CN110124047B - 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法,包括将至少一条单链DNA和疏水性药物分子通过共价键连接形成共价连接产物;将共价连接产物和剩余的单链DNA加入含有镁离子的第一缓冲液中进行反应,组装成DNA纳米结构和疏水性药物分子的复合物,剩余的单链DNA与共价连接产物的单链DNA自组装形成具有锁的DNA纳米结构,疏水性药物分子被锁在DNA纳米结构的内侧;提供钥匙,所述钥匙与所述锁配合以使得疏水性药物分子从所述纳米结构暴露,从而提供DNA纳米机器人载药体系。本发明还提供由此得到的DNA纳米机器人载药体系。本发明用于活细胞内药物分子的靶向输送和可控释放,在重大疾病的智能诊疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地涉及一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA纳米机器人载药体系。
背景技术
2016年诺贝尔化学奖授予Bernard L.Feringa,Jean-Pierre Sauvage和J.FraserStoddart三位教授,以表彰他们在分子机器领域的杰出贡献。分子机器是由一系列分子结构基元组装而成的,在外部刺激下可以产生机械运动的分子设备。其中由核酸或蛋白组装形成的智能分子机器因其独特的拓扑结构、动态变化特性以及丰富的外部刺激来源,在肿瘤诊断和治疗中展现出独特的优势。
DNA不仅可以作为遗传信息的载体,由DNA分子经碱基互补配对形成的自组装DNA纳米结构是一类具有精确结构和尺寸的纳米生物材料,同时具备多个化学反应位点、手性性质等特点,在众多领域都有广泛的应用前景。研究表明,DNA纳米结构生物安全性好,细胞摄取效率高,并且可以被动靶向至肿瘤细胞,是良好的药物转运载体。而由DNA分子精确自组装形成的DNA纳米结构在制备智能纳米机器中应用广泛。这些纳米机器可感知外源刺激或环境因子变化,实现实时细胞内传感、细胞成像和智能药物转运。除细胞外的应答,也已证实了DNA纳米机器可在细胞内应用。
目前,DNA纳米结构荷载药物分子多通过嵌入DNA双螺旋或物理吸附的方式,经细胞摄取后进入溶酶体。随后,在溶酶体内发生DNA纳米结构的降解并释放药物分子。然而在细胞内将药物完全释放所需时间较长,并且释放过程难以控制。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的DNA纳米结构作为药物载体时无法控制释放过程的问题,本发明提供一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA纳米机器人载药体系。
本发明提供一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法,包括以下步骤:S1,提供多条单链DNA和疏水性药物分子,将至少一条单链DNA和疏水性药物分子通过共价键连接形成共价连接产物;S2,将共价连接产物和剩余的单链DNA加入含有镁离子的第一缓冲液中进行反应,基于Watson-Crick原理有序组装成DNA纳米结构和疏水性药物分子的复合物,其中,剩余的单链DNA与共价连接产物的单链DNA自组装形成具有锁的DNA纳米结构,其中,疏水性药物分子被锁在DNA纳米结构的内侧;S3,提供钥匙,所述钥匙与所述锁配合以使得疏水性药物分子从所述纳米结构暴露,从而提供DNA纳米机器人载药体系。
应该理解,疏水性药物分子与单链DNA的共价连接位点应该在设计阶段进行筛选,以确保其在步骤S2中位于DNA纳米结构的内侧。
优选地,所述锁为位于单链DNA上的锁链,所述钥匙为单独的钥匙链,所述钥匙链和所述锁链为可杂交的DNA序列。在优选的实施例中,所述钥匙链与所述锁链杂交发生链取代反应,可以将六螺旋完全打开形成两个三螺旋结构,暴露出六螺旋结构的内腔,从而使连接的疏水性药物分子发挥作用。
优选地,所述锁为位于单链DNA上的与ATP分子结合的适配体序列,所述钥匙为小分子ATP。在优选的实施例中,所述小分子ATP与所述适配体序列杂交,可以将六螺旋的一侧打开,暴露出六螺旋结构的内腔,从而使连接的疏水性药物分子发挥作用。所述单链DNA上还具有与该适配体序列互补的DNA序列。
优选地,所述锁为位于单链DNA上的与核仁素蛋白分子结合的适配体序列,所述钥匙为核仁素蛋白。在优选的实施例中,所述核仁素蛋白与所述适配体序列杂交,可以将六螺旋的一侧打开,暴露出六螺旋结构的内腔,从而使连接的疏水性药物分子发挥作用。所述单链DNA上还具有与该适配体序列互补的DNA序列。
优选地,所述第一缓冲液为含有氯化镁或醋酸镁的缓冲液。在一个优选的实施例中,该第一缓冲液为含有5-125mmol/L氯化镁或醋酸镁的缓冲液。应该理解,该第一缓冲液用于中和核酸的负电荷,更有利于自主装过程中的DNA杂交。
优选地,共价连接产物、剩余的单链DNA和第一缓冲液组成的混合溶液进行退火处理。具体地,将混合溶液在95℃进行热变性,再缓慢过夜降至室温完成整个退火过程。
优选地,所述步骤S1具体包括:提供多条单链DNA和带有功能基团的疏水性药物分子,其中,至少一条单链DNA为功能化单链DNA;将功能化单链DNA溶于水中形成单链DNA水溶液,将疏水性药物分子溶于有机溶剂中形成疏水性药物分子溶液;将单链DNA水溶液与疏水性药物分子溶液加入第二缓冲液中进行反应,使得功能化单链DNA与疏水性药物分子的功能基团发生偶联反应形成共价键,以得到单链DNA和疏水性药物分子的共价连接产物。
优选地,所述单链DNA的序列的长度介于1-120bp之间。应该理解,其他长度的单链DNA同样可以用在本发明中。
优选地,发生偶联反应的反应温度为25-50℃,反应时间为2-24小时。
优选地,所述功能化单链DNA选自以下单链DNA中的至少一种:羧基修饰单链DNA、氨基修饰单链DNA、巯基修饰单链DNA、叠氮基修饰单链DNA、炔基修饰单链DNA、SMCC修饰单链DNA、或硫代磷酸化单链DNA。
优选地,所述功能化单链DNA通过在单链DNA的3’端、5’端、和/或链内修饰至少一个官能团制备得到。
优选地,剩余的单链DNA为非功能化单链DNA。应该理解,提供的多条单链DNA中的每条单链DNA也可以均为功能化单链DNA,其同样通过自组装形成DNA纳米结构。
优选地,DNA纳米结构为一维、二维、或三维结构。一维DNA纳米结构可以是空心DNA纳米管、实心DNA纳米线。二维DNA纳米结构可以是以长方形、笑脸为代表的对称结构和以中国地图为代表的非对称结构。三维DNA纳米结构可以是四面体、多面立方体、长方体、乐高积木、以花瓶为代表的三维曲率折纸,例如六螺旋结构。优选地,DNA纳米结构的尺寸介于1-1000纳米之间。
优选地,所述疏水性药物分子选自以下药物小分子中的至少一种:美登素、卡奇霉素、奥斯他汀、多卡米星、或蒽环类药物。
优选地,所述疏水性药物分子的功能基团选自以下基团中的至少一种:羧基、氨基、巯基、叠氮基、炔基、SMCC、或硫代磷酸基团。
优选地,所述共价键选自以下化学键中的至少一种:酰胺键、磷脂键、或咪唑键。
优选地,所述有机溶剂选自以下溶剂中的至少一种:甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、或二甲基甲酰胺。
优选地,所述第二缓冲液选自以下缓冲液中的至少一种:磷酸盐缓冲液、Tris-HCl、HEPES、TAE-Mg、或TBE。应该理解,缓冲液被用来将反应体系维持在略碱性的环境下。例如,磷酸盐缓冲液将反应体系维持在碱性pH7.2下。通常,该反应体系被维持在pH6.5-7.5的条件下以确保偶联反应的进行,同时避免反应物发生竞争反应。
本发明还提供上述的方法得到的DNA纳米机器人载药体系,其中,该DNA纳米机器人载药体系包括由DNA纳米结构和疏水性药物分子共价连接的复合物。
本发明的DNA纳米结构具有高度的空间可寻址性,可以精确控制药物分子的载带数目,无需反复进行产品试验;DNA纳米结构稳定性高、生物安全性好,是一种良好的药物转运载体。而且,本发明制备的智能DNA纳米机器人载药体系,可以实现药物分子在靶向位点的可控释放。总之,本发明构建了一种智能DNA纳米机器人体系用于活细胞内药物分子的靶向输送和可控释放,在重大疾病的智能诊疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是根据本发明的一个优选实施例的一种智能DNA纳米机器人载药体系在活细胞内运行的工作原理示意图;
图2a是以DNA单链为钥匙的DNA纳米机器人的序列设计图;
图2b是图2a对应的示意图;
图3a是以ATP为钥匙的DNA纳米机器人的序列设计图;
图3b是图3a对应的示意图;
图4a是以核仁素为钥匙的DNA纳米机器人的序列设计图;
图4b是图4a对应的示意图;
图5是加钥匙链后6HB-key strands的电泳表征图;
图6是加钥匙链前后6HB-key strands的原子力显微镜表征图;
图7是加钥匙链前后6HB-key strands-FRET的荧光光谱图;
图8是加钥匙链后FRET效率变化的时间动力学表征;
图9a-图9c分别是ssDNA、S-ssDNA和6HB-key strands在RPMI 1640培养基中的稳定性表征,在每个胶图中,条带1是DNA marker,条带2是未与培养基孵育的DNA样品,条带3-10依次是2uL DNA样品与8uL培养基孵育0min,30min,1h,2h,3h,6h,12h,24h;
图9d是对图9a-图9c中的条带的灰度值计算,得到DNA样品稳定性的定量变化;
图10a-图10d分别是激光共聚焦显微镜拍摄的MCF-7细胞对ssDNA,S-ssDNA,3HB和6HB的细胞摄取;
图11是流式细胞仪统计MCF-7细胞对ssDNA,S-ssDNA,3HB和6HB的摄取量;
图12是激光共聚焦显微镜拍摄的钥匙链和6HB在细胞内的定位,以及两种材料的共定位分析;
图13a是激光共聚焦显微镜拍摄的有无钥匙链的6HB-key strands在MCF-7细胞内的FRET效果;
图13b是分别对10个细胞FRET效率的统计结果;
图14是有无ATP分子时6HB-ATP结构的细胞外光谱图;
图15a是6HB-ATP和6HB-key strands在MCF-7细胞内的成像情况;
图15b是分别对10个细胞FRET效率的统计结果;
图16是有无核仁素蛋白时6HB-NCL结构的细胞外光谱图;
图17a是6HB-NCL和6HB-key strands在MCF-7细胞内的成像情况;
图17b是分别对10个细胞FRET效率的统计结果
图18a是单链DNA连接DM1的示意图;
图18b是DNA单链连接DM1后的电泳表征,其中条带1为20bp DNA marker,条带2为DNA,条带3为DNA-DM1;
图18c是DNA-DM1的质谱表征;
图18d是高效液相色谱对DNA-DM1和DM1的水溶性表征;
图19是6HB装载DM1后的电泳表征图,其中条带1为20bp DNA marker,条带2为6HB,条带3为6HB-DM1;
图20a是有无钥匙链时,加入6HB-key strands-DM1后SK-BR-3细胞的存活率比较的MTT结果;
图20b是图20a对应的激光共聚焦结果。
具体实施方式
下面结合附图,给出本发明的较佳实施例,并予以详细描述。
如图1所示,根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的基本原理包括:在体外构建DNA纳米结构载药体系,然后该载药体系经内吞作用被摄取进入活细胞内部,随后加入钥匙链,在细胞内将六螺旋DNA纳米结构打开并释放药物分子,最终观察到该细胞的凋亡。
例1以DNA单链为钥匙的智能DNA纳米机器人的活细胞内运行
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法首先包括提供多条单链DNA。
在本实施例中,由上海生工公司合成20条寡核苷酸序列,其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:1-SECQ ID NO:20所示,其中,SECQ ID NO:7的3’端具有5个碱基的第一锁链GGGCG,SECQ ID NO:8的3’端具有5个碱基的第二锁链CGGCC,SECQ ID NO:17的3’端具有5个碱基的第三锁链TTGGA,SECQ ID NO:18的3’端具有5个碱基的第四锁链CGTTAT。
具体地,从5’端到3’端,
SECQ ID NO:1(6-HB-1):
CAGTTGACTGCTAGTACCTGAGCACTGAATGCGATGTAGAAGTAGCTCTGCTCCATC;
SECQ ID NO:2(6-HB-2):
CGACTTGATGGAGCAGACCTATCGTCAC;
SECQ ID NO:3(6-HB-3):
AGGCAGATACGAAGAGCGAGGCTATGTCGTAGATAGTTCTCGCACGACGCTAGACAC
SECQ ID NO:4(6-HB-4):
GCAGTCAACTG
