CN114262735A - 用于表征多核苷酸的衔接体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于表征多核苷酸的衔接体及其用途。所述衔接体在5'到3'端方向包含{L‑S}n或{S‑L}n；并且，所述L双链包含与S连接的多核苷酸链L'及所述L'的互补链L”，所述L'包括远离阻断链S的第一区段、和靠近阻断链S的第二区段，所述第一区段包含修饰部分，所述第二区段包含马达蛋白结合活性区，该活性区被所述互补链L”封闭；互补链L”包含能够与所述马达蛋白竞争性结合到L'链的聚合物。本发明提供了一种新型的Y型衔接体，使用该衔接体能极大避免纳米孔测序中的ATP空耗，显著地提高了测序效率。

Description

用于表征多核苷酸的衔接体及其用途
技术领域
本发明属于基因测序领域，涉及一种表征多核苷酸中使用的衔接体，本发明还涉及使用所述衔接体表征多核苷酸的方法。
背景技术
纳米孔测序技术具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点，在长片段核酸检测变异(包括但不仅限于点突变、插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不仅限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序平台有更明显优势。该平台支持数据生产和分析并行的特点实现了实时变异/修饰检出和诊断，加上便携式的设计，使其具有广泛的应用前景。
对纳米孔两侧施加电压后，当分析物(例如多核苷酸、多肽)通过纳米孔时造成电流下降，不同结构的分析物所引起的电流阻断程度不同。当分析物在纳米孔的桶(barrel)中暂时停留一段时间时，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。
在纳米孔测序技术中，未施加电势时，多核苷酸的阻断链通常能够使解旋酶停滞，防止解旋酶穿过阻断链沿目标多核苷酸进一步移动。但当解旋酶与多核苷酸复合物同跨膜孔接触并施加电势后，可以移动一个或多个停滞的解旋酶穿过多核苷酸上的阻断链，沿着待测多核苷酸序列进行移动，从而达到测序的目的。因此，纳米孔测序中需要使用包含酶的结合区和阻断链的接头。
在纳米孔测序中，通常使用核酸接头如Y型衔接体或类发夹衔接体(专利CN202111018113.0)，其中，马达蛋白如解旋酶结合到接头的结合区。现有的衔接体在实际应用中存在ATP空耗现象，即没有进行过孔测序的接头也会消耗大量ATP。由于在测序环境中ATP浓度的降低会导致测序速度降低，测序时长过短，进而影响测序数据的产出量。因此，当前对能够减少ATP消耗的测序方法存在需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的衔接体，本发明还提供了所述衔接体的制备方法，及其用于纳米孔测序的用途。使用本发明的衔接体，极大地降低了纳米孔测序中的ATP空耗。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一方面，本发明提供了一种用于表征目标多核苷酸的衔接体，所述衔接体在5'到3'端方向包含{L-S}n或{S-L}n，
其中，L为修饰的双链多核苷酸，S为阻断链，n为正整数；
并且，所述L双链包含与S连接的多核苷酸链L'及所述L'的互补链L”，
所述L'包括远离阻断链S的第一区段、和靠近阻断链S的第二区段，所述第一区段包含修饰部分，所述第二区段包含马达蛋白结合活性区，该活性区被所述互补链L”封闭；
互补链L”包含能够与所述马达蛋白竞争性结合到L'链的聚合物。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述衔接体在5'到3'端方向包含{D1-L-S}n或{S-L-D1}n，D1为第一双链多核苷酸，
和/或，所述衔接体在5'到3'端方向包含{L-S-D2}n或{D2-S-L}n，D2为第二双链多核苷酸；
优选地，所述n为1-20的整数，例如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8或更多个。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述链L'的修饰部分使所述第一区段与马达蛋白的结合能力弱于所述第二区段，或者使所述第一区段不与马达蛋白结合；
优选地，所述链L'中修饰部分为核糖核苷酸(RNA)和/或核酸类似物；
所述核糖核苷酸包括2′位修饰的核糖核苷酸，优选2′烷氧基修饰的核糖核苷酸，更优选2′甲氧基修饰的核糖核苷酸；
所述核酸类似物包括肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、桥核酸(BNA)中的任一种或两种以上任意组合，更优选地，所述链L'的未修饰部分为脱氧核糖核苷酸；
优选地，所述修饰的多核苷酸个数为1-20，更优选地为1-15、1-10或2-6，进一步优选地为3个、4个、5个。
其中，在多核苷酸链L'中远离阻断链S的一端(第一区段)提供修饰，修饰端(第一区段)与马达蛋白的结合能力更弱，使得在衔接体的制备过程中，马达蛋白更容易结合到多核苷酸链L'中靠近阻断链S的一端(第二区段)，从而更有利于后续对马达蛋白的驱逐。本领域技术人员可以理解的是，该修饰部分可以是任选的修饰，只要该修饰能够削弱修饰部分与马达蛋白的结合即可。所述修饰部分的长度可以根据多核苷酸链L'的长度确定。不限于任何特定理论，在保证多核苷酸链L'中靠近阻断链S的一端(第二区段)具有足够数目的多核苷酸结合马达蛋白后，其余的部分均可以选择性的被修饰，而不影响本申请的技术效果。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述互补链L”靠近阻断链S的一端包含与多核苷酸链L'或所述第二区段结合力更强的部分；优选地，该部分包含PNA或者LNA。
所述互补链L”的主要作用为通过与多核苷酸链L'的互补，行使对马达蛋白的驱逐。本领域技术人员可以理解的是，不限于任何特定理论，只要互补链L”具有更强的结合力。在衔接体的制备中，就可以通过与多核苷酸链L'互补，将马达蛋白驱逐到阻断链。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述互补链L”远离阻断链S的一端包含点击化学的第一部分，优选点击反应基团；
和/或，所述D1双链包含与L'连接的多核苷酸链D1'及其互补链D1”，所述互补链D1”靠近阻断链S的一端包含点击化学的第二部分，优选点击反应基团；
和/或，所述D2双链包含与阻断链S连接的多核苷酸链D2'及其互补链D2”，所述互补链D2”包含不与所述衔接体杂交的部分；优选地，所述不与所述衔接体杂交的部分位于互补链D2”临近阻断链S的一端。
通过引入点击化学基团，可以使该部分的结合更牢固。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述阻断链具有与所述多核苷酸不同的结构，用于阻滞马达蛋白；
优选地，所述阻断链包含一个或多个硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿嘧啶、一个或多个反向胸苷(反向dTs)、一个或多个反向二脱氧胸苷(ddTs)、一个或多个二脱氧胞苷(ddCs)、一个或多个5-甲基胞苷酸、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2’烷氧基修饰的核糖核苷酸(优选2’甲氧基修饰的核糖核苷酸)、一个或多个异脱氧胞苷(异-dCs)、一个或多个异脱氧鸟苷(异-dGs)、一个或多个C3基团、一个或多个光裂解(PC)的基团、一个或多个己二醇、一个或多个iSp9基团、一个或多个iSp18基团、聚合物或一个或多个硫醇连接。
