CN114854826A

CN114854826A - 序列、包含序列的接头及其用途

Info

Publication number: CN114854826A
Application number: CN202210516614.XA
Authority: CN
Inventors: 刘艺; 邹美娟
Original assignee: Qitan Technology Ltd Beijing
Current assignee: Qitan Technology Ltd Beijing
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-08-05

Abstract

本发明提供了序列、包含序列的接头及其用途。本发明提供了用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列，所述序列包含第一区段和第二区段，所述第一区段用于结合所述多核苷酸结合蛋白，所述第二区段用于阻滞所述多核苷酸结合蛋白，其中所述第二区段包含多核苷酸，所述多核苷酸的磷酸基团被修饰，所述修饰减少了所述多核苷酸的净负电荷，从而实现了对所述多核苷酸结合蛋白的阻滞。本发明提供了用于表征靶多核苷酸的接头。本发明的接头制备方法简单，并且可以直接用于纳米孔的测序，显著地提高了文库构建的效率和测序数据的有效性。

Description

序列、包含序列的接头及其用途

技术领域

本发明属于基因测序领域，涉及一种用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列，包含所述序列的接头，以及使用所述接头表征多核苷酸的方法。

背景技术

纳米孔测序技术具有长读长、直接读取修饰信息和实时数据生产并行分析的特点，在长片段核酸检测变异(包括但不仅限于点突变、插入缺失、倒位易位、基因融合、RNA异常剪切、RNA编辑等多种核酸相关变异)和修饰信息(包括但不仅限于甲基化、乙酰化等)检测方面比二代测序或其他测序平台有更明显优势。该平台支持数据生产和分析并行的特点实现了实时变异/修饰检出和诊断，加上便携式的设计，使其具有广泛的应用前景。

对纳米孔两侧施加电压后，当分析物（例如多核苷酸、多肽）通过纳米孔时造成电流下降，不同结构的分析物所引起的电流阻断程度不同。当分析物在纳米孔的桶（barrel）中暂时停留一段时间时，电流会发生变化。纳米孔检测核苷酸给出已知特征和持续时间的电流变化。

在纳米孔测序技术中，未施加电势时，多核苷酸的阻滞区通常能够使多核苷酸结合蛋白如解旋酶停滞，防止多核苷酸结合蛋白如解旋酶穿过间隔区沿目标多核苷酸进一步移动。但当多核苷酸结合蛋白如解旋酶与多核苷酸的复合物同纳米孔接触并施加电势后，可以移动一个或多个停滞的多核苷酸结合蛋白如解旋酶穿过多核苷酸上的阻滞区，沿着待测多核苷酸序列进行移动，从而达到测序的目的。因此，现有的多核苷酸接头均是包含正常多核苷酸的多核苷酸结合蛋白的结合区和各种结构的阻滞区。

然而，现有的纳米孔测序技术中，用于使多核苷酸结合蛋白如解旋酶停滞的多核苷酸的阻滞区多在核苷酸的碱基和戊糖上进行修饰。这些修饰需要先通过几步甚至几十步的反应制备修饰核酸的亚磷酰化单体。

因此，当前对能够阻滞多核苷酸结合蛋白如解旋酶的更简单的方法存在需求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新的接头序列，本发明还提供了所述接头序列的制备方法，及其用于纳米孔测序的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面提供了用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列，所述序列包含第一区段和第二区段，所述第一区段用于结合所述多核苷酸结合蛋白，所述第二区段用于阻滞所述多核苷酸结合蛋白，其中所述第二区段包含多核苷酸，所述多核苷酸的磷酸基团被修饰，所述修饰减少了所述多核苷酸的净负电荷，从而实现了对所述多核苷酸结合蛋白的阻滞。

所述序列包括但不限于多核苷酸。

根据本发明所述的序列，其中发明人发现，当多核苷酸的磷酸基团上存在修饰基团时，就能实现阻滞解旋酶的作用。具体地，将多核苷酸的磷酸基团进行烷基化修饰，减少多核苷酸上的电荷密度，可作为新型的阻滞方式。由于对多核苷酸的磷酸骨架的硫代烷基化修饰可以在任意位置，因此在不同位置进行的修饰相对比较灵活，而且还可以根据需求变换不同的疏水性基团。

根据本发明所述的序列，其中所述修饰包括疏水性修饰。

用于所述疏水性修饰的基团选自C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-链烯基、C_2-6-炔基、C_2-6-烷硫基、芳基、芳硫基芳基、芳氧基和芳羰基的一种或多种；和/或

所述第二区段的多核苷酸中，所述被修饰的磷酸基团的数量为一个或多个；和/或

所述序列包含一个或多个第一区段以及一个或多个第二区段；其中，所述第一区段和第二区段间隔排列；每个相邻的第一区段和第二区段结合并停滞的多核苷酸结合蛋白的数量为1个。

根据本发明所述的序列，其中用于所述疏水性修饰的基团为乙基或苯乙酰胺基。

根据本发明所述的序列，其中所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶。

所述多核苷酸处理酶选自聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶中的一种或多种。

所述解旋酶选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、Tral解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和DDA解旋酶中的一种或多种。

本发明的第二方面提供了所述序列的制备方法，包括：

合成包含第一区段和第二区段的序列，其中，所述第二区段中一个或多个核苷酸的磷酸基团为硫代磷酸基团；和

使所述硫代磷酸基团发生烷基化反应，从而所述第二区段的多核苷酸的磷酸基团被修饰，所述修饰减少了的所述多核苷酸的净负电荷。

本发明的第三方面提供了一种用于表征靶多核苷酸的接头，其中，所述接头包括用于引导所述接头进入纳米孔的第三区段和用于连接靶多核苷酸的第四区段，所述第三区段与所述第四区段之间插入前述序列。

