CN110124047A - 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系 - Google Patents

一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系 Download PDF

Info

Publication number
CN110124047A
CN110124047A CN201910340438.7A CN201910340438A CN110124047A CN 110124047 A CN110124047 A CN 110124047A CN 201910340438 A CN201910340438 A CN 201910340438A CN 110124047 A CN110124047 A CN 110124047A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
single stranded
stranded dna
key
hydrophobic drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910340438.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110124047B (zh
Inventor
樊春海
王丽华
赵彦
李凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Original Assignee
Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institute of Applied Physics of CAS filed Critical Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority to CN201910340438.7A priority Critical patent/CN110124047B/zh
Publication of CN110124047A publication Critical patent/CN110124047A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110124047B publication Critical patent/CN110124047B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法，包括将至少一条单链DNA和疏水性药物分子通过共价键连接形成共价连接产物；将共价连接产物和剩余的单链DNA加入含有镁离子的第一缓冲液中进行反应，组装成DNA纳米结构和疏水性药物分子的复合物，剩余的单链DNA与共价连接产物的单链DNA自组装形成具有锁的DNA纳米结构，疏水性药物分子被锁在DNA纳米结构的内侧；提供钥匙，所述钥匙与所述锁配合以使得疏水性药物分子从所述纳米结构暴露，从而提供DNA纳米机器人载药体系。本发明还提供由此得到的DNA纳米机器人载药体系。本发明用于活细胞内药物分子的靶向输送和可控释放，在重大疾病的智能诊疗中具有广阔的应用前景。

Description

一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA 纳米机器人载药体系
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA纳米机器人载药体系。
背景技术
2016年诺贝尔化学奖授予Bernard L.Feringa,Jean-Pierre Sauvage和J.FraserStoddart三位教授，以表彰他们在分子机器领域的杰出贡献。分子机器是由一系列分子结构基元组装而成的，在外部刺激下可以产生机械运动的分子设备。其中由核酸或蛋白组装形成的智能分子机器因其独特的拓扑结构、动态变化特性以及丰富的外部刺激来源，在肿瘤诊断和治疗中展现出独特的优势。
DNA不仅可以作为遗传信息的载体，由DNA分子经碱基互补配对形成的自组装DNA纳米结构是一类具有精确结构和尺寸的纳米生物材料，同时具备多个化学反应位点、手性性质等特点，在众多领域都有广泛的应用前景。研究表明，DNA纳米结构生物安全性好，细胞摄取效率高，并且可以被动靶向至肿瘤细胞，是良好的药物转运载体。而由DNA分子精确自组装形成的DNA纳米结构在制备智能纳米机器中应用广泛。这些纳米机器可感知外源刺激或环境因子变化，实现实时细胞内传感、细胞成像和智能药物转运。除细胞外的应答，也已证实了DNA纳米机器可在细胞内应用。
目前，DNA纳米结构荷载药物分子多通过嵌入DNA双螺旋或物理吸附的方式，经细胞摄取后进入溶酶体。随后，在溶酶体内发生DNA纳米结构的降解并释放药物分子。然而在细胞内将药物完全释放所需时间较长，并且释放过程难以控制。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的DNA纳米结构作为药物载体时无法控制释放过程的问题，本发明提供一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA纳米机器人载药体系。
本发明提供一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法，包括以下步骤：S1，提供多条单链DNA和疏水性药物分子，将至少一条单链DNA和疏水性药物分子通过共价键连接形成共价连接产物；S2，将共价连接产物和剩余的单链DNA加入含有镁离子的第一缓冲液中进行反应，基于Watson-Crick原理有序组装成DNA纳米结构和疏水性药物分子的复合物，其中，剩余的单链DNA与共价连接产物的单链DNA自组装形成具有锁的DNA纳米结构，其中，疏水性药物分子被锁在DNA纳米结构的内侧；S3，提供钥匙，所述钥匙与所述锁配合以使得疏水性药物分子从所述纳米结构暴露，从而提供DNA纳米机器人载药体系。
应该理解，疏水性药物分子与单链DNA的共价连接位点应该在设计阶段进行筛选，以确保其在步骤S2中位于DNA纳米结构的内侧。
优选地，所述锁为位于单链DNA上的锁链，所述钥匙为单独的钥匙链，所述钥匙链和所述锁链为可杂交的DNA序列。在优选的实施例中，所述钥匙链与所述锁链杂交发生链取代反应，可以将六螺旋完全打开形成两个三螺旋结构，暴露出六螺旋结构的内腔，从而使连接的疏水性药物分子发挥作用。
优选地，所述锁为位于单链DNA上的与ATP分子结合的适配体序列，所述钥匙为小分子ATP。在优选的实施例中，所述小分子ATP与所述适配体序列杂交，可以将六螺旋的一侧打开，暴露出六螺旋结构的内腔，从而使连接的疏水性药物分子发挥作用。所述单链DNA上还具有与该适配体序列互补的DNA序列。
优选地，所述锁为位于单链DNA上的与核仁素蛋白分子结合的适配体序列，所述钥匙为核仁素蛋白。在优选的实施例中，所述核仁素蛋白与所述适配体序列杂交，可以将六螺旋的一侧打开，暴露出六螺旋结构的内腔，从而使连接的疏水性药物分子发挥作用。所述单链DNA上还具有与该适配体序列互补的DNA序列。
优选地，所述第一缓冲液为含有氯化镁或醋酸镁的缓冲液。在一个优选的实施例中，该第一缓冲液为含有5-125mmol/L氯化镁或醋酸镁的缓冲液。应该理解，该第一缓冲液用于中和核酸的负电荷，更有利于自主装过程中的DNA杂交。
优选地，共价连接产物、剩余的单链DNA和第一缓冲液组成的混合溶液进行退火处理。具体地，将混合溶液在95℃进行热变性，再缓慢过夜降至室温完成整个退火过程。
优选地，所述步骤S1具体包括：提供多条单链DNA和带有功能基团的疏水性药物分子，其中，至少一条单链DNA为功能化单链DNA；将功能化单链DNA溶于水中形成单链DNA水溶液，将疏水性药物分子溶于有机溶剂中形成疏水性药物分子溶液；将单链DNA水溶液与疏水性药物分子溶液加入第二缓冲液中进行反应，使得功能化单链DNA与疏水性药物分子的功能基团发生偶联反应形成共价键，以得到单链DNA和疏水性药物分子的共价连接产物。
优选地，所述单链DNA的序列的长度介于1-120bp之间。应该理解，其他长度的单链DNA同样可以用在本发明中。
优选地，发生偶联反应的反应温度为25-50℃，反应时间为2-24小时。
优选地，所述功能化单链DNA选自以下单链DNA中的至少一种：羧基修饰单链DNA、氨基修饰单链DNA、巯基修饰单链DNA、叠氮基修饰单链DNA、炔基修饰单链DNA、SMCC修饰单链DNA、或硫代磷酸化单链DNA。
优选地，所述功能化单链DNA通过在单链DNA的3’端、5’端、和/或链内修饰至少一个官能团制备得到。
优选地，剩余的单链DNA为非功能化单链DNA。应该理解，提供的多条单链DNA中的每条单链DNA也可以均为功能化单链DNA，其同样通过自组装形成DNA纳米结构。
优选地，DNA纳米结构为一维、二维、或三维结构。一维DNA纳米结构可以是空心DNA纳米管、实心DNA纳米线。二维DNA纳米结构可以是以长方形、笑脸为代表的对称结构和以中国地图为代表的非对称结构。三维DNA纳米结构可以是四面体、多面立方体、长方体、乐高积木、以花瓶为代表的三维曲率折纸，例如六螺旋结构。优选地，DNA纳米结构的尺寸介于1-1000纳米之间。
优选地，所述疏水性药物分子选自以下药物小分子中的至少一种：美登素、卡奇霉素、奥斯他汀、多卡米星、或蒽环类药物。
优选地，所述疏水性药物分子的功能基团选自以下基团中的至少一种：羧基、氨基、巯基、叠氮基、炔基、SMCC、或硫代磷酸基团。
优选地，所述共价键选自以下化学键中的至少一种：酰胺键、磷脂键、或咪唑键。
优选地，所述有机溶剂选自以下溶剂中的至少一种：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、或二甲基甲酰胺。
优选地，所述第二缓冲液选自以下缓冲液中的至少一种：磷酸盐缓冲液、Tris-HCl、HEPES、TAE-Mg、或TBE。应该理解，缓冲液被用来将反应体系维持在略碱性的环境下。例如，磷酸盐缓冲液将反应体系维持在碱性pH7.2下。通常，该反应体系被维持在pH6.5-7.5的条件下以确保偶联反应的进行，同时避免反应物发生竞争反应。
本发明还提供上述的方法得到的DNA纳米机器人载药体系，其中，该DNA纳米机器人载药体系包括由DNA纳米结构和疏水性药物分子共价连接的复合物。
本发明的DNA纳米结构具有高度的空间可寻址性，可以精确控制药物分子的载带数目，无需反复进行产品试验；DNA纳米结构稳定性高、生物安全性好，是一种良好的药物转运载体。而且，本发明制备的智能DNA纳米机器人载药体系，可以实现药物分子在靶向位点的可控释放。总之，本发明构建了一种智能DNA纳米机器人体系用于活细胞内药物分子的靶向输送和可控释放，在重大疾病的智能诊疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是根据本发明的一个优选实施例的一种智能DNA纳米机器人载药体系在活细胞内运行的工作原理示意图；
图2a是以DNA单链为钥匙的DNA纳米机器人的序列设计图；
图2b是图2a对应的示意图；
图3a是以ATP为钥匙的DNA纳米机器人的序列设计图；
图3b是图3a对应的示意图；
图4a是以核仁素为钥匙的DNA纳米机器人的序列设计图；
图4b是图4a对应的示意图；
图5是加钥匙链后6HB-key strands的电泳表征图；
图6是加钥匙链前后6HB-key strands的原子力显微镜表征图；
图7是加钥匙链前后6HB-key strands-FRET的荧光光谱图；
图8是加钥匙链后FRET效率变化的时间动力学表征；
图9a-图9c分别是ssDNA、S-ssDNA和6HB-key strands在RPMI 1640培养基中的稳定性表征，在每个胶图中，条带1是DNA marker，条带2是未与培养基孵育的DNA样品，条带3-10依次是2uL DNA样品与8uL培养基孵育0min，30min，1h，2h，3h，6h，12h，24h；
图9d是对图9a-图9c中的条带的灰度值计算，得到DNA样品稳定性的定量变化；
图10a-图10d分别是激光共聚焦显微镜拍摄的MCF-7细胞对ssDNA，S-ssDNA，3HB和6HB的细胞摄取；
图11是流式细胞仪统计MCF-7细胞对ssDNA,S-ssDNA,3HB和6HB的摄取量；
图12是激光共聚焦显微镜拍摄的钥匙链和6HB在细胞内的定位，以及两种材料的共定位分析；
图13a是激光共聚焦显微镜拍摄的有无钥匙链的6HB-key strands在MCF-7细胞内的FRET效果；
图13b是分别对10个细胞FRET效率的统计结果；
图14是有无ATP分子时6HB-ATP结构的细胞外光谱图；
图15a是6HB-ATP和6HB-key strands在MCF-7细胞内的成像情况；
图15b是分别对10个细胞FRET效率的统计结果；
图16是有无核仁素蛋白时6HB-NCL结构的细胞外光谱图；
图17a是6HB-NCL和6HB-key strands在MCF-7细胞内的成像情况；
图17b是分别对10个细胞FRET效率的统计结果
图18a是单链DNA连接DM1的示意图；
图18b是DNA单链连接DM1后的电泳表征，其中条带1为20bp DNA marker，条带2为DNA，条带3为DNA-DM1；
图18c是DNA-DM1的质谱表征；
图18d是高效液相色谱对DNA-DM1和DM1的水溶性表征；
图19是6HB装载DM1后的电泳表征图，其中条带1为20bp DNA marker，条带2为6HB，条带3为6HB-DM1；
图20a是有无钥匙链时，加入6HB-key strands-DM1后SK-BR-3细胞的存活率比较的MTT结果；
图20b是图20a对应的激光共聚焦结果。
具体实施方式
下面结合附图，给出本发明的较佳实施例，并予以详细描述。
如图1所示，根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的基本原理包括：在体外构建DNA纳米结构载药体系，然后该载药体系经内吞作用被摄取进入活细胞内部，随后加入钥匙链，在细胞内将六螺旋DNA纳米结构打开并释放药物分子，最终观察到该细胞的凋亡。
例1以DNA单链为钥匙的智能DNA纳米机器人的活细胞内运行
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法首先包括提供多条单链DNA。
在本实施例中，由上海生工公司合成20条寡核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:1-SECQ ID NO:20所示，其中，SECQ ID NO:7的3’端具有5个碱基的第一锁链GGGCG，SECQ ID NO:8的3’端具有5个碱基的第二锁链CGGCC，SECQ ID NO:17的3’端具有5个碱基的第三锁链TTGGA，SECQ ID NO:18的3’端具有5个碱基的第四锁链CGTTAT。
具体地，从5’端到3’端，
SECQ ID NO:1(6-HB-1)：
CAGTTGACTGCTAGTACCTGAGCACTGAATGCGATGTAGAAGTAGCTCTGCTCCATC；
SECQ ID NO:2(6-HB-2)：
CGACTTGATGGAGCAGACCTATCGTCAC；
SECQ ID NO:3(6-HB-3)：
AGGCAGATACGAAGAGCGAGGCTATGTCGTAGATAGTTCTCGCACGACGCTAGACAC
SECQ ID NO:4(6-HB-4)：
GCAGTCAACTG
SECQ ID NO:5(6-HB-5)：
CGGTACGTGACGATAGGACACATCAGATGTCTTAGGAGAGGTCACAGTAACCTTCGACAATCT
SECQ ID NO:6(6-HB-6)：
AGATTGTCGAACGTATCTGCCT
SECQ ID NO:7(6-HB-7)：
GAACTATGACATCTGATGTGTGCTACTTGTCACCAGGGCG
SECQ ID NO:8(6-HB-8)：
CGCTCTTGGTTACTGTGACCTGTGCTCACGAGGACCGGCC
SECQ ID NO:9(6-HB-9)：
GCATTCACTCCTAACTACGAC
SECQ ID NO:10(6-HB-10)：
TCTAGCGTGTCTAGCGT
SECQ ID NO:11(6-HB-11)：
TGTCCGTGCAACCGATCAATCC
SECQ ID NO:12(6-HB-12)：
GCCTAGCGATCCAATGGAACGACCGTATTGCTGAGGTGAGTGTATGTATCACTTGCACGGACA
SECQ ID NO:13(6-HB-13)：
CTGTACCGTTG
SECQ ID NO:14(6-HB-14)：
GGATTGATCGGATGCCAGACGCATCGGATTCGATGAGCCTACTCGACCAACTCAACG
SECQ ID NO:15(6-HB-15)：
GGCAATGTCCACCATTGGATCG
SECQ ID NO:16(6-HB-16)：
CAACGGTACAGTGGTGACTCCAACCTTGTAACGTCCTCGATAACGCTGGACATTGCC
SECQ ID NO:17(6-HB-17)：
GGAGGCGTGCGACTGGCATGTGATACATACACTGGTTGGA
SECQ ID NO:18(6-HB-18)：
GGATGATAGCCTGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
SECQ ID NO:19(6-HB-19)：
GTTACAACACCTCACGAATCC
SECQ ID NO:20(6-HB-20)：
GCACCACGTTGAGTTGG
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法接下来包括将多条单链DNA加入含有镁离子的缓冲液中进行反应，基于Watson-Crick原理有序组装成DNA纳米结构。
在本实施例中，将核苷酸序列分别为SECQ ID NO:1-SECQ ID NO:20的单链DNA进行自组装以形成六螺旋DNA纳米结构(6-helix bundle，6-HB)，也被称为钥匙链开关的6-HB(6-HB-key strands)。具体地，每条DNA单链以1μmol/L(即1uM)的终浓度混合于合成缓冲液(40mM Tris，20mM醋酸，2mM EDTA，125mM醋酸镁，pH 8.0)中，终体积为100μL。将混合好的溶液置于DNA低吸附管，使其悬浮于95℃热水中，缓慢过夜降温至25℃，而后取出备用。此时6-HB的终浓度为1uM。
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法接下来包括提供至少一条钥匙链。
在本实施例中，由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SECQID NO:21-SECQ ID NO:24所示，其中，SECQ ID NO:21为第一钥匙链，其与核苷酸序列为SECQ ID NO:7的第一锁链GGGCG适配；SECQ ID NO:22为第二钥匙链，其与核苷酸序列为SECQ ID NO:8的第二锁链CGGCC适配；SECQ ID NO:23为第三钥匙链，其与核苷酸序列为SECQ ID NO:17的第三锁链TTGGA适配；SECQ ID NO:24为第四钥匙链，其与核苷酸序列为SECQ ID NO:18的第四锁链CGTTAT适配。
具体地，从5’端到3’端，
SECQ ID NO:21(key-cstr7)：
CGCCCTGGTGAC
SECQ ID NO:22(key-cstr8)：
GGCCGGTCCTCG
SECQ ID NO:23(key-cstr17)：
GCGGGGATGTAG
SECQ ID NO:24(key-cstr18)：
GCGCGTAGTACC
根据本发明的DNA纳米机器人载药体系的制备方法接下来包括提供使钥匙链与DNA纳米结构发生链取代反应。
在本实施例中，在6-HB的溶液中，分别加入4倍摩尔浓度的第一钥匙链、第二钥匙链、第三钥匙链和第四钥匙链，37℃孵育30min可将6-HB打开形成3HB，即三螺旋DNA纳米结构。
6％PAGE表征6-HB的合成以及打开效果
配置6％的PAGE分离胶(40％Acr-Bis，0.9mL；超纯水，4.5mL；10×TAE缓冲液，0.6mL；10％APS，60uL)，待胶凝好后置于1×TAE缓冲液中，将6-HB和3HB分别与6×上样缓冲液按体积5:1混合均匀，上样，用DL2000的DNA marker，100V室温电泳90min，最后Gel Red按1:10000进行稀释，染色15min后置于G:Box.Chem.XL1.4成像仪中成像。
结果如图5所示，其中，条带1是DL 2000DNA标记物，自上而下依次是2000、1000、750、500、250、100bp，条带2是6-HB打开后形成的3HB，条带3是6-HB。显然，6-HB条带单一，表明合成效率较高；加入钥匙链后随着6-HB打开形成3HB，分子量降低，条带迁移变快，并且打开效率可达90％以上。
AFM表征6-HB打开前后的形貌
用Q水(高纯水)冲洗云母片并吹干，分别滴加5uL终浓度为10nM的3HB和6-HB至云母片表面，吸附1min后用Q水冲洗并吹干，随后用AFM扫描成像。
由图6所示，3HB高度1.3nm，为6-HB高度的一半，这一结果与PAGE相符，即钥匙链对6-HB的打开效果较好，效率高。
荧光共振能量转移(FRET)表征6-HB打开效率
由上海生工公司合成2条寡核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:25-SECQ ID NO:26所示，其中，SECQ ID NO:25是在核苷酸序列为SECQ ID NO:9的单链DNA的3’端修饰荧光标记Cy3，SECQ ID NO:26是在核苷酸序列为SECQ ID NO:18的单链DNA的中间修饰荧光标记Cy5。
具体地，从5’端到3’端，
SECQ ID NO:25(Cy3-6-HB-9)：
GCATTCACTCCTAACTACGAC-Cy3
SECQ ID NO:26(Cy5-6-HB-18)：
GGATGT-Cy5-TAGCCTGGCTCATGCAATACG GTCGTTGCGTTAT
如图2a所示，在6-HB上标记了Cy3-Cy5的FRET对得到6-HB-key strands-FRET，加入钥匙链孵育30min后，随着6-HB打开形成2个3HB，荧光分子间距增大，导致FRET现象消失(图7)。荧光动力学研究表明，这一打开过程大约需要10min(图8)，即钥匙链对6-HB的打开效率高、速度快。其中，6-HB-key strands-FRET所需的序列是将6-HB-key strands中6-HB-9和6-HB-18替换为Cy3-6-HB-9和Cy5-6-HB-18。
6-HB DNA纳米结构在生理条件下的稳定性
由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:27-SECQ ID NO:30所示，其中，SECQ ID NO:27是在核苷酸序列为SECQ ID NO:21的硫代磷酸酯骨架，SECQ ID NO:28是在核苷酸序列为SECQ ID NO:22的硫代磷酸酯骨架，SECQ ID NO:29是在核苷酸序列为SECQ ID NO:23的硫代磷酸酯骨架，SECQ ID NO:30是在核苷酸序列为SECQ ID NO:24的硫代磷酸酯骨架。
具体地，从5’端到3’端，
SECQ ID NO:27(S-key-cstr7)：
CGCCCTGGTGAC(硫代磷酸酯骨架)
SECQ ID NO:28(S-key-cstr8)：
GGCCGGTCCTCG(硫代磷酸酯骨架)
SECQ ID NO:29(S-key-cstr17)：
GCGGGGATGTAG(硫代磷酸酯骨架)
SECQ ID NO:30(S-key-cstr18)：
GCGCGTAGTACC(硫代磷酸酯骨架)
将含10％胎牛血清(FBS)的1640培养基分别与6-HB、S-ssDNA(硫代磷酸化修饰的单链DNA)和ssDNA(单链DNA)在37℃孵育，时间点设置为24h、12h、6h、3h、2h、1h、30min、0min。PAGE表征孵育后各结构的稳定性。
结果：图9a-c依次为ssDNA、S-ssDNA和6-HB的电泳结果，其中各胶图从左至右依次为：DNA marker、样品对照、孵育0min、30min、1h、2h、3h、6h、12h、24h的电泳条带。从图9a中，孵育24h后，6-HB的电泳条带基本没有发生变化，表明大部分DNA纳米结构在生理条件下仍能保持稳定。然而ssDNA在2h后条带明显变浅，表明在这一时间ssDNA几乎完全降解。与ssDNA相比，6-HB DNA纳米结构稳定性明显提高，在生理条件下能抵抗核酸酶降解，是药物转运的优良载体。
激光共聚焦检测细胞对6-HB DNA纳米结构的摄取
(1)将生长到对数期的MCF-7细胞用0.25％的胰酶进行消化，制成单细胞悬液，为提高摄取效率，所用培养基为含0.5％FBS的RPMI 1640。随后将细胞以7万/皿接种于Confocal皿中，接种完毕后，将Confocal皿置于细胞培养箱中饥饿培养12h。
(2)弃去Confocal皿中旧培养基，用PBS洗3次，将标记Cy3的6-HB、3HB、S-ssDNA和ssDNA以100nM的终浓度分别与细胞共培养4h。
(3)终止培养，弃去培养基，PBS洗3次。
(4)5mg/ml的Hochest稀释500倍，在培养箱中染核20min。
(5)培养基洗3次，每次10min，洗后进行Confocal拍摄。激发波长为514nm，发射波长为550-600nm，Hochest通道为405nm二极管激光器激发，发射为450-500nm。
注意：从步骤(2)开始需要避光操作。
分别将Cy3标记的6-HB、3HB、S-ssDNA和ssDNA与MCF-7细胞孵育4h后，激光共聚焦显微镜观察，结果如图10所示，6-HB的摄取量明显高于3HB、S-ssDNA和ssDNA。
流式细胞仪检测细胞对6-HB DNA纳米结构的摄取
MCF-7细胞以20万/孔接种于24孔板中，接种完毕后，将24孔板置于细胞培养箱中饥饿培养12h，设置4组，每组做3个复孔。将标记Cy3的6-HB、3HB、S-ssDNA和ssDNA以100nM的终浓度分别与细胞共培养4h。并用流式细胞仪进行定量分析。
流式细胞仪的分析(图11)证实了6-HB DNA纳米结构的摄取量明显高于其他三种结构。在等摩尔浓度条件下，3HB的细胞摄取量为完整6-HB的一半，ssDNA摄取量最低。尽管ssDNA经硫代磷酸化修饰后摄取有所提高，但仍远低于细胞对DNA纳米结构的摄取量。因此，6-HB可在不含转染试剂的条件下经高效摄取进入细胞。
6-HB DNA纳米机器人与钥匙链在活细胞内的共定位分析
为确认钥匙链与6-HB可在活细胞内存在共定位，分别研究6-HB和钥匙链在细胞内的分布情况。
MCF-7细胞以7万/皿接种于Confocal皿中，接种完毕后，将Confocal皿置于细胞培养箱中饥饿培养12h。将Cy3标记的6-HB DNA纳米结构以100nM的终浓度与细胞共培养4h。弃去培养基，用PBS洗3遍，加入4倍物质的量的Cy5标记S-keys与细胞共培养4h。Hochest染核20min后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm，发射波长为550-600nm。Cy5激发波长为633nm，发射波长为650-700nm，Hochest通道为405nm二极管激光器激发，发射为450-500nm。
由图12，在MCF-7细胞中，6-HB DNA纳米结构与S-key的分布有部分重叠。统计结果表明，约有44％的纳米结构与钥匙链存在共定位。考虑到两组结构是在无转染试剂的条件下分别转运的，这一细胞内共定位效率已经相当高，足以实现纳米机器人的细胞内运行
为研究由钥匙链触发的DNA纳米结构在细胞内的打开情况，采用共聚焦显微镜检测FRET效率变化的方法。
(1)MCF-7细胞以7万/皿的数目接种于Confocal皿中，在含0.5％FBS的RPMI 1640培养基中饥饿培养过夜。
(2)弃去培养基，PBS洗3遍，将含Cy3-Cy5FRET对的6-HB以100nM的终浓度与细胞共培养4h。
(3)弃去培养基，PBS洗3遍。设置两组，一组为Keys-组，加入培养基；一组为Keys+组，加入4倍物质的量的S-keys，两组均培养4h。
(4)终止培养，弃去培养基，PBS洗3次。5mg/ml的Hochest稀释500倍，在培养箱中染核20min。
(5)培养基洗3次，每次10min，洗后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm，发射波长为550-600nm；Cy5激发波长为633nm，发射波长为650-700nm；FRET激发波长为514nm，发射波长为650-700nm。
如图13所示，Keys-组在8h后FRET效率依然很高，而加入钥匙链4h后，Keys+组FRET效率明显降低，这是由钥匙链触发的DNA纳米结构在细胞内打开造成的。定义Fa和Fd分别为受体Cy5和供体Cy3的荧光值，对多个细胞的Fa/Fd进行统计，结果表明两组细胞FRET效率差异显著。
例2以细胞内的ATP分子为钥匙的DNA纳米机器人的运行
以下仅说明与例1不同的部分，而与例1相同的部分不再赘述。
由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:31-SECQ ID NO:34所示，其中，SECQ ID NO:31带有与ATP适配体序列部分互补的序列，SECQ IDNO:32带有与ATP分子结合的DNA适配体序列，SECQ ID NO:33带有与ATP分子结合的DNA适配体序列，SECQ ID NO:34带有Cy5修饰。
具体地，从5’端到3’端，
SECQ ID NO:31(6-HB-3-ATP)：
AGGCAGATACGAAGAGCGTGGACCCGTCGTAGATAGTTCTGGACCCACGCTAGACAC
SECQ ID NO:32(6-HB-17-ATP)：
TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCACTGGCATGTGATACATACACTGGTTGGA
SECQ ID NO:33(6-HB-18-ATP)：
TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
SECQ ID NO:34(Cy5-6-HB-18-ATP)：
TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGT-Cy5-CCAGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
为研究ATP分子对6-HB结构的半打开情况，分别在细胞外和细胞内对开关效率进行表征。
纳米机器人的细胞外运行
6-HB-ATP纳米结构的组装过程与6-HB-key strands相同，其中，6-HB-keystrands中6-HB-3替换为6-HB-3-ATP，6-HB-17和6-HB-18替换为6-HB-17-ATP和6-HB-18-ATP。将ATP分子用超纯水溶解至终浓度1mM。ATP与6-HB-ATP以1000:1的摩尔比混合，置于37℃反应30min即可。
FRET表征6-HB-ATP打开效率
在6-HB上标记Cy3-Cy5的FRET对(图3)得到6-HB-ATP-FRET，加入ATP分子孵育30min后，随着6-HB一侧打开，荧光分子间距增大，导致FRET现象消失(图14)。其中，6-HB-ATP-FRET所需的序列是将6-HB-ATP中6-HB-9和6-HB-18-ATP替换为Cy3-6-HB-9和Cy5-6-HB-18-ATP。
纳米机器人的细胞内运行
为研究由ATP分子触发的DNA纳米结构在细胞内的打开情况，采用共聚焦显微镜检测FRET效率变化的方法
(1)MCF-7细胞以7万/皿的数目接种于Confocal皿中，在含0.5％FBS的RPMI 1640培养基中饥饿培养过夜。
(2)弃去培养基，PBS洗3遍。设置两组，实验组(6-HB-ATP)和对照组(6-HB-keystrands)。分别将含Cy3-Cy5FRET对的两组6-HB以100nM的终浓度与细胞共培养4h。
(3)终止培养，弃去培养基，PBS洗3次。5mg/ml的Hochest稀释500倍，在培养箱中染核20min。
(4)培养基洗3次，每次10min，洗后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm，发射波长为550-600nm；Cy5激发波长为633nm，发射波长为650-700nm；FRET激发波长为514nm，发射波长为650-700nm。
如图15所示，6-HB-key strands组在4h后FRET效率依然很高，而6-HB-ATP组FRET效率明显降低，这是由细胞内ATP分子触发的6-HB在细胞内打开造成的。定义Fa和Fd分别为受体Cy5和供体Cy3的荧光值，对多个细胞的Fa/Fd进行统计，结果表明两组细胞FRET效率差异显著。
例3以细胞表面核仁素蛋白为钥匙的DNA纳米机器人的运行
以下仅说明与例1不同的部分，而与例1相同的部分不再赘述。
由上海生工公司合成4条寡核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SECQ ID NO:35-SECQ ID NO:38所示，其中，SECQ ID NO:35带有与核仁素适配体序列部分互补的序列，SECQID NO:36带有与核仁素蛋白结合的DNA适配体序列，SECQ ID NO:37带有与核仁素蛋白结合的DNA适配体序列，SECQ ID NO:38带有Cy5修饰。
具体地，从5’端到3’端，
SECQ ID NO:35(6-HB-3-NCL)：
AGGCAGATACGAAGAGCGCCACCACGTCGTAGATAGTTCCCACCACACGCTAGACAC
SECQ ID NO:36(6-HB-17-NCL)：
GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGCTGGCATGTGATACATACACTGGTTGGA
SECQ ID NO:37(6-HB-18-NCL)：
GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
SECQ ID NO:38(Cy5-6-HB-18-NCL)：
GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT-Cy5-GGTGGGGCTCATGCAATACGGTCGTTGCGTTAT
为研究核仁素蛋白对6-HB结构的半打开情况，分别在细胞外和细胞内对开关效率进行表征。
纳米机器人的细胞外运行
6-HB-NCL纳米结构的组装过程与6-HB-key strands相同，6-HB-key strands中6-HB-3替换为6-HB-3-NCL，6-HB-17和6-HB-18替换为6-HB-17-NCL和6-HB-18-NCL。核仁素蛋白用缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl,pH 8.0)溶解至1mg/ml(约41.7uM)。核仁素与6-HB-NCL以摩尔比5:1混合，置于37℃反应30min。
FRET表征6-HB-NCL打开效率
在6-HB上标记Cy3-Cy5的FRET对(图4)得到6-HB-NCL-FRET，加入核仁素蛋白孵育30min后，随着6-HB一侧打开，荧光分子间距增大，导致FRET现象消失(图16)。其中，6-HB-NCL-FRET所需的序列是将6-HB-NCL中6-HB-9和6-HB-18-ATP替换为Cy3-6-HB-9和Cy5-6-HB-18-NCL。
纳米机器人的细胞内运行
为研究由核仁素蛋白触发的DNA纳米结构在细胞内的打开情况，采用共聚焦显微镜检测FRET效率变化的方法。
(1)MCF-7细胞(高表达NCL)和MCF-10A细胞(低表达NCL)以7万/皿的数目接种于Confocal皿中，在含0.5％FBS的RPMI 1640培养基中饥饿培养过夜。
(2)弃去培养基，PBS洗3遍。设置两组，6-HB-NCL分别响应高表达NCL的MCF-7细胞和低表达NCL的MCF-10A细胞。将含Cy3-Cy5FRET对的两组6-HB-NCL以100nM的终浓度与两组细胞共培养4h。
(3)终止培养，弃去培养基，PBS洗3次。5mg/ml的Hochest稀释500倍，在培养箱中染核20min。
(4)培养基洗3次，每次10min，洗后进行Confocal拍摄。Cy3激发波长为514nm，发射波长为550-600nm；Cy5激发波长为633nm，发射波长为650-700nm；FRET激发波长为514nm，发射波长为650-700nm。
如图17所示，在培养4h后，MCF-10A细胞内的FRET效率依然很高，而MCF-7细胞内的FRET效率明显降低，这是由细胞表面核仁素蛋白触发的6-HB-NCL在细胞内打开造成的。定义Fa和Fd分别为受体Cy5和供体Cy3的荧光值，对多个细胞的Fa/Fd进行统计，结果表明两组细胞FRET效率差异显著。
实施例1活细胞内运行的智能DNA纳米机器人载药体系
为检测这一智能DNA纳米机器人载药体系的抗癌效果，在6-HB管状结构内共价连接6个美登素-DM1分子，采用MTT和激光共聚焦两种方式观察细胞死亡情况。
6-HB DNA纳米结构装载DM1分子
(1)确定6个朝向6-HB空腔内侧的位点标记氨基，将预先溶于DMSO的DM1分子以100:1的比例与DNA混合，注意DMSO的比例不低于50％，室温震荡2h后，用10K超滤管反复洗涤5次以除去过量的DM1分子。紫外分光光度计对修饰DM1后的DNA单链精确定量。
具体地，由Invitrogen公司合成20条具有磷酸二酯键骨架的寡核苷酸序列，即单链DNA，其中6条DNA单链的3’端或5’端标记氨基，即6条功能化单链DNA。由凯惠科技发展(上海)有限公司购买DM1-SMCC，即SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯)修饰的DM1(N2'-去乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素)分子。在功能化单链DNA中加入Millipore超纯水稀释至约100μmol/L得单链DNA水溶液。将DM1-SMCC完全溶解于二甲基亚砜(DMSO)。将单链DNA水溶液与DM1-SMCC的二甲基亚砜溶液混匀，控制DM1-SMCC和DNA的摩尔比为100:1，加入到PBS缓冲液和二甲基亚砜的混合溶剂中混匀，形成反应溶液。将混合均匀的反应溶液置于恒温震荡仪中，转速300rpm/min，反应温度25℃，反应时间2小时得到通过连接分子SMCC连接的DM1和单链DNA(共价连接产物DNA-SMCC-DM1)。将反应后的溶液加入10kDa的超滤管中，10000rpm离心15分钟，重复洗涤5次，以除去过量的DM1-SMCC分子。
(2)将修饰DM1的DNA单链与其他序列共同退火合成6-HB DNA纳米结构。
具体地，将6条共价连接产物的DNA单链和剩余的14条单链DNA分别以1μmol/L的终浓度混合于合成缓冲液(40mM Tris，20mM醋酸，2mM EDTA，125mM醋酸镁，pH 8.0)中，终体积为100μL。将混合好的溶液置于DNA低吸附管，使其悬浮于95℃热水中，缓慢过夜降温至25℃。
DNA单链与DM1的连接示意图如图18a所示，12％的PAGE(图18b)和质谱结果(图18c)表明DNA与DM1成功连接，并且高效液相色谱结果表明连接DNA后，DM1的水溶性有了明显提升(图18d)。并用6％的PAGE对连接DM1后的6-HB进行表征，证明连接DM1后6-HB依然可以合成(图19)。
MTT检测智能载药体系对癌细胞的杀伤效果
SK-BR-3细胞以10万/孔的密度接种于24孔板中，设置两个实验组，每组三个复孔：6-HB-DM1组和6-HB-DM1+keys组。两组各以100nM的终浓度孵育0h、3h、6h、18h、30h后，用MTT染色4h，加入10％酸性SDS溶解生成的甲瓒结晶，于490nm处测定每孔的紫外吸收值。
结果如图20a所示，加钥匙链组DM1对细胞的杀伤有明显增强，尤其是3-18h效果最为明显。
激光共聚焦显微镜观察加钥匙链18h时细胞死亡情况
SK-BR-3细胞以7万/皿接种于Confocal皿中，设置三组：6-HB组作为空白对照，6-HB-DM1组和6-HB-DM1+keys组。加入钥匙链孵育18h后，用碘化丙啶(PI)染色30min，Confocal观察PI染色情况。
碘化丙啶能够对死细胞的细胞核进行染色，如图20b，6-HB-DM1+keys组PI染色量明显增加，对癌细胞杀伤效果更加明显。这一智能DNA纳米机器人载药体系可在活细胞内进行药物可控释放。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海应用物理研究所
<120> 一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的DNA纳米机器人载药
体系
<130>
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagttgactg ctagtacctg agcactgaat gcgatgtaga agtagctctg ctccatc 57
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgacttgatg gagcagacct atcgtcac 28
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggcagatac gaagagcgag gctatgtcgt agatagttct cgcacgacgc tagacac 57
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcagtcaact g 11
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggtacgtga cgataggaca catcagatgt cttaggagag gtcacagtaa ccttcgacaa 60
tct 63
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agattgtcga acgtatctgc ct 22
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaactatgac atctgatgtg tgctacttgt caccagggcg 40
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgctcttggt tactgtgacc tgtgctcacg aggaccggcc 40
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcattcactc ctaactacga c 21
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tctagcgtgt ctagcgt 17
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtccgtgca accgatcaat cc 22
<210> 12
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcctagcgat ccaatggaac gaccgtattg ctgaggtgag tgtatgtatc acttgcacgg 60
aca 63
<210> 13
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgtaccgtt g 11
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggattgatcg gatgccagac gcatcggatt cgatgagcct actcgaccaa ctcaacg 57
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggcaatgtcc accattggat cg 22
<210> 16
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caacggtaca gtggtgactc caaccttgta acgtcctcga taacgctgga cattgcc 57
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggaggcgtgc gactggcatg tgatacatac actggttgga 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggatgatagc ctggctcatg caatacggtc gttgcgttat 40
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttacaacac ctcacgaatc c 21
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcaccacgtt gagttgg 17
<210> 21
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cgccctggtg ac 12
<210> 22
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggccggtcct cg 12
<210> 23
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcggggatgt ag 12
<210> 24
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gcgcgtagta cc 12
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Cy3修饰
<400> 25
gcattcactc ctaactacga c 21
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> Cy5修饰
<400> 26
ggatgttagc ctggctcatg caatacggtc gttgcgttat 40
<210> 27
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 27
cgccctggtg ac 12
<210> 28
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 28
ggccggtcct cg 12
<210> 29
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 29
gcggggatgt ag 12
<210> 30
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 硫代磷酸化修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 硫代磷酸化修饰
<400> 30
gcgcgtagta cc 12
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aggcagatac gaagagcgtg gacccgtcgt agatagttct ggacccacgc tagacac 57
<210> 32
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
tggaaggagg cgttatgagg gggtccactg gcatgtgata catacactgg ttgga 55
<210> 33
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
tggaaggagg cgttatgagg gggtccaggc tcatgcaata cggtcgttgc gttat 55
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> cy5修饰
<400> 34
tggaaggagg cgttatgagg gggtccaggc tcatgcaata cggtcgttgc gttat 55
<210> 35
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
aggcagatac gaagagcgcc accacgtcgt agatagttcc caccacacgc tagacac 57
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggctgg catgtgatac atacactggt tgga 54
<210> 37
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggggct catgcaatac ggtcgttgcg ttat 54
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(22)
<223> Cy5修饰
<400> 38
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggggct catgcaatac ggtcgttgcg ttat 54

Claims (10)

1.一种DNA纳米机器人载药体系的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1，提供多条单链DNA和疏水性药物分子，将至少一条单链DNA和疏水性药物分子通过共价键连接形成共价连接产物；
S2，将共价连接产物和剩余的单链DNA加入含有镁离子的第一缓冲液中进行反应，基于Watson-Crick原理有序组装成DNA纳米结构和疏水性药物分子的复合物，其中，剩余的单链DNA与共价连接产物的单链DNA自组装形成具有锁的DNA纳米结构，其中，疏水性药物分子被锁在DNA纳米结构的内侧；
S3，提供钥匙，所述钥匙与所述锁配合以使得疏水性药物分子从所述纳米结构暴露，从而提供DNA纳米机器人载药体系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锁为位于单链DNA上的锁链，所述钥匙为单独的钥匙链，所述钥匙链和所述锁链为可杂交的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锁为位于单链DNA上的与ATP分子结合的适配体序列，所述钥匙为小分子ATP。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锁为位于单链DNA上的与核仁素蛋白分子结合的适配体序列，所述钥匙为核仁素蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲液为含有氯化镁或醋酸镁的缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共价连接产物、剩余的单链DNA和第一缓冲液组成的混合溶液进行退火处理。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：提供多条单链DNA和带有功能基团的疏水性药物分子，其中，至少一条单链DNA为功能化单链DNA；将功能化单链DNA溶于水中形成单链DNA水溶液，将疏水性药物分子溶于有机溶剂中形成疏水性药物分子溶液；将单链DNA水溶液与疏水性药物分子溶液加入第二缓冲液中进行反应，使得功能化单链DNA与疏水性药物分子的功能基团发生偶联反应形成共价键，以得到单链DNA和疏水性药物分子的共价连接产物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，DNA纳米结构为一维、二维、或三维结构。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水性药物分子选自以下药物小分子中的至少一种：美登素、卡奇霉素、奥斯他汀、多卡米星、或蒽环类药物。
10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的方法得到的DNA纳米机器人载药体系，其特征在于，该DNA纳米机器人载药体系包括由DNA纳米结构和疏水性药物分子共价连接的复合物。
CN201910340438.7A 2019-04-25 2019-04-25 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系 Active CN110124047B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910340438.7A CN110124047B (zh) 2019-04-25 2019-04-25 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910340438.7A CN110124047B (zh) 2019-04-25 2019-04-25 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110124047A true CN110124047A (zh) 2019-08-16
CN110124047B CN110124047B (zh) 2022-03-29

Family

ID=67571225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910340438.7A Active CN110124047B (zh) 2019-04-25 2019-04-25 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110124047B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113063946A (zh) * 2021-03-26 2021-07-02 湖南大学 一种dna纳米机器及其在降低血糖中的应用
CN113368239A (zh) * 2021-06-08 2021-09-10 青岛科技大学 一种新型端粒酶触发dna纳米机器及其构建方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101744645A (zh) * 2008-12-17 2010-06-23 中国科学院生物物理研究所 纳米生物机器人及其应用
CN103014161A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法
CN108310391A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 国家纳米科学中心 一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用
CN108498451A (zh) * 2018-06-19 2018-09-07 郑州轻工业学院 一种具有高载药效果的dna纳米药物载体、制备方法及应用
CN108629415A (zh) * 2018-05-11 2018-10-09 郑州轻工业学院 一种基于dna纳米技术的信息加密方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101744645A (zh) * 2008-12-17 2010-06-23 中国科学院生物物理研究所 纳米生物机器人及其应用
CN103014161A (zh) * 2012-12-13 2013-04-03 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种纳米材料表面进行的杂交链式反应技术的制备方法
CN108310391A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 国家纳米科学中心 一种核酸蛋白纳米复合物及其制备方法和应用
CN108629415A (zh) * 2018-05-11 2018-10-09 郑州轻工业学院 一种基于dna纳米技术的信息加密方法
CN108498451A (zh) * 2018-06-19 2018-09-07 郑州轻工业学院 一种具有高载药效果的dna纳米药物载体、制备方法及应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113063946A (zh) * 2021-03-26 2021-07-02 湖南大学 一种dna纳米机器及其在降低血糖中的应用
CN113368239A (zh) * 2021-06-08 2021-09-10 青岛科技大学 一种新型端粒酶触发dna纳米机器及其构建方法
CN113368239B (zh) * 2021-06-08 2022-11-15 青岛科技大学 一种新型端粒酶触发dna纳米机器及其构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110124047B (zh) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bujold et al. DNA nanostructures at the interface with biology
Hong et al. DNA origami: scaffolds for creating higher order structures
Kong et al. DNA origami-based protein networks: from basic construction to emerging applications
Stephanopoulos et al. Immobilization and one-dimensional arrangement of virus capsids with nanoscale precision using DNA origami
Steinmetz et al. Utilisation of plant viruses in bionanotechnology
US9835558B2 (en) Aggregation-induced emission luminogen having an peptide sequence and its uses thereof
Biju et al. FRET from quantum dots to photodecompose undesired acceptors and report the condensation and decondensation of plasmid DNA
CN106794256A (zh) 蛋白质/寡核苷酸核‑壳纳米颗粒治疗剂
Rahbani et al. Dynamic DNA nanotubes: Reversible switching between single and double-stranded forms, and effect of base deletions
Zheng et al. NIR‐remote selected activation gene expression in living cells by upconverting microrods
CN106754894B (zh) 一种多功能磁性dna纳米球及其制备方法与应用
JP2018533005A (ja) 水溶性高分子が結合したナノ物質を含む消光剤及びその用途
CN106620725B (zh) 一种集光学和光声于一体的双模态分子影像探针及其制备方法和应用
CN110124047A (zh) 一种dna纳米机器人载药体系的制备方法以及由此得到的dna纳米机器人载药体系
Bhatia et al. Self‐assembled, Programmable DNA Nanodevices for Biological and Biomedical Applications
CN107397960A (zh) 一种脑靶向制剂及其制备方法和应用
Pavlova et al. Amphiphilic “like-a-brush” oligonucleotide conjugates with three dodecyl chains: Self-assembly features of novel scaffold compounds for nucleic acids delivery
Zhou et al. Interfacing DNA nanotechnology and biomimetic photonic complexes: advances and prospects in energy and biomedicine
CN105999305A (zh) 一种纳米粒子的表面修饰方法及其一种表面功能化的纳米材料
CN109045304A (zh) 一种携带Polymerase I抑制剂的核仁靶向纳米载体及其制备方法和应用
CN114981384A (zh) 发光两性聚合物纳米颗粒
Maly et al. Highly organized self-assembled dendriplexes based on poly (propylene imine) glycodendrimer and anti-HIV oligodeoxynucleotides
US20220003773A1 (en) Dna-cage erasable labels for fluorescence-based pathology
Rothenbühler et al. Complex DNA Architectonics─ Self-Assembly of Amphiphilic Oligonucleotides into Ribbons, Vesicles, and Asterosomes
Devkota et al. Glucosamine/β-alanine carbon dots use as DNA carriers into E. coli cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant