CN101744645A - 纳米生物机器人及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明从纳米生物机器人的角度，构建分子马达驱动的，以血栓抗体为导向的辅助快速溶栓的纳米机器人，通过分子马达在血栓局部的快速旋转，产生类似于微动力搅拌器的效应，并采用光驱动分子马达，实现纳米生物机器人的可调控性，加快药物与纤维蛋白的接触，实现纳米生物机器人的生物机械力学效应与药物酶解作用的协同，加速纤维蛋白溶解。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物新技术领域，涉及旋转式ATP马达构建的光驱动纳米机器人的设计，组装及在辅助药物扩散(溶栓)中的应用。
背景技术
传统溶栓治疗方法包括药物溶栓、器械辅助溶栓。在急性心肌梗死的抢救治疗中，溶栓治疗是快速恢复心肌血流的有效方法，早期使用溶栓剂治疗可使急性心肌梗塞患者的病死率降低30％[FEBS.Lett.2005，579(15)：3303-3309]。目前溶栓药物中效果较好的是重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)，该药的主要优点是与纤维蛋白的亲和力很高，溶栓速度快；缺点是易被肝脏清除，半衰期短(4分钟-5分钟)，需要持续静脉滴注，因而用药剂量大、价格昂贵(高达4000-5000元/治疗单位剂量)，当剂量超过150mg时，可因导致血小板聚集而诱发再栓塞、颅内出血等并发症[N.Engl.J.Med.，1995，333(24)：1581-1587.]。
器械辅助溶栓方面，介入治疗引人关注[Nat.Clin.Pract.Neurol.2007，3(1)：45-53.]，随着Greenfiedl首次运用静脉切开导管介入技术治疗肺栓塞，近年来介入技术逐渐进入血管栓塞的治疗领域。在心血管疾病的介入治疗中，通过在股静脉处开一个小口，插入中空的导丝，在X光机、核磁共振仪等成像设备的导引下，通过体外操纵导丝到达血管栓塞或狭窄部位，导丝前端可配置球囊、机械穿刺碎栓、血管内膜旋切和旋磨装置，对血栓或狭窄的血管内膜进行治疗，其特点是创伤小、安全可靠，对其适应症疗效明显。但由于传统加工技术在器件尺寸方面固有的局限，因此在导丝前端的可配置器件的设计原理、尺寸大小、动力学特性等方面存在着难以突破的技术障碍，介入治疗的应用范围仅局限于相对较大的血管，技术本身存在一些局限性，例如机械碎栓过程中会产生大量的血栓碎片，其在血管内的四散可能引发其他部位的小血管栓塞，尽管目前在碎栓的同时采取了吸栓的相应措施，但实际尚需进一步完善；而血管内膜旋切和旋磨装置在治疗过程中，可能会导致血管内膜的损伤，从而导致血栓的原位再形成，限制了该技术在临床上的进一步应用。因此美国医学会规定rt-pA是目前唯一许可的溶栓治疗措施。
发明内容
本发明从纳米生物机器人的角度，构建分子马达驱动的，以血栓抗体为导向的辅助快速溶栓的纳米机器人，通过分子马达在血栓局部的快速旋转，产生类似于微动力搅拌器的效应，并采用光驱动分子马达，实现纳米生物机器人的可调控性，加快药物与纤维蛋白的接触，实现纳米生物机器人的生物机械力学效应与药物酶解作用的协同，加速纤维蛋白溶解。
具体地，本发明提供以下各项：
1.一种纳米生物机器人，其包括载色体，该载色体上含有分子马达F0F1-ATPase，其中所述F0F1-ATPase不含δ亚基，并且所述F0F1-ATPase的α或β亚基上连接有纳米蛋白粒子。
2.根据以上1的纳米生物机器人，其中所述α或β亚基是经由抗α或β亚基抗体与所述纳米蛋白粒子连接，其中所述抗α或β亚基抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
3.根据以上2的纳米生物机器人，其中所述抗α或β亚基抗体是通过生物素-链酶抗生物素-生物素与所述纳米蛋白粒子连接。
4.根据以上1的纳米生物机器人，其中所述纳米蛋白粒子的粒径在10nm至100nm范围内，优选在20nm至50nm范围内。
5.根据以上1的纳米生物机器人，其中所述纳米蛋白粒子进一步与一个DNA片段连接。在一个实施方案中，一个纳米蛋白粒子上的DNA片段与另一个纳米蛋白粒子上的DNA片段互补(或部分互补)结合，由此抑制纳米蛋白粒子的运动(旋转)。
6.根据以上1的纳米生物机器人，其中所述纳米蛋白粒子进一步与一个DNA片段连接，所述DNA片段与另一个DNA片段在该另一个DNA片段的5’或3’端互补结合，所述另一个DNA片段的5’和3’端的序列分别与所述纳米蛋白粒子上的所述DNA片段互补。在一个实施方案中，纳米蛋白粒子上的所述DNA片段与另一个游离DNA片段(部分或完全)互补结合，该游离DNA的5’和3’末端分别可以与相邻的两个纳米生物机器人上的纳米蛋白粒子上的DNA片段(部分或完全)互补结合，由此抑制纳米蛋白粒子的运动(旋转)。
7.根据以上1的纳米生物机器人，其中所述载色体进一步与导向分子连接。
8.根据以上7的纳米生物机器人，其中所述导向分子是抗体或核酸，优选所述导向分子是纤维蛋白原抗体，该纤维蛋白原抗体是多克隆抗体或单克隆抗体、或人工抗体、或重组抗体。
9.根据以上8的纳米生物机器人，其中所述纤维蛋白原抗体是纤维蛋白原多抗，并且通过生物素-链酶抗生物素-连接脂质的生物素与所述载色体连接。
10.根据以上1-9任一项所述的纳米生物机器人在制备辅助药物中的应用，所述辅助药物用于促进活性药物在目标区域的扩散。
本发明还提供应用于疾病治疗的纳米生物机器人的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)载色体(chromatophores)的制备
培养光合作用细菌(R.Capsulatus I20，(保藏号1.2359)商购于中科院微生物所细胞库)。培养基：KH2PO4，1.0g，MgCl20.5g，CaCl2，0.1g，NaCl1.0g，醋酸钠1.0g，琥珀酸钠1g，酵母膏，1.0g，NaHCO30.5g，蛋白胨0.5g(OXOID英国)，微量元素1.0ml，维生素液1.0ml，蒸馏水1.0L，pH 6.8，8磅，高压灭菌30分钟。维生素液成分：生物素0.1g(进口分装)，烟酸0.35g，烟酸硫胺素(Thiamine dichloride)0.3g，泛酸钙(Ca-panthothenate)0.1g，维生素B12(Vitamin B12，0.05g，盐酸吡多胺(PyridoxoliumHydrochloride，Fluka)0.1g，蒸馏水1.0L；微量元素成分：FeCl2·4H2O 1.8g；CoCl2·6H2O 0.25g；NiCl2·6H2O，0.01g；CuCl2·2H2O 0.01g，MnCl2·4H2O0.07g；ZnCl2 0.1g，B3PO4 0.5g，Na2SeO3·5H2O 0.01g，NaMoO4·H2O 0.03g，蒸馏水1.0L)温度30-35℃。收获：细菌的培养温度为28℃，在光照(4,000Lx)下培养5-7天，5000g离心收集。载色体(Chromatophores)的提取：样品用TS缓冲液(50mM，Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸，Amresco进口分装)pH 8.0，0.25M蔗糖；5mM MgCl2)洗涤一次，然后再加入15ml的TS缓冲液，悬浮后，加入1mg/ml的溶菌酶(Sigma分装)，在冰中孵育30分钟，超声(20％振幅，Cole Parmer CPX 600超声仪13#探头)10分钟，25,000g离心30分钟，保留上清，再将上清180,000g在4℃离心90分钟，沉淀为载色体(Chromatophores)。此复合物为含一个分子马达F0F1-ATPase，多个光转换载体。