SECQ ID NO:5(6-HB-5):
CGGTACGTGACGATAGGACACATCAGATGTCTTAGGAGAGGTCACAGTAACCTTCGACAATCT
SECQ ID NO:6(6-HB-6):
AGATTGTCGAACGTATCTGCCT
SECQ ID NO:7(6-HB-7):
GAACTATGACATCTGATGTGTGCTACTTGTCACCAGGGCG
SECQ ID NO:8(6-HB-8):
CGCTCTTGGTTACTGTGACCTGTGCTCACGAGGACCGGCC
SECQ ID NO:9(6-HB-9):
GCATTCACTCCTAACTACGAC
SECQ ID NO:10(6-HB-10):
TCTAGCGTGTCTAGCGT
SECQ ID NO:11(6-HB-11):
TGTCCGTGCAACCGATCAATCC
SECQ ID NO:12(6-HB-12):
GCCTAGCGATCCAATGGAACGACCGTATTGCTGAGGTGAGTGTATGTATCACTTGCACGGACA
SECQ ID NO:13(6-HB-13):
CTGTACCGTTG
SECQ ID NO:14(6-HB-14):
GGATTGATCGGATGCCAGACGCATCGGATTCGATGAGCCTACTCGACCAACTCAACG
SECQ ID NO:15(6-HB-15):
GGCAATGTCCACCATTGGATCG
SECQ ID NO:16(6-HB-16):
CAACGGTACAGTGGTGACTCCAACCTTGTAACGTCCTCGATAACGCTGGACATTGCC
SECQ ID NO:17(6-HB-17):
GGAGGCGTGCGACTGGCATGTGATACATACACTGGTTGGA
SECQ ID NO:18(6-HB-18):
GGATGATAGCCTGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
SECQ ID NO:19(6-HB-19):
GTTACAACACCTCACGAATCC
SECQ ID NO:20(6-HB-20):
GCACCACGTTGAGTTGG
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法接下来包括将多条单链DNA加入含有镁离子的缓冲液中进行反应,基于Watson-Crick原理有序组装成DNA纳米结构。
在本实施例中,将核苷酸序列分别为SECQ ID NO:1-SECQ ID NO:20的单链DNA进行自组装以形成六螺旋DNA纳米结构(6-helix bundle,6-HB),也被称为钥匙链开关的6-HB(6-HB-key strands)。具体地,每条DNA单链以1μmol/L(即1uM)的终浓度混合于合成缓冲液(40mM Tris,20mM醋酸,2mM EDTA,125mM醋酸镁,pH 8.0)中,终体积为100μL。将混合好的溶液置于DNA低吸附管,使其悬浮于95℃热水中,缓慢过夜降温至25℃,而后取出备用。此时6-HB的终浓度为1uM。
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法接下来包括提供至少一条钥匙链。
在本实施例中,由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列,其核苷酸序列分别如SECQID NO:21-SECQ ID NO:24所示,其中,SECQ ID NO:21为第一钥匙链,其与核苷酸序列为SECQ ID NO:7的第一锁链GGGCG适配;SECQ ID NO:22为第二钥匙链,其与核苷酸序列为SECQ ID NO:8的第二锁链CGGCC适配;SECQ ID NO:23为第三钥匙链,其与核苷酸序列为SECQ ID NO:17的第三锁链TTGGA适配;SECQ ID NO:24为第四钥匙链,其与核苷酸序列为SECQ ID NO:18的第四锁链CGTTAT适配。
具体地,从5’端到3’端,
SECQ ID NO:21(key-cstr7):
CGCCCTGGTGAC
SECQ ID NO:22(key-cstr8):
GGCCGGTCCTCG
SECQ ID NO:23(key-cstr17):
GCGGGGATGTAG
SECQ ID NO:24(key-cstr18):
GCGCGTAGTACC
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法接下来包括提供使钥匙链与DNA纳米结构发生链取代反应。
在本实施例中,在6-HB的溶液中,分别加入4倍摩尔浓度的第一钥匙链、第二钥匙链、第三钥匙链和第四钥匙链,37℃孵育30min可将6-HB打开形成3HB,即三螺旋DNA纳米结构。
6%PAGE表征6-HB的合成以及打开效果
配置6%的PAGE分离胶(40%Acr-Bis,0.9mL;超纯水,4.5mL;10×TAE缓冲液,0.6mL;10%APS,60uL),待胶凝好后置于1×TAE缓冲液中,将6-HB和3HB分别与6×上样缓冲液按体积5:1混合均匀,上样,用DL2000的DNA marker,100V室温电泳90min,最后Gel Red按1:10000进行稀释,染色15min后置于G:Box.Chem.XL1.4成像仪中成像。
结果如图5所示,其中,条带1是DL 2000DNA标记物,自上而下依次是2000、1000、750、500、250、100bp,条带2是6-HB打开后形成的3HB,条带3是6-HB。显然,6-HB条带单一,表明合成效率较高;加入钥匙链后随着6-HB打开形成3HB,分子量降低,条带迁移变快,并且打开效率可达90%以上。
AFM表征6-HB打开前后的形貌
用Q水(高纯水)冲洗云母片并吹干,分别滴加5uL终浓度为10nM的3HB和6-HB至云母片表面,吸附1min后用Q水冲洗并吹干,随后用AFM扫描成像。
由图6所示,3HB高度1.3nm,为6-HB高度的一半,这一结果与PAGE相符,即钥匙链对6-HB的打开效果较好,效率高。
荧光共振能量转移(FRET)表征6-HB打开效率
由上海生工公司合成2条寡核苷酸序列,其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:25-SECQ ID NO:26所示,其中,SECQ ID NO:25是在核苷酸序列为SECQ ID NO:9的单链DNA的3’端修饰荧光标记Cy3,SECQ ID NO:26是在核苷酸序列为SECQ ID NO:18的单链DNA的中间修饰荧光标记Cy5。
具体地,从5’端到3’端,
SECQ ID NO:25(Cy3-6-HB-9):
GCATTCACTCCTAACTACGAC-Cy3
SECQ ID NO:26(Cy5-6-HB-18):
GGATGT-Cy5-TAGCCTGGCTCATGCAATACG GTCGTTGCGTTAT
如图2a所示,在6-HB上标记了Cy3-Cy5的FRET对得到6-HB-key strands-FRET,加入钥匙链孵育30min后,随着6-HB打开形成2个3HB,荧光分子间距增大,导致FRET现象消失(图7)。荧光动力学研究表明,这一打开过程大约需要10min(图8),即钥匙链对6-HB的打开效率高、速度快。其中,6-HB-key strands-FRET所需的序列是将6-HB-key strands中6-HB-9和6-HB-18替换为Cy3-6-HB-9和Cy5-6-HB-18。
6-HB DNA纳米结构在生理条件下的稳定性
由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列,其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:27-SECQ ID NO:30所示,其中,SECQ ID NO:27是在核苷酸序列为SECQ ID NO:21的硫代磷酸酯骨架,SECQ ID NO:28是在核苷酸序列为SECQ ID NO:22的硫代磷酸酯骨架,SECQ ID NO:29是在核苷酸序列为SECQ ID NO:23的硫代磷酸酯骨架,SECQ ID NO:30是在核苷酸序列为SECQ ID NO:24的硫代磷酸酯骨架。
具体地,从5’端到3’端,
SECQ ID NO:27(S-key-cstr7):
CGCCCTGGTGAC(硫代磷酸酯骨架)
SECQ ID NO:28(S-key-cstr8):
GGCCGGTCCTCG(硫代磷酸酯骨架)
SECQ ID NO:29(S-key-cstr17):
GCGGGGATGTAG(硫代磷酸酯骨架)
SECQ ID NO:30(S-key-cstr18):
GCGCGTAGTACC(硫代磷酸酯骨架)
将含10%胎牛血清(FBS)的1640培养基分别与6-HB、S-ssDNA(硫代磷酸化修饰的单链DNA)和ssDNA(单链DNA)在37℃孵育,时间点设置为24h、12h、6h、3h、2h、1h、30min、0min。PAGE表征孵育后各结构的稳定性。
结果:图9a-c依次为ssDNA、S-ssDNA和6-HB的电泳结果,其中各胶图从左至右依次为:DNA marker、样品对照、孵育0min、30min、1h、2h、3h、6h、12h、24h的电泳条带。从图9a中,孵育24h后,6-HB的电泳条带基本没有发生变化,表明大部分DNA纳米结构在生理条件下仍能保持稳定。然而ssDNA在2h后条带明显变浅,表明在这一时间ssDNA几乎完全降解。与ssDNA相比,6-HB DNA纳米结构稳定性明显提高,在生理条件下能抵抗核酸酶降解,是药物转运的优良载体。
激光共聚焦检测细胞对6-HB DNA纳米结构的摄取
(1)将生长到对数期的MCF-7细胞用0.25%的胰酶进行消化,制成单细胞悬液,为提高摄取效率,所用培养基为含0.5%FBS的RPMI 1640。随后将细胞以7万/皿接种于Confocal皿中,接种完毕后,将Confocal皿置于细胞培养箱中饥饿培养12h。
(2)弃去Confocal皿中旧培养基,用PBS洗3次,将标记Cy3的6-HB、3HB、S-ssDNA和ssDNA以100nM的终浓度分别与细胞共培养4h。
(3)终止培养,弃去培养基,PBS洗3次。
(4)5mg/ml的Hochest稀释500倍,在培养箱中染核20min。
(5)培养基洗3次,每次10min,洗后进行Confocal拍摄。激发波长为514nm,发射波长为550-600nm,Hochest通道为405nm二极管激光器激发,发射为450-500nm。
注意:从步骤(2)开始需要避光操作。
分别将Cy3标记的6-HB、3HB、S-ssDNA和ssDNA与MCF-7细胞孵育4h后,激光共聚焦显微镜观察,结果如图10所示,6-HB的摄取量明显高于3HB、S-ssDNA和ssDNA。
流式细胞仪检测细胞对6-HB DNA纳米结构的摄取
MCF-7细胞以20万/孔接种于24孔板中,接种完毕后,将24孔板置于细胞培养箱中饥饿培养12h,设置4组,每组做3个复孔。将标记Cy3的6-HB、3HB、S-ssDNA和ssDNA以100nM的终浓度分别与细胞共培养4h。并用流式细胞仪进行定量分析。
流式细胞仪的分析(图11)证实了6-HB DNA纳米结构的摄取量明显高于其他三种结构。在等摩尔浓度条件下,3HB的细胞摄取量为完整6-HB的一半,ssDNA摄取量最低。尽管ssDNA经硫代磷酸化修饰后摄取有所提高,但仍远低于细胞对DNA纳米结构的摄取量。因此,6-HB可在不含转染试剂的条件下经高效摄取进入细胞。
6-HB DNA纳米机器人与钥匙链在活细胞内的共定位分析
为确认钥匙链与6-HB可在活细胞内存在共定位,分别研究6-HB和钥匙链在细胞内的分布情况。
MCF-7细胞以7万/皿接种于Confocal皿中,接种完毕后,将Confocal皿置于细胞培养箱中饥饿培养12h。将Cy3标记的6-HB DNA纳米结构以100nM的终浓度与细胞共培养4h。弃去培养基,用PBS洗3遍,加入4倍物质的量的Cy5标记S-keys与细胞共培养4h。Hochest染核20min后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm,发射波长为550-600nm。Cy5激发波长为633nm,发射波长为650-700nm,Hochest通道为405nm二极管激光器激发,发射为450-500nm。
由图12,在MCF-7细胞中,6-HB DNA纳米结构与S-key的分布有部分重叠。统计结果表明,约有44%的纳米结构与钥匙链存在共定位。考虑到两组结构是在无转染试剂的条件下分别转运的,这一细胞内共定位效率已经相当高,足以实现纳米机器人的细胞内运行
为研究由钥匙链触发的DNA纳米结构在细胞内的打开情况,采用共聚焦显微镜检测FRET效率变化的方法。
(1)MCF-7细胞以7万/皿的数目接种于Confocal皿中,在含0.5%FBS的RPMI 1640培养基中饥饿培养过夜。
