CN1686081A - Ptd－sod融合蛋白及其衍生物在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白转导结构域PTD连接的超氧化物歧化酶SOD的融合蛋白及其衍生物在化妆品中的应用，在每克的化妆品中加入SOD活性范围为50～10000活力单位的PTD－SOD共价结合形成的融合蛋白或其衍生物，通过PTD与SOD的融合解决了SOD分子跨膜进入皮肤细胞的问题，本发明可广泛用于美白、消除青春痘、疤痕、皱纹等调整皮肤失调方面，并可用于外部皮肤的局部应用和许多肤发疾病的治疗，具有防晒、抗辐射、增白、防皱、消炎和延缓衰老的功效，使皮肤更细嫩；特别适合长期在计算机前或烈日下工作的各类人员使用，它能有效地防止紫外线对皮肤的损伤，抑制黑色素和老年斑的形成，还能有效抑制面部粉刺和痤疮的形成。
Description
技术领域
该发明涉及融合蛋白领域，尤其涉及蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)连接的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)的融合蛋白及其衍生物在化妆品中的应用。
背景技术
众所周知，由于阳光中的紫外线和生活中许多其他的因素，例如电脑辐射、抽烟饮酒、紧张压力、垃圾食品等等，都会增加体内自由基的产生，加速细胞的氧化，导致皮肤的加速老化，特别是紫外线，它在渗透入皮肤后，会产生有害的自由基(Free Radicals)，这些自由基会增加上皮脂质过氧化物(LPO)的数量，破坏皮肤的胶原蛋白及弹性纤维，而且还会刺激黑色素细胞，增加黑色素的分泌[1]，从而导致皮肤干燥松弛、失去弹性、产生皱纹、变黄变黑、产生色素沉积或雀斑等。而SOD有助于将人体内最主要的自由基——超氧阴离子自由基转化为对人体无害的氧和水，从而改善皮肤生理状况。如今SOD已被广泛用于调整皮肤的化妆品中，人们采用加入SOD的化妆品来美容养颜、去除黑斑、雀斑、老年斑、色素沉着、青春痘，减少皱纹、疤痕和掉发，促进伤口愈合、皮肤再生。
然而，人体自身对外来物质具有免疫排斥特性，并且蛋白质、肽和寡聚核苷酸等生物大分子在对细胞进行胞内治疗时，本身难以进入细胞。在传统的实验和临床治疗上，已有许多方法用于将蛋白质及其他大分子物质递送进入活细胞中，这些方法可以分成病毒载体或非病毒载体法两大类。较之病毒载体法，非病毒递送策略在生物安全和给药方便性方面具有很大的优点。非病毒载体法包括：显微注射法、电穿孔法、脂质体法、以及细菌毒素、红细胞或其它受体介导的胞吞作用等；但是这些方法大都效率不高或费时、容易引起细胞死亡或形成胞内小泡而不能使外源蛋白有效地跨膜进入细胞[2]。为此，寻找一种能有效地将外源物质输入活细胞并且在细胞内保持活性的外源物质就显得相当重要。
过去几年有报道指出一类蛋白质本身就能跨膜进入细胞。这类蛋白主要是一些病毒蛋白，包括人体免疫缺陷病毒HIV-1的TAT蛋白[3、4]、来自人体I型单纯疱疹病毒(HSV-1)DNA结合蛋白VP22[5]、B型肝炎病毒蛋白PreS2 [6]、基态纤维细胞生长因子bFGF[7]、白介素-1[8]和果蝇触角足(ANTP)同源异型转录因子[9]等。进一步的研究发现，协助这些蛋白质分子跨膜转运的是一类被称为蛋白转导结构域(PTD)的肽片断。
蛋白转导结构域(PTD)是一种在蛋白传导过程中能高效穿过生物膜的结构域，它能将与其共价连接的多肽、蛋白质和DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，传导效率非常高并且对身体没有损伤。比如，TAT蛋白的PTD能有效地将外源物质输入活细胞中，外源物质在细胞质中保持活性，并且其作用不受细胞类型的限制[3、4、10]。
1.R.Ogura et al.The Biological Role of Reactive oxygen Species in Skin，edited by O.Hayaishi，S.Imamuraand Y.Miyachi，University of Tokyo Press，1987，P.55.
2.陈亚兵，温龙平，Tat介导外源蛋白引入活细胞，国外医学免疫学分册，1996年，第5期，243页。
3.Frankel AD，Pabo CO.Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.Cell，1988，55(6)：1189-1193.
4.Green M.Loewenstein PM.Autonomous functional domains of chemically synthesized humanimmunodeficiency virus Tat trans-activator protein.Cell，1988，55：1179-1188.
5.He J，Furmanski P.Sequence specificity and transcriptional activation in the binding of lactoferrin to DNA.Nature，1995，373：721-724.
6.Oess S，Hildt E.Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surfaceantigens.Gene Ther.2000，7：750-758.
7.Sosnowski BA，Gonzalez AM，Chandler LA，et al.Targeting DNA to cells with basic fibroblast growth factor(FGF2).J Biol Chem，1996，271：33647-33653.
