CN113063946B - 一种dna纳米机器及其在降低血糖中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种DNA纳米机器，包括由核苷酸序列构成的感受器和执行器，所述感受器中含有用于与葡萄糖分子结合的核苷酸链R链，还包含核苷酸链Hs链和用于封闭Hs链的封闭链Bs链，所述执行器中包含用于与所述感受器中的Hs链共同作用而执行一定功能的核苷酸链Ha链和用于封闭Ha链的封闭链Ba链，所述Hs链和Ha链能够部分链段碱基配对，因而能结合形成二聚体结构，而所述封闭链Bs链和封闭链Ba链均相应解离。本发明所述DNA纳米机器在体内响应高血糖而不响应低糖，只有体内高血糖时方具备降糖功能，避免了胰岛素治疗过程中出现的低血糖的风险。该DNA纳米机器具有智能、高效、稳定以及低毒等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学和医学领域，具体涉及一种DNA纳米机器及其在降低血糖中的应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，常导致严重的继发性并发症，影响全世界4.25亿人。2型糖尿病占糖尿病患者的90％以上，胰岛素抵抗是2型糖尿病的典型特征之一，即由于各种原因导致胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率降低。胰岛素治疗是目前糖尿病治疗的主要方法，然而，胰岛素治疗存在一定的缺陷与风险。首先，胰岛素生产存在一定的批次间差异，并且稳定性较差，其次，糖尿病治疗通常涉及每日监测血糖水平和多次皮下注射或输液，以调整允许剂量的安全性和有效性。最后，目前胰岛素治疗的选择仍然受到低血糖风险的限制，血糖控制效果较差。因此，目前的治疗需要开发一种稳定性较好且能智能动态调节血糖的方法。
DNA是纳米材料和生物技术中一个强大的构建单元。DNA可以通过成熟的固相合成方法进行化学合成，在合成可扩展性和成本效益方面，与胰岛素的生物生产相比具有一定优势。此外，与胰岛素相比，DNA具有很高的热稳定性，其热变性是可逆的。并且由于DNA的可编程性和低免疫原性使其具有精确设计和应用的方便性。筛选的具有高亲和力和靶向性的DNA序列在生物传感和治疗方面具有很大的潜力。目前，DNA已被应用于通过设计DNA特制的表面受体来非遗传调节细胞功能。
因此，本领域需要一种由DNA材料构成的用于治疗糖尿病的DNA纳米机器。
发明内容
现有研究表明肝细胞生长因子能够刺激脂肪细胞、骨骼肌细胞和肝脏细胞的葡萄糖摄取与代谢，能够治疗糖尿病。目前，肝细胞生长因子受体的特异性靶向结合DNA序列已经通过SELEX筛选得到。该靶向DNA序列与肝细胞生长因子受体具有较高的亲和力。并且能够替代肝细胞生长因子诱导其受体二聚，促进细胞的增殖和迁移。
为避免目前胰岛素治疗存在的一些问题，本发明构建了一种DNA纳米机器，其具有智能感应葡萄糖水平的能力，并且在高血糖状态下具有降糖效果。本发明为糖尿病治疗提供了一种新思路。
本发明首先提供一种DNA纳米机器，包括由核苷酸序列构成的感受器和由核苷酸序列构成的执行器，所述感受器用于感受血糖水平，所述执行器用于执行调节血糖功能，所述感受器中含有用于与葡萄糖分子结合的核苷酸链R链，还包含核苷酸链Hs链和用于封闭Hs链的封闭链Bs链，所述执行器中包含用于与所述感受器中的Hs链共同作用而执行一定功能的核苷酸链Ha链和用于封闭Ha链的封闭链Ba链，所述Hs链和Ha链能够部分链段碱基配对，因而能结合形成二聚体结构，而所述封闭链Bs链和封闭链Ba链均相应解离；所述R链、Hs链和Ha链的序列分别如下，
R链：CTCTCGGGACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTCGTCCC；
Hs链：GGTCGTCCCGAGAGACAGTCATTGAATAGCCGTGTCACGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAGTGACACG；
Ha链：ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATGCTATTCAATGACTGTCTCTCGG。
本发明中，R链、Hs链与Bs链通过部分碱基互补配对结合形成感受器，所述感受器简称为S链，所述Ha链和Ba链同样通过部分碱基互补配对结合形成执行器，所述执行器简称为A链，所述DNA纳米机器因而简称为AS。
在一种具体的实施方式中，所述封闭链Bs链和封闭链Ba链的碱基个数均为8～24个，优选16个。