其中，所述序列的第一区段靠近所述第三区段，所述序列的第二区段靠近所述第四区段。

本发明的第四方面提供了一种用于表征靶多核苷酸的构建体，其中，所述构建体包含靶多核苷酸和前述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

本发明的第五方面提供了用于表征靶多核苷酸的复合物，其中，所述复合物包含所述的接头或所述的构建体，以及多核苷酸结合蛋白；

其中，所述多核苷酸结合蛋白结合于所述接头或所述构建体的第一区段，能够停滞于所述第二区段处。

本发明的第六方面提供了一种用于表征靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)一个或多个前述的接头，(b)多核苷酸结合蛋白。

本发明的第七方面提供了一种控制靶多核苷酸穿过纳米孔的移动的方法，包括：

I. 提供前述复合物；

II. 将所述复合物与纳米孔接触；以及

III. 跨所述纳米孔施加电势，使得所述多核苷酸结合蛋白移动穿过所述第二区段，并控制所述靶多核苷酸穿过所述孔的移动。

本发明的第八方面提供了一种表征靶多核苷酸的方法，包括：

1）使用所述的方法，使靶多核苷酸穿过纳米孔移动；以及

2）随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个电和/或光测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述靶多核苷酸。

根据本发明所述的方法，其中所述靶多核苷酸包括脱氧核糖核酸和/或核糖核酸；和/或

所述多核苷酸的至少一部分是双链的；和/或

所述用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列包括在所述多核苷酸的单链区域或非杂交区域中。

本发明的第九方面提供了一种控制一个或多个多核苷酸结合蛋白在目标多核苷酸上加载的方法，包括：

a．提供插入有一个或多个前述的序列的目标多核苷酸；以及

b．将在步骤a中提供的所述目标多核苷酸与所述多核苷酸结合蛋白接触，使得所述多核苷酸结合蛋白结合到所述目标多核苷酸并且在所述第二区段处停滞。

与现有技术相比，本发明的技术方案具备以下优点：

1）本发明的技术方案首次通过在多核苷酸序列的磷酸基团上修饰降低所述磷酸基团的电荷，对阻滞多核苷酸结合蛋白如解旋酶运动具有良好的效果，且在施加电场力后能够穿过阻滞进行正常测序；

2）本发明的技术方案是一种新的阻滞方法，区别于现有技术中阻滞方案，丰富了现有的测序方案；

3）使用本发明的方法进行测序文库的组装和构建，可以直接用于纳米孔的测序，显著地提高了文库构建的效率和测序数据的有效性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本发明的实施例1，设计的结合并阻滞酶的序列的示意图。

图2是本发明的实施例1，得到的结果的电泳图。

图3是本发明的实施例2，得到的结果的电泳图。

图4是本发明的实施例3，使用本发明的接头进行纳米孔测序的结果图。

具体实施方式

下面将详细描述本发明的各个方面的特征和示例性实施例。在下面的详细描述中，提出了许多具体细节，以便提供对本发明的全面理解。但是，对于本领域技术人员来说很明显的是，本发明可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本发明的示例来提供对本发明的更好的理解。

此外，除非内容另外明确指出，否则用于本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一”，“一个”，和“所述”包括复数指代。因此，例如，涉及“多核苷酸”时包括两个或更多个多核苷酸，涉及“锚”时包括两个或更多个锚，涉及“解旋酶”时包括两个或更多个解旋酶，涉及“纳米孔”时包括两个或更多个孔，等。

本发明的用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列

本发明的提供了用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列，所述序列包含第一区段和第二区段，所述第一区段用于结合所述多核苷酸结合蛋白，所述第二区段用于阻滞所述多核苷酸结合蛋白，其中所述第二区段包含多核苷酸，所述多核苷酸的磷酸基团被修饰，所述修饰减少了所述多核苷酸的净负电荷，从而实现了对所述多核苷酸结合蛋白的阻滞。

发明人发现，当多核苷酸的磷酸基团上存在修饰基团时，就能实现阻滞解旋酶的作用。具体地，将多核苷酸的磷酸基团进行烷基化修饰，减少多核苷酸上的电荷密度，可作为新型的阻滞方式。由于对多核苷酸的磷酸骨架的硫代烷基化修饰可以在任意位置，因此在不同位置进行的修饰相对比较灵活，而且还可以根据需求变换不同的疏水性基团。

用于所述疏水性修饰的基团选自C_1-6-烷基、C_1-6-烷氧基、C_2-6-链烯基、C_2-6-炔基、C_2-6-烷硫基、芳基、芳硫基芳基、芳氧基和芳羰基的一种或多种。本领域技术人员可以理解的是，这些疏水性的基团具有大小类似的芳香性杂环，碳链等结构，可以发挥相同的阻滞作用。

所述第一区段优选地至少包含部分单链多核苷酸，所述单链多核苷酸用于结合多核苷酸结合蛋白。所述多核苷酸结合蛋白（如解旋酶）结合到多核苷酸的能力可以使用本领域中已知的任何方法来确定。合适的结合测定包括但不限于，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，荧光各向异性、量热法和表面等离子共振(SPR，如BiacoreTM)。所述第二区段至少包含部分多核苷酸，所述多核苷酸的一个或多个磷酸基团被修饰，使得所述多核苷酸结合蛋白可以停滞在第二区段处。