在一个优选的实施方案中，2’烷氧基修饰的核糖核苷酸的数量为1-10个，更优选2-6个；更优选地，
所述2′烷氧基修饰的核糖核苷酸均匀分布于所述阻断链。
根据本发明所述的衔接体，其L'的远离S的一端包含先导链序列；
S的远离L'的一端用于连接目标多核苷酸；
与S连接的多核苷酸链L'在靠近阻断链S的一端包含马达蛋白结合活性区，该活性区被所述互补链L”封闭；
所述马达蛋白为能够结合到多核苷酸并且控制其移动穿过孔的蛋白；优选地，所述马达蛋白选自聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶中的一种或多种，更优选地，所述解旋酶选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、Tral解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和DDA解旋酶中的一种或多种。
另一方面，本发明提供了一种复合物，所述复合物包含本发明所述的衔接体，和所述马达蛋白和/或所述目标多核苷酸，其中所述马达蛋白位于阻断链。
再一方面，本发明提供了所述的复合物的制备方法，包括：
S1：使包含L'-S的Y1链与马达蛋白结合，所述结合的区域位于L'链；
S2：加入包含互补链L”的PNA-R链，得到所述复合物，其中所述马达蛋白被PNA-R链驱赶到阻断链；
优选地，所述方法包括
S101：使包含D1'-L'-S-D2'的Y1链、包含D1”的Y2链和包含D2”的YB链的退火产物与马达蛋白结合，所述结合区域位于退火产物的L'链处；
S102：加入包含互补链L”的PNA-R链，得到所述复合物，其中马达蛋白通过PNA-R链驱赶到阻断链。
本发明还提供了一种表征目标多核苷酸的方法，所述方法使用所述衔接体或所述的复合物；
优选地，所述方法包括：
(a)使目标多核苷酸穿过跨膜孔移动，
其中所述目标多核苷酸与所述的衔接体或所述的复合物连接；以及
(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个电和/或光测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
再一方面，本发明还提供了一种用于表征多核苷酸的试剂盒，
所述试剂盒的组成为如下1)-4)中任一种：
1)包含独立包装的所述的衔接体，优选地，还包含独立包装的所述的马达蛋白；
2)包含所述的复合物；
3)包含所述制备方法得到的复合物；
4)包含分别独立包装的如下组分：
如所述的衔接体中的用于与S连接的多核苷酸链L'、所述阻断链S、和所述核苷酸链L'的互补链L”，优选地，还包含独立包装的所述的马达蛋白。阻断链在纳米孔测序中，现有测序接头存在较为严重的ATP空耗现象，即没有进行过孔测序的接头也会消耗大量ATP。在测序火警中，ATP浓度的降低会导致测序速度降低，测序时长过短，进而影响到测序数据的产出值。本发明的发明人尝试提供一种方法，不需要ATP的消耗，将加载到衔接体上的马达蛋白驱赶到阻断链上，从而避免ATP的空耗。本发明的技术构思结合图1描述如下，图1为使用本发明的Y型衔接体将解旋酶驱逐到阻断链的原理示意图；其中，Y-Top-1链(Y1链)包含D1'-L'-S-D2'，Y-Top-2链(Y2链)包含D1”，YB链包含D2”；首先，将Y1链、Y2链和YB链退火，然后加入解旋酶，所述解旋酶结合到L'链处，并且所述Y-Top-2链包含化学点击基团；加入PNA-R链，所述PNA-R链能够与Y-Top-1链(Y1链)中的L'更好的结合，并且PNA-R链与Y-Top-2链之间的化学点击反应进一步稳固了该结合，从而将结合于L'链处的解旋酶沿着5'到3'端方向驱逐到S区，该驱逐依靠的是双链之间的结合力的驱动，不需要消耗任何ATP，从而降低了实际测序过程中ATP的消耗；
其中，在图1中，所述Y-Top-2链的星型信号为点击反应基团，具体的实施例中为DBCO修饰；所述PNA-R链中的三角形信号为点击反应基团，具体的实施例中为N3。
与现有技术相比，本发明的技术方案具备以下优点：
本发明提供了一种新型的衔接体，使用该衔接体能极大避免纳米孔测序中的ATP空耗，显著地提高了测序效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为使用本发明的Y型衔接体将解旋酶驱逐到阻断链的原理示意图；其中，Y-Top-1链(Y1链)包含D1'-L'-S-D2'，Y-Top-2链(Y2链)包含D1”，YB链包含D2”；首先，将Y1链、Y2链和YB链退火，然后加入解旋酶，所述解旋酶结合到L'链处，并且所述Y-Top-2链包含化学点击基团；加入PNA-R链，所述PNA-R链能够与Y-Top-1链(Y1链)中的L'更好的结合，并且PNA-R链与Y-Top-2链之间的化学点击反应进一步稳固了该结合，从而将结合于L'链处的解旋酶沿着5'到3'端方向驱逐到S区，该驱逐依靠的是双链之间的结合力的驱动，不需要消耗任何ATP，从而降低了实际测序过程中ATP的消耗；
其中，在图1中，所述Y-Top-2链的星型信号为点击反应基团，具体的实施例中为DBCO修饰；所述PNA-R链中的三角形信号为点击反应基团，具体的实施例中为N3。
图2是根据本发明的实施例1，将第四链PNA加载前后，衔接体接头复合物的质检图。
图3是根据本发明的实施例2，将酶驱赶到不同的结构和序列的阻断链后，测定得到的ATP/NADH消耗的曲线图。
图4是根据本发明的实施例3，实际测序中不同衔接体的速率降幅。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例。在下面的详细描述中，提出了许多具体细节，以便提供对本发明的全面理解。但是，对于本领域技术人员来说很明显的是，本发明可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本发明的示例来提供对本发明的更好的理解。
此外，除非内容另外明确指出，否则用于本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一”，“一个”，和“所述”包括复数指代。因此，例如，涉及“多核苷酸”时包括两个或更多个多核苷酸，涉及“锚”时包括两个或更多个锚，涉及“解旋酶”时包括两个或更多个解旋酶，涉及“跨膜孔”时包括两个或更多个孔，等。
衔接体
本发明提供了一种用于表征多核苷酸的衔接体，所述衔接体在5'到3'端方向包含{L-S}n或{S-L}n，其中，L为修饰的双链多核苷酸，S为阻断链，n为整数；并且，所述L双链包含与S连接的多核苷酸链L'及所述L'的互补链L”，所述L'包括远离阻断链S的第一区段、和靠近阻断链S的第二区段，所述第一区段包含修饰部分，所述第二区段包含马达蛋白结合活性区，该活性区被所述互补链L”封闭；互补链L”包含能够与所述马达蛋白竞争性结合到L'链的聚合物。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述衔接体包含{D1-L-S}n或{S-L-D1}n，D1为第一双链多核苷酸；和/或，所述衔接体在5'到3'端方向包含{L-S-D2}n或{D2-S-L}n，D2为第二双链多核苷酸；优选地，所述n为1-20的整数，例如n可以为1、2、3、4、5、6、7、8，或更多个。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述链L'的修饰部分使所述第一区段与马达蛋白的结合能力弱于所述第二区段，或者使所述第一区段不与马达蛋白结合；和/或