在一种具体的实施方式中，所述DNA纳米机器中Hs链：Bs链：R链的摩尔比例为1：1～3：0.8～1.6，优选1：2：1，所述DNA纳米机器中Ha链：Ba链的摩尔比例为1：1～3，优选1：2。
在一种具体的实施方式中，所述Bs链和Ba链的序列分别如下，
Bs链：GCTATTCAATGACTGT；
Ba链：ACAGTCATTGAATAGC。
本发明中，所述核苷酸序列均为5’端至3’端的序列。
在一种具体的实施方式中，所述R链、Hs链和Bs链配置在HEPES缓冲液中，在93～97℃下退火3～7min后冷却得到所述感受器；所述Ha链和Ba链配置在HEPES缓冲液中，在93～97℃下退火3～7min后冷却得到所述执行器；优选所述HEPES缓冲液中还含有NaCl、MgCl2和KCl；优选在冰箱中分别冷藏得到的感受器溶液和执行器溶液。
在一种具体的实施方式中，与所述R链、Hs链、Bs链、Ha链和Ba链的序列中的任一序列具有60％以上同源性的一条或多条核苷酸序列，优选同源性在80％以上，更优选同源性在90％以上；或能与所述R链、Hs链、Bs链、Ha链和Ba链的序列中的任一序列进行杂交的一条或多条核苷酸序列。
在一种具体的实施方式中，所述核苷酸链或核苷酸序列中的核苷酸分子上修饰有功能基团、纳米材料和/或蛋白类材料；优选所述功能基团包括硫代修饰、甲氧基修饰以及氟代修饰中的一种或多种，所述纳米材料包括磁性颗粒、荧光颗粒、纳米药物、生物素和纳米高分子聚合物中的一种或多种，所述蛋白类材料包括多肽和酶中的一种或多种。
本发明还提供一种药物组合物，包括如上任意一项所述的DNA纳米机器或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种如上所述的DNA纳米机器在降低血糖中的应用，或者所述的DNA纳米机器在调控细胞糖摄取的试剂或调控细胞糖释放的试剂中的应用。
本发明还提供一种如上所述的二聚体结构在降低血糖中的应用，或者所述的二聚体结构在调控细胞糖摄取的试剂或调控细胞糖释放的试剂中的应用。
本发明中，该二聚体结果注入体内后，也可以起到降糖效果。但与DNA纳米机器相比，该二聚体不具有响应葡萄糖含量水平的特点，也就是说，不管体内血液中葡萄糖含量水平低还是高，该二聚体结构都会产生降糖效果。可见本发明提供的二聚体结构同样也属于一种降糖药物。一般情况下，无论是DNA纳米机器，还是二聚体结构，都是以溶液形式通过尾静脉注射的方式注入动物体内。此外，不管是体内还是体外，只要所述DNA纳米结构所处环境中葡萄糖含量水平高于10mmol/L，则所述DNA纳米结构都能形成所述二聚体结构。
本发明至少具有如下有益效果：
1)本发明提供的所述DNA纳米机器，其感受器和执行器都是通过体外组装而成，在体外组装时，所述核苷酸序列能自主折叠形成二级结构和三级结构，其结构具有较好的稳定性，且不具有毒副作用。
2)本发明公开了一种智能监测并降低血糖的DNA纳米机器。本发明的智能DNA纳米机器包括感应血糖水平的感受器以及执行调节血糖功能的执行器。本发明所述DNA纳米机器在体内响应高血糖而不响应低糖，只有体内高血糖时方具备降糖功能，避免了胰岛素治疗过程中出现的低血糖的风险。该DNA纳米机器具有智能、高效、稳定以及低毒等优点。
附图说明
图1为本发明所述的DNA纳米机器结构图及其形成二聚体原理图。
图2为通过NUPACK模拟所得的Hs链和Ha链的二级结构图。
图3为智能DNA纳米机器在24h和48h以及在不同浓度下对肝细胞LO2和肌肉细胞C2C12的MTT比色法实验结果图。
图4为智能DNA纳米机器促进葡萄糖摄取的结果图。
图5为智能DNA纳米机器在STZ-诱导的糖尿病小鼠的腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)的结果图。
图6为智能DNA纳米机器在STZ-诱导的糖尿病小鼠的腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)的降糖速率的结果图。
图7为智能DNA纳米机器对正常血糖小鼠的影响结果图。
图8为智能DNA纳米机器对高血糖小鼠的影响结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
图1为本发明所述的DNA纳米机器结构图及其形成二聚体原理图。
图1中，箭头左边为DNA纳米机器结构图。图1整体的原理图表明：基于DNA介导的葡萄糖诱导二聚反应，通过葡萄糖分子诱导链置换反应产生DNA二聚体(Ha/Hs)，该二聚体的结构体现在反应式的右边，此外，反应式右边还包括解离下来的封闭链Bs链和Ba链。