(2)弃去培养基,PBS洗3遍,将含Cy3-Cy5FRET对的6-HB以100nM的终浓度与细胞共培养4h。
(3)弃去培养基,PBS洗3遍。设置两组,一组为Keys-组,加入培养基;一组为Keys+组,加入4倍物质的量的S-keys,两组均培养4h。
(4)终止培养,弃去培养基,PBS洗3次。5mg/ml的Hochest稀释500倍,在培养箱中染核20min。
(5)培养基洗3次,每次10min,洗后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm,发射波长为550-600nm;Cy5激发波长为633nm,发射波长为650-700nm;FRET激发波长为514nm,发射波长为650-700nm。
如图13所示,Keys-组在8h后FRET效率依然很高,而加入钥匙链4h后,Keys+组FRET效率明显降低,这是由钥匙链触发的DNA纳米结构在细胞内打开造成的。定义Fa和Fd分别为受体Cy5和供体Cy3的荧光值,对多个细胞的Fa/Fd进行统计,结果表明两组细胞FRET效率差异显著。
例2以细胞内的ATP分子为钥匙的DNA纳米机器人的运行
以下仅说明与例1不同的部分,而与例1相同的部分不再赘述。
由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列,其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:31-SECQ ID NO:34所示,其中,SECQ ID NO:31带有与ATP适配体序列部分互补的序列,SECQ IDNO:32带有与ATP分子结合的DNA适配体序列,SECQ ID NO:33带有与ATP分子结合的DNA适配体序列,SECQ ID NO:34带有Cy5修饰。
具体地,从5’端到3’端,
SECQ ID NO:31(6-HB-3-ATP):
AGGCAGATACGAAGAGCGTGGACCCGTCGTAGATAGTTCTGGACCCACGCTAGACAC
SECQ ID NO:32(6-HB-17-ATP):
TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCACTGGCATGTGATACATACACTGGTTGGA
SECQ ID NO:33(6-HB-18-ATP):
TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
SECQ ID NO:34(Cy5-6-HB-18-ATP):
TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGT-Cy5-CCAGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
为研究ATP分子对6-HB结构的半打开情况,分别在细胞外和细胞内对开关效率进行表征。
纳米机器人的细胞外运行
6-HB-ATP纳米结构的组装过程与6-HB-key strands相同,其中,6-HB-keystrands中6-HB-3替换为6-HB-3-ATP,6-HB-17和6-HB-18替换为6-HB-17-ATP和6-HB-18-ATP。将ATP分子用超纯水溶解至终浓度1mM。ATP与6-HB-ATP以1000:1的摩尔比混合,置于37℃反应30min即可。
FRET表征6-HB-ATP打开效率
在6-HB上标记Cy3-Cy5的FRET对(图3)得到6-HB-ATP-FRET,加入ATP分子孵育30min后,随着6-HB一侧打开,荧光分子间距增大,导致FRET现象消失(图14)。其中,6-HB-ATP-FRET所需的序列是将6-HB-ATP中6-HB-9和6-HB-18-ATP替换为Cy3-6-HB-9和Cy5-6-HB-18-ATP。
纳米机器人的细胞内运行
为研究由ATP分子触发的DNA纳米结构在细胞内的打开情况,采用共聚焦显微镜检测FRET效率变化的方法
(1)MCF-7细胞以7万/皿的数目接种于Confocal皿中,在含0.5%FBS的RPMI 1640培养基中饥饿培养过夜。
(2)弃去培养基,PBS洗3遍。设置两组,实验组(6-HB-ATP)和对照组(6-HB-keystrands)。分别将含Cy3-Cy5FRET对的两组6-HB以100nM的终浓度与细胞共培养4h。
(3)终止培养,弃去培养基,PBS洗3次。5mg/ml的Hochest稀释500倍,在培养箱中染核20min。
(4)培养基洗3次,每次10min,洗后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm,发射波长为550-600nm;Cy5激发波长为633nm,发射波长为650-700nm;FRET激发波长为514nm,发射波长为650-700nm。
如图15所示,6-HB-key strands组在4h后FRET效率依然很高,而6-HB-ATP组FRET效率明显降低,这是由细胞内ATP分子触发的6-HB在细胞内打开造成的。定义Fa和Fd分别为受体Cy5和供体Cy3的荧光值,对多个细胞的Fa/Fd进行统计,结果表明两组细胞FRET效率差异显著。
例3以细胞表面核仁素蛋白为钥匙的DNA纳米机器人的运行
以下仅说明与例1不同的部分,而与例1相同的部分不再赘述。
由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列,其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:35-SECQ ID NO:38所示,其中,SECQ ID NO:35带有与核仁素适配体序列部分互补的序列,SECQID NO:36带有与核仁素蛋白结合的DNA适配体序列,SECQ ID NO:37带有与核仁素蛋白结合的DNA适配体序列,SECQ ID NO:38带有Cy5修饰。
具体地,从5’端到3’端,
SECQ ID NO:35(6-HB-3-NCL):
AGGCAGATACGAAGAGCGCCACCACGTCGTAGATAGTTCCCACCACACGCTAGACAC
SECQ ID NO:36(6-HB-17-NCL):
GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGCTGGCATGTGATACATACACTGGTTGGA