所述链L'中所述修饰部分为核糖核苷酸和/或核酸类似物。
优选地，所述核糖核苷酸包括2′位修饰的核糖核苷酸，优选2′烷氧基修饰的核糖核苷酸，更优选为2′甲氧基修饰的核糖核苷酸；或优先地，所述核酸类似物包括肽核酸、甘油核酸、苏糖核酸、锁核酸、桥核酸中的任一种或两种以上任意组合；和/或所述链L'中所述马达蛋白结合活性区为脱氧核糖核苷酸；和/或所述核糖核苷酸和/或核酸类似物的个数为1-20、1-15或1-10；优选2-6，例如为2个、3个、4个、5个或6个。
其中，在多核苷酸链L'中远离阻断链S的一端提供修饰，修饰端与马达蛋白的结合能力更弱，使得在衔接体的制备过程中，马达蛋白更容易结合到多核苷酸链L'中靠近阻断链S的一端，从而更有利于后续对马达蛋白的驱逐。本领域技术人员可以理解的是，该修饰部分可以是任选的修饰，只要该修饰能够削弱修饰部分与马达蛋白的结合即可。所述修饰部分的长度可以根据多核苷酸链L'的长度确定。不限于任何特定理论，在保证多核苷酸链L'中靠近阻断链S的一端具有足够数目的多核苷酸结合马达蛋白后，其余的部分均可以选择性的被修饰，而不影响本申请的技术效果。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述互补链L”靠近阻断链S的一端包含与多核苷酸链L'结合力更强的部分；优选地，该部分包含PNA或者LNA。
所述互补链L”的主要作用为通过与多核苷酸链L'的互补，行使对马达蛋白的驱逐。本领域技术人员可以理解的是，不限于任何特定理论，只要互补链L”具有更强的结合力。在衔接体的制备中，就可以通过与多核苷酸链L'互补，将马达蛋白驱逐到阻断链。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述互补链L”远离阻断链S的一端包含点击化学的第一部分，优选点击反应基团；
和/或，所述D1双链包含与L'连接的多核苷酸链D1'及其互补链D1”，所述互补链D1”靠近阻断链S的一端包含点击化学的第二部分，优选点击反应基团；
和/或，所述D2双链包含与阻断链S连接的多核苷酸链D2'及其互补链D2”，所述互补链D2”包含不与所述衔接体杂交的部分；优选地，所述不与所述衔接体杂交的部分位于互补链D2”临近阻断链S的一端。
通过引入点击化学基团，可以使该部分的结合更牢固。
根据本发明所述的衔接体，其中，所述阻断链具有与所述多核苷酸不同的结构。
复合物
本发明提供了一种复合物，所述复合物包含本发明所述的衔接体和马达蛋白，其中所述马达蛋白位于阻断链；
优选地，所述马达蛋白为能够结合到多核苷酸并且控制其移动穿过孔的蛋白；优选为酶。例如，所述酶选自聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶中的一种或多种。例如，所述解旋酶选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、Tral解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和DDA解旋酶中的一种或多种。
本发明提供了所述的复合物的制备方法，包括：
S1：使包含L'-S的Y1链与马达蛋白结合，所述结合区域位于L'链；
S2：加入包含互补链L”的PNA-R链，得到所述复合物，其中所述马达蛋白被PNA-R链驱赶到阻断链；
优选地，所述方法包括
S101：使包含D1'-L'-S-D2'的Y1链、包含D1”的Y2链和包含D2”的YB链的退火产物与马达蛋白结合，所述结合区域位于退火产物的L'链处；
S102：加入包含互补链L”的PNA-R链，得到所述复合物，其中马达蛋白通过PNA-R链驱赶到阻断链。
多核苷酸
多核苷酸如核酸是含有两个或更多个核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可包括任何核苷酸的任意组合。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸的可被损坏。例如，多核苷酸可包含嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线导致的损坏相关联，且是皮肤黑素瘤的首要原因。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被修饰，例如用标记物或标签。合适的标记物如下所述。
多核苷酸中的核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸可包含以下核苷：腺苷，尿苷，鸟苷和胞苷。所述核苷酸优选脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸优选包括下列核苷：脱氧腺苷(dA)，脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)，脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。
核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸盐可连接在核苷酸的5”或3”侧上。
合适的核苷酸包括但不限于，单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、单磷酸胞苷(CMP)，环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、脱氧单磷酸腺苷(dAMP)，脱氧单磷酸鸟苷(dGMP)、脱氧单磷酸胸苷(dTMP)、脱氧单磷酸尿苷(dUMP)和脱氧单磷酸胞苷(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。所述核苷酸最优选自dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。所述多核苷酸优选包括以下核苷酸：dAMP、dUMP和/或dTMP和dCMP。
所述多核苷酸中的核苷酸可以任何方式彼此连接。核苷酸通常被它们的糖和的磷酸基连接，如在核酸中。所述核苷酸可通过它们的核碱基的连接，如嘧啶二聚体中。
所述多核苷酸可以是核酸。所述多核苷酸可以是任何本领域已知的合成的核酸，例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)，或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。该PNA骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。该GNA骨架由通过磷酸二酯键连接的重复的乙二醇单元组成。该TNA骨架由通过磷酸二酯键连接在一起的重复的苏糖组成。该LNA是由如上所讨论的具有在核糖中连接2”氧和4”碳的额外的桥的核苷酸形成。
该多核苷酸是最优选核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