具体的，所述感受器由Hs，Bs，R链组成，分别为80，16，51个碱基，其中R链是靶向葡萄糖的特异性DNA序列；执行器由Ha，Ba链组成，Ha为73个碱基，Ba为16个碱基；Ba和Bs链起封闭作用。通过NUPACK模拟Hs和Ha链的二级结构，如图2所示。图2中直链代表Hs和Ha链中本身互补配对的链段，而环状结构代表Hs和Ha链中本身不能内部互补配对的链段。Hs和Ha链中均有一段内部互补配对的链，也均有一段用于与别的核苷酸链配对的链。
血糖值对于治疗疾病和观察疾病有着指导意义，血糖正常是指人空腹的时候血糖值在3.9～6.1mmol/L并且餐后两小时血糖不超过7.8mmol/L，空腹全血血糖超过7.0mmol/L或者餐后两小时血糖超过11.1mmol/L是糖尿病。靶向葡萄糖的特异性DNA序列(R链)的Kd值为10mmol/L，符合高血糖状态下引发链置换反应，低血糖不响应的要求，这避免了低血糖风险。
本发明中，所述Hs链和Ha链结合形成二聚体结构后，则信号已经激活，细胞外的血糖就会进入细胞内，开始形成糖原，降低血糖。本发明中的感受器感应葡萄糖的浓度，若血糖含量高，则会形成二聚体结构，并控制葡萄糖被摄取到胞内，以在细胞内(肝细胞或肌细胞内)形成糖原等方式降血糖。因此，本发明提供了一种不打胰岛素，不吃降糖药(例如“二甲双胍”等现有降糖药)，以感应血糖浓度来控制血糖的“以糖控糖”的糖尿病治疗新策略。
本发明中，体内的二聚体结构也最终能像其他核酸一样被人体消化代谢，因此，不具有毒副作用。
目标分子如图1所示，本发明在体内形成的所述二聚体结构能靶向肝细胞生长因子受体，从而促进葡萄糖从细胞外摄取进入细胞内，形成肌糖原或肝糖原。
以下为具体实施例。
本发明的智能DNA纳米机器由感应血糖水平的感受器DNA和执行调节血糖功能的执行器DNA组成。感受器的R链是用于与葡萄糖结合的特异性DNA序列，Ba和Bs均为包含16个碱基的封闭链。当加入的葡萄糖与R链结合时，由于Ha/Hs的亲和力更高，Ba和Bs链会解离，Ha和Hs形成二聚体结构。
感受器和执行器的制备：感受器和执行器均由1×HEPES(20mmol/L HEPES,1000mmol/L NaCl,10mmol/L MgCl2,5mmol/L KCl,pH＝7.5)的缓冲液配置，HEPES为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。感受器的缓冲液中含有R链、Hs链、Bs链三种单链，执行器的缓冲液中含有Ha链和Ba链两种单链，感受器的缓冲液和执行器的缓冲液分别在95℃退火5min后冷却至室温，二者均形成稳定的杂交结构，分别放置于4℃冰箱保存。后续DNA纳米机器的感受器和执行器在应用时，共同称为AS。
使用DNA纳米机器进行MTT测试：MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。具体地，分别取肝细胞LO2和肌肉细胞C2C12，用含10％胎牛血清的培养基配成单细胞悬液，计数以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul，贴壁后加入不同浓度的AS(5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L和200nmol/L)，于24h、48h进行测定，在测定前加入20ul的5％MTT，孵育4h后，每孔加入150ul DMSO于摇床室温溶解10min，在酶标仪上490nm波长测定各孔吸收值，记录结果并计算细胞活力。结果如图3所示，可见AS对正常细胞基本不具有毒副作用。其中，图3a为肝细胞LO2的相对细胞活力，图3b为肌肉细胞C2C12的相对细胞活力。
使用DNA纳米机器进行葡萄糖摄取检测：将50nmol/L的AS刺激肝细胞LO2，通过2-DG(即2-脱氧-D-葡萄糖)检测葡萄糖摄取的方法实时监测细胞的葡萄糖摄取情况，该方法能产生荧光，结果如图4所示。图4a中横坐标表示是否添加葡萄糖和是否添加AS，“-”代表不添加相应物质，“+”代表添加相应物质，数字代表添加的相应葡萄糖的浓度，纵坐标为荧光值。图4a为单次定量实验的结果图，图4b为实时动态监测图。图4a的前三组试验为对照组，都没有同时加入AS和葡萄糖，而第4～6组都同时加入AS和葡萄糖，且第4～6组葡萄糖添加量分别为5mmol/L、10mmol/L和15mmol/L。图4b中最上方曲线为图4a中第6组实验的实时动态结果图，向下依次为图4a中第5组、第4组和三个对照组实验的实时动态结果图。从图4可见，当葡萄糖浓度达到糖尿病水平时，AS能够促进葡萄糖摄取，从而降低血糖，在葡萄糖浓度低的时候基本不响应。因此，该智能DNA纳米机器具有在高糖响应而在低糖不响应的降糖功能。