SECQ ID NO:37(6-HB-18-NCL):
GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
SECQ ID NO:38(Cy5-6-HB-18-NCL):
GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT-Cy5-GGTGGGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
为研究核仁素蛋白对6-HB结构的半打开情况,分别在细胞外和细胞内对开关效率进行表征。
纳米机器人的细胞外运行
6-HB-NCL纳米结构的组装过程与6-HB-key strands相同,6-HB-key strands中6-HB-3替换为6-HB-3-NCL,6-HB-17和6-HB-18替换为6-HB-17-NCL和6-HB-18-NCL。核仁素蛋白用缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0)溶解至1mg/ml(约41.7uM)。核仁素与6-HB-NCL以摩尔比5:1混合,置于37℃反应30min。
FRET表征6-HB-NCL打开效率
在6-HB上标记Cy3-Cy5的FRET对(图4)得到6-HB-NCL-FRET,加入核仁素蛋白孵育30min后,随着6-HB一侧打开,荧光分子间距增大,导致FRET现象消失(图16)。其中,6-HB-NCL-FRET所需的序列是将6-HB-NCL中6-HB-9和6-HB-18-ATP替换为Cy3-6-HB-9和Cy5-6-HB-18-NCL。
纳米机器人的细胞内运行
为研究由核仁素蛋白触发的DNA纳米结构在细胞内的打开情况,采用共聚焦显微镜检测FRET效率变化的方法。
(1)MCF-7细胞(高表达NCL)和MCF-10A细胞(低表达NCL)以7万/皿的数目接种于Confocal皿中,在含0.5%FBS的RPMI 1640培养基中饥饿培养过夜。
(2)弃去培养基,PBS洗3遍。设置两组,6-HB-NCL分别响应高表达NCL的MCF-7细胞和低表达NCL的MCF-10A细胞。将含Cy3-Cy5FRET对的两组6-HB-NCL以100nM的终浓度与两组细胞共培养4h。
(3)终止培养,弃去培养基,PBS洗3次。5mg/ml的Hochest稀释500倍,在培养箱中染核20min。
(4)培养基洗3次,每次10min,洗后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm,发射波长为550-600nm;Cy5激发波长为633nm,发射波长为650-700nm;FRET激发波长为514nm,发射波长为650-700nm。
如图17所示,在培养4h后,MCF-10A细胞内的FRET效率依然很高,而MCF-7细胞内的FRET效率明显降低,这是由细胞表面核仁素蛋白触发的6-HB-NCL在细胞内打开造成的。定义Fa和Fd分别为受体Cy5和供体Cy3的荧光值,对多个细胞的Fa/Fd进行统计,结果表明两组细胞FRET效率差异显著。
实施例1活细胞内运行的智能DNA纳米机器人载药体系
为检测这一智能DNA纳米机器人载药体系的抗癌效果,在6-HB管状结构内共价连接6个美登素-DM1分子,采用MTT和激光共聚焦两种方式观察细胞死亡情况。
6-HB DNA纳米结构装载DM1分子
(1)确定6个朝向6-HB空腔内侧的位点标记氨基,将预先溶于DMSO的DM1分子以100:1的比例与DNA混合,注意DMSO的比例不低于50%,室温震荡2h后,用10K超滤管反复洗涤5次以除去过量的DM1分子。紫外分光光度计对修饰DM1后的DNA单链精确定量。
具体地,由Invitrogen公司合成20条具有磷酸二酯键骨架的寡核苷酸序列,即单链DNA,其中6条DNA单链的3’端或5’端标记氨基,即6条功能化单链DNA。由凯惠科技发展(上海)有限公司购买DM1-SMCC,即SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)修饰的DM1(N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素)分子。在功能化单链DNA中加入Millipore超纯水稀释至约100μmol/L得单链DNA水溶液。将DM1-SMCC完全溶解于二甲基亚砜(DMSO)。将单链DNA水溶液与DM1-SMCC的二甲基亚砜溶液混匀,控制DM1-SMCC和DNA的摩尔比为100:1,加入到PBS缓冲液和二甲基亚砜的混合溶剂中混匀,形成反应溶液。将混合均匀的反应溶液置于恒温震荡仪中,转速300rpm/min,反应温度25℃,反应时间2小时得到通过连接分子SMCC连接的DM1和单链DNA(共价连接产物DNA-SMCC-DM1)。将反应后的溶液加入10kDa的超滤管中,10000rpm离心15分钟,重复洗涤5次,以除去过量的DM1-SMCC分子。
(2)将修饰DM1的DNA单链与其他序列共同退火合成6-HB DNA纳米结构。
具体地,将6条共价连接产物的DNA单链和剩余的14条单链DNA分别以1μmol/L的终浓度混合于合成缓冲液(40mM Tris,20mM醋酸,2mM EDTA,125mM醋酸镁,pH 8.0)中,终体积为100μL。将混合好的溶液置于DNA低吸附管,使其悬浮于95℃热水中,缓慢过夜降温至25℃。
DNA单链与DM1的连接示意图如图18a所示,12%的PAGE(图18b)和质谱结果(图18c)表明DNA与DM1成功连接,并且高效液相色谱结果表明连接DNA后,DM1的水溶性有了明显提升(图18d)。并用6%的PAGE对连接DM1后的6-HB进行表征,证明连接DM1后6-HB依然可以合成(图19)。
MTT检测智能载药体系对癌细胞的杀伤效果
SK-BR-3细胞以10万/孔的密度接种于24孔板中,设置两个实验组,每组三个复孔:6-HB-DM1组和6-HB-DM1+keys组。两组各以100nM的终浓度孵育0h、3h、6h、18h、30h后,用MTT染色4h,加入10%酸性SDS溶解生成的甲瓒结晶,于490nm处测定每孔的紫外吸收值。
结果如图20a所示,加钥匙链组DM1对细胞的杀伤有明显增强,尤其是3-18h效果最为明显。
激光共聚焦显微镜观察加钥匙链18h时细胞死亡情况
SK-BR-3细胞以7万/皿接种于Confocal皿中,设置三组:6-HB组作为空白对照,6-HB-DM1组和6-HB-DM1+keys组。加入钥匙链孵育18h后,用碘化丙啶(PI)染色30min,Confocal观察PI染色情况。