本发明还提供了所述的序列的制备方法，包括：

i) 合成包含第一区段和第二区段的序列，其中，所述第二区段的序列中一个或多个核苷酸的磷酸基团为硫代磷酸基团；和

ii)使所述硫代磷酸基团发生烷基化反应，从而所述第二区段的多核苷酸的磷酸基团被修饰，所述修饰减少了的所述多核苷酸的净负电荷。

其中，步骤i)中，所述第二区段的多核苷酸中的一个或多个核苷酸的磷酸基团为硫代磷酸基团。在步骤ii)中，所述包含硫代磷酸基团的核苷酸通过烷基化反应，将疏水性基团加添加磷酸基团，实现了所述修饰。

烷基化反应

核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。所述核碱基和糖形成核苷。核苷酸可以是天然核苷酸或非天然核苷酸。每个核苷酸携带一个负电荷的磷酸基团和部分负电荷的碱基。亲电试剂(Electrophile)进攻负电中心时，常会将烷基添加到负电中心，即烷基化(Alkylation)。

本申请中通过烷基化反应修饰本发明所述序列的磷酸基团的步骤如下：

其中，在一个具体的实施例中，考虑到2-溴代乙酰胺类似物的水溶性不佳，因此先用甲醇将其溶解，然后与DNA骨架上的硫代磷酸酯在PBS缓冲液中，80℃下反应30 min即可获得目标产物。而后通过HPLC进行纯化，得到满足纯度需求的产品。

多核苷酸结合蛋白

多核苷酸结合蛋白可以是能够结合到多核苷酸且控制其相对于孔移动例如穿过所述孔的任何蛋白质。现有技术中可直接确定蛋白质是否结合到多核苷酸。所述蛋白质通常与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性。所述蛋白质可通过裂解多核苷酸以形成单个核苷酸或较短链的核苷酸，如二核苷酸或三核苷酸，来修饰所述多核苷酸。

任何数目的多核苷酸蛋白可以被连接到靶多核苷酸。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个蛋白质可以被连接。所述一个或多个多核苷酸结合蛋白可以是一个或多个单链结合蛋白(SSB)。所述一个或多个单链结合蛋白(SSB)可以包含不具有净负电荷的羧基末端(C-末端)的区域或(ii)在其C-末端区包含一个或多个修饰且可降低C-末端区域的净负电荷的被修饰的SSB。

所述一个或多个多核苷酸结合蛋白优选衍生自多核苷酸处理酶。所述多核苷酸处理酶是能够与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性的多肽。所述酶可以通过裂解多核苷酸以形成单个核苷酸或较短链的核苷酸，如二核苷酸或三核苷酸，来修饰多核苷酸。所述酶可以通过定向多核苷酸或将多核苷酸移动到特定的位置而修饰该多核苷酸。只要多核苷酸处理酶能够结合多核苷酸并控制其相对于孔的移动，例如穿过所述孔，所述多核苷酸处理酶并不需要显示酶活性。例如，所述酶可被修饰以去除其酶活性或者可在防止其作为酶的条件下使用。

例如，所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；所述多核苷酸处理酶选自聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶中的一种或多种，所述解旋酶选自Hel308解旋酶、RecD解旋酶、Tral解旋酶、TrwC解旋酶、XPD解旋酶和DDA解旋酶中的一种或多种。

接头

所述接头用于连接靶多核苷酸并表征靶多核苷酸，其中，所述接头包括用于引导所述接头进入纳米孔的第三区段和用于连接靶多核苷酸的第四区段，所述第三区段与所述第四区段之间插前述序列；

可以理解的是，所述第三区段优选包含前导序列。前导序列有助于本发明的方法。前导序列被设计为优先进入纳米孔中，并由此有助于靶多核苷酸相对于所述孔的移动，如穿过所述孔。前导序列还可以用于将多核苷酸连接到一个或多个锚，如上文所述。

前导序列通常包含聚合物。所述聚合物优选带负电荷。聚合物优选为多核苷酸，如DNA或RNA，修饰的核苷酸(如脱碱基的DNA)、PNA、LNA、BNA、聚乙二醇(PEG)或多肽。所述前导序列优选包含多核苷酸，并且更优选包含单链多核苷酸。

前导序列可以包含上述的任何多核苷酸。单链前导序列最优选包含DNA的单链，如聚dT段。

前导序列可以是任意长度，但通常为10至150个核苷酸长度，例如20至150个核苷酸长度。前导序列的长度通常取决于在本方法中使用的纳米孔。

纳米孔

所述纳米孔选自固态纳米孔和/或生物纳米孔，优选生物纳米孔，所述生物纳米孔包括跨膜孔，优选跨膜蛋白孔。

跨膜蛋白孔是多肽或允许水合离子例如分析物从膜的一侧流动到膜的另一侧的一系列多肽。在本发明中，跨膜蛋白孔能够形成允许通过施加的电势驱动的水合离子流从所述膜的一侧流动到另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选允许分析物如核苷酸从膜如脂质双分子层的一侧流动到膜的另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸或核酸，如DNA或RNA，被移动穿过孔。

跨膜蛋白孔可以为单体或低聚物。所述孔优选由数个重复亚基，如6个，7个，8个或9个亚基组成。所述孔优选为六聚体，七聚体，八聚体或九聚体。

跨膜蛋白孔通常包括离子可以流动的桶状体或通道。孔的亚基通常围绕中心轴线并向跨膜β桶状体或通道或跨膜α螺旋束或通道提供链(strands)。

跨膜蛋白孔的桶状体或通道通常包括促进与分析物相互作用的氨基酸，所述分析物如核苷酸，多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选位于所述桶状体或通道的缢痕附近。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，例如精氨酸，赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进孔与核苷酸，多核苷酸或核酸之间的相互作用。