体内实验：为了进一步探究AS具有一定的降糖效果，以20g/只的雄性C57/B6黑鼠建立链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型。当空腹血糖浓度>11.1mmol/L时证明建模成功。在建模成功的糖尿病小鼠中随机将其分为两组：对照组和注射0.5nmol/只AS的剂量组，每组5只，分组后分笼饲养。建模成功且糖尿病小鼠血糖稳定后进行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)对AS的降糖效果进行测试。实验前过夜禁食16h，禁食期间，小鼠保持正常的饮水。
实验结果：如图5所示，AS在30min后发挥作用，相比于对照组(即注射生理盐水)能够快速使血糖下降。其中，图5a的纵坐标为血糖值。从图5a可见，在30min后AS组比对照组的血糖水平明显下降显著。图5b为计算0～120min内的AS组和对照组的血糖值曲线面积，更能明确表示AS组和对照组相比的降糖总量效果，其中面积越小说明降糖效果越好。图5b的纵坐标为血糖值曲线面积。另外，通过计算降糖速率得到图6。图6中横坐标表示对照组和AS组，纵坐标表示降糖速率。图6表明AS的降糖速率比对照组快。因此，AS具有一定的降糖效果。
图7和图8分别为智能DNA纳米机器对正常血糖和对高血糖小鼠的影响结果图。在小鼠血糖值低于10mmol/L时，注射AS链(即注射DNA纳米机器)，1h后测量血糖，如图7所示，血糖值基本不变。当小鼠血糖值高于10mmol/L时，注射AS链，1h后测量血糖，如图8所示，血糖值明显降低。因此，体内实验也表明该智能DNA纳米机器具有在高糖响应而在低糖不响应的降糖功能。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种DNA纳米机器，包括由核苷酸序列构成的感受器和由核苷酸序列构成的执行器，所述感受器用于感受血糖水平，所述执行器用于执行调节血糖功能，所述感受器中含有用于与葡萄糖分子结合的核苷酸链R链，还包含核苷酸链Hs链和用于封闭Hs链的封闭链Bs链，所述执行器中包含用于与所述感受器中的Hs链共同作用而执行一定功能的核苷酸链Ha链和用于封闭Ha链的封闭链Ba链，所述Hs链和Ha链能够部分链段碱基配对，因而能结合形成二聚体结构，而所述封闭链Bs链和封闭链Ba链均相应解离；所述R链、Hs链、Ha链、Bs链和Ba链的序列分别如下，
R链：CTCTCGGGACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTCGTCCC；
Hs链：GGTCGTCCCGAGAGACAGTCATTGAATAGCCGTGTCACGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAGTGACACG；
Ha链：ATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATGCTATTCAATGACTGTCTCTCGG；
Bs链：GCTATTCAATGACTGT；
Ba链：ACAGTCATTGAATAGC。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米机器，其特征在于，所述DNA纳米机器中Hs链：Bs链：R链的摩尔比例为1：1~3：0.8~1.6，所述DNA纳米机器中Ha链：Ba链的摩尔比例为1：1~3。
3.根据权利要求1所述的DNA纳米机器，其特征在于，所述R链、Hs链和Bs链配置在HEPES缓冲液中，在93~97℃下退火3~7min后冷却得到所述感受器；所述Ha链和Ba链配置在HEPES缓冲液中，在93~97℃下退火3~7min后冷却得到所述执行器。
4.根据权利要求3所述的DNA纳米机器，其特征在于，所述HEPES缓冲液中还含有NaCl、MgCl2和KCl；且在冰箱中分别冷藏得到的感受器溶液和执行器溶液。
5.根据权利要求1所述的DNA纳米机器，其特征在于，所述核苷酸链或核苷酸序列中的核苷酸分子上修饰有功能基团、纳米材料和/或蛋白类材料；且所述功能基团包括硫代修饰、甲氧基修饰以及氟代修饰中的一种或多种，所述纳米材料包括磁性颗粒、荧光颗粒、纳米药物、生物素和纳米高分子聚合物中的一种或多种，所述蛋白类材料包括多肽和酶中的一种或多种。
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