(2)60μl，0.5μg/μl的chromatophores(带有分子马达)与0.5μl，5.5mM的lipid-biotin在4℃连接25分钟；然后加入95μl，29μM的avidin，室温连接5分钟，形成(分子马达-lipid-biotin-avidin)，备用；
(3)50μl，17μM的纤维蛋白原多抗，与4.25μl，1mM N-biotin室温连接60分钟，形成(N-biotin-纤维蛋白原多抗)，备用；
(4)50μl，350μg/ml的纳米蛋白粒子(粒径为23nm)，与85μl，100μM的N-biotin室温连接60分钟，形成(N-biotin-纳米蛋白粒子)，备用；
纳米蛋白粒子的制备方法为：纳米蛋白粒子为SV40主要衣壳蛋白VP1，重组VP1通过其N末端融合的组氨酸标签(histag)被纯化。携带质粒pET32a-hisVP1的大肠杆菌表达菌株在500mL LB培养基中37℃长至OD600约0.6，加入1mM的IPTG并转入25℃继续培养9h。将菌体离心收集并重悬于40mL缓冲液B(25mM Tris-HCl pH 7.8，500mM NaCl，5mMimidazole，和5％glycerol)中超声破碎。菌体残渣通过12000rpm离心30min除去。将上清上样至镍亲和层析柱；再先后用含有40mM和80mM咪唑(imidazole)的缓冲液B洗柱；最后用含500mM咪唑的缓冲液B将VP1洗脱。所得VP1对缓冲液D(10mM Tris-HCl pH 8.8，200mM NaCl，2mM EDTA，30mM β-mercaptoethanol，和5％glycerol)透析20h，然后在4℃55000rpm离心1h，取上清即得解聚状态的VP1。蛋白浓度用考马斯亮蓝G250染色法测定。制备好的纳米颗粒保存于4℃。
(5)50μl，17μM的分子马达β亚基多抗，与4.25μl，1mM N-biotin室温连接60分钟，形成(N-biotin-β亚基多抗)，然后加入147μl，29μM的avidin，室温连接5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin)，备用；
(6)取20μl的(分子马达-lipid-biotin-avidin)，与4.4μl(N-biotin-纤维蛋白原多抗)室温连接5分钟，形成(分子马达-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纤维蛋白原多抗)；
(7)取48μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin)，与10μl(N-biotin-纳米蛋白粒子)室温连接5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子)；
(8)取17μl，29μM的avidin，与100μl，10μM的biotin-DNA1，室温连接5分钟，形成(avidin-biotin-DNA1)；然后加入5μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子)，室温反应5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)；
(9)取24.4μl(分子马达-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纤维蛋白原多抗)，与29.3μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)室温反应60分钟，形成(纤维蛋白原多抗-N-biotin-avidin-lipid-biotin-分子马达-β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)；然后加入13μl，10μM的DNA2，室温反应2h，完成分子马达刹车片的安装。
其中在步骤(3)中加入纤维蛋白抗体以实现纳米生物机器人与血栓的特异性结合。
在上述方法中，加入纳米蛋白粒子(直径约为23nm)，其中将该纳米粒子用于纳米生物机器人螺旋桨的构建，用于产生足够的生物机械效应。
在上述方法中，加入DNA1和/或DNA2，利用DNA序列互补的效应，实现纳米生物机器人的刹车制动，从而实现在体内血栓局部也可以进行光照储能的目的。
本申请还包括将纳米生物机器人应用于体内辅助药物溶栓及纳米动力装置辅助药物治疗的其他医学应用。
相对于常规溶栓治疗技术的上述局限，纳米生物技术在疾病治疗领域体现出强劲的活力，构建纳米生物机器人，利用纳米机械力学特性协同传统药物的生化酶解效应溶栓，并利用纳米在器件尺寸方面的优势，将纳米生物机器人与血栓抗体相结合，在血栓局部发挥促溶作用，这将为血栓性疾病的治疗提供了新的思路。
本发明用光驱动旋转式分子马达构建的生物纳米机器与血栓抗体结合，是一种全新的纳米生物机器人；该纳米生物机器人具备对血栓具有靶向结合能力和辅助药物快速溶栓能力，鉴于血栓性疾病中的脑血管疾病和心血管疾病目前位列全球人类疾病死因谱的第1位和第3位，而且据世界卫生组织预测，这两类疾病仍将是未来人类健康的首要威胁，而目前的治疗手段仅仅依赖于药物溶栓和介入治疗，因此本发明构建的能与血栓特异性结合的光驱动纳米机器人具有广阔的国内外应用前景及巨大的市场价值，是纳米生物机器人辅助药物溶栓的一个较大的技术突破，潜在的用户包括各大中型医院的脑血管及心血管病治疗的临床科室，产品投入使用后将产生直接的经济效益。在社会作用方面，纳米生物机器人辅助传统的单一药物溶栓，将极大的降低心脑血管疾病的死亡率和致残率，提高临床抢救与治疗的成功率及康复程度，减少病残，恢复一定的劳动能力，提高生活自理能力，提高病人的生活质量，为广大中风患者家庭及心肌梗死家庭减轻生活负担，具有很大的社会效益。
发明详述
本发明是对中国专利申请号200410098929.9(公开日：2006年6月21日，CN1789425，已授权)的进一步改进，区别在于在本发明中，分子马达不仅仅是作为一种生物传感器使用，而是将其作为纳米生物机器人的动力装置，构建了纳米生物机器，并将其应用于医学治疗中。