所述多核苷酸可以为任何长度。例如，多核苷酸可以为至少10个，至少50个，至少100，至少150，至少200，至少250，至少300，至少400或至少500个核苷酸长度。所述多核苷酸可以为1000或更多个核苷酸，5000或更多个核苷酸长度或100000或更多个核苷酸长度。
解旋酶可沿本发明的方法中的全部或仅部分目标多核苷酸移动。全部或部分目标多核苷酸可以使用本发明的方法进行表征。
目标多核苷酸可以是单链的。所述目标多核苷酸的至少一部分优选为双链。解旋酶通常结合至单链多核苷酸。如果目标多核苷酸的至少一部分是双链的，所述目标多核苷酸优选地包括单链区域或非杂交区域。所述一个或多个解旋酶能够结合到单链区域或非杂交区域的一条链上。所述目标多核苷酸优选地包括一个或多个单链区域或一个或多个非杂交的区域。
样品
目标多核苷酸存在于任何合适的样品中。本发明通常在已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样品上实施。替换的，可以对样本实施本发明，以确认所识别的一个或多个目标多核苷酸，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。
所述样品可以是生物样品。本发明可以针对从任何生物体或微生物中获得或提取的样品在体外实施。所述生物体或微生物通常是古核的(archaean)，原核的或真核的，并且通常属于以下五界中的一个：植物界，动物界，真菌，原核生物和原生生物。本发明针对从任何病毒中获得或提取的样品在体外实施。所述样品优选是液体样品。样品通常包括患者的体液。所述样品可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，但优选血液，血浆或血清。通常，所述样品是来源于人的，但可替代地可以是来自其他哺乳动物动物的，如自商业上养殖的动物如马，牛，绵羊或猪，或者可以是宠物如猫或狗。或者，植物来源的样品通常从商业作物获得，如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，藜，大麦，燕麦，芸苔，玉米，大豆，水稻，香蕉，苹果，西红柿，土豆，葡萄，烟草，菜豆，小扁豆，甘蔗，可可，棉花。
所述样品可以是非生物样品。非生物样品优选为液体样品。非生物样品的示例包括外科手术液体，水如饮用水，海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。
样品通常在测试前被处理，例如通过离心或通过膜滤除不需要的分子或细胞，例如红血细胞。可以在获取所述样本后立即进行检测。通常也可以在分析前储存所述样本，优选低于-70℃。
阻断链
所述一个或多个阻断链包括在目标多核苷酸中。一个或多个阻断链优选是目标多核苷酸的一部分，例如它/它们中断多核苷酸序列。一个或多个阻断链优选不为一个或多个嵌段分子的一部分，该嵌段分子如与目标多核苷酸杂交的减速带。
在目标多核苷酸中具有任意数量的阻断链，如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个阻断链。优选在目标多核苷酸中具有2个，4个或6个阻断链。目标多核苷酸的不同区域中可具有阻断链，例如前导序列中的阻断链和发卡环中的阻断链。
一个或多个阻断链各提供了能量障碍，所述一个或多个解旋酶甚至在活动模式也不能克服该能量障碍。所述一个或多个阻断链可通过减少解旋酶的牵拉(例如通过除去目标多核苷酸中的核苷酸的碱基)或物理性地阻断一个或多个解旋酶的移动(例如利用庞大的化学基团)来停滞一个或多个解旋酶。
所述一个或多个阻断链可包括停滞一个或多个解旋酶的任意分子或任意分子的组合。所述一个或多个阻断链可以包括阻止所述一个或多个解旋酶沿目标多核苷酸移动的任意分子或任意分子的组合。其直接地确定在缺少跨膜孔和施加的电势的条件下，一个或多个解旋酶是否停留在一个或多个阻断链处。例如，这可如实施例中所示进行测试，例如解旋酶穿过阻断链且置换DNA的互补链的能力可以通过PAGE进行测量。
一个或多个阻断链通常包括直链分子如聚合物。所述一个或多个阻断链通常具有与目标多核苷酸不同的结构。例如，如果所述目标多核苷酸是DNA，一个或多个阻断链通常不是脱氧核糖核酸。特别是，如果目标多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，所述一个或多个阻断链优选包括肽核酸(PNA)，甘油核酸(GNA)，苏糖核酸(TNA)，锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的合成聚合物。
一个或多个阻断链优选包括一个或多个硝基吲哚，例如一个或多个5-硝基吲哚，一个或多个肌苷，一个或多个吖啶，一个或多个2-氨基嘌呤，一个或多个2-6-二氨基嘌呤，一个或多个5-溴-脱氧尿嘧啶，一个或多个反向胸苷(反向dTs)，一个或多个反向脱氧胸苷(ddTs)，一个或多个二脱氧胞苷(ddCs)，一个或多个5-甲基胞苷，一个或多个5-羟甲基胞苷，一个或多个2’烷氧基修饰的核糖核苷酸(优选2’甲氧基修饰的核糖核苷酸)，一个或多个异脱氧胞苷(异-dCs)，一个或多个异脱氧鸟苷(异dGs)，一个或多个iSpC3基团(即缺少糖和碱基的核苷酸)，一个或多个光裂解(PC)基团，一个或多个己二醇基团，一个或多个阻断链9(iSp9)基团，一个或多个阻断链18(iSp18)基团，聚合物或一个或多个硫醇连接。所述一个或多个阻断链可包括这些基团的任意组合。许多这些基团可以购自(Integrated DNA)。
所述一个或多个阻断链可包含任何数量的这些基团。例如，对于2-氨基嘌呤，2-6-二氨基嘌呤，5-溴脱氧尿苷，反向dTs，ddTs，ddCs，5-甲基胞苷，5-羟甲基胞苷，2’烷氧基修饰的核糖核苷酸(优选2’甲氧基修饰的核糖核苷酸)，异dCs，异dGs，iSpC3基团，PC基团，己二醇基团和硫醇连接，一个或多个阻断链优选包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多。一个或多个阻断链优选包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多iSp9基团。一个或多个阻断链优选包含2个、3个、4个、5个或6个或更多iSp18基团。最优选的阻断链基团是4个iSp18基团。
聚合物优选为多肽或聚乙二醇(PEG)。所述多肽优选地包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个氨基酸。所述PEG优选包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多单体单元。
一个或多个阻断链优选包括一个或多个无碱基核苷酸(即缺乏核碱基的核苷酸)，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个无碱基的核苷酸。核碱基可以被无碱基核苷酸中的-H(idSp)或-OH置换。无碱基的阻断链可以通过从一个或多个相邻的核苷酸中除去核碱基而被插入到目标多核苷酸中。
一个或多个阻断链优选包含一个或多个物理上导致一个或多个解旋酶停滞的化学基团。所述一个或多个化学基团优选为一个或多个侧挂的化学基团。所述一个或多个化学基团可以连接到目标多核苷酸中的一个或更多个核碱基。所述一个或多个化学基团可以连接到目标多核苷酸的骨架。可存在任何数量，如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或更多个这些化学基团。合适的基团包括但不限于，荧光团，链霉亲和素和/或生物素，胆固醇，亚甲基蓝，二硝基苯酚(DNPs)，洋地黄毒苷和/或抗洋地黄毒苷和二苯基环辛炔基团。
