CN108949701A - 一种猴类脑区的病毒注射方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猴类的病毒注射方法及应用,尤其涉及一种猴类脑区的病毒注射方法及应用。所述猴类的病毒注射方法主要包括:将病毒包装后,在病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒(即纳米机器人),用脊髓穿孔技术将其注入猴类脊髓液中;最后在外部磁场的控制下,引导修饰后的病毒进入目的脑区。与现有技术相比,本发明的方法对猴脑没有创伤,不会激活猴脑中的免疫反应,在释放病毒时提高猴脑中病毒表达的效率;通过磁感应蛋白和计算机控制下的磁力的配合,使修饰后的病毒可以散在分布,在大面积的目的脑区表达,大幅度提高了病毒的表达效率。
Description
技术领域
本发明涉及非人灵长类模式动物病毒研究领域,具体涉及一种猴类的病毒注射方法及应用,尤其涉及一种猴类脑区的病毒注射方法及应用。
背景技术
猴类作为非人灵长类模式动物常被用在人类疾病的研究中,但神经环路疾病方面的研究仍旧没有突破,主要原因是研究神经环路用的工具病毒很难在猴类目的脑区表达。传统的猴类脑区病毒注射方式与捏齿类动物相似,首先用混合麻醉药麻醉猴类;其次,在常规消毒后,切开猴类的头皮,保留颅骨,固定猴脑,将颧弓和正中矢状缝定为骨性标志,参照猴类脑立体定位图谱确定注射位点,结合磁共振的方式进行目的脑区定位,用钢制针吸取病毒后进行注射。
然而,采用上述方法,在猴类脑区的病毒表达效果往往达不到实验要求。其中,首要的技术难点在于病毒本身会引起猴类机体的免疫反应,产生抗体中和病毒。其次,仅从一个位点注射,病毒很难扩散到大面积区域;注射一个面积较大脑区需要消耗大量病毒,另外对病毒滴度要求也很高。再次,病毒注射需要在猴类颅骨上开窗,这会激活免疫系统,产生抗体中和病毒;有研究表明,可以通过修饰病毒的抗原基因,达到修改表面抗原的效果,最终降低免疫反应提高病毒表达效率;然而,手术创伤引起的免疫反应往往不能通过上述手段得到缓解。
2016年诺贝尔化学奖授予法国斯特拉斯堡大学的让-皮埃尔·索瓦(Jean-PierreSauvage)、美国西北大学的詹姆斯·弗雷泽·司徒塔特(Sir J.Fraser Stoddart)以及荷兰格罗宁根大学的伯纳德·费灵格(Bernard L.Feringa),以奖励他们“在分子机器的设计和合成”方面的贡献。1983年,Jean-Pierre Sauvage将两个环状分子连成链状,命名为索烃。1991年,Sir J.Fraser Stoddart成功制备轮烷,其中一个分子为链状,一个分子为环状,环状分子可绕链状分子转动。1999年,Bernard L.Feringa制备了一种能够在供给能量时持续朝一个方向转动的分子发动机,即马达蛋白(分子马达)。将马达蛋白装载在分子机械中,即可让其在机体内移动。若在分子机械上耦合一个磁力或者电力传感器,即可在外部磁场的控制下,让分子机械在机体内移动。
纳米技术已经在肿瘤研究方面取得重要进展,2016年8月蒙特利尔工学院的Sylvain Martel团队研制的纳米机器人可以在人体血管中自由移动,并且能精准地识别癌症细胞并且投递药物,治疗癌症;Sachar Arnon在Plos one上发表了可在意识控制下的纳米机器人,能释放药物治疗癫痫;具体为:将DNA折叠后形成有空腔的纳米机器人,将药物首先经过化学处理,用氧化铁颗粒将药物“锁住”,然后放入纳米机器人的空腔壳中;然后用电磁铁加热并破坏纳米机器人的DNA结构的壳,释放出药物。
因此,受纳米机器人技术在肿瘤研究方面的启发,将马达蛋白和磁力或电力传感器组装成纳米机器人,并应用在猴类脑区病毒注射方面成为研究人员的主要研究方向,这对于非灵长类模式动物的研究尤其在人类神经环路疾病的研究方面将产生重要的影响。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种猴类脑区的病毒注射方法及应用;所述方法将病毒包装后,在病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒(即纳米机器人),用脊髓穿孔技术将其注入猴类脊髓液中,最后在外部磁场的控制下,引导修饰后的病毒进入目的脑区。
为达此目的,本发明采用了以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种猴类脑区的病毒注射方法,所述猴类脑区的病毒注射方法包括以下步骤:
(1)病毒包装:将载有目的基因和/或报告基因的质粒载体片段插入修饰后的病毒基因组,构建病毒质粒并进行包装,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:将猴类麻醉后形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;
(4)定位目的脑区:手术缝合伤口并康复后,固定猴脑,定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区,再在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑固定、脱水后,用组织液包埋切片,在荧光显微镜下通过观察目的基因或报告基因的表达检测修饰后的病毒的表达情况。
本发明中,所述目的基因为实现特异性控制神经元的基因,如在某类神经元里特异表达基因,所述报告基因为GFP或mCherry。
在本发明中,步骤(1)所述对病毒进行包装为本领域的常规方法,在此不做特殊限定;所述病毒基因组为腺相关病毒和慢病毒的基因组,在作为病毒工具之前基因组经过修饰,其致病性的基因片段被剪切,最终导致该病毒没有毒性;
根据本发明,步骤(1)所述构建病毒质粒具体包括:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有目的基因或报告基因的质粒载体片段和修饰后的病毒基因组连接;
优选地,所述修饰后的病毒基因组为致病性基因被剪切后的无毒性的病毒基因组。
优选地,步骤(1)所述包装具体包括:将所述病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖,并进行提纯、滴度测试和表达测试。
优选地,步骤(3)具体包括:将猴类麻醉后,剥离脊髓,并在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中。
优选地,所述剥离为采用用手术刀剥离脊髓,所述穿洞为用颅骨钻在脊髓上穿洞;所述方法避免了现有技术中在颅骨上开窗的步骤,猴脑没有创伤,因此不会激活猴脑中的免疫反应,在释放病毒时提高猴脑中病毒表达的效率。
优选地,步骤(4)所述手术缝合为:先用生物组织胶将伤口粘合,然后用手术缝合线进行伤口的缝合;
优选地,在步骤(4)所述手术缝合后还包括:用利多卡因止痛,用碘伏消毒。
优选地,步骤(4)所述定位目的脑区位置为使用核磁共振方法定位目的脑区的位置。
优选地,步骤(6)所述将释放了病毒的猴脑固定为:用福尔马林和/或多聚甲醛固定释放了病毒的猴脑。
优选地,步骤(6)中所述脱水为用质量分数为25-35%,例如可以是25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%,优选为30%的蔗糖脱水。
优选地,所述猴类脑区的病毒注射方法包括以下步骤:
(1)病毒包装:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有目的基因或报告基因的质粒载体片段和修饰后的病毒基因组连接,构建病毒质粒;将病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖;进行提纯、滴度测试和表达测试,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:猴类麻醉后,用手术刀剥离脊髓,并用颅骨钻在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;
(4)定位目的脑区:先用生物组织胶将伤口粘合,用手术缝合线进行伤口的缝合,同时用利多卡因止痛,用碘伏消毒;康复后固定猴脑,使用核磁共振方法定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区;再在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑用福尔马林或多聚甲醛固定、用质量分数为30%的蔗糖脱水后,用组织液包埋切片,在荧光显微镜下通过观察目的基因或报告基因的表达检测修饰后的病毒的表达情况。
另外,本发明中的病毒可替换成药物,利用本发明的方法进行药物注射;磁感应蛋白可替换成电场感应蛋白,并用计算机控制电场的大小和方向,推动病毒或药物在体内的移动。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的方法在猴类脑区病毒注射方面的应用。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明的方法与传统的猴类脑区病毒注射方法相比,用在脊髓上穿洞代替了传统方法的在猴类颅骨上开窗,对猴脑没有创伤,不会激活猴脑中的免疫反应,在释放病毒时提高猴脑中病毒表达的效率;
(2)本发明的方法将包装后的病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒(即纳米机器人);通过计算机控制磁力的大小和方向,由于病毒外壳上偶联了能感应磁力的磁感应蛋白从而能跟随磁力运动,因此能将修饰后的病毒导向目的脑区,随后使磁力消失,因此修饰后的病毒可以在所处位置散开,实现散在分布,在大面积的目的脑区表达,大幅度提高了病毒的表达效率。
具体实施方式
为便于理解本发明,本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1向猴类脑区注射病毒
(1)病毒包装:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有GFP基因的质粒载体片段和修饰后的腺病毒基因组连接,构建病毒质粒;将病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖;然后进行提纯、滴度测试和表达测试,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上化学偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:猴类麻醉后,用手术刀剥离脊髓,并用颅骨钻在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;