复合物

本发明提供了一种复合物，所述复合物包含本发明所述的接头和多核苷酸结合蛋白，其中，所述多核苷酸结合蛋白结合于所述接头或所述构建体的第一区段，能够停滞于所述第二区段处。

试剂盒

本发明还提供了一种用于表征多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含所述的接头或所述的复合物。

所述试剂盒包括（a）一个或多个接头，（b）一个或多个多核苷酸结合蛋白。所述试剂盒可包括上面讨论的任何解旋酶和孔。

所述试剂盒还可以包括膜的成分，如形成两性分子层需要的磷脂如脂质双分子层。

本发明的试剂盒可以另外包含使得上述提及的任何实施例能够实施的一个或多个其它试剂或仪器。这类试剂或仪器包括以下试剂或仪器中的一个或多个：合适的缓冲液（水溶液），从受体（subject）中得到样品的工具（例如包含针的容器或仪器），扩增和/或表达多核苷酸的工具，上文定义的膜或压力钳或膜片钳装置。试剂在试剂盒中可以干燥状态存在，使得流体样品重新悬浮试剂。所述试剂盒还可，可选地，包括使本发明的方法中如何使用试剂盒的说明书，或者该方法可用于何种患者的详细信息。所述试剂盒可选地包括促进解旋酶移动的必要的组分（例如ATP和Mg²⁺）。

多核苷酸

多核苷酸如核酸是含有两个或更多个核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可包括任何核苷酸的任意组合。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸的可被损坏。例如，多核苷酸可包含嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线导致的损坏相关联，且是皮肤黑素瘤的首要原因。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被修饰，例如用标记物或标签。合适的标记物如下所述。

多核苷酸中的核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸可包含以下核苷：腺苷，尿苷，鸟苷和胞苷。所述核苷酸优选脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸优选包括下列核苷：脱氧腺苷（dA），脱氧尿苷（dU）和/或胸苷（dT），脱氧鸟苷（dG）和脱氧胞苷（dC）。

核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸盐可连接在核苷酸的5'或3'侧上。

合适的核苷酸包括但不限于，单磷酸腺苷（AMP）、单磷酸鸟苷（GMP）、单磷酸胸苷（TMP）、单磷酸尿苷（UMP）、单磷酸胞苷（CMP），环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）、脱氧单磷酸腺苷（dAMP），脱氧单磷酸鸟苷（dGMP）、脱氧单磷酸胸苷（dTMP）、脱氧单磷酸尿苷（dUMP）和脱氧单磷酸胞苷（dCMP）。所述核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。所述核苷酸最优选自dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。所述多核苷酸优选包括以下核苷酸：dAMP、dUMP和/或dTMP和dCMP。

所述多核苷酸中的核苷酸可以任何方式彼此连接。核苷酸通常被它们的糖和磷酸基连接，如在核酸中。所述核苷酸可通过它们的核碱基连接，如嘧啶二聚体中。

所述多核苷酸可以是核酸。所述多核苷酸可以是任何本领域已知的合成的核酸，例如肽核酸（PNA）、甘油核酸（GNA）、苏糖核酸（TNA）、锁核酸（LNA），或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。该PNA骨架由通过肽键连接的重复的N-（2-氨基乙基）-甘氨酸单元组成。该GNA骨架由通过磷酸二酯键连接的重复的乙二醇单元组成。该TNA骨架由通过磷酸二酯键连接在一起的重复的苏糖组成。该LNA是由如上所讨论的具有在核糖中连接2''氧和4''碳的额外的桥的核苷酸形成。

该多核苷酸是最优选核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）。

所述多核苷酸可以为任何长度。例如，多核苷酸可以为至少10个，至少50个，至少100，至少150，至少200，至少250，至少300，至少400或至少500个核苷酸长度。所述多核苷酸可以为1000或更多个核苷酸，5000或更多个核苷酸长度或100000或更多个核苷酸长度。

解旋酶可沿本发明的方法中的全部或仅部分目标多核苷酸移动。全部或部分目标多核苷酸可以使用本发明的方法进行表征。

目标多核苷酸可以是单链的。所述目标多核苷酸的至少一部分优选为双链。解旋酶通常结合至单链多核苷酸。如果目标多核苷酸的至少一部分是双链的，所述目标多核苷酸优选地包括单链区域或非杂交区域。所述一个或多个解旋酶能够结合到单链区域或非杂交区域的一条链上。所述目标多核苷酸优选地包括一个或多个单链区域或一个或多个非杂交的区域。

样品

目标多核苷酸存在于任何合适的样品中。本发明通常在已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样品上实施。替换的，可以对样本实施本发明，以确认所识别的一个或多个目标多核苷酸，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。

所述样品可以是生物样品。本发明可以针对从任何生物体或微生物中获得或提取的样品在体外实施。所述生物体或微生物通常是古核的（archaean），原核的或真核的，并且通常属于以下五界中的一个：植物界，动物界，真菌，原核生物和原生生物。本发明针对从任何病毒中获得或提取的样品在体外实施。所述样品优选是液体样品。样品通常包括患者的体液。所述样品可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，但优选血液，血浆或血清。通常，所述样品是来源于人的，但可替代地可以是来自其他哺乳动物动物的，如自商业上养殖的动物如马，牛，绵羊或猪，或者可以是宠物如猫或狗。或者，植物来源的样品通常从商业作物获得，如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，藜，大麦，燕麦，芸苔，玉米，大豆，水稻，香蕉，苹果，西红柿，土豆，葡萄，烟草，菜豆，小扁豆，甘蔗，可可，棉花。