目标多核苷酸中的不同阻断链可以包含不同停滞分子。例如，一个阻断链可以包括如上讨论的一个线性分子，另一个阻断链可以包括一个或多个物理上导致一个或多个解旋酶停滞的化学基团。阻断链可包括如上讨论的任何线性分子和一个或多个物理上导致一个或多个解旋酶停滞的化学基团，例如一个或多个无碱基和荧光团。
合适的阻断链可以根据目标多核苷酸的类型而设计并且在本发明的方法条件下进行实施。大多数解旋酶结合DNA且沿DNA移动，所以可以用任何不为DNA的物质而停滞。合适的分子如上所述。
在一个具体的实施例中，所述2′甲氧基修饰的核糖核苷酸的数量为1-10个，更优选2-6个；和/或所述2′甲氧基修饰的核糖核苷酸均匀分布于所述阻断链。
解旋酶
本发明可使用任何解旋酶。解旋酶可以为或衍生自Hel308解旋酶，RecD解旋酶，如TraI解旋酶或TrwC解旋酶，XPD解旋酶或Dda解旋酶。解旋酶可以为实施例1中提供的解旋酶、或中国专利CN201880095718.X中公开的解旋酶，也可以是其它解旋酶。
点击化学
本申请的多核苷酸之间可共价地连接。例如，可使用游离铜点击化学或铜催化的点击化学。由于点击化学令人满意的性质和其对于在多种构建块(building blocks)之间生成共价连接的范围，使得在这些应用中使用点击化学。例如，它是快速的，清洁的并且无毒的，只产生无害的副产物。点击化学是由Kolb等在2001首次介绍的术语，为描述更广泛的一系列强大，有选择性的和模块化的构建块，所述构建块可靠地用于小规模和大规模应用(Kolb HC Finn,MG,Sharp less KB,click chemistry:diverse chemical function froma few good reactions,Angew.Chem.Int.Ed.40(2001)2004-2021)。他们定义了如下一系列严格标准用于点击化学：“反应必须是模块化的，宽的范围，给出非常高的产量，只产生无害的可通过非色谱法去除的副产物，并且是立体定向的(但不必然是对映选择性)。所要求的方法特征包括简单的反应条件(理想地所述方法应对氧气和水不敏感)，容易获得的起始物质和试剂，无溶剂或溶剂的使用，所述溶剂是温和的(例如水)或容易去除的，和简单的产物分离。纯化如果需要必须是通过非色谱法，例如结晶或蒸馏，并且所述产物在生理状态下必须是稳定的”。
点击化学的合适例子包括但不限于以下：
(a)游离铜的变体的1,3偶级环加成反应，其中叠氮化物与炔烃在应力例如在环辛烷环中反应；
(b)在一个连接体上的氧亲核试剂与在其他连接体上的环氧化合物或氮杂环丙烷反应性部分的反应；和
(c)施陶丁格连接，其中炔烃部分可被芳基膦取代，导致和叠氮化物的特异性反应，从而得到酰胺键。
优选所述点击化学反应是在炔烃和叠氮化物之间Cu(I)催化的1,3偶极环加成反应。在优选实施例中，第一基团是叠氮化物基团，第二基团是炔烃基团。核酸碱基已被合成，在优选位置中插入叠氮化物和炔烃基团(例如Kocalka P,El-Sagheer AH,Brown T,Rapidand efficient DNA strand cross-linking by click chemistry,Chembiochem.2008.9(8):1280-5)。炔烃基团是从Berry Associates(Michigan,USA)商业可获得的，并且叠氮化物基团是通过ATDBio或IDT bio合成的。
在本申请的一个具体的实施方案中，优选地反应基团是叠氮化物和己基基团，例如叠氮化物N3和DBCO。
方法
本发明还提供了一种表征目标多核苷酸的方法，所述方法使用所述衔接体或所述的复合物；
优选地，所述方法包括：
(a)使目标多核苷酸穿过跨膜孔移动，
其中所述目标多核苷酸与所述的衔接体或所述的复合物连接；以及
(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个电和/或光测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
本发明的方法包括测量所述目标多核苷酸的一个或多个特征。该方法可以包括测量2个，3个，4个，5个或更多个目标多核苷酸的特征。所述一个或多个特征，优选选自(i)目标多核苷酸的长度，(ii)所述目标多核苷酸的同一性，(iii)所述目标多核苷酸的序列，(iv)所述目标多核苷酸的二级结构；以及(v)目标多核苷酸是否是经修饰的。(i)至(v)的任何组合可以根据本发明进行测量。
对于(i)，多核苷酸的长度例如可以通过确定所述目标多核苷酸和所述孔的相互作用数量，以及目标多核苷酸与所述孔相互作用之间的持续时间来测定。
对于(ii)，所述多核苷酸的同一性可以通过多种方式测定。多核苷酸的同一性可以联合目标多核苷酸的序列的测定，或不联合目标多核苷酸的序列的测定进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以以几种方式来完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(而无需测定该多核苷酸的其余序列)。或者，方法中测定的特定的电和/或光信号可鉴定来自特定来源的目标多核苷酸。
对于(iii)，多核苷酸的序列可以如前所述确定。合适的测序方法，特别是那些使用电测量的方法，描述于Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12；106(19):7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO 2000/28312中。
对于(iv)，所述二级结构可以以多种方式测量。例如，如果该方法包含电测量，二级结构可以利用穿过孔的停留时间的改变或电流变化进行测量。这使得单链和双链多核苷酸的区域能够得到识别。
对于(v)，可以测定任何存在或不存在修饰。该方法优选包括确定所述目标多核苷酸是否通过甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物，标签或阻断链进行了修饰。特异性修饰将导致与孔的特异性相互作用，其可以使用下面描述的方法来测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过孔的电流，识别胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。
该方法通常在缓冲剂存在下实施。在上面讨论的示例性设备中，缓冲剂存在所述室的水溶液中。本发明的方法可使用任何缓冲剂。通常地，缓冲剂是磷酸盐缓冲液。其他合适的缓冲剂是HEPES和Tris-HCl缓冲剂。该方法通常在pH值为4.0至12.0，4.5至10.0，5.0至9.0，5.5至8.8，6.0至8.7，7.0至8.8，或7.5至8.5下实施。所使用的pH优选约为7.5。
该方法可在0至100℃，15℃至95℃，16℃至90℃，17℃至85℃，18℃至80℃，19℃至70℃，或20℃至60℃实施。该方法通常在室温下进行。该方法可选地在支持解旋酶功能的温度下，例如约37℃实施。
该方法可以在游离核苷酸或游离核苷酸类似物和/或辅助解旋酶功能发挥的辅助因子存在下实施。该方法也可以在游离核苷酸或游离核苷酸类似物不存在且解旋酶的辅助因子不存在下实施。所述游离核苷酸可以为如上面讨论的单个核苷酸的任意一个或多个。游离核苷酸包括，但不限于，单磷酸腺苷(AMP)，二磷酸腺苷(ADP)，三磷酸腺苷(ATP)，单磷酸鸟苷(GMP)，二磷酸鸟苷(GDP)，三磷酸鸟苷(GTP)，单磷酸胸苷(TMP)，二磷酸胸苷(TDP)，三磷酸胸苷(TTP)，单磷酸尿苷