借助于分子马达的结构，功能与原理的研究进展，提出了F1F0-ATP马达全旋转式纳米机器人的新概念与新技术；提供一种F1β(或F1α)亚基作为血栓抗体连接的靶位点的新技术；提出了DNA链作为刹车片在分子马达旋转启动控制中的新技术。
本发明内容的要点：(1)变静态溶栓为动态溶栓，即将传统的药物溶栓转变为药物在纳米生物机器人辅助下的溶栓；(2)实现纳米生物机器人与血栓的靶向结合，即制备纤维蛋白抗体，通过生物素-亲和素-生物素连接体系与分子马达相连，实现纳米生物机器人在血栓表面的固定；(3)为分子马达增加制动装置，将DNA互补双链的结合与解链两种状态作为分子马达的刹车控制装置的制动与去制动，解决调控纳米生物机器人旋转启动控制的关键问题，为纳米生物机器人应用于临床治疗提供控制技术。
以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。
在本发明的一个实施方案中，提供一种纳米生物机器人(一种改进的生物载色体体系)，其包括载色体(chromatophore，脂囊泡)，该载色体上含有分子马达F0F1-ATPase，其中所述F0F1-ATPase不含δ亚基，并且所述F0F1-ATPase的α或β亚基上连接有纳米蛋白粒子。
F0F1-ATP合酶是由多亚基组成的复合体，包括膜内的F0部分，基本组成是ab2cn；膜外亲水F1部分亚基的基本组成是α3β3γεδ。这两部分分别由2个柄连接：中心的柄为γε复合物，连接F1的α3β3亚基和F0的c亚基；偏心柄为插入膜区的a亚基与膜外b2亚基，b2的另一端与δ亚基的C端连接，而δ亚基的N端与F1部分α亚基联接(图1A)。
本发明通过生物工程技术将δ亚基去掉[方法参见Biochem.Biophys.Res.Commun.2006，350(4)：1013-1018.]，对天然的F0F1-ATP合酶进行重构，得到去δ的F0F1-ATP合酶，在重构体中，分子马达的定子为ab2，转子为α3β3γεcn(图1B)，经此改造后，分子马达成为一种理想的纳米动力装置。天然分子马达中，可转动部分仅为活动范围非常有限的γε和cn(图1A中的深色部分)，且包涵在酶分子内部，该结构大大限制了其作为分子马达的应用。而重构的分子马达，可转动部分为α3β3γεcn，转子暴露在表面，方便进一步的工程化改造，例如在α或β亚基上接上各种生物材料构成的“螺旋桨”，那么可充分利用F0F1-ATP合酶这一旋转分子马达的特性，广泛应用于生物、医学、纳米材料等领域。
在本发明中，将所述纳米粒子用于纳米生物机器人螺旋桨的构建，用于产生足够的生物机械效应。所述纳米粒子随着F0F1-ATPase的α或β亚基旋转，对载色体周围产生搅拌效应，可以促进载色体周围环境的生物或化学物质(包括药物)的扩散。如CN1789425所述，分子马达F0F1-ATPase的旋转可以由ATP水解驱动，也可以由光能转换的跨膜电化学电位差驱动的，优选所述跨膜电化学电位差是由光能或化学能转换的。
在本发明的另一个实施方案中，所述α或β亚基是经由抗α或β亚基抗体与所述纳米蛋白粒子连接，其中所述抗α或β亚基抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗α或β亚基抗体是通过生物素-链酶抗生物素-生物素与所述纳米蛋白粒子连接。
在本发明中，对于纳米蛋白粒子的粒径没有特别限制(也可以是磁性的材料)，只要其作为“螺旋桨”能够产生搅拌作用即可。在本发明的一个优选实施方案中，所述纳米蛋白粒子的粒径在10nm至100nm范围内，更优选在20nm至50nm范围内。
在本发明的另一个实施方案中，所述纳米蛋白粒子进一步与一个DNA片段(在本文中也称为DNA1)连接。该DNA片段是起“刹车片”的作用，控制纳米蛋白粒子的旋转。在一个实施方案中，该DNA片段是通过生物素-链酶抗生物素-生物素与所述纳米蛋白粒子连接。对于该DNA片段的序列没有特别限制。优选地，一个纳米蛋白粒子上的DNA片段与另一个纳米蛋白粒子上的DNA片段互补(或部分互补)结合，由此抑制纳米蛋白粒子的运动(旋转)(示意图参见图4B和5B)。
在另一个实施方案中，对DNA1的序列没有特别要求，可以另外加入一个游离DNA片段(在本文中也称为DNA2)，DNA2的设计原理为序列的两侧为对称序列，且5’和3’端的序列分别与DNA1互补，其长度按照设计要求，可以进行相应调整。由此，DNA2可以分别与相邻的两个载色体F0F1-ATPase上的DNA1互补结合，形成部分DNA双链，由此使得分子马达不能旋转(参见图4A和5A)。
在本发明的另一个实施方案中，所述载色体进一步与导向分子连接。与导向分子连接的目的是为了将包含带有“螺旋桨”的分子马达的纳米生物机器人导向需要“螺旋桨”搅拌的区域。所述区域可以是需要给药的任何生物体内或体外部位，例如肿瘤部位，病毒感染部位，炎症部位，血栓形成部位等任何病灶部位。相应地，所述导向分子可以是蛋白质抗体(例如，生物大分子、病毒分子特异性抗原、炎性因子、趋化因子、肿瘤因子、血栓形成因子的抗体)或核酸(如反义RNA，探针、核酸适体等)。在本发明的一个优选实施方案中，所述导向分子是纤维蛋白原抗体，该纤维蛋白原抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。在本发明的另一个优选实施方案中，所述导向分子是通过生物素-链酶抗生物素-连接脂质的生物素与所述载色体连接。本发明使用的生物素可以是N-生物素的形式。
在本发明的另一个实施方案中，将上述纳米生物机器人在制备辅助药物中的应用，所述辅助药物用于促进活性药物在目标区域(各种病灶区域或给药区域)的扩散。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含：根据本发明的纳米生物机器人和活性药物，其中所述纳米生物机器人可以促进所述活性药物在目标区域的扩散。
鉴于血栓性疾病中的脑血管疾病和心血管疾病目前位列全球人类疾病死因谱的第1位和第3位，而目前的治疗手段仅仅依赖于药物溶栓和介入治疗，因此本发明构建的能与血栓特异性结合的光驱动纳米机器人具有广阔的国内外应用前景及巨大的市场价值，是纳米生物机器人辅助药物溶栓的一个较大的技术突破，潜在的用户包括各大中型医院的脑血管及心血管病治疗的临床科室，产品投入使用后将产生直接的经济效益和巨大的社会效益。
目前肿瘤位列人类疾病死因谱的第2位，而目前化疗由于全身大剂量用药导致的副作用，限制了抗肿瘤药物的效果。因此本发明构建的能与肿瘤特异性结合的光驱动纳米机器人具有广阔的国内外应用前景及巨大的市场价值，是纳米生物机器人辅助药物抗肿瘤治疗的一个较大的技术突破，潜在的用户包括各大中型医院的肿瘤治疗的临床科室，产品投入使用后将产生直接的经济效益和巨大的社会效益。
附图说明
图1是分子马达的重构(去δ亚基的F0F1-ATP合酶)示意图；
F0F1-ATP合酶是由多亚基组成的复合体，包括膜内的F0部分，基本组成是ab2cn；膜外亲水F1部分亚基的基本组成是α3β3γεδ。这两部分分别由2个柄连接：中心的柄为γε复合物，连接F1的α3β3亚基和F0的c亚基；偏心柄为插入膜区的a亚基与膜外b2亚基，b2的另一端与δ亚基的C端连接，而δ亚基的N端与F1部分α亚基联接(图1A)。
本发明通过生物工程技术将δ亚基去掉[参见Biochem.Biophys.Res.Commun.2006，350(4)：1013-1018.]，对天然的F0F1-ATP合酶进行重构，得到去δ的F0F1-ATP合酶，在重构体中，分子马达的定子为ab2，转子为α3β3γεcn(图1B)，经此改造后，分子马达成为一种理想的纳米动力装置。天然分子马达中，可转动部分仅为活动范围非常有限的γε和cn(图1A中的深色部分)，且包涵在酶分子内部，该结构大大限制了其作为分子马达的应用。而重构的分子马达，可转动部分为α3β3γεcn，转子暴露在表面，方便进一步的工程化改造，例如在α或β亚基上接上各种生物材料构成的“螺旋桨”，那么可充分利用F0F1-ATP合酶这一旋转分子马达的特性，广泛应用于生物、医学、纳米材料等领域。
图2是纳米生物机器人的光驱动实现；
F0F1-ATP酶位于载色体(也称为脂囊泡，chromatophore)上，脂囊泡相当于一个质子(H+)的贮存库，脂囊泡来自于光合细菌，脂囊泡上有光合反应中心。光照时，通过光合反应中心，质子由脂囊泡外进入囊泡内，随光照时间增加囊泡内的质子浓度增高，质子势能储存在脂囊泡中。经一定时间储能后，升高温度至37℃，用质子梯差启动F0F1-ATP酶的旋转，在这个过程中，质子的流动推动分子马达的旋转，即质子能转化为生物机械能。在此过程中，实现纳米生物机器人的光控制。
本发明的实验中光照储能方式包括两种，第一种为在体外冰上进行光照，光照储能后升温至37℃后注入体内促进药物溶解，第二种为体内原位光照，此时分子马达的旋转的制动与启动依靠DNA双链刹车进行控制，当DNA双链处于结合状态时，分子马达处于制动状态，脂囊泡中的质子无法流出，在这种状态下，原位光照可以增加囊泡内的质子梯度，储存质子势能，当质子势能储存到一定程度，DNA双链打开，分子马达开始旋转，从而实现分子马达在体内的光驱动。
图3.微混合器加速溶纤的工作原理示意图(注：
溶栓药物；
血栓中的纤维蛋白；
纤维蛋白碎片)；
A为实验组，为微混合器加速溶栓工作原理，经过光照，微混合器中分子马达储能；约37℃热启动后，分子马达开始旋转，通过搅拌作用，药物快速与纤维蛋白结合，作用时间大大缩短，溶栓依靠药物的生化酶解及生物机械效应的协同作用，溶栓过程明显加快。
B为对照组，为常规的药物治疗，在溶栓药物的作用下，纤维蛋白降解为碎片，进入溶液，血栓分解，溶栓效应仅仅依靠药物被动扩散作用，药物与纤维蛋白之间也是单一的生化酶解效应，药物与纤维蛋白之间接触靠弥散作用，作用时间相对较长，效应单一；
图4为纳米生物机器人安装刹车装置；
利用生物素末端修饰的短的DNA互补双链作为分子马达的刹车装置，DNA链通过末端的生物素与分子马达相连，而DNA双链的结合与解聚两种状态对应分子马达的制动与去制动，设计、合成适当长度及GC含量的DNA双链，实现在室温状态下分子马达不启动，到达血栓部位后，通过局部原位光照储能，能量储存到一定程度足以克服DNA双链的制动作用，DNA双链解开，启动分子马达旋转，辅助药物溶栓，从而达到降低溶栓药物用量，加快血栓溶解的目的。
(1)体外光照，储存质子梯度。在冰上光照时，质子由脂囊泡外通过光合反应中心进入囊泡内，形成质子势能，配合低的环境温度，低温可以限制马达的旋转，可以实现脂囊泡内质子势能的储存。
(2)纳米生物机器人与特定部位的固定技术。纳米生物机器人进入血栓局部，环境温度为37℃，相邻分子马达螺旋桨上连接的DNA双链呈互补结合状态，限制了分子马达的旋转，这种状态(分子马达不旋转)有利于纤维蛋白抗体导引纳米生物机器人与纤维蛋白特异性结合。
(3)血栓局部原位短时间光照，质子驱动力大于DNA双链结合力时，启动纳米生物机器人旋转。
图5刹车装置示意图；
采用光照设备，在血栓对应的局部进行光照，适当增加血栓局部的脂囊泡内的质子势能，使其达到纳米生物机器人启动所需的质子驱动力，此时限制分子马达旋转的DNA双链解链，纳米生物机器人开始旋转，在血栓局部，辅助溶栓药物快速溶栓。
图6刹车装置解除前后的荧光变化图；
对照组荧光强度无变化；光照30分钟组，荧光强度依然无变化，显示在此光照条件下，刹车片处于制动状态，无分子马达的旋转及其伴随的质子的膜内外转运；光照60分钟组，荧光强度明显上升，显示经过较长时间的光照储能，能量已经足以克服刹车片的束缚，纳米机器人携带的分子马达开始旋转，质子由chromatophore膜内泵到膜外，膜内pH升高，经过超声标记及离心洗涤，F1300标记在膜内，膜内pH升高将引起对pH敏感的F1300的荧光强度变化，荧光强度升高，表明分子马达已启动，开始旋转。
图7纳米机器人刹车装置解除前后的溶栓效果示意图；
首先，采用DNA互补链使纳米机器人的旋转装置处于制动状态(处于刹车状态)，然后，实验组采用冰上光照1小时，然后短时原位局部光照，储存的质子势能突破刹车的制动作用，启动纳米机器人工作，加入低浓度溶栓药物，观察溶栓效果。对照组冰上光照30分钟，光照储能不足以解除刹车装置。结果可见刹车状态解除组，血栓的溶解明显加快。
图8分子马达与溶栓药物协同作用加快溶栓的示意图；
兔耳缘静脉取血，24小时4℃自然凝血，取6mg栓体与20μl连接有血栓抗体的分子马达室温反应60分钟，塞入毛细玻璃管中，加入10μl，4500U/ml的蚓激酶，封闭毛细管末端，对照组不光照，实验组冰上光照60分钟后，37℃反应6小时后观察试验结果。其中光照组毛细管末端以绿色封闭，对照组毛细管末端以白色封闭，可见两组初始状态一致，反应后光照组栓体溶解速度明显快于对照组，柱体长度约为对照组的50％。
图9纳米生物机器人进入血栓；
光照组毛细管末端以绿色封闭，对照组毛细管末端以白色封闭。毛细玻璃管中的血栓在10μl，4500U/ml的蚓激酶作用下，血细胞首先从血栓中游离出来(图9A)，血细胞在血栓中占据的空间腾出来之后，纳米机器人通过连接的血栓抗体，进入到血栓内部(图9B)，可见光照组血栓的颜色比对照组深，这是纳米生物机器人进入血栓柱体所致。实验在毛细玻璃管中进行，体内实验数据见图13。
图10纳米生物机器人进入血栓的微观图像；
毛细玻璃管中的血栓在10μl，4500U/ml的蚓激酶作用下，血细胞首先从血栓中游离出来(图10A)，血细胞在血栓中占据的空间腾出来之后，纳米机器人通过连接的血栓抗体，进入到血栓内部(图10B)，加快溶栓药物的溶栓作用。结果见图10。
图11纳米生物机器人进入血栓的微观图像；
纳米机器人用量子点进行荧光标记，在荧光显微镜下可见纳米机器人通过连接的血栓抗体，逐步进入到血栓内部。结果见图11。图中荧光点为纳米机器人。图11与图10的区别在于图11中对纳米机器人进行了荧光标记。