碘化丙啶能够对死细胞的细胞核进行染色,如图20b,6-HB-DM1+keys组PI染色量明显增加,对癌细胞杀伤效果更加明显。这一智能DNA纳米机器人载药体系可在活细胞内进行药物可控释放。
以上所述的,仅为本发明的较佳实施例,并非用以限定本发明的范围,本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰,皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海应用物理研究所
<120> 一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA纳米机器人载药
体系
<130>
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagttgactg ctagtacctg agcactgaat gcgatgtaga agtagctctg ctccatc 57
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgacttgatg gagcagacct atcgtcac 28
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggcagatac gaagagcgag gctatgtcgt agatagttct cgcacgacgc tagacac 57
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagtcaact g 11
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggtacgtga cgataggaca catcagatgt cttaggagag gtcacagtaa ccttcgacaa 60
tct 63
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agattgtcga acgtatctgc ct 22
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaactatgac atctgatgtg tgctacttgt caccagggcg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgctcttggt tactgtgacc tgtgctcacg aggaccggcc 40
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcattcactc ctaactacga c 21
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctagcgtgt ctagcgt 17
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtccgtgca accgatcaat cc 22
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcctagcgat ccaatggaac gaccgtattg ctgaggtgag tgtatgtatc acttgcacgg 60
aca 63
<210> 13
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgtaccgtt g 11
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
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<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggcaatgtcc accattggat cg 22
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caacggtaca gtggtgactc caaccttgta acgtcctcga taacgctgga cattgcc 57
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggaggcgtgc gactggcatg tgatacatac actggttgga 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggatgatagc ctggctcatg caatacggtc gttgcgttat 40
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttacaacac ctcacgaatc c 21
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcaccacgtt gagttgg 17
<210> 21
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgccctggtg ac 12
<210> 22
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<212> DNA
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<400> 22
ggccggtcct cg 12
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<400> 23
gcggggatgt ag 12
<210> 24
<211> 12
<212> DNA
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<400> 24
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Cy3修饰
<400> 25
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<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Cy5修饰