(UMP)，二磷酸尿苷(UDP)，三磷酸尿苷(UTP)，单磷酸胞苷
(CMP)，二磷酸胞苷(CDP)，三磷酸胞苷(CTP)，环磷酸腺苷(cAMP)，环单磷酸鸟苷(cGMP)，脱氧单磷酸腺苷(dAMP)，脱氧二磷酸腺苷(DADP)，脱氧三磷酸腺苷(dATP)，脱氧单磷酸鸟苷(dGMP)，脱氧二磷酸鸟苷(dGDP)，脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)，脱氧单磷酸胸苷(dTMP)，脱氧二磷酸胸苷(dTDP)，脱氧三磷酸胸苷(dTTP)，脱氧二磷酸尿苷(dUMP)，脱氧二磷酸尿苷(dUDP)，脱氧三磷酸尿苷(dUTP)，脱氧单磷酸胞苷(dCMP)，脱氧二磷酸胞苷(dCDP)和脱氧三磷酸胞苷(dCTP)。该游离核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP或dCMP。该游离核苷酸优选三磷酸腺苷(ATP)。解旋酶辅助因子是使解旋酶或构建体发挥功能的因子。解旋酶辅助因子优选为二价金属阳离子。所述二价金属阳离子优选为Mg2+，Mn2+，Ca2+或Co2+。解旋酶辅助因子最优选Mg2+。
试剂盒
再一方面，本发明还提供了一种用于表征多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含所述的衔接体或所述的复合物。
所述试剂盒包括(a)一个或多个衔接体，(b)一个或多个解旋酶。所述试剂盒可包括上面讨论的任何解旋酶和孔。
所述试剂盒还可以包括膜的成分，如形成两性分子层需要的磷脂如脂质双分子层。
本发明的试剂盒可以另外包含使得上述提及的任何实施例能够实施的一个或多个其它试剂或仪器。这类试剂或仪器包括以下试剂或仪器中的一个或多个：合适的缓冲液(水溶液)，从受体(subject)中得到样品的工具(例如包含针的容器或仪器)，扩增和/或表达多核苷酸的工具，上文定义的膜或压力钳或膜片钳装置。试剂在试剂盒中可以干燥状态存在，使得流体样品重新悬浮试剂。所述试剂盒还可，可选地，包括使本发明的方法中如何使用试剂盒的说明书，或者该方法可用于何种患者的详细信息。所述试剂盒可选地包括促进解旋酶移动的必要的组分(例如ATP和Mg2+)。
下列实施例说明本发明。
实施例1：降低ATP空耗的Y衔接体-酶复合物的制备
SEQ ID NO:1GCGGAGTCAAACGGTAGAAGTCG
SEQ ID NO:2TAACGTATTC
SEQ ID NO:3ACTGCTCATTCGGTCCTGCTGACT
SEQ ID NO:4CGACTTCTACCGTTTGACTCCGC
SEQ ID NO:5GTCAGCAGGACCGAATGA
SEQ ID NO:6GAATACGTTAGCGG，其中SEQ ID NO:6由PNA组成
SEQ ID NO:7GCAGTAGTCCAGCACCGACC
SEQ ID NO:8
GTFDDLTEGQKNAFNIVMKAIKEKKHHVTINGPAGTGKTTLTKFIIEALISTGETGIILAAPTHAAKKILSKLSGKEASTIHSILKINPVTYECNVLFEQKEVPDLAKARVLICDEVSMYDRKLFKILLSTIPPWATIIGIGDNKQIRPVDPGENTAYISPFFTHKDFYQCELTEVKRSNAPIIDVATDVRNGKWIYDKVVDGHGVRGFTGDTALRDFMVNYFSIVKSLDDLFENRVMAFTNKSVDKLNSIIRKKIFETDKDFIVGEIIVMQEPLFKTYKIDGKPVSEIIFNNGQLVRIIEAEYTSTFVKARGVPGEYLIRHWDLTVETYGDDEYYREKIKIISSDEELYKFNLFLGKTCETYKNWNKGGKAPWSDFWDAKSQFSKVKALPASTFHKAQGMSVDRAFIYTPCIHYADVELAQQLLYVGVTRGRYDVFYV
复合物是由4个不同链杂交在一起构成的；
第一链(Y-Top-1)，依次包含前导序列，即iSpC3阻断链，表示为3，其连接到SEQ IDNO:1的5′端，其3′端依次连接到4个i2OMeC和SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:2的3′端连接到阻断链(R0-R6如表2所示)和SEQ ID NO:3，其中i2OmeC和i2OmeG为2”-O-甲基RNA，即2′甲氧基修饰的RNA。
第二链(Y-Top-2)，DBCO连接SEQ ID NO:4的5′端。
第三链(Y-Bottom)，SEQ ID NO:4的3′端链接SEQ ID NO:7。
第四链(PNA-R)，[GAATACGTTAGCGG]pna-OO-azide(N3)，其中O为O-liker(也称为AEEA或eg1)，用于增加PNA-R的溶解性。
Y-Top-1：
Figure BDA0003412474700000201
Y-Top-2:DBCO-CGACTTCTACCGTTTGACTCCGC；
Y-Bottom:
Figure BDA0003412474700000202
PNA-R:
Figure BDA0003412474700000203
将Y1、Y2、YB三条合成单链以1：1.1：1.1的比例进行退火(从95℃缓慢降温到25℃，降温幅度不超过0.1℃/s)。退火终体系包括160mM HEPES 7.0；200mM NaCl，Y1的终浓度为4-8μM，最终形成Y型衔接体。将Y型衔接体(500nM)与6倍物质的量的酶T4 Dda-M1G/E94C/C109A/C136A/A360C(3μM)(序列如SEQ ID NO：8所示)，在缓冲液(100mM NaAc(pH 7)；1.5mMTMAD)中混合并室温孵育30分钟。该混合物称为样品1。
在样品1中加入1μM的PNA-R链，并且在室温下孵育30分钟。得到样品2。
TBE(天然的)PAGE凝胶检测样品1和样品2在相同条件下的迁移率。PNA-R链加载到接头上之后的样品2迁移率会下降，较未加PNA-R链的对照(样品1)迁移率较慢，其中，使用阻断链为R0的对比结果如图2所示。
将样品2使用DNAPac PA200柱，使用下列洗脱缓冲液(缓冲液A:20mM Na-CHES,250mM NaCl,4％(W/V)甘油，pH 8.6,缓冲液B:20mM Na-CHES,1M NaCl,4％(W/V)甘油，pH8.6)进行纯化，将样品1装在所述柱子上，并且用缓冲液A将没有结合到DNA上的酶从柱上洗脱掉。然后用10倍柱体积的0-100％缓冲液E将结合了酶的Y型衔接体复合物进行洗脱。然后汇集主洗脱峰，测量其浓度用于实施例2的检测。。
实施例2：ATPase活性检测
首先进行NADH反应混合液的制备，主要按照下表1进行该反应混合液的配制，配制完成后，室温水平翻转，孵育10分钟。
表1 NADH反应混合液的制备
Figure BDA0003412474700000211
之后，在96孔板内加入112.5μL NADH反应混合液，37.5μL(20nM)Y衔接体-酶复合 物(即实施例1纯化后的样品1和样品2中的任一种)，然后将其放入紫外-可见光分光光度计内测量380nn处的吸光值，温度设定为34℃；检测200个循环，每个循环5分钟。收集的数据进行标准曲线绘制并通过标准曲线斜率得出ATP消耗值。