图12小鼠肺动脉栓塞模型示意图；
小鼠眼球取血1ml，注入1.5ml的聚乙烯管中，置于冰箱中，4℃保存24h，形成血栓，PBS洗涤后备用。临用前用剪刀处理成小血栓，然后冰上超声5分钟，进一步将血栓破碎，形成血栓混悬液。取2月龄BALB/c小鼠1只，尾静脉注射血栓混悬液250μl，构建小鼠急性肺动脉栓塞模型(见图12)。图12A可见，肺组织中多处血栓栓塞；图12B可见单个肺动脉管腔中的血栓，血栓由箭头指示。
图13纳米生物机器人对血栓靶向结合的体内试验；
通过尾静脉注射F1300标记的纳米生物机器人溶液100μl，1小时后断颈处死小鼠，冰冻切片观察肺动脉栓塞情况，可见荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。结果见图13(血栓由箭头指示)。图13A是可见光下的肺血管栓塞图像，图13B是荧光下的肺栓塞图像，血栓没有标记荧光，荧光物质F1300标记在纳米生物机器人上，血栓部位呈现荧光图像，而周围血管及肺组织中未见荧光物质，说明纳米生物机器人高度特异的靶向结合到血栓上。
图14.荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。血栓形态为附壁血栓，管腔未全部堵塞，是一个血管横切的图像；
图15.荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。血栓形态是一个血管纵切的图像；
图16.荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。血管横切的图像；
图17.荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。将图16对应血管经过共聚焦双荧光成像扫描后构建的双荧光叠加图像；
图18.动物体内血栓溶解实验。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。
本发明的目的是通过下面的技术方案实现的：
1.分子马达及光合作用的复合物(Chromatophores)制备
载色体(Chromatophores)的制备与中国专利申请号200410098929.9相同。具体地，培养光合作用细菌(R.Capsulatus I 20，(保藏号1.2359)，商购于中科院微生物所细胞库)。培养基：KH2PO4，1.0g，MgCl20.5g，CaCl2，0.1g，NaCl 1.0g，醋酸钠1.0g，琥珀酸钠1g，酵母膏，1.0g，NaHCO30.5g，蛋白胨0.5g(OXOID英国)，微量元素1.0ml，维生素液1.0ml，蒸馏水1.0L，pH 6.8，8磅，高压灭菌30分钟。维生素液成分：生物素0.1g(进口分装)，烟酸0.35g，烟酸硫胺素(Thiamine dichloride)0.3g，泛酸钙(Ca-panthothenate)0.1g，维生素B12(Vitamin B12，0.05g，盐酸吡多胺(Pyridoxolium Hydrochloride，Fluka)0.1g，蒸馏水1.0L；微量元素成分：FeCl2·4H2O 1.8g；CoCl2·6H2O 0.25g；NiCl2·6H2O，0.01g；CuCl2·2H2O 0.01g，MnCl2·4H2O 0.07g；ZnCl20.1g，B3PO40.5g，Na2SeO35H2O 0.01g，NaMoO4·H2O 0.03g，蒸馏水1.0L)温度30-35℃。收获：细菌的培养温度为28℃，在光照(4,000Lx)下培养5-7天，5000g离心收集。载色体(Chromatophores)的提取：样品用TS缓冲液(50mM，Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸，Amresco进口分装)pH 8.0，0.25M蔗糖；5mM MgCl2)洗涤一次，然后再加入15ml的TS缓冲液，悬浮后，加入1mg/ml的溶菌酶(Sigma分装)，在冰中孵育30分钟，超声(20％振幅，Cole Parmer CPX600超声仪13#探头)10分钟，25,000g离心30分钟，保留上清，再将上清180,000g在4℃离心90分钟，沉淀为载色体(Chromatophores)。此复合物为含一个分子马达F0F1-ATPase，多个光转换载体。
2.纳米生物机器人的组装
(1)60μl，0.5μg/μl的分子马达与0.5μl，5.5mM的lipid-biotin(Avanti公司，货号：870285，1-油酰-2-(12-生物素基(氨基十二烷酰))-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，1-Oleoyl-2-(12-biotinyl(aminododecanoyl))-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine)在4℃连接，连接方式为lipid-biotin与脂囊泡chromatophore相连[Biochem.Biophys.Res.Commun.2006，350(4)：370-374.]，连接25分钟；然后加入95μl，29μM的avidin，室温连接5分钟，形成(分子马达-lipid-biotin-avidin)，备用；
(2)50μl，17μM的纤维蛋白原多抗[制备方法参见：首都医科大学学报，1998，19(1)：63-64]，与4.25μl，1mM N-biotin(Fluka公司，货号：14405)室温连接(生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与蛋白共价结合)[参见：复旦学报(自然科学版)，2003，42(6)：1020-1024]，60分钟，形成(N-biotin-纤维蛋白原多抗)，备用；
(3)50μl，350μg/ml的纳米蛋白粒子(所用纳米蛋白粒子为SV40主要衣壳蛋白VP1(氨基酸序列的GenBank Accession no.AF316139.1)，重组VP1通过其N末端融合的组氨酸标签(histag)被纯化。携带质粒pET32a-hisVP1的大肠杆菌表达菌株在500mL LB培养基中37℃长至OD600约0.6，加入1mM的IPTG并转入25℃继续培养9h。
pET32a-hisVP1质粒的详细构建过程如下：
SV40VP1基因(GenBankAccession no.AF316139.1)片段以SV40基因组为模板，以5′TACTTCTGCTCTAAAGATCTATGAAG(P1)和5′ACAACTCGAGCAATAGCATCACAAA(P2)为引物扩增获得，BglII-XhoI双酶切后插入载体pQE30(Qiagen)的BamHI-SalI位点，从而获得载体pQEVP1。然后以pQEVP1为模板，以5′GAAATTACATATGAGAGGATCGC(P3)和P2为引物扩增获得5′端融合了histag的VP1编码序列，该片段经NdeI-XhoI双酶切后，与NdeI-XhoI完全酶切的pET32a(+)(Novagen，美国)载体片段连接，获得载体pET32hisVP1，用于VP1的表达。