8.Rubartelli A，Cozzolino F，Talio M，et al.A novel secretory pathway for interleukin-1 beta，a protein lacking asinal sequence.EMBO J.1990，9：1503-1510.
9.Derossi D，Joliot AH，Chassaing G，et al.The third helix of the Antennapedia homeodomain translocatesthrough biological membranes.J Biol Chem，1994，269：10444-10450.
10.Silhol M，Tyagi M，Giacca M，et al.Different mechanisms for cellular internalization of the HIV-1Tat-derived cell penetrating peptide and recombinant proteins fused to Tat.Eur J Biochem 2002，269：494-501.
发明内容
本发明目的是将蛋白转导结构域与超氧化物歧化酶共价结合形成的融合蛋白及其衍生物与现有的化妆品混合使用，提高化妆品的美肤功能。
本发明的技术方案是：在每克的化妆品中加入SOD活性范围为50～10000活力单位的蛋白转导结构域与超氧化物歧化酶共价结合形成的融合蛋白或其衍生物。
还可以在每克的化妆品中加入SOD活性范围为100～1000活力单位的融合蛋白或其衍生物。
以上化妆品指面霜、洁面乳、皮肤调理液、皮肤滋养品以及皮肤修复用品等。
化妆品通常用于皮肤护理，皮肤是具有自我更新、自我修复的脊椎动物有机体与其环境之间的分界面，并几乎覆盖身体的所有表面，皮肤细胞的正常功能可用于调节与脂类生成，肤发着色以及由于紫外线的辐射形成的自由基的去除有关的酶反应途径，还有吸收和排泄功能，并且在抵御抗原入侵和激发初次免疫应答方面起重要作用。皮肤也执行许多具有局部和系统效应的生化合成反应，从这个意义上皮肤也可以被认作内分泌器官。例如，皮肤负责维生素D的形成以及细胞因子和生长因子的合成。需详细回顾皮肤及其功能可参阅格雷的解剖学：TheAnatomical Basis of Medicine and Surgery，Williams et al.(eds.)1995 Churchill Livingstone，NewYork，p376-417。
由于皮肤的易接近性，皮肤成为一种最便捷的给药靶器官，表皮是递送本发明的SOD融合蛋白的靶组织。本发明通过PTD与SOD的融合解决了SOD分子跨膜进入皮肤细胞的问题，该手段采用细胞内的自然机制，故此避免了对靶细胞的损害，并且采用该方法能将SOD分子大量递送进入细胞，本发明可广泛用于美白、消除青春痘、疤痕、皱纹等调整皮肤失调方面，并可用于外部皮肤的局部应用和许多肤发疾病的治疗，具有防晒、抗辐射、增白、防皱、消炎和延缓衰老的功效，使皮肤更细嫩；特别适合长期在计算机前或烈日下工作的各类人员使用，它能有效地防止紫外线对皮肤的损伤，抑制黑色素和老年斑的形成，还能有效抑制面部粉刺和痤疮的形成。
具体实施方式
1.超氧化物歧化酶面霜的制备：
1.1重组TAT蛋白转导结构域(TAT-PTD)和人铜，锌SOD(hCu，Zn SOD)的融合蛋白(TAT-SOD)的制备：
通过RT-PCR克隆人肝细胞来源的hCu，Zn SOD cDNA，再用5’端含有TAT-PTD的编码基因的引物A和能与hCu，Zn SOD cDNA的3’端互补的引物2做PCR扩增获取hCu，Zn SOD和TAT-PTD融合基因。扩增后的产物经酶切和电泳回收后，插入质粒pET21的多克隆位点，构建表达质粒pET-TAT-SOD，转化大肠杆菌BL21(DE3)，酶切鉴定筛选阳性克隆。
挑取阳性单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃生长约2h后，OD600达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，CuSO4至终浓度为500mmol/L，ZnSO4终浓度为100mmol/L，30℃诱导4 h，离心收集茵体。从超声波破碎的细胞破碎液中回收得到TAT-SOD。实验中采用黄嘌呤氧化法对TAT-SOD的SOD活性进行定量检测，SOD活性检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
1.2面霜处方：
硬脂酸130g，液体石蜡200g，石蜡130g，三乙醇胺30g，甘油100g，SOD 2×105U，蒸馏水加至1000g。
1.3面霜的制备：
取硬脂酸、液体石蜡和石蜡加热至80℃(油相)；另取三乙醇胺、甘油及蒸馏水亦加热至80℃(水相)。在搅拌下将水相缓缓加入80℃油相中，待乳化完全后，停止加热，搅拌至近凝，即得乳膏基质。取乳膏基质适量，每克加入SOD活性范围为50～10000活力单位的TAT-SOD研匀，再分次加入乳膏基质至全量，研匀即得TAT-SOD面霜。
2.使用方法：
每克乳剂含250U超氧化物歧化酶活性单位的TAT-SOD面霜，每日擦2次，用药前先用温水把脸洗干净，然后涂抹上适量TAT-SOD面霜(存放于冰箱内或阴凉处)，每天随访一次，一周后评定效果。
3.评定方法：
皮肤生理失调消失或部分消失为有效；不消失为无效。
4.试用结果：
SOD活性范围约为50活力单位的TAT-SOD霜剂的疗效统计
| 测试方向 | 测试总人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 美白除斑 | 20 | 16 | 4 | 80.0％ |
| 除皱 | 10 | 8 | 2 | 80.0％ |
| 除青春痘 | 50 | 28 | 22 | 56.0％ |
| 去疤痕 | 10 | 6 | 4 | 60.0％ |
SOD活性范围约为100活力单位的TAT-SOD霜剂的疗效统计
| 测试方向 | 测试总人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 美白除斑 | 20 | 17 | 3 | 85.0％ |
| 除皱 | 10 | 9 | 1 | 90.0％ |
| 除青春痘 | 50 | 34 | 16 | 68.0％ |
| 去疤痕 | 10 | 7 | 3 | 70.0％ |
SOD活性范围约为1000活力单位的TAT-SOD霜剂的疗效统计
| 测试方向 | 测试总人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 美白除斑 | 20 | 18 | 2 | 90.0％ |
| 除皱 | 10 | 9 | 1 | 90.0％ |
| 除青春痘 | 50 | 35 | 15 | 70.0％ |
| 去疤痕 | 10 | 8 | 2 | 75.0％ |
SOD活性范围约为3000活力单位的TAT-SOD霜剂的疗效统计
| 测试方向 | 测试总人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 美白除斑 | 20 | 17 | 3 | 85.0％ |
| 除皱 | 10 | 8 | 2 | 80.0％ |
| 除青春痘 | 50 | 31 | 19 | 62.0％ |
| 去疤痕 | 10 | 7 | 3 | 70.0％ |
SOD活性范围约为10000活力单位的TAT-SOD霜剂的疗效统计
| 测试方向 | 测试总人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 美白除斑 | 20 | 16 | 4 | 80.0％ |
| 除皱 | 10 | 8 | 2 | 80.0％ |
| 除青春痘 | 50 | 29 | 21 | 58.0％ |
| 去疤痕 | 10 | 6 | 4 | 60.0％ |
TAT-SOD衍生物GST-TAT-SOD(GST是谷胱甘肽-S-转移酶)霜剂的疗效统计
| 测试方向 | 测试总人数 | 有效人数 | 无效人数 | 有效率 |
| 美白除斑 | 20 | 18 | 2 | 90.0％ |
| 除皱 | 10 | 9 | 1 | 90.0％ |
| 除青春痘 | 50 | 33 | 17 | 66.0％ |
| 去疤痕 | 10 | 8 | 2 | 80.0％ |
以上数据表明，加入TAT-SOD融合蛋白的化妆品，对美白除斑，去除皱纹、青春痘和疤痕等美化皮肤、治疗皮肤受损和调整皮肤失调方面具有显著疗效。
以上化妆品加入SOD活性范围为100～1000活力单位时，疗效比较好。
以上所述化妆品可以是面霜、洁面乳、皮肤调理液、皮肤滋养品以及皮肤修复用品等作用于皮肤上的用品。
本发明明确地提供了细胞内递送的有效应用，而没有口服或注射用药物的弊处。只要不违背PTD与蛋白质共价连接的理论，连接可以发生在蛋白的氨基端或羧基端，亦或沿着蛋白结构的其它任何不明显妨碍SOD活性的部位。
Claims (4)
1、PTD-SOD融合蛋白及其衍生物在化妆品中的应用，其特征在于：在每克的化妆品中加入SOD活性范围为50～10000活力单位的蛋白转导结构域与超氧化物歧化酶形成的融合蛋白或其衍生物并研匀。
2、根据权利要求1所述的PTD-SOD融合蛋白及其衍生物在化妆品中的应用，其特征在于：加入的融合蛋白或其衍生物的SOD活性范围为100～1000活力单位。
3、根据权利要求1或2所述的PTD-SOD融合蛋白及其衍生物在化妆品中的应用，其特征在于：PTD与蛋白质共价连接，连接发生在蛋白的氨基端或羧基端，或沿着蛋白结构的其它任何不明显妨碍SOD活性的部位。
4、根据权利要求1或2所述的PTD-SOD融合蛋白或其衍生物在化妆品中的应用，其特征在于：该化妆品为面霜、洁面乳、皮肤调理液、皮肤滋养品或皮肤修复用品。
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| CN102079790A (zh) * | 2010-08-06 | 2011-06-01 | 暨南大学 | 一种重组融合蛋白pacap-ptd及其表达方法和应用 |
| CN101721690B (zh) * | 2009-12-14 | 2012-05-02 | 厦门意奇生物科技有限公司 | Ptd-sod融合蛋白在防醉解酒产品中的应用 |
| CN101812439B (zh) * | 2009-02-25 | 2012-07-04 | 张舒羽 | 一种透皮结构域及其衍生的具有透皮作用的融合蛋白和其制备方法 |
| WO2023229102A1 (ko) * | 2022-05-26 | 2023-11-30 | 주식회사 바이오셀트란 | 신규한 미백 펩타이드 및 이를 함유하는 화장료 조성물 |
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