所述样品可以是非生物样品。非生物样品优选为液体样品。非生物样品的示例包括外科手术液体，水如饮用水，海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。

样品通常在测试前被处理，例如通过离心或通过膜滤除不需要的分子或细胞，例如红血细胞。可以在获取所述样本后立即进行检测。通常也可以在分析前储存所述样本，优选低于-70℃。

当部分靶多核苷酸进入所述孔，并相对于所述孔沿着由所施加的电势而产生的场移动如穿过所述孔时，随着多核苷酸相对于所述孔移动，如穿过所述孔，所述一个或多个解旋酶被所述孔移动穿过所述序列的第二区段。这是因为，多核苷酸(包括所述一个或多个第二区段)相对于所述孔移动，如穿过所述孔，并且所述一个或多个解旋酶保留在所述孔的顶部。

方法

本发明提供了一种控制靶多核苷酸穿过纳米孔的移动的方法，包括：

I. 提供前述复合物；

II. 将所述复合物与纳米孔接触；以及

本发明还提供了一种表征目标多核苷酸的方法，包括：

1）使用前述的方法，使靶多核苷酸穿过纳米孔移动；以及

本发明的方法包括测量所述目标多核苷酸的一个或多个特征。该方法可以包括测量2个，3个，4个，5个或更多个目标多核苷酸的特征。所述一个或多个特征，优选选自（i）目标多核苷酸的长度，（ii）所述目标多核苷酸的同一性，（iii）所述目标多核苷酸的序列，（iv）所述目标多核苷酸的二级结构；以及（v）目标多核苷酸是否是经修饰的。（i）至（v）的任何组合可以根据本发明进行测量。

对于（i），多核苷酸的长度例如可以通过确定所述目标多核苷酸和所述孔的相互作用数量，以及目标多核苷酸与所述孔相互作用之间的持续时间来测定。

对于（ii），所述多核苷酸的同一性可以通过多种方式测定。多核苷酸的同一性可以联合目标多核苷酸的序列的测定，或不联合目标多核苷酸的序列的测定进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以以几种方式来完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在（而无需测定该多核苷酸的其余序列）。或者，方法中测定的特定的电和/或光信号可鉴定来自特定来源的目标多核苷酸。

对于（iii），多核苷酸的序列可以如前所述确定。合适的测序方法，特别是那些使用电测量的方法，描述于Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12；106（19）:7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010；132（50）:17961-72,和国际申请WO 2000/28312中。

对于（iv），所述二级结构可以以多种方式测量。例如，如果该方法包含电测量，二级结构可以利用穿过孔的停留时间的改变或电流变化进行测量。这使得单链和双链多核苷酸的区域能够得到识别。

对于（v），可以测定任何存在或不存在修饰。该方法优选包括确定所述目标多核苷酸是否通过甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物，标签进行了修饰。特异性修饰将导致与孔的特异性相互作用，其可以使用下面描述的方法来测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过孔的电流，识别胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。

该方法通常在缓冲剂存在下实施。在上面讨论的示例性设备中，缓冲剂存在所述室的水溶液中。本发明的方法可使用任何缓冲剂。通常地，缓冲剂是磷酸盐缓冲液。其他合适的缓冲剂是HEPES和Tris-HCl缓冲剂。该方法通常在pH值为4.0至12.0，4.5至10.0，5.0至9.0，5.5至8.8，6.0至8.7，7.0至8.8，或7.5至8.5下实施。所使用的pH优选约为7.5。

该方法可在0至100℃，15℃至95℃，16℃至90℃，17℃至85℃，18℃至80℃，19℃至70℃，或20℃至60℃实施。该方法通常在室温下进行。该方法可选地在支持解旋酶功能的温度下，例如约37℃实施。

该方法可以在游离核苷酸或游离核苷酸类似物和/或辅助解旋酶功能发挥的辅助因子存在下实施。该方法也可以在游离核苷酸或游离核苷酸类似物不存在且解旋酶的辅助因子不存在下实施。所述游离核苷酸可以为如上面讨论的单个核苷酸的任意一个或多个。游离核苷酸包括，但不限于，单磷酸腺苷（AMP），二磷酸腺苷（ADP），三磷酸腺苷（ATP），单磷酸鸟苷（GMP），二磷酸鸟苷（GDP），三磷酸鸟苷（GTP），单磷酸胸苷（TMP），二磷酸胸苷（TDP），三磷酸胸苷（TTP），单磷酸尿苷（UMP），二磷酸尿苷（UDP），三磷酸尿苷（UTP），单磷酸胞苷（CMP），二磷酸胞苷（CDP），三磷酸胞苷（CTP），环磷酸腺苷（cAMP），环单磷酸鸟苷（cGMP），脱氧单磷酸腺苷（dAMP），脱氧二磷酸腺苷（DADP），脱氧三磷酸腺苷（dATP），脱氧单磷酸鸟苷（dGMP），脱氧二磷酸鸟苷（dGDP），脱氧三磷酸鸟苷（dGTP），脱氧单磷酸胸苷（dTMP），脱氧二磷酸胸苷（dTDP），脱氧三磷酸胸苷（dTTP），脱氧二磷酸尿苷（dUMP），脱氧二磷酸尿苷（dUDP），脱氧三磷酸尿苷（dUTP），脱氧单磷酸胞苷（dCMP），脱氧二磷酸胞苷（dCDP）和脱氧三磷酸胞苷（dCTP）。该游离核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP或dCMP。该游离核苷酸优选三磷酸腺苷（ATP）。解旋酶辅助因子是使解旋酶或构建体发挥功能的因子。解旋酶辅助因子优选为二价金属阳离子。所述二价金属阳离子优选为Mg²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺或Co²⁺。解旋酶辅助因子最优选Mg²⁺。

实施例1

本实施例描述了对硫代磷酸核苷酸序列进行烷基化修饰后可以阻滞解旋酶运动。

如图1的引物A、B、C所示，分别采用乙基或是乙酰胺修饰硫代磷酸基团核苷酸链以及未烷基化修饰的硫代磷酸基团核苷酸链，并形成相应的互补链形式。

对于引物A而言，首先合成Seq-10T-P_S，其序列如TTTTT TTTTT*CGGTTTCGTCCGTCG所示，合成方法是先合成硫代磷酸引物，其中*处的核苷酸为胞嘧啶，其磷酸基团为硫代磷酸基团，再进行烷基化反应加上苯乙酰胺基（如图1中A示出，其中Ph表示苯乙酰胺基），其互补序列为Seq-com-1。

对于引物B而言，首先合成Seq-10T-P_S，其序列如TTTTT TTTTT *CGGTTTCGTCCGTCG所示，合成方法是先合成硫代磷酸引物，其中*处的核苷酸为胞嘧啶，其磷酸基团为硫代磷酸基团，再进行烷基化反应加上乙烷基（如图1中B示出，其中C₂H₅表示乙烷基），其互补序列为Seq-com-1。

对于引物C而言，首先合成Seq-10T-P_S，其序列如TTTTT TTTTT *CGGTTTCGTCCGTCG所示，合成方法是先合成硫代磷酸引物，其中*处的核苷酸为胞嘧啶，其磷酸基团为硫代磷酸基团（如图1中C示出），其互补序列为Seq-com-1。

Seq-10T-P_S：TTTTTTTTTT*CGGTT TCGTC CGTCG（SEQ ID NO：1）；

Seq-com-1：FAM-CGACG GACGA AACCG（SEQ ID NO： 2）。

将上述序列与其配对序列按照1:0.8的比例退火，在10μL的孵育体系中加入100nM的退火引物（如图1中的A、B和C所示），30×的ED1酶（其序列如SEQ ID NO：3所示）（稀释比例为1：30），2×孵育buffer（50mM KCl，20mM HEPES，pH7.0，1mM EDTA），30℃孵育1h后加入1000× TMAD，再30℃继续孵育30min，最后加入10mM ATP/Mg²⁺处理20min。对于A，B，C三种引物，分别将相应的退火双链（如图2中Lane1，4，7），酶孵育后形成的复合物（如图2中Lane2，5，8）及 ATP/Mg²⁺处理后的产物（如图2中Lane3，6，9）进行凝胶电泳。

T4 Dda -M1G/E94C/C109A/C136A/A360C：

SEQ ID NO：3

GTFDDLTEGQKNAFNIVMKAIKEKKHHVTINGPAGTGKTTLTKFIIEALISTGETGIILAAPTHAAKKILSKLSGKEASTIHSILKINPVTYECNVLFEQKEVPDLAKARVLICDEVSMYDRKLFKILLSTIPPWATIIGIGDNKQIRPVDPGENTAYISPFFTHKDFYQCELTEVKRSNAPIIDVATDVRNGKWIYDKVVDGHGVRGFTGDTALRDFMVNYFSIVKSLDDLFENRVMAFTNKSVDKLNSIIRKKIFETDKDFIVGEIIVMQEPLFKTYKIDGKPVSEIIFNNGQLVRIIEAEYTSTFVKARGVPGEYLIRHWDLTVETYGDDEYYREKIKIISSDEELYKFNLFLGKTCETYKNWNKGGKAPWSDFWDAKSQFSKVKALPASTFHKAQGMSVDRAFIYTPCIHYADVELAQQLLYVGVTRGRYDVFYV

如引物A所示，当使用苯乙酰胺修饰磷酸基团时，具有明显的阻滞效果。引物结构B（乙基修饰磷酸基团）也具有明显的阻滞效果，而硫代磷酸修饰，即引物结构C对ED1酶完全没有阻滞效果。

以上结果说明，在所述引物结构中，单链区相当于本发明所述的第一区段，可以用于结合ED1酶（多核苷酸结合蛋白），而具有苯乙酰胺或乙基修饰的多核苷酸区可以起到阻滞酶的作用。

实施例2

在实施例1的基础上，进一步尝试在磷酸基团上增加苯乙酰胺个数。按照实施例1的方法进行实验。

对于引物ds-2而言，首先合成Seq-10T-P_S_2，其序列如TTTTT TTTTT*C*GGTTTCGTC CGTCG所示，合成方法是先合成硫代磷酸引物，其中*处的核苷酸为胞嘧啶和鸟嘌呤，其磷酸基团为硫代磷酸基团，再进行烷基化反应加上两个苯乙酰胺，其互补序列为Seq-com-1。

对于引物ds-3而言，首先合成Seq-10T-P_S_3，其序列如TTTTT TTTTT*C*G*GTTTCGTC CGTCG所示，合成方法是先合成硫代磷酸引物，其中*处的核苷酸为胞嘧啶和2个鸟嘌呤，其磷酸基团为硫代磷酸基团，再进行烷基化反应加上三个苯乙酰胺，其互补序列为Seq-com-1。

对于引物Ds-4而言，首先合成Seq-10T-P_S_4，其序列如TTTTT TTTTT*C*G*G*TTTCGTC CGTCG所示，合成方法是先合成硫代磷酸引物，其中*处的核苷酸为胞嘧啶、2个鸟嘌呤和胸腺嘧啶，其磷酸基团为硫代磷酸基团，再进行烷基化反应加上四个苯乙酰胺，其互补序列为Seq-com-1。

将上述序列与其配对序列按照1:0.8的比例退火，在10μL的孵育体系中加入100nM的退火引物，30×的ED1酶（其序列如SEQ ID NO：3所示）（稀释比例为1：30），2×孵育buffer（50mM KCl，20mM HEPES，pH7.0，1mM EDTA），30℃孵育1h后加入1000× TMAD，再30℃继续孵育30min，最后加入10mM ATP/Mg²⁺处理20min。对于A，B，C三种引物，分别将相应的退火双链（如图3中Lane1，4，7），酶孵育后形成的复合物（如图3中Lane2，5，8）及 ATP/Mg²⁺处理后的产物（如图3中Lane3，6，9）进行凝胶电泳。

结果如图3所示，结果表明：随着磷酸基团上苯乙酰胺个数增加，结合多酶现象明显，所以阻滞解旋酶现象减弱，推测磷酸基团上苯乙酰胺修饰也具有结合解旋酶的能力。

实施例3

SEQ ID NO： 4 ATCCT TTTTA GAATT TTAGA GAT TTTTT TTTTT AGAGA TTCAGAGATT CAGAG ATTCA GAG

SEQ ID NO： 5 ATCTC TAAAA TTCTA AAAAG GAT

SEQ ID NO： 6 CTCTG AATCT CTGAA TCTCT GAATC TCTAG TCCAG CACCG ACC

SEQ ID NO： 7 GGTCG GTGCT GGACT

1. 接头结构的序列如下：

① Y1-S：5’-XXXXX XXXXX XXXXX XXXXX ATCCT TTTTA GAATT TTAGA GAT TTTTT TTTTT *AGAGA TTCAG AGATT CAGAG ATTCA GAG-3’，其中*A磷酸基团替换为苯乙酰胺修饰磷酸基团。

其中，Y1-S链依次包含前导序列，即iSpC3，表示为X，其连接到SEQ ID NO: 5的5′端。

② Y2-S：5’-ATCTC TAAAA TTCTA AAAAG GAT -3’

③ Y-Bottom-S：5’-P-CTCTG AATCT CTGAA TCTCT GAATC TCT AG TCCAG CACCG ACC -3’

④ Tether-S：5’-Chol-(iSpC3)20-GGTCG GTGCT GGACT-3’

其中Chol表示胆固醇，(iSpC3)20表示20个iSpC3组成的链。

使用以上序列，合成如图4（A）所示的接头。合成方法如下所示：将引物①、②、③按照 1:2.5:2.5 比例退火，引物退火终浓度为 4μM，退火程序 98℃ 10min；6s/-0.1℃，300× Cys；65℃，5min；6s/-0.1℃，400× Cys；12℃，Hold。

退火后的引物按照如下表 1 中的体系进行孵育。

表1：退火后的引物的孵育体系

将样品加入 1.5mL 低吸附离心管中（锡纸包裹避光），轻柔混匀（不可以使用涡旋震荡仪），放入 30℃金属浴 30min。最后，孵育后的产物进行磁珠纯化，获得结合解旋酶的复合物。

2. 使用合成的接头进行测序：

按照下表配制连接反应体系，瞬时离心，室温静置 10min。

表2：连接反应的体系：

将产物进行磁珠纯化，获得待测序的产物。

使用 QNome9604 测序平台，取 4 μL 浓度 1μM 的引物 ④加入到 200 μL测序buffer（600mM KCl、10mM HEPES pH8.0、3mM MgCl₂ 、3mM ATP）中，涡旋混匀，瞬时离心，将该混合液加入到测序芯片中静置 15min；然后取 40fmol 的上述制备好的接头加入到 200μL 测序 buffer 中，轻轻颠倒混匀，瞬时离心，将该混合液加入到测序芯片中静置 15min之后开始测序。

在 600mM KCl、10mM HEPES pH8.0、3mM MgCl₂ 、3mM ATP、35℃的条件下进行测试，信号采集过程中捕捉到的信号及部分放大图如图4（B）所示。从该图可以看到可获得完整的测序信号，说明在达到纳米孔进行测序之前，该修饰结构能够阻滞解旋酶在待测多核苷酸序列上的移动，直至当接头复合物与纳米孔接触，并在电压的作用下解除修饰结构的阻滞作用才开始沿着待测多核苷酸序列进行正常移动。从而达到获得完整测序信号的作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 北京齐碳科技有限公司

<120> 序列、包含序列的接头及其用途

<130> 21NI2699

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

tttttttttt cggtttcgtc cgtcg 25

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

cgacggacga aaaccg 16

<210> 3

<211> 439

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Gly Thr Phe Asp Asp Leu Thr Glu Gly Gln Lys Asn Ala Phe Asn Ile

1 5 10 15

Val Met Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys His His Val Thr Ile Asn Gly

20 25 30

Pro Ala Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Lys Phe Ile Ile Glu Ala

35 40 45

Leu Ile Ser Thr Gly Glu Thr Gly Ile Ile Leu Ala Ala Pro Thr His

50 55 60

Ala Ala Lys Lys Ile Leu Ser Lys Leu Ser Gly Lys Glu Ala Ser Thr

65 70 75 80

Ile His Ser Ile Leu Lys Ile Asn Pro Val Thr Tyr Glu Cys Asn Val

85 90 95

Leu Phe Glu Gln Lys Glu Val Pro Asp Leu Ala Lys Ala Arg Val Leu

100 105 110

Ile Cys Asp Glu Val Ser Met Tyr Asp Arg Lys Leu Phe Lys Ile Leu

115 120 125

Leu Ser Thr Ile Pro Pro Trp Ala Thr Ile Ile Gly Ile Gly Asp Asn

130 135 140

Lys Gln Ile Arg Pro Val Asp Pro Gly Glu Asn Thr Ala Tyr Ile Ser

145 150 155 160

Pro Phe Phe Thr His Lys Asp Phe Tyr Gln Cys Glu Leu Thr Glu Val

165 170 175

Lys Arg Ser Asn Ala Pro Ile Ile Asp Val Ala Thr Asp Val Arg Asn

180 185 190

Gly Lys Trp Ile Tyr Asp Lys Val Val Asp Gly His Gly Val Arg Gly

195 200 205

Phe Thr Gly Asp Thr Ala Leu Arg Asp Phe Met Val Asn Tyr Phe Ser

210 215 220

Ile Val Lys Ser Leu Asp Asp Leu Phe Glu Asn Arg Val Met Ala Phe

225 230 235 240

Thr Asn Lys Ser Val Asp Lys Leu Asn Ser Ile Ile Arg Lys Lys Ile

245 250 255

Phe Glu Thr Asp Lys Asp Phe Ile Val Gly Glu Ile Ile Val Met Gln

260 265 270

Glu Pro Leu Phe Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Pro Val Ser Glu

275 280 285

Ile Ile Phe Asn Asn Gly Gln Leu Val Arg Ile Ile Glu Ala Glu Tyr

290 295 300

Thr Ser Thr Phe Val Lys Ala Arg Gly Val Pro Gly Glu Tyr Leu Ile

305 310 315 320

Arg His Trp Asp Leu Thr Val Glu Thr Tyr Gly Asp Asp Glu Tyr Tyr

325 330 335

Arg Glu Lys Ile Lys Ile Ile Ser Ser Asp Glu Glu Leu Tyr Lys Phe

340 345 350

Asn Leu Phe Leu Gly Lys Thr Cys Glu Thr Tyr Lys Asn Trp Asn Lys

355 360 365

Gly Gly Lys Ala Pro Trp Ser Asp Phe Trp Asp Ala Lys Ser Gln Phe

370 375 380

Ser Lys Val Lys Ala Leu Pro Ala Ser Thr Phe His Lys Ala Gln Gly

385 390 395 400

Met Ser Val Asp Arg Ala Phe Ile Tyr Thr Pro Cys Ile His Tyr Ala

405 410 415

Asp Val Glu Leu Ala Gln Gln Leu Leu Tyr Val Gly Val Thr Arg Gly

420 425 430

Arg Tyr Asp Val Phe Tyr Val

435

<210> 4

<211> 61

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

atccttttta gaattttaga gatttttttt tttagagatt cagagattca gagattcaga 60

g 61

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

atctctaaaa ttctaaaaag gat 23

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

ctctgaatct ctgaatctct gaatctctag tccagcaccg acc 43

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

ggtcggtgct ggact 15

Claims

1.一种用于结合并阻滞多核苷酸结合蛋白的序列，其特征在于，所述序列包含第一区段和第二区段，所述第一区段用于结合所述多核苷酸结合蛋白，所述第二区段用于阻滞所述多核苷酸结合蛋白，其中所述第二区段包含多核苷酸，所述多核苷酸的磷酸基团被修饰，所述修饰减少了所述多核苷酸的净负电荷，从而实现了对所述多核苷酸结合蛋白的阻滞。

2.根据权利要求1所述的序列，其中所述修饰包括疏水性修饰；

3.根据权利要求2所述的序列，其中用于所述疏水性修饰的基团包括乙基、苯乙酰胺基中的任一种或两种。

4.根据权利要求1所述的序列，其中所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；

所述多核苷酸处理酶选自聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶中的一种或多种，

5.根据权利要求1至4中任一项所述的序列的制备方法，包括：

6.一种用于表征靶多核苷酸的接头，其中，所述接头包括用于引导所述接头进入纳米孔的第三区段和用于连接靶多核苷酸的第四区段，所述第三区段与所述第四区段之间插入权利要求1-4中任一所述序列；

7.一种用于表征靶多核苷酸的构建体，其中，所述构建体包含靶多核苷酸和权利要求6所述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

8.一种用于表征靶多核苷酸的复合物，其中，所述复合物包含权利要求6所述的接头或权利要求7所述的构建体，以及多核苷酸结合蛋白；

9.一种用于表征靶多核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)一个或多个如权利要求6所述的接头，(b)多核苷酸结合蛋白。

10.一种控制靶多核苷酸穿过纳米孔的移动的方法，包括：

I. 提供权利要求8所述复合物；

II. 将所述复合物与纳米孔接触；以及

III. 跨所述孔施加电势，使得所述多核苷酸结合蛋白移动穿过所述第二区段，并控制所述靶多核苷酸穿过所述孔的移动。

11.一种表征靶多核苷酸的方法，包括：

1）使用如权利要求10所述的方法，使靶多核苷酸穿过纳米孔移动；以及

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述靶多核苷酸包括脱氧核糖核酸和/或核糖核酸；和/或

所述多核苷酸的至少一部分是双链的；和/或

13.一种控制一个或多个多核苷酸结合蛋白在目标多核苷酸上加载的方法，包括：

a．提供插入有一个或多个如权利要求1至4中任一项所述的序列的目标多核苷酸；以及