp Gly His Gly Val Arg Gly
195 200 205
Phe Thr Gly Asp Thr Ala Leu Arg Asp Phe Met Val Asn Tyr Phe Ser
210 215 220
Ile Val Lys Ser Leu Asp Asp Leu Phe Glu Asn Arg Val Met Ala Phe
225 230 235 240
Thr Asn Lys Ser Val Asp Lys Leu Asn Ser Ile Ile Arg Lys Lys Ile
245 250 255
Phe Glu Thr Asp Lys Asp Phe Ile Val Gly Glu Ile Ile Val Met Gln
260 265 270
Glu Pro Leu Phe Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu
275 280 285
Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gln Leu Val Arg Ile Ile Glu Ala Glu Tyr
290 295 300
Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile
305 310 315 320
Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr
325 330 335
Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe
340 345 350
Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Ala Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys
355 360 365
Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly
385 390 395 400
Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala
405 410 415
Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly
420 425 430
Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val
435
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实施例中讨论的多核苷酸链的核苷酸序列。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5Biosg
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> iSp18
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> iSp18
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> iSp18
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> iSp18
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> iBNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> iBNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> iBNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> iBNA-C
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> iBNA-A
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> 3Bio
<400> 9
nccttttttt tggcgtctgc ttgggtgttt aaccnnnnnn nnnacttcgt tcagttacgt 60
attgcn 66
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实施例中讨论的多核苷酸链的核苷酸序列（“测试”链）。
<400> 10
ggttaaacac ccaagcagac gccaaaaaaa agg 33
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实施例中讨论的多核苷酸链的核苷酸序列。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5phos
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> iBNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> iBNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> iBNA-T
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> iBNA-G
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> iBNA-G
<400> 11
ngcaatacgt aactgaacga agtnnnnn 28
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 实施例中讨论的多核苷酸链的核苷酸序列（“测试-10”链）。
<400> 12
ccaagcagac gccaaaaaaa agg 23

Claims (41)

1.一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)使所述多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；以及
iii)将所述马达蛋白定位在所述间隔区上；
其中与所述多核苷酸衔接子结合的封闭部分防止了所述马达蛋白从所述间隔区移开。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子和与所述多核苷酸衔接子结合的封闭部分；
ii)使所述多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；以及
iii)将所述马达蛋白定位在所述间隔区上；
其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
3.一种将马达蛋白加载到多核苷酸衔接子上的方法，所述方法包括：
i)提供包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)使所述多核苷酸衔接子与马达蛋白接触；