(4)定位目的脑区:先用生物组织胶将伤口粘合,然后用手术缝合线进行伤口的缝合,同时用利多卡因止痛,用碘伏消毒;康复后,固定猴脑,使用核磁共振方法定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区;随后,在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑用福尔马林固定、用质量分数为30%的蔗糖脱水后,用组织液包埋切片。
实施例2向猴类脑区注射病毒
(1)病毒包装:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有GFP基因的质粒载体片段和修饰后的腺病毒基因组连接,构建病毒质粒;将病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖;然后进行提纯、滴度测试和表达测试,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上化学偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:猴类麻醉后,用手术刀剥离脊髓,并用颅骨钻在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;修饰后的病毒注入量与实施例1相同;
(4)定位目的脑区:先用生物组织胶将伤口粘合,然后用手术缝合线进行伤口的缝合,同时用利多卡因止痛,用碘伏消毒;康复后,固定猴脑,使用核磁共振方法定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区;随后,在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑用多聚甲醛固定、用质量分数为25%的蔗糖脱水后,用组织液包埋切片。
实施例3向猴类脑区注射病毒
(1)病毒包装:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有GFP基因的质粒载体片段和修饰后的慢病毒基因组连接,构建病毒质粒;将病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖;然后进行提纯、滴度测试和表达测试,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上化学偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:猴类麻醉后,用手术刀剥离脊髓,并用颅骨钻在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;修饰后的病毒注入量与实施例1相同;
(4)定位目的脑区:先用生物组织胶将伤口粘合,然后用手术缝合线进行伤口的缝合,同时用利多卡因止痛,用碘伏消毒;康复后,固定猴脑,使用核磁共振方法定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区;随后,在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑用福尔马林固定、用质量分数为35%的蔗糖脱水后,用组织液包埋切片。
实施例4向猴类脑区注射病毒
(1)病毒包装:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有GFP基因的质粒载体片段和修饰后的慢病毒基因组连接,构建病毒质粒;将病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖;然后进行提纯、滴度测试和表达测试,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上化学偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:猴类麻醉后,用手术刀剥离脊髓,并用颅骨钻在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;修饰后的病毒注入量与实施例1相同;
(4)定位目的脑区:先用生物组织胶将伤口粘合,然后用手术缝合线进行伤口的缝合,同时用利多卡因止痛,用碘伏消毒;康复后,固定猴脑,使用核磁共振方法定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区;随后,在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑用多聚甲醛固定、用质量分数为30%的蔗糖脱水后,用组织液包埋切片。
对比例1
与实施例1相比,除步骤(3)为在猴类颅骨上开窗并注入病毒外,其它与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比,除省略步骤(2)外,其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例2相比,除步骤(3)为在猴类颅骨上开窗并注入病毒外,其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例2相比,除省略步骤(2)外,其它与实施例1相同。
实施例5病毒表达检测
将实施例1-4和对比例1-4中制备得到的切片在荧光显微镜下观察GFP或mCherry基因的表达情况,以检测修饰后的病毒的表达效率。
经多次重复,对比例1和3相比于实施例1-4,GFP基因在目的脑区的表达明显减少,说明病毒的表达效率明显偏低,说明本发明采用在脊髓上穿洞代替了传统方法的在猴类颅骨上开窗,对猴脑没有创伤,不会激活猴脑中的免疫反应,在释放病毒时提高猴脑中病毒表达的效率。对比例2和4相比于实施例1-4,GFP基因在目的脑区的表达明显减少,说明病毒的表达效率明显偏低,说明采用本发明的方法将包装后的病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒(即纳米机器人);通过计算机控制磁力的大小和方向,由于病毒外壳上偶联了能感应磁力的磁感应蛋白从而能跟随磁力运动,因此能将修饰后的病毒导向目的脑区。随后使磁力消失,因此修饰后的病毒可以在所处位置散开,实现散在分布,在大面积的目的脑区表达,大幅度提高了病毒的表达效率。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程,但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (8)
1.一种猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,所述猴类脑区的病毒注射方法包括以下步骤:
(1)病毒包装:将载有目的基因和/或报告基因的质粒载体片段插入修饰后的病毒基因组,构建病毒质粒并进行包装,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:将猴类麻醉后形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;
(4)定位目的脑区:手术缝合伤口并康复后,固定猴脑,定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区,再在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑固定、脱水后,用组织液包埋切片,在荧光显微镜下通过观察目的基因或报告基因的表达检测修饰后的病毒的表达情况。
2.如权利要求1所述的猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,步骤(1)所述构建病毒质粒具体包括:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有目的基因或报告基因的质粒载体片段和修饰后的病毒基因组连接;
优选地,所述修饰后的病毒基因组为致病性基因被剪切后的无毒性的病毒基因组;
优选地,步骤(1)所述包装具体包括:将所述病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖,并进行提纯、滴度测试和表达测试。
3.如权利要求1或2所述的猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,步骤(3)具体包括:将猴类麻醉后,剥离脊髓,并在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;
优选地,所述剥离为采用手术刀剥离脊髓;
优选地,所述穿洞为用颅骨钻在脊髓上穿洞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,步骤(4)所述手术缝合为:先用生物组织胶将伤口粘合,然后用手术缝合线进行伤口的缝合;
优选地,在步骤(4)所述手术缝合后还包括:用利多卡因止痛,用碘伏消毒。
5.如权利要求1-4中任一项所述的猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,步骤(4)所述定位目的脑区位置为使用核磁共振方法定位目的脑区的位置。
6.如权利要求1-5中任一项所述的猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,步骤(6)所述将释放了病毒的猴脑固定为用福尔马林和/或多聚甲醛固定释放了病毒的猴脑;
优选地,步骤(6)中所述脱水为用质量分数为25-35%,优选为30%的蔗糖脱水。
7.如权利要求1-6中任一项所述的猴类脑区的病毒注射方法,其特征在于,所述猴类脑区的病毒注射方法包括以下步骤:
(1)病毒包装:利用DNA连接酶将具有互补粘性末端的载有目的基因或报告基因的质粒载体片段和修饰后的病毒基因组连接,构建病毒质粒;将病毒质粒转染到239T细胞中,进行病毒质粒的增殖;进行提纯、滴度测试和表达测试,得到包装后的病毒;
(2)病毒修饰:在包装后的病毒外壳裸露的表面残基上偶联磁感应蛋白、马达蛋白和ATP,形成修饰后的病毒;
(3)病毒注射:猴类麻醉后,用手术刀剥离脊髓,并用颅骨钻在脊髓上穿洞而形成伤口,将修饰后的病毒从伤口处注射到脊髓液中;
(4)定位目的脑区:先用生物组织胶将伤口粘合,用手术缝合线进行伤口的缝合,同时用利多卡因止痛,用碘伏消毒;康复后,固定猴脑,使用核磁共振方法定位目的脑区的位置;
(5)病毒靶向目的脑区:用计算机控制磁力的大小和方向,在磁力的推动下将修饰后的病毒靶向目的脑区;再在计算机的控制下使磁力消失,病毒随即释放到目的脑区;
(6)病毒表达检测:将释放了病毒的猴脑用福尔马林或多聚甲醛固定、用质量分数为30%的蔗糖脱水后,用组织液包埋切片,在荧光显微镜下通过观察目的基因或报告基因的表达检测修饰后的病毒的表达情况。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法在猴类脑区病毒注射方面的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20181207 |