结果如图3和表2(加入复合物10h)所示。以不加入PNA-R为对照(其使用的阻断链与R1相同)，并且设置为基线(100％)。ATP消耗百分比如果低于100％说明相较于对照接头具有降低ATP消耗的潜力。所有测试的接头适配体的阻断链序列如下表2所示，将酶驱赶到不同的结构和序列的阻断链后，测定得到的ATP/NADH消耗，具体见图3所示。
由图3得知：相较于对照R0，衔接体R1-R6的ATP消耗速率均有明显下降。与R1相比，R2-R6的阻断链不同，ATP消耗量不同，其中，阻断链增加1个2′甲氧基修饰的核糖核苷酸如R2，ATP消耗变化不明显，阻断链增加4个2′甲氧基修饰的核糖核苷酸如R3-R6，ATP消耗明显降低。另外，图3中还设置了不含衔接体的酶(与实施例1相同)对照(CK)，该酶依赖底物消耗ATP，不含衔接体时由于酶没有结合底物，其ATP消耗较低。
表2
Figure BDA0003412474700000221
实施例3：降低ATP空耗的Y衔接体-酶复合物的上机测试
通过末端修复方式制备长为10kb的文库，并且用实施例1中制备的降低ATP空耗的Y衔接体-酶复合物(接头为R4)与文库即目标多核苷酸进行连接建库，目标多核苷酸连接位置为图1所示衔接体的右端。以不加入PNA-R链为对照(记为RC)。
使用齐碳科技有限公司纳米孔测序仪QNome-9604进行测序，测序缓冲液：终浓度10mM HEPEs，100mM MgCl 2，375mM KCl，ATP100mM，pH 7.1，测序温度：30-40℃。
结果：如图4所示，对照RC在测序16小时内下降幅度约为80bp/s；接头R4在测序16小时内速率下降幅度约为10bp/s。测序速率和ATP浓度呈正相关，若测序过程中，ATP浓度显著下降，则其测序速率也会下降。
另外，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
应理解，在本发明实施例中，“与A相应的B”表示B与A相关联，根据A可以确定B。但还应理解，根据A确定B并不意味着仅仅根据A确定B，还可以根据A和/或其它信息确定B。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 成都齐碳科技有限公司
<120> 用于表征多核苷酸的衔接体及其用途
<130> 21NI2349
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggagtcaa acggtagaag tcg 23
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taacgtattc 10
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actgctcatt cggtcctgct gact 24
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgacttctac cgtttgactc cgc 23
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcagcagga ccgaatga 18
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaatacgtta gcgg 14
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagtagtcc agcaccgacc 20
<210> 8
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Thr Phe Asp Asp Leu Thr Glu Gly Gln Lys Asn Ala Phe Asn Ile
1 5 10 15
Val Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys His His Val Thr Ile Asn Gly
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Lys Phe Ile Ile Glu Ala
35 40 45
Leu Ile Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ile Ile Leu Ala Ala Pro Thr His
50 55 60
Ala Ala Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Gly Lys Glu Ala Ser Thr
65 70 75 80
Ile His Ser Ile Leu Lys Ile Asn Pro Val Thr Tyr Glu Cys Asn Val
85 90 95
Leu Phe Glu Gln Lys Glu Val Pro Asp Leu Ala Lys Ala Arg Val Leu
100 105 110
Ile Cys Asp Glu Val Ser Met Tyr Asp Arg Lys Leu Phe Lys Ile Leu
115 120 125
Leu Ser Thr Ile Pro Pro Trp Ala Thr Ile Ile Gly Ile Gly Asp Asn
130 135 140
Lys Gln Ile Arg Pro Val Asp Pro Gly Glu Asn Thr Ala Tyr Ile Ser
145 150 155 160
Pro Phe Phe Thr His Lys Asp Phe Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Glu Val
165 170 175
Lys Arg Ser Asn Ala Pro Ile Ile Asp Val Ala Thr Asp Val Arg Asn
180 185 190
Gly Lys Trp Ile Tyr Asp Lys Val Val Asp Gly His Gly Val Arg Gly
195 200 205
Phe Thr Gly Asp Thr Ala Leu Arg Asp Phe Met Val Asn Tyr Phe Ser
210 215 220
Ile Val Lys Ser Leu Asp Asp Leu Phe Glu Asn Arg Val Met Ala Phe
225 230 235 240
Thr Asn Lys Ser Val Asp Lys Leu Asn Ser Ile Ile Arg Lys Lys Ile
245 250 255
Phe Glu Thr Asp Lys Asp Phe Ile Val Gly Glu Ile Ile Val Met Gln
260 265 270
Glu Pro Leu Phe Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu
275 280 285
Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gln Leu Val Arg Ile Ile Glu Ala Glu Tyr
290 295 300
Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile
305 310 315 320
Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr
325 330 335
Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe
340 345 350
Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Cys Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys
355 360 365
Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly
385 390 395 400
Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala
405 410 415
Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly
420 425 430
Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val
435

Claims (10)

1.一种用于表征目标多核苷酸的衔接体，其特征在于，所述衔接体在5'到3'端方向包含{L-S}n或{S-L}n，
其中，L为修饰的双链多核苷酸，S为阻断链，n为正整数；
并且，所述L双链包含与S连接的多核苷酸链L'及所述L'的互补链L”，所述L'包括远离阻断链S的第一区段和靠近阻断链S的第二区段，所述第一区段包含修饰部分，所述第二区段包含马达蛋白结合活性区，该活性区被所述互补链L”封闭；
互补链L”包含能够与所述马达蛋白竞争性结合到L'链的聚合物。
2.根据权利要求1所述的衔接体，其特征在于，所述衔接体在5'到3'端方向包含{D1-L-S}n或{S-L-D1}n，D1为第一双链多核苷酸；
和/或，所述衔接体在5'到3'端方向包含{L-S-D2}n或{D2-S-L}n，D2为第二双链多核苷酸；
优选地，所述n为1-20的整数。
3.根据权利要求1或2所述的衔接体，其中，所述链L'的修饰部分使所述第一区段与马达蛋白的结合能力弱于所述第二区段，或者使所述第一区段不与马达蛋白结合；和/或
所述链L'中所述修饰部分为核糖核苷酸和/或核酸类似物；
优选地，所述核糖核苷酸包括2′位修饰的核糖核苷酸，优选2′烷氧基修饰的核糖核苷酸，更优选为2′甲氧基修饰的核糖核苷酸；或
优先地，所述核酸类似物包括肽核酸、甘油核酸、苏糖核酸、锁核酸、桥核酸中的任一种或两种以上任意组合；和/或
所述链L'中所述马达蛋白结合活性区为脱氧核糖核苷酸；和/或
所述核糖核苷酸和/或核酸类似物的个数为1-20、1-15或1-10；优选2-6。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的衔接体，其中，所述互补链L”靠近阻断链S的一端包含与多核苷酸链L'或所述第二区段结合力更强的部分；优选地，该部分包含PNA或者LNA；
和/或，所述互补链L”远离阻断链S的一端包含点击化学的第一部分，优选点击反应基团；
和/或，所述D1双链包含与L'连接的多核苷酸链D1'及其互补链D1”，所述互补链D1”靠近阻断链S的一端包含点击化学的第二部分，优选点击反应基团；
和/或，所述D2双链包含与阻断链S连接的多核苷酸链D2'及其互补链D2”，所述互补链D2”包含不与所述衔接体杂交的部分；优选地，所述不与所述衔接体杂交的部分位于互补链D2”临近阻断链S的一端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的衔接体，其中，所述阻断链具有与所述多核苷酸不同的结构，用于阻滞马达蛋白；
优选地，所述阻断链包含一个或多个硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿嘧啶、一个或多个反向胸苷、一个或多个反向二脱氧胸苷、一个或多个二脱氧胞苷、一个或多个5-甲基胞苷酸、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2’烷氧基修饰的核糖核苷酸优选2’甲氧基修饰的核糖核苷酸、一个或多个异脱氧胞苷、一个或多个异脱氧鸟苷、一个或多个C3基团、一个或多个光裂解(PC)的基团、一个或多个己二醇、一个或多个iSp9基团、一个或多个iSp18基团、聚合物或一个或多个硫醇连接。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的衔接体，其L'的远离S的一端包含先导链序列；
S的远离L'的一端用于连接目标多核苷酸；
所述马达蛋白为能够结合到多核苷酸并且控制其移动穿过孔的蛋白；优选地，所述马达蛋白选自聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶中的一种或多种，更优选地，所述解旋酶选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、Tral解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和DDA解旋酶中的一种或多种。
7.一种复合物，所述复合物包含权利要求1至6中任一项所述的衔接体，和所述马达蛋白和/或所述目标多核苷酸；
优选地，所述马达蛋白位于阻断链。
8.如权利要求7所述的复合物的制备方法，包括：
S1：使包含L'-S的Y1链与马达蛋白结合，所述结合区域位于L'链；
S2：加入包含互补链L”的PNA-R链，得到所述复合物，其中所述马达蛋白被PNA-R链驱赶到阻断链；
优选地，所述方法包括
S101：使包含D1'-L'-S-D2'的Y1链、包含D1”的Y2链和包含D2”的YB链的退火产物与马达蛋白结合，所述结合区域位于退火产物的L'链处；
S102：加入包含互补链L”的PNA-R链，得到所述复合物，其中马达蛋白通过PNA-R链驱赶到阻断链。
9.一种表征目标多核苷酸的方法，所述方法使用如权利要求1至6中任一项所述的衔接体或如权利要求7或8所述的复合物；
优选地，所述方法包括：
(a)使目标多核苷酸穿过跨膜孔移动，
其中所述目标多核苷酸与如权利要求1至6中任一项所述的衔接体或如权利要求7或8所述的复合物连接；以及
(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个电和/或光测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
10.一种用于表征多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒的组成为如下1)-4)中任一种：
1)包含独立包装的如权利要求1至6中任一项所述的衔接体，优选地，还包含独立包装的如权利要求1至6中任一项所述的马达蛋白；
2)包含如权利要求7所述的复合物；
3)包含如权利要求8所述制备方法得到的复合物；
4)包含分别独立包装的如下组分：
如权利要求1至6中任一项所述的衔接体中的用于与S连接的多核苷酸链L'、所述阻断链S、和所述核苷酸链L'的互补链L”，优选地，还包含独立包装的如权利要求1至6中任一项所述的马达蛋白。
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