iii)使所述马达蛋白前进到所述间隔区上；以及
iv)使封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合，其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括：
i)提供包含连接至间隔区的加载位点的多核苷酸衔接子；
ii)使所述加载位点与马达蛋白接触；
iii)使所述马达蛋白从所述加载位点前进到所述间隔区上；以及
iv)使封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合，其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开并移到所述加载位点上。
5.根据权利要求4所述的方法，其中：
-步骤(ii)包括使所述加载位点与马达蛋白接触，其中所述马达蛋白与所述加载位点接合；并且
-步骤(iv)包括使封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合，其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开并与所述加载位点重接合。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与当所述马达蛋白与多核苷酸结合时相比，防止所述马达蛋白从所述间隔区移开降低了所述马达蛋白转换燃料分子的速率。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点，并且其中所述马达蛋白与所述多核苷酸衔接子的所述加载位点结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述马达蛋白前进到所述间隔区上包括向所述马达蛋白施加物理力或化学力。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述马达蛋白前进到所述间隔区上包括使所述马达蛋白与一种或多种燃料分子接触。
10.根据权利要求1或3至9中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点；所述马达蛋白是第一马达蛋白并且使所述第一马达蛋白从所述加载位点前进到所述间隔区上包括将第二马达蛋白加载到所述加载位点上并且使所述第二马达蛋白从所述加载位点朝向所述间隔区前进，其中所述第二马达蛋白迫使所述第一马达蛋白到所述间隔区上。
11.根据权利要求1或3至10中任一项所述的方法，其中使所述封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合迫使所述马达蛋白到所述间隔区上。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点并且所述封闭部分与所述加载位点结合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述加载位点与所述间隔区邻接并且所述封闭部分与紧邻所述间隔区的所述加载位点结合。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括使所述马达蛋白前进到所述间隔区上，使得所述间隔区占据所述马达蛋白的所述活性位点。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸衔接子包含连接至间隔区的加载位点并且所述加载位点包含单链或非杂交的多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述加载位点包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述封闭部分是物理或化学封闭部分。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合在空间上防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述封闭部分与所述多核苷酸衔接子结合引入了化学基团，所述化学基团防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中(i)所述加载部分包含单链或非杂交多核苷酸并且所述封闭部分包含单链或非杂交多核苷酸；并且(ii)使所述封闭部分与所述加载位点结合包括将所述封闭部分与所述加载位点杂交。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述封闭部分包含长度介于约2个核苷酸单位与约1000个核苷酸单位之间的单链或非杂交多核苷酸。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述间隔区包含：
i)一个或多个硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿苷、一个或多个反向胸苷(反向dT)、一个或多个反向双脱氧胸苷(ddT)、一个或多个双脱氧胞苷(ddC)、一个或多个5-甲基胞苷、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2’-O-甲基RNA碱基、一个或多个异脱氧胞苷(Iso-dC)、一个或多个异脱氧鸟苷(Iso-dG)、一个或多个C3(OC3H6OPO3)基团、一个或多个可光分解(PC)[OC3H6-C(O)NHCH2-C6H3NO2-CH(CH3)OPO3]基团、一个或多个己二醇基团、一个或多个间隔区9(iSp9)[(OCH2CH2)3OPO3]基团、一个或多个间隔区18(iSp18)[(OCH2CH2)6OPO3]基团；
ii)一个或多个硫醇连接；
iii)一个或多个无碱基核苷酸；
iv)一个或多个具有与所述加载位点不同的骨架结构的核苷酸；
v)一个或多个化学基团，所述一个或多个化学基团导致所述一个或多个马达蛋白停滞；和/或
vi)聚合物，任选地其中所述聚合物是多肽或聚乙二醇(PEG)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述间隔区包含一个或多个核苷酸，优选地其中所述间隔区包含一个或多个核苷酸岛。
24.根据权利要求1、2、6至9、或12至23中任一项所述的方法，其中：
i)所述多核苷酸衔接子包含间隔区，所述间隔区包含一个或多个核苷酸，优选地一个或多个核苷酸岛；以及与所述多核苷酸衔接子结合的封闭部分；并且
ii)将所述马达蛋白定位在所述间隔区上包括使所述马达蛋白与所述间隔区接触并修饰所述马达蛋白以防止所述马达蛋白从所述间隔区脱离。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述间隔区包含一个或多个选自以下的部分：
-S-N-S-N-S-N-S-；-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；-S-S-S-S-S-S-N-N-S-S-；
-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；
-S-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-N-N-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-N-N-S-；
-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-S-；
-S-S-N-N-S-S-N-N-S-S-S-；-S-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-S-；
-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-S-；-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-S-；-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-S-；
-S-S-S-S-N-N-S-N-N-S-S-；和-S-S-S-N-N-S-S-N-N-S-；
其中每个S是间隔区单元，并且每个N是核苷酸。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述马达蛋白是解旋酶、聚合酶、外切核酸酶、拓扑异构酶或它们的变体。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中修饰所述多核苷酸衔接子的所述间隔区上的所述马达蛋白以防止所述马达蛋白从所述间隔区脱离。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述或每个马达蛋白是独立地选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、TraI解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和Dda解旋酶或它们的变体的解旋酶。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
v)去除不在所述间隔区上的多余马达蛋白分子。
30.一种控制靶多核苷酸相对于跨膜纳米孔的移动的方法，所述方法包括：
i)提供(A)靶多核苷酸；(B)包含间隔区的多核苷酸衔接子；和(C)马达蛋白；
ii)进行根据前述权利要求中任一项所述的方法，从而使所述马达蛋白在所述多核苷酸衔接子的所述间隔区上停滞；
iii)使所述靶多核苷酸和所述多核苷酸衔接子的所述间隔区上停滞的所述马达蛋白与所述纳米孔接触；以及
iv)在所述跨膜纳米孔上施加电位，从而使所述马达蛋白移动越过所述间隔区到达所述靶多核苷酸上，从而控制所述靶多核苷酸相对于所述纳米孔的运动。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在所述多核苷酸衔接子附接至所述靶多核苷酸之前，所述马达蛋白停滞在所述多核苷酸衔接子上。
32.根据权利要求30所述的方法，其中在所述马达蛋白停滞在所述多核苷酸衔接子上之前，所述多核苷酸衔接子附接至所述靶多核苷酸。
33.一种控制靶多核苷酸相对于跨膜纳米孔移动的方法，所述方法包括：
i)提供靶多核苷酸；
ii)提供多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含间隔区并且具有在所述间隔区上停滞的马达蛋白，其中所述多核苷酸衔接子是根据权利要求1至29中任一项所述的方法获得的；
iii)使所述靶多核苷酸和所述多核苷酸衔接子与纳米孔接触；以及
iv)在所述跨膜纳米孔上施加电位，从而使所述马达蛋白移动越过所述间隔区到达所述靶多核苷酸上，从而控制所述靶多核苷酸相对于所述纳米孔的运动。
34.一种表征靶聚核苷酸的方法，所述方法包括：
i)进行根据权利要求30至33中任一项所述的方法，以及
ii)在所述靶多核苷酸相对于所述纳米孔移动时进行一次或多次测量，其中所述一次或多次测量指示所述靶多核苷酸的一个或多个特征，从而在所述靶多核苷酸相对于所述纳米孔移动时表征所述靶多核苷酸。
35.一种多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含(i)间隔区；(ii)停滞在所述间隔区上的马达蛋白，其中所述马达蛋白的活性位点被所述间隔区占据；以及(iii)与所述衔接子结合的封闭部分，其中所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
36.根据权利要求35所述的多核苷酸衔接子，其中(i)所述衔接子包含连接至所述间隔区的加载位点并且所述封闭部分与所述加载位点结合；并且(ii)所述封闭部分阻止所述马达蛋白与所述加载位点接合。
37.根据权利要求36所述的多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含：
i)在5'到3'方向上的{LB-S-D}n或{D-S-LB}n；其中LB是经封闭的加载位点；S是间隔区；D是双链多核苷酸；并且n是整数，可选地1至约20的整数；以及
ii)停滞在所述间隔区(S)上的一个或多个马达蛋白；
其中该或每个LB部分防止该或每个马达蛋白在远离所述双链多核苷酸(D)的方向上从所述间隔区(S)移开。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的多核苷酸衔接子，所述多核苷酸衔接子包含：
i)在5'到3'方向上的{LB-S-D}n或{D-S-LB}n；其中LB是第一双链多核苷酸；S是间隔区；D是第二双链多核苷酸；并且n是整数，可选地1至约20的整数；并且其中所述第一双链多核苷酸(LB)与所述间隔区(S)邻接并且所述间隔区(S)与所述第二双链多核苷酸(D)邻接；以及
ii)停滞在所述间隔区(S)上的一个或多个马达蛋白。
39.一种用于修饰靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)包含间隔区的多核苷酸衔接子；
ii)能够控制所述靶多核苷酸的运动的马达蛋白；以及
iii)封闭部分，所述封闭部分能够与所述多核苷酸衔接子结合，使得当所述马达蛋白位于所述多核苷酸衔接子的所述间隔区上并且所述马达蛋白的活性位点被所述间隔区占据时，防止所述马达蛋白从所述间隔区移开；
任选地其中所述多核苷酸衔接子包含加载位点并且所述封闭部分能够与所述多核苷酸衔接子结合，从而防止所述马达蛋白与所述加载位点接合。
40.一种用于修饰靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i)包含间隔区的多核苷酸衔接子和与所述多核苷酸衔接子结合的封闭部分；和
ii)能够控制所述靶多核苷酸的运动的马达蛋白；
其中当所述马达蛋白与所述衔接子结合时，所述封闭部分防止所述马达蛋白从所述间隔区移开。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的多核苷酸衔接子或试剂盒，其中：
-所述加载位点、封闭部分和/或间隔区各自独立地如根据权利要求12至25中任一项所定义；和/或
-所述马达蛋白如根据权利要求26至28中任一项所定义。
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