<400> 26
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<211> 12
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 27
cgccctggtg ac 12
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 28
ggccggtcct cg 12
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
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<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 29
gcggggatgt ag 12
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<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
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<223> 硫代磷酸化修饰
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 33
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<210> 34
<211> 55
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
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<212> DNA
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<400> 37
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggggct catgcaatac ggtcgttgcg ttat 54
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> Cy5修饰
<400> 38
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggggct catgcaatac ggtcgttgcg ttat 54
Claims (10)
1.一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
S1,提供多条单链DNA和疏水性药物分子,将至少一条单链DNA和疏水性药物分子通过共价键连接形成共价连接产物,其中,单链DNA的核苷酸序列分别如SECQ ID NO:1- SECQID NO:20所示;
S2,将共价连接产物和剩余的单链DNA加入含有镁离子的第一缓冲液中进行反应,基于Watson-Crick原理有序组装成DNA纳米结构和疏水性药物分子的复合物,其中,剩余的单链DNA与共价连接产物的单链DNA自组装形成具有锁的DNA纳米结构,其中,疏水性药物分子被锁在DNA纳米结构的内侧;
S3,提供钥匙,所述钥匙与所述锁配合以使得疏水性药物分子从所述纳米结构暴露,从而提供DNA纳米机器人载药体系,其中,钥匙的核苷酸序列分别如SECQ ID NO:21- SECQ IDNO:24所示。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述锁为位于单链DNA上的锁链,所述钥匙为单独的钥匙链,所述钥匙链和所述锁链为可杂交的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述锁为位于单链DNA上的与ATP分子结合的适配体序列,所述钥匙为小分子ATP。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述锁为位于单链DNA上的与核仁素蛋白分子结合的适配体序列,所述钥匙为核仁素蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一缓冲液为含有氯化镁或醋酸镁的缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,共价连接产物、剩余的单链DNA和第一缓冲液组成的混合溶液进行退火处理。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤S1具体包括:提供多条单链DNA和带有功能基团的疏水性药物分子,其中,至少一条单链DNA为功能化单链DNA;将功能化单链DNA溶于水中形成单链DNA水溶液,将疏水性药物分子溶于有机溶剂中形成疏水性药物分子溶液;将单链DNA水溶液与疏水性药物分子溶液加入第二缓冲液中进行反应,使得功能化单链DNA与疏水性药物分子的功能基团发生偶联反应形成共价键,以得到单链DNA和疏水性药物分子的共价连接产物。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,DNA纳米结构为一维、二维、或三维结构。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述疏水性药物分子选自以下药物小分子中的至少一种:美登素、卡奇霉素、奥斯他汀、多卡米星、或蒽环类药物。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的方法得到的DNA纳米机器人载药体系,其特征在于,该DNA纳米机器人载药体系包括由DNA纳米结构和疏水性药物分子共价连接的复合物。
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CN103014161A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-04-03 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法 |
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