将菌体离心收集并重悬于40mL缓冲液B(25mM Tris-HCl pH 7.8，500mM NaCl，5mM imidazole，和5％glycerol)中超声破碎。菌体残渣通过12000rpm离心30min除去。将上清上样至镍亲和层析柱；再先后用含有40mM和80mM咪唑(imidazole)的缓冲液B洗柱；最后用含500mM咪唑的缓冲液B将VP1洗脱。所得VP1对缓冲液D(10mM Tris-HCl pH8.8，200mM NaCl，2mM EDTA，30mM β-mercaptoethanol，和5％glycerol)透析20h，然后在4℃55,000rpm离心1h，取上清即得解聚状态的VP1。蛋白浓度用考马斯亮蓝G250染色法测定。制备好的纳米颗粒保存于4℃。粒径为23nm)，与85μl，100μM的N-biotin室温连接(生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与蛋白共价结合)60分钟，形成(N-biotin-纳米蛋白粒子)，备用；
(4)50μl，17μM的分子马达β亚基多抗，与4.25μl，1mM N-biotin室温连接(生物素通过噻吩环戊酸侧链上的羧基与蛋白共价结合)60分钟，形成(N-biotin-β亚基多抗)，然后加入147μl，29μM的avidin，室温连接5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin)，备用；
(5)取20μl的(分子马达-lipid-biotin-avidin)，与4.4μl(N-biotin-纤维蛋白原多抗)室温连接5分钟，形成(分子马达-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纤维蛋白原多抗)；
(6)取48μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin)，与10μl(N-biotin-纳米蛋白粒子)室温连接5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子)；
(7)取17μl，29μM的avidin，与100μl，10μM的biotin-DNA1，室温连接5分钟，形成(avidin-biotin-DNA1)；然后加入5μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子)，室温反应5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)；
DNA1的碱基序列为(21bp)：
5′→3′：biotin-ATTCGTAATCGTTTAAAGATC
其中DNA1序列与biotin的连接为北京奥科生物公司完成。
DNA1序列与biotin的连接方法为：
1.将0.1μmol氨基修饰核苷酸溶于0.7ml无菌蒸馏水中。
2.加入0.1ml的1.0M NaHCO3/Na2CO3缓冲液，pH值为9.0。
3.将10mg/ml的酯类试剂Biotin-X-NHS-Ester溶液溶于二甲基甲酰氨中。取配好的此溶液0.2ml加入反应混合物中。
4.室温放置2小时。
5.用反相HPLC法纯化生物素化寡核苷酸。
该DNA序列与下述的DNA2序列的一侧序列为互补序列，按照设计要求，两者达到互补的要求即可，序列可以替代，DNA长度可根据设计要求进行调整，长度非严格限定。
(8)取24.4μl(分子马达-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纤维蛋白原多抗)，与29.3μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)室温反应60分钟，形成(纤维蛋白原多抗-N-biotin-avidin-lipid-biotin-分子马达-β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)；然后加入13μl，10μM的DNA2，室温反应2h，完成分子马达刹车片的安装。
DNA2的碱基序列为：
5′-TAAgCATTAgCAAATTTCTAgACTACATCgTCATAgTAgATCTTTAAACgATTACgAAT-3′
DNA2序列的设计原理为序列的两侧为对称序列，且5′和3′端的序列分别与DNA1互补，其长度按照设计要求，可以进行相应调整。
本发明的分子马达应用于方法包括以下步骤：
(1)旋转马达的重组：对F0F1-ATP酶进行结构改造，得到去δ的F0F1-ATP酶；
(2)血栓抗体与分子马达进行连接；
(3)完成旋转马达的刹车片安装。
实施例1纳米机器人的组装
在刹车装置制动有效性的观测指标方面，采用pH敏感的荧光物质F1300标记脂囊泡(chromatophore，带有分子马达)，当刹车装置起作用时，分子马达不能旋转，膜内外无质子流动，那么膜内外无pH变化，荧光强度不出现变化；当光照储能达到一定程度时，分子马达开始旋转，挣脱了DNA双链的束缚，刹车装置被解除，质子由膜内泵到膜外，引起膜上标记的F1300荧光的变化，从而验证短链DNA互补双链作为刹车装置的有效性。以下组装的详细过程，除非另外指出或明显不符，与以上在具体实施方式中所述相同。
1.F1300标记载色体(chromatophore)
60μl，0.5μg/μl载色体(chromatophore)(带有分子马达的脂囊泡)，加入0.1mM 540μl的Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸，Amresco进口分装)(pH＝8.0)，充分混匀，加入1μl，1mg/ml的F1300(荧光探针，购自美国Molecular Probes公司，产品名：fluorescein reference standard，产品编号F1300)，冰水中超声5分钟，15,000rpm，30分钟，洗两遍，去掉游离的F1300，重悬于60μl，0.1mM的Tricine(pH＝6.5)，备用。
2.纳米机器人安装DNA双链刹车片
(1)60μl，0.5μg/μl的F1300标记的chromatophore(带有分子马达的脂囊泡)与0.5μl，5.5mM的lipid-biotin在4℃连接25分钟；然后加入95μl，29μM的avidin，室温连接5分钟，形成(分子马达-lipid-biotin-avidin)，备用；
(2)50μl，17μM的纤维蛋白原多抗，与4.25μl，1mM N-biotin室温连接60分钟，形成(N-biotin-纤维蛋白原多抗)，备用；
(3)50μl，350μg/ml的纳米蛋白粒子(粒径为23nm)，与85μl，100μM的N-biotin室温连接60分钟，形成(N-biotin-纳米蛋白粒子)，备用；
(4)50μl，17μM的分子马达β亚基多抗，与4.25μl，1mM N-biotin室温连接60分钟，形成(N-biotin-β亚基多抗)，然后加入147μl，29μM的avidin，室温连接5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin)，备用；
(5)取20μl的(分子马达-lipid-biotin-avidin)，与4.4μl(N-biotin-纤维蛋白原多抗)室温连接5分钟，形成(分子马达-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纤维蛋白原多抗)；
(6)取48μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin)，与10μl(N-biotin-纳米蛋白粒子)室温连接5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子)；
(7)取17μl，29μM的avidin，与100μl，10μM的biotin-DNA1，室温连接5分钟，形成(avidin-biotin-DNA1)；然后加入5μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子)，室温反应5分钟，形成(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)；
DNA1的碱基序列为(21bp)：
5′→3′：biotin-ATTCGTAATCGTTTAAAGATC
(8)取24.4μl(分子马达-lipid-biotin-avidin-N-biotin-纤维蛋白原多抗)，与29.3μl(β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)室温反应60分钟，形成(纤维蛋白原多抗-N-biotin-avidin-lipid-biotin-分子马达-β亚基多抗-N-biotin-avidin-N-biotin-纳米蛋白粒子-N-biotin-avidin-biotin-DNA1)；然后加入13μl，10μM的DNA2，室温反应2h，完成分子马达刹车片的安装。
DNA2的碱基序列为：
5′-TAAGCATTAGCAAATTTCTAGACTACATCGTCATAGTAGATCTTTAAACGATTACGAAT-3′
3.刹车片打开后，荧光变化的观察
荧光变化的观察在荧光显微镜下进行(Olympus IX71，日本)，荧光图像信号的记录由低温数字高速照相机完成(iXon CCD，ANDORTechnology，英国)。
结果可见，对照组荧光强度无变化；光照30分钟组，荧光强度依然无变化，显示在此光照条件下，刹车片处于制动状态，无分子马达的旋转及其伴随的质子的膜内外转运；光照60分钟组，荧光强度明显上升，显示经过较长时间的光照储能，能量已经足以克服刹车片的束缚，纳米机器人携带的分子马达开始旋转，质子由chromatophore膜内泵到膜外，膜内pH升高，经过超声标记及离心洗涤，F1300标记在膜内，膜内pH升高将引起对pH敏感的F1300的荧光强度变化，荧光强度变化方向为升高。结果见附图6。
实施例2纳米生物机器人在DNA双链刹车装置的结合与解开状态下的溶栓效果。
纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变成纤维蛋白，纤维蛋白是血栓的主要成分，血栓的形成过程是纤维蛋白首先形成网状结构，结合血细胞，构成血栓。
1.纤维蛋白原的FITC荧光标记和纤维蛋白的形成
纤维蛋白原(10mg/ml，0.03mM，购自Sigma公司，商品目录号：F8630，美国)溶于PBS缓冲溶液中(137mM NaCl，3mM KCl，8mM Na2HPO4，1mMKH2PO4，pH 8.5)，加入FITC(Fluorescein isothiocyanate，终浓度为50mg/ml，购自Molecular Probes公司，美国)，振荡混匀，置摇床上慢速混匀反应1小时。转入透析袋中，以PBS为透析液，将未标记上的FITC透析干净。取FITC标记的纤维蛋白原500μl(10mg/ml)，加入凝血酶250U(0.5unit/μl，购自Sigma公司，美国)，37℃孵育30分钟，得到纤维蛋白沉淀。
2.取纤维蛋白1mg，与3.3μl上述实施例制备的连接有血栓抗体的，带有DNA刹车装置的分子马达室温反应60分钟，置入毛细玻璃管中，加入10μl，4500U/ml的蚓激酶(北京百奥药业有限责任公司，溶栓药)，封闭毛细管末端。对照组冰上光照30分钟，实验组冰上光照60分钟后(对照组仅光照30分钟，30分钟和60分钟是根据光能转换效率及DNA双链的结合力确定的)在加温设备40℃环境中启动纳米机器人旋转，荧光显微镜下间隔10分钟进行拍照观测。结果见附图6，可见实验组光照时间长，质子势能储备多，在40℃时打开了DNA双链的刹车装置，启动了分子马达旋转，加快了溶栓作用，图中可见荧光标记的纤维蛋白溶解。而对照组光照时间短，储备的质子势能不足以打开DNA双链刹车装置对纳米机器人的制动，因此溶栓效果明显不如实验组。结果见附图7-8(附图7为荧光下观测结果，附图8为可见光下观测结果，附图中由箭头标出血栓)。图中可直接观察到血栓溶解的情况。
实施例3兔血栓溶解实验
兔耳缘静脉取血，24小时4℃自然凝血，取6mg栓体(该栓体为血液自然凝血而成，其主要成分为纤维蛋白，除纤维蛋白之外，还包括了血细胞)，与20μl上述实施例制备的连接有血栓抗体的分子马达室温反应60分钟，塞入毛细玻璃管中，加入10μl，4500U/ml的蚓激酶，封闭毛细管末端，对照组不光照，实验组冰上光照60分钟后，37℃反应6小时后观察试验结果，其中光照组以绿色封泥封闭，对照组以白色封泥封闭，可见两组初始状态一致，反应后光照组栓体溶解速度明显快于对照组，柱体长度约为对照组的50％。结果见附图9。
实施例4荧光标记兔血栓溶解实验
毛细玻璃管中的血栓在10μl，4500U/ml的蚓激酶作用下，血细胞首先从血栓中游离出来(图10A)，血细胞在血栓中占据的空间腾出来之后，纳米机器人通过连接的血栓抗体，进入到血栓内部(图10B)，加快溶栓药物的溶栓作用。结果见附图10。
上述实施例制备的纳米机器人用量子点进行荧光标记[参见Anal.Biochem.2007，364(2)：122-127]，在荧光显微镜下可见纳米机器人通过连接的血栓抗体，逐步进入到血栓内部。结果见附图11。图中荧光点为纳米机器人。实施例4与实施例3的区别在于实施例4中对纳米机器人进行了荧光标记。
实施例5动物体内纳米机器人与血栓的靶向结合实验(单荧光标记)
小鼠眼球取血0.5ml，注入1.5ml的聚乙烯管中，置于冰箱中，4℃保存24h，形成血栓，无菌生理盐水洗涤后备用。临用前用剪刀处理成小血栓，加入1ml生理盐水，然后冰上超声5分钟，进一步破碎形成血栓混悬液。取2月龄BALB/c小鼠1只，尾静脉注射血栓混悬液250μl，构建小鼠急性肺动脉栓塞模型(见图12)。图12A可见(血栓由箭头指示)，肺组织中多处血栓栓塞；图12B可见单个肺动脉管腔中的血栓。
通过尾静脉注射F1300标记的上述实施例制备的纳米生物机器人溶液100μl，1小时后断颈处死小鼠，冰冻切片观察肺动脉栓塞情况，可见荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。结果见图13。图13A是可见光下的肺血管栓塞图像，图13B是荧光下的肺栓塞图像(血栓由箭头指示)，血栓没有标记荧光，荧光物质F1300标记在纳米生物机器人上，血栓部位呈现荧光图像，而周围血管及肺组织中未见荧光物质，说明纳米生物机器人高度特异的靶向结合到血栓上。
实施例6动物体内纳米机器人与血栓的靶向结合实验(双荧光标记)
取1.5ml的聚乙烯管1支，加入0.1ml FITC标记的纤维蛋白原(10mg/ml)[制备参见Biochem.Biophys.Res.Commun.2008，377(1)：191-194]，小鼠眼球取血0.5ml，注入聚乙烯管中，充分混匀，避光4℃保存24h，形成FITC标记的血栓，无菌生理盐水洗涤后备用。临用前用剪刀处理成小血栓，加入1ml无菌生理盐水，然后冰上超声5分钟，进一步破碎形成血栓混悬液。取2月龄BALB/c小鼠1只，尾静脉注射血栓混悬液250μl，构建小鼠急性肺动脉栓塞模型。
通过尾静脉注射580nm的量子点[参见J.Phys.Chem.B.2007，111(41)：12024-12031.]标记的上述实施例制备的纳米生物机器人溶液100μl，1小时后断颈处死小鼠，冰冻切片观察肺动脉栓塞情况，可见荧光标记的纳米生物机器人与血栓的靶向结合。结果见图14-图17。图14中的血栓形态为附壁血栓，管腔未全部堵塞，是一个血管横切的图像。图15中的血栓形态是一个血管纵切的图像。图16是一个血管横切的图像。图14A-图16A是可见光下的肺血管栓塞图像，图14B-图16B是520nm荧光下的图像，图14C-图16C是580nm荧光下的图像。图17是图16对应血管经过共聚焦双荧光成像扫描后构建的双荧光叠加图像。血栓标记的荧光物质为FITC，呈现为绿光，分子马达标记的荧光物质为580nm的量子点，呈现为红色。血栓部位在不同波长(520nm和580nm)的荧光下，分别呈现绿色和红色荧光图像，而周围血管及肺组织中未见荧光物质，说明纳米生物机器人高度特异的靶向结合到血栓上。图17中清晰可见纤维状的纤维蛋白发出的绿色荧光附在血管壁上，指示出血栓的位置，而分子马达携带的量子点红色荧光与纤维状的血栓绿色荧光交织在一起，充分说明了纳米生物机器人与血栓的高度特异性结合，体现了靶向性。
实施例7动物体内血栓溶解实验
取1.5ml的聚乙烯管1支，加入0.1ml FITC标记的纤维蛋白原(10mg/ml)，小鼠眼球取血0.5ml，注入聚乙烯管中，充分混匀，避光4℃保存24h，形成FITC标记的血栓，无菌生理盐水洗涤后备用。临用前用剪刀处理成小血栓，加入1ml无菌生理盐水，然后冰上超声5分钟，进一步破碎形成血栓混悬液。取2月龄BALB/c小鼠9只，每只尾静脉注射血栓混悬液250μl，构建小鼠急性肺动脉栓塞模型。
取以上实施例制备的纳米生物机器人分成3组，每组3个样本，每个样本取100μl，共900μl。第1组冰上光照60分钟，第2组冰上光照45分钟，第3组不光照。通过尾静脉注射，将纳米生物机器人分别注入上述9只形成了急性肺动脉栓塞的小鼠体内，每只注射100μl。随后，每只小鼠注入尿激酶(Sigma)5U。
设置6个时间点，分别为注射后0分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，150分钟，在每个时间点取血10μl，取血方式为眼眶取血。血取出后置于已预先放入100μl，0.04％的Na2EDTA的ep管中，避光保存。4℃，4000g离心30分钟除去血细胞，采用微荧光测定仪[参见J.Phys.Chem.B.2007，111(41)：12024-12031.]对小鼠各个时间点的血浆荧光值进行测定，结果见图18。
由图18可见，分子马达辅助药物溶栓组中小鼠血液中的荧光强度值高峰前移，与单纯药物溶栓组比较，荧光强度高峰前移30分钟，说明分子马达促进了溶栓药物的作用，加速了血栓溶解，而血栓的快速溶解具有重要的临床治疗意义。(注：数据进行了归一化处理，样本例数N＝3)。
Claims (10)
1.一种纳米生物机器人，其包括载色体，该载色体上含有分子马达F0F1-ATPase，其中所述F0F1-ATPase不含δ亚基，并且所述F0F1-ATPase的α或β亚基上连接有纳米蛋白粒子。
2.根据权利要求1的纳米生物机器人，其中所述α或β亚基是经由抗α或β亚基抗体与所述纳米蛋白粒子连接，其中所述抗α或β亚基抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
3.根据权利要求2的纳米生物机器人，其中所述抗α或β亚基抗体是通过生物素-链酶抗生物素-生物素与所述纳米蛋白粒子连接。
4.根据权利要求1的纳米生物机器人，其中所述纳米蛋白粒子的粒径在10nm至100nm范围内，优选在20nm至50nm范围内。
5.根据权利要求1的纳米生物机器人，其中所述纳米蛋白粒子进一步与一个DNA片段连接。
6.根据权利要求1的纳米生物机器人，其中所述纳米蛋白粒子进一步与一个DNA片段连接，所述DNA片段与另一个DNA片段结合，所述另一个DNA片段的5’和3’端的序列分别与所述纳米蛋白粒子上的所述DNA片段互补。
7.根据权利要求1的纳米生物机器人，其中所述载色体进一步与导向分子连接。
8.根据权利要求7的纳米生物机器人，其中所述导向分子是抗体或核酸，优选所述导向分子是纤维蛋白原抗体，该纤维蛋白原抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
9.根据权利要求8的纳米生物机器人，其中所述纤维蛋白原抗体是纤维蛋白原多抗，并且通过生物素-链酶抗生物素-连接脂质的生物素与所述载色体连接。
10.根据权利要求1-9任一项所述的纳米生物机器人在制备辅助药物中的应用，所述辅助药物用于促进活性药物在目标区域的扩散。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120905 Termination date: 20141217 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |