JPH05503090A - 非グリコシル化ｆｇｆ―４およびそれを含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非グリコノル化ＦＧＦ−４およびそれを含む組成物［背景コ 成長因子類は多細胞生物がその全体性に対する種々の型の障害を修復する過程を 仲介する。このような過程の中には、創傷治癒、例えば切開または穿刺後の皮ふ の閉鎖、および代償成長、例えば機械的または化学的創傷後に元の水準の機能と 寸法を回復するための機能とある種の臓器の再成長が含まれる。これらの因子は 、破壊または障害された組織を置換する細胞の成長および分化に必要である。

ある種の培養セルラインの増殖および分化を刺激する因子を含めて、組織抽出物 の能力に基づいて種々の活性因子が同定された。

線維芽細抱成長因子類（ＦＧＦ類）は創傷修復過程の仲介に特に関係があるよう に見える。これらは、とりわけ、生物の血管を作る内皮細胞の増殖を刺激し分化 を誘導または遅延させる血管形成性、ホルモン様蛋白質である。バット等、キド ニー・インターナショナル２３巻６０３−６１０頁（１９８３年）参照。創傷治 癒一般における成長ホルモンの役割についてはテン・ダイク、バイオテクノロジ ー７巻７９３−９７頁（１９８９年８月）参照。

ＦＧＦファミリー中の２種、すなわち酸性および塩基性Ｆ　Ｇ　Ｆ　（ａＦＧＦ およびｂＦＧＦ）が始めに概説され深い研究の対象となった。

例えば、トーマス、ＦＡＳＥＢ４３４−４０（１９８７年）、ゴスポダロウイッ クズ等、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー補遺５巻１５−２６頁（ １９８７年）およびＰＣＴ公開ＷＯ３７１０１７２８号（１９８７年３月２６日 公開）参照。最近、さらに５種の推定因子が同定された。ＦＧＦ−５、ツァーン 等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー８巻（８号）３４８７−９ ５頁（１９８８年）参照、ＦＧＦ・６、マリックス、オンコジーン４巻３３５− ４０頁（１９８９年）参照、Ｉｎｔ−２、ムーア等、ＥＭＢＯジャーナル５巻（ ５号）９１９−２４頁（１９８６年）およびディクスン等、ネイチャー３２６巻 ８３３頁（１９８７年）参照、ＫＧＦ、フィンチ等、サイエンス２４５巻７５２ −５５頁（１９８９年）参照、およびＦＧＦ−４、プリ・ボビ等、セル５０巻７ ２９−３７頁（１９８７年）およびダイク等、ブロシーデインダス・オブ・ザ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８４巻２９ ８０−８４頁（１９８７年）参照。歴史的には、ＦＧＦ−４はに−ＦＧＦとして 知られていた。この蛋白質群の命名は改定され、Ｋ−ＦＧＦがＦＧＦ−４と呼ば れることになった。両語は同一の成長因子を指す。

［発明の要約コ ＦＧＦ−４は、創傷、火傷組織またはその他の哺乳類組織の障害の治癒促進のよ うな細胞の成長および分化の促進に有用な、特に望ましい治療剤である。

カポジ肉腫ＤＮＡから単離された腫瘍遺伝子に由来するＦＧＦ−４の完全な配列 が決定されている。しかし、治療剤としては、蛋白質の均質な製品を用いる必要 がある。この発明は、このような製品を提供する。

一態様として、この発明は非グリコジル化ＦＧＦ−４を提供する。

この発明の非グリコジル化ＦＧＦ−４は、実施例３で述べた還元条件下のＳＤＳ ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析したとき約２１ＫＤの分子量を もつことおよびポリペプチドに結合するオリゴ糖部分が存在しないことにより特 徴づけられる。別の態様として、この発明は均質な非グリコノル化ＦＧＦ−４を 提供する。均質な非グリコノル化ＦＧＦ−４は、非グリコジル化ＦＧＦ−４と同 じ分子量とオリゴ糖部分の不存在に加えて、実施例４で述べた条件下の逆相高速 液体クロマトグラフィーで単一ピークとして移動することまたは実施例５で述べ た条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥをクーマシーブルー染色したとき単一バンドとして 現れることを特徴とする。

さらに別の特徴として、この発明は非グリコジル化ＦＧＦ−４の製造法を提供す る。この方法は、ＦＧＦ−４と実質的に同一のペプチド配列を含むことを特徴と する蛋白質をコード化するｃＤＮＡ配列で形質転換した適当な細菌細胞を培養す ることを含む。この方法で用いるｃＤＮＡ配列はまた、適当な発現制御配列と機 能可能に結合している。生成したＦＧＦ−４は均質、純粋な形で別に採取される 。

さらに別の態様として、この発明は、医薬として許容される媒質中にこの発明の 均質ＦＧＦ−４の有効量を含む創傷治癒用の局所用および注射用医薬組成物を提 供する。

さらに別の態様として、この発明は、この発明のＦＧＦ−４を、骨または軟部組 織の創傷の処置に敵する医薬組成物の製造に使用することを含む。

［図面の概説コ 第１図は、逆相高速液体クロマトグラフィーで処理したこの発明の均質な非グリ コジル化ＦＧＦ−４蛋白質の溶離特性を示すクロマトグラムであり、時間に対す る２８０ナノメートル吸収値として示す。

第２図は、実施例３にしたがって処理したこの発明の均質な非グリコジル化ＦＧ Ｆ−４の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル特性であり、見がけの近似分子量２１ＫＤをもつ 単一成分を示す。

［詳細な記述コ この発明は、非グリコジル化および均質な非グリコジル化ＦＧＦ−４蛋白質を提 供する。「均質」の語は、自然状態（すなわち天然に産するかまたは組換え体細 胞中にある状態）でＦＧＦ−４に普通に随伴する物質、特に他の哺乳類蛋白質を 全く含まないか実質的に含まないことを意味する。均質なＦＧＦ−４蛋白質は、 天然産であってもまた哺乳類もしくは非哺乳類で組換え操作により生産されたも のであっても、本発明者の知る限り今まで科学文献に発表されたことがない。

非グリコジル化ＦＧＦ−４は、ポリペプチド鎖または分子の部分に結合したオリ ゴ糖部分の不存在、および実施例３で述べた還元条件下のＳＤＳポリアクリルア ミドゲル電気泳動で約２１．０００ダルトンの分子量をもつことを特徴とする。

さらに、均質な非グリコジル化ＦＧＦ−４は、実施例４で述べた条件下の逆相Ｈ ＰＬＣで単一のピークとして移動し、実施例５で述べた条件下のクーマシーブル ー染色で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドとして現れる。また、均質な非グリコ ジル化ＦＧＦ−４は、還元性５ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドとして現れ、カブト ガニアメーバ様細胞溶解物アッセイ［アソシエーツ・オブ・ケープ・コツト・イ ンコーホレイテッド］による測定でＦＧＦ−４の５００マイクログラム当り約０ ．１２５単位より少ないエンドトキンン含量しか有しない。さらに、非グリコジ ル化および均質な非グリコジル化ＦＧＦ−４は、Ｂａ１ｂ−Ｃ−３Ｔ３細胞によ る３Ｈ−チミジンとり込みアッセイで、約０．１−約１゜０ナノグラム／ｍｌ、 好ましくは約０．４−約０．６ナノグラム／ｍｌ、最適には約０．５ナノグラム ／ＩＩｌの３Ｈ−チミジンとり込みハーフ・マキシマム・レベルを特徴とするこ とができる。均質な非グリコジル化ＦＧＦ−４は、アラニンＮ−末端またはプロ リンＮ−末端をもつＦＧＦ−４を含み得る（実施例１参照）。何れの場合にも、 細菌発現均質生産物の全部または一部は、イニンエーターであるメチオニン残基 を含むことができる。所望ならば、イニシエーターであるメチオニン残基は、末 端メチオニンを効果的に除去するメチオニン・アミノペプチダーゼを過剰発現す る細菌株中でＦＧＦ−４を発現することにより、除去することができる。

この発明はまた、非グリコジル化ＦＧＦ−４の製造法を提供する。

この方法は、適当な転写制御配列の発現調節下にあるＦＧＦ−４蛋白コ一ド化Ｄ ＮＡ配列により形質転換した（すなわち含有し発現可能な）細菌性宿主細胞を培 養することを含む。このＤＮＡ配列は、プリ・ボビ、セル５０巻７２９−３７頁 （１９８７年）、ヨシダ、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８４巻７３０５−０９頁（１９ ８７年）およびダイラ、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８４巻２９８０−８４頁（１９８ ７年）記載のものと同一の成熟ペプチド配列または実質的に同一の成熟ペプチド 配列をコード化するが、第１表に示すように、細菌細胞中での発現に好ましいコ ドンを含むように意図的にデザインすることができる。後者の場合、このように 意図的にデザインしたＤＮＡ配列から得られる生産物は、第１表に示す総成熟ペ プチド配列を含むことができ、またＮ−末端アラニンから数えて２４位のセリン で始まる、端を切った、生物活性をもつ成熟ペプチド配列を含むことができる。

ひとＦＧＦ−４をコード化するＤＮＡは、プリ・ボビ、セル５０巻７２９−３７ 頁（１９８７年）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー８巻（７号 ）２９３３−４１頁（１９８７年）、ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８４巻５６６０−６ ４頁（１９８７年）、またはヨシダ、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８４巻７３０５−０ ９頁（１９８７年）およびダイラ、ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ニーニスエイ８４巻２９８０−８４ 頁（１９８７年）記載の方法にしたがって、適当なベクター、選択マーカーおよ び既知の組換え体ＤＮＡ技術を用いて分離しクローン化することができる。ＦＧ Ｆ−４コード化ｃＤＮＡはこのような方法で得ることができる。別法として、Ｆ ＧＦ−４コ一ド化ＤＮＡ配列は全部または一部を合成により製造することができ る。この配列はまた、第１表に示し実施例１で検討したように適当に修飾するこ とができる。

ＦＧＦ−４をコード化するＤＮＡ配列は、当業界で周知のよう−に目的とする細 菌宿主細胞に適する発現ベクター中に常法によって挿入することができる。ベク ターは、複製部位、選択マーカーおよび宿主に適する転写制御配列を含めて当業 界で周知の代表的なベクター要素を含む必要がある。均質なＦＧＦ−４の産生用 宿主細胞として有用な種々のエシェリキア・コリ株が周知である。このような株 のリスト（制限するものではない）には、ＭＣ１０６１、ＤＨＩ、ＲＲｌ、Ｃ６ ００ｈｆｌ、Ｋ２Ｏ２、ＪＡ２２１、ＨＢＩＯＩ、ＪＭＩｏｌおよび実施例で用 いたものを含めて種々のに１２株が含まれる。

他の適当な細菌としては、バチルス・サブチルス、種々のシュードモナス株、他 の桿菌類等が含まれる。

この発明のＦＧＦ−４は、普通の場合活性形で蛋白質を得る必要はないから通常 折たたみに関係なく細胞内で発現させることができ、また、もし分泌リーダーが 保存されているなら細菌細胞から活性形で分泌させることができる。生物活性の 低下がみられる場合、必要または所望に応じて、ＦＧＦ−４生成物は純粋に公知 の方法を用いて折たたむことができる。

好ましい方法としては、一般に本書に記載したような方法でＦＧＦ−４のＤＮＡ 配列を発現するように操作したエシェリキア・コリ細胞を、ＦＧＦ−４蛋白質の 産生と細胞内集積を可能とするに適当な条件下で培養する。ついで細胞を採取、 すなわち培養に用いた培地および存在し得る他の物質から分離し、溶解し、溶解 物から目的とする生物活性ＦＧＦ−４を精製する。「生物活性」の語はｓＨ−チ ミジンとり込みアッセイでＢａ１ｂ−Ｃ−３Ｔ３細胞に対して検出可能なレベル のマイトジェン活性を示すＦＧＦ−４製品を意味する。

カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過および逆相ＨＰＬＣのような種々の精製技 術を、目的とする蛋白質を少なくとも部分的に精製するために使用できる。例え ば、ゴスポダロウイツクズ等、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー１ ２２巻３２３−３２頁（１９８５年）、イワネ等、バイオケミカル・アンド・バ イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ１４６巻４７０−７７頁（１ ９８７年）、フォックス等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー ２６３巻１８４５２−５８（１９８８年）、ＥＰｏ、２５９．９５３（１９８７ 年６月４日公開）、およびＥＰｏ、２３７．９６６（１’９８７年９月２３日公 開）参照。しかし、本発明者は、蛋白質の生物活性を著しく損なうことがない特 に効果的な精製刃を開発した。

好ましい精製方法は、ＦＧＦ−４を含む溶解質を約０．１Ｍより大きいか、約２ Ｍより小さい塩濃度を有する水性溶液と接触させること、及びＦＧＦ−４を可能 化させることを含む。次いで全ての不材料を反応生成溶液から：例えば遠心又は 濾過により除去し、その溶液の塩濃度は例えば透析又は、透濾過（ｄｉａｆｉｌ ｔｒａｔｉｏｎ）によりＦＧＦ−４の有効沈殿により減する。沈殿したＦＧＦを 次いでまた溶解している材料から、例えば混合物の遠心及び上澄液からベレット の除去により又は、ゲル濾過又はイオン交換クロマトグラフィーを含む、全ての 他の慣用分離方法により、分離回収する。約５０％純粋である、回収されたＦＧ Ｆ−４は、ヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィ、ゲル濾過、イオン 交換クロマトグラフィ或はこれらの又は慣用方法の種々の組み合わせによりさら に精製できる。ＦＧＦ−４の溶解特性の利益を利用する好ましい方法は、より効 果的でコストの小さい精製となり、反覆濾過又はクロマトグラフィ段階が排除さ れて、逆相ＨＰＬＣによる精製さら得ることができる生物学的活性での減少を避 ける。

精製の好ましい方法の実施では、種々の中性塩が用いられる。例えば、以下の全 てが用いうる。ＮａＣＬ　ＫＣＩ、Ｎａ２５Ｏｎ、Ｎａ３０ａ）（ｓ○７、Ｎａ Ｃ２Ｈ５Ｏ２、ＮＨ２ＳＯ，、ＭｇＣ１，好ましくはｐＨ７，５に滴定された塩 で、ＮａＣ］及びＭｇＣｌ２は好ましい塩である。ＮａＣ］を用いる場合、約０ ．５Ｍないし約２Ｍの範囲の塩の塩濃度が好ましい。ＭｇＣｌ２を用いる場合、 約０．１Ｍないし約０．５Ｍの範囲の塩濃度が好ましく、約０．２Ｍの濃度が特 に好ましい。

本発明の非グリコジル化又は均一、非グリコジル化ＦＧＦ−４を含む医薬組成物 は、外傷治癒又は骨形成誘導剤として有用である。

かかる医薬組成物は又、製薬上許容しうる担体、希釈剤、添加剤、塩、緩衝剤、 安定剤及び／又はこの分野でよく知られた他の材料を含みうる。用語「製薬上許 容しつる」は、活性成分（類）の生物学的活性の有効性をそこなわず、それが投 与されるホストに毒性でない材料を意味する。担体又は他の材料の特性は投与ル ートによる。

投与は種々の慣用方法により実施される。外傷又は傷害部位への局所投与が好ま しい。このような場合、本発明のＦＧＦ−４はパイロジエンフリーの、皮膚科学 的に許容しつる。溶液又は半固体処方、例えば軟膏、クリーム、ローション、フ オーム又はゲルの形である。

かかる局所に適用される製剤の調製はこの分野の当業者に範囲内にある。

局所投与のための好ましい医薬組成物はゲル製剤である。かかるげゲル製剤は、 ＦＧＦ−４に加えて、約２ないし約５％ｗ／ｖのゲル化剤を含む。ゲル化剤は又 、ＦＧＦ−４活性成分を安定化するのに作用し、好ましくは水溶性である。製剤 は又約２％Ｗ／Ｗの殺菌剤および緩衝剤をも含む。

典型的なゲルはエチル、メチル及びプロピルセルロースを含む。

好ましいゲルは、カルボキンポリメチレン、例えばカーポポール（９３４Ｐ、Ｂ 、Ｆ、グツドリッチ）、ヒドロキシブロピルチルセルロールフタラート、例えば ブラノース（７ＨＦ、アクアロン、英国）、キサンタンガム、例えばケルトロー ル（ＴＦ、　ケルコインターナショナル）、ヒドロキシエチルセルロース、例え ばセロサイス（ＱＰＩｏｏＭＨ，ユニオンカーバイト）、フロピレンゲリコール 、ポリエチレングリコール及びそれらの混合物を含む。カーボポールを用いる場 合、中和剤、例えばＮａＯＨは約７ないし約８の望ましい範囲のそして最も望ま しくは約７．５のｐＨを維持するために必要とされる。典型的な好ましい殺菌剤 はステリル（ｓｔｅｒｙｌ）アルコール類、特にベンジルアルコールを含む。緩 衝剤は医薬製剤に有用であるとこの分野で既に知られているものいずれも、例え ば２０ｍＭリン酸バッファーｐ）Ｉ’７．５であることができる。

皮膚または皮下注射も適用され、その場合、本発明のＦＧＦ−４はパイロジエン フリーの非経口的に許容しつる水性溶液の形である。

ｐＨ１等張性、安定性等を考慮に入れて有するかかる非経口的に許容し得る蛋白 溶液は、この分野の当業者の範囲内である。

活性成分の量は、条件の厳格さ、投与のルート、ＦＧＦ−４の分裂誘発活性に依 存し、最後に主治医により決定される。種々の医薬組成物はミリリットルのＦＧ Ｆ−４当たり約０．１ミクログラムないし約１ミリグラムを含むことを意図する 。小さな外傷については、製剤、特に局所製剤は、ミリリットルのＦＧＦ−４当 り約０１ミクログラムなしい約１００ミクログラムの範囲で含む。慢性又は大き な外傷にっては、高濃度が望ましい。例えば、ミリリットル当り約１０ミクログ ラムないし約１ミリグラムの範囲の濃度が適当である。よりしばしばの用量につ いては、ミリリットル当り約１〜１００ミクログラムが用いつる。

本発明のＦＧＦ−４ポリペプチドは治療応用に関連する種々の外傷又は骨におい て医師によるインビボ哺乳動物の処置に用いることができる。本発明のＦＧＦ− ４が全ての軟組織又は筋骨絡め損傷凝結に薬理学的試薬として有用であることは 予期されるが、これらの応用のあるものは、熱及び化学火傷、外科傷、褥癒性潰 ｉ（褥瘉）、糖尿病性潰瘍、静脈停止ａ瘍、形成外科からの外科剥離又は他の原 因からの剥離、及び皮膚又は骨移植、骨破損、靭帯、軟膏及び腿裂離及び粘液の う及び鍵の炎症を含む。

ＦＧＦ−４は又、損傷した中枢及び末梢神経組織の修復を増進するのに用いられ 、これらの徴候に所望により神経成長因子と組み合わせて用いる。つまり、本発 明の方法及び組成物は、表皮性損傷又は裂は目により、又は血管崩壊により特徴 づけられる軟組織の処置に、並びに筋骨格及び神経組織障害及び損傷の処置に用 いうる。

本発明の処置方法を実施する場合、治療的に有効な量のＦＧＦ−４がかかる損傷 及び外傷を有する哺乳動物に投与される。用語「治療的に有効な量」は、意味の ある患者恩恵、即ち、慢性条件の治癒、又は治癒の速度の増加を示すに充分であ る、方法又は組成物の各活性成分の全量を意味する。投与されただけの各活性成 分に適用される場合、用語はその成分のみをいう。組み合わせて適用されるとき 、連続的に又は同時に組み合わせて投与され、治療効果を示す活性成分の組み合 わせた量をいう。本発明のＦＧＦ−４の治療的に有効な用量は応用当たりミリリ ットル当たり約１０ミクログラムないし約１００ミリグラムの範囲にあるよう意 図される。応用の数は各患者及び損傷のひどさにより変わり得る。局所投与には 、標準局所製剤を用いることができる。

本発明のＦＧＦ−４ポリペプチドは、単独又は他の治療との組み合わせて投与し つる。例えばＦＧＦ−４は、傷つけられた地域への細胞を増進し、細胞成長を刺 激する走化剤として作用する集落刺激因子を有効に組み合わせうる。好ましい集 落刺激因子はＭ、−Ｃ５Ｆである。Ｍ−Ｃ３Ｆの投与は、外傷又はやけどを除去 し、清浄を促進し、これにより均−ＦＧＦ−４の治癒をより速やかにすることに 役立つことを意図する。

Ｍ−Ｃ５Ｆの種々の形又は種が天然起源からの精製によりまたは組換えＤＮＡ技 術により分離、生成された。例えば、ウォング等、サイエンス２３５．１５０４ 〜０８　（１９８７）　、ＷＯ’８７１０６９５４、ＥＰ０２６１５９２、ＷＯ ３８１０３１７３，ＥＰＯ２７６５５１、米国出願番号４．８４７．２０１、Ｅ Ｐ○２４９．４７７、ＧＢ２０１６７７７、ＷＯ３９１０３８８１、米国出願番 号４，８４７．３２５、ＷＯ３８１０８００３及びＷ○８６１０４５８７参照。

Ｍ−ＣＳＦがその特徴的生物学的活性、ウォング等、サイエンス２３５．１５０ ４〜０８　（１９８７）の標準骨髄アッセーでの単核球／マクロファージ系統の 細胞の長成を増殖する能力を示し、特に厳重な条件下でウォング、上述の図２に 示すように天然に起きる形について、ＤＮＡにハイブリッド形成する能力を有す るＤＮＡによりコード化される限り、記載した刊行物に述べるものに限定されな いが含む、全てのＭ−Ｃ３Ｆは本発明の方法で用いうろことが意図される。もち ろん、天然に基因するイソタイプ又は蛋白又は種の異なるメンバーに起きるよう にそれらのコード付は配列中の対立遺伝子変種も含まれる。

活性成分としてＭ−Ｃ３Ｆの種を含む医薬組成物は非経口的に、例えば静脈内又 は皮下に投与される。非経口的に投与される場合、Ｍ−Ｃ５Ｆ組成物は非−パイ ロ−ジエン、無菌、非経口的に許容しうる水溶液の形でありうる。かかる溶液の 調製はこの分野の当業者の水準内にある。

本発明の均−ＦＧＦ−４との組み合わせて用いられる場合、Ｍ−Ｃ３Ｆ医薬組成 物は、ＦＧＦ−４組成物と、好ましくは前に、又は同時に投与しつる。どの場合 も治療的に有効な用量は約１０〜２００ミクログラムＭ−ＣＳＦ／ｋｇ／日の範 囲で、好ましくは約２０〜１００ミリグラム／ｋ　ｇ１日の範囲であることが意 図される。

ＦＧＦ−４は、又、骨形成誘引因子、例えば骨又は軟骨成長仲介剤として作用す るＢＭＰと有効に組み合わせつる。本発明のＦＧＦ−４との組み合わせでＢＭＰ の投与は付加的に又は相系的に軟骨及び骨の形成速度を増強し、これにより軟骨 及び骨損傷、関節置換外科、形成外科、慢性前異常、歯根膜疾患等からの回復を 促進することを意図する。

ＢＭＰの種々の形又は種が分離、生成された。例えば１９８８年１月１４日公開 されたＷＯ８８１０Ｏ２０５及び１９８９年１１月２日公開されたＷＯ３９／１ ０４０９参照。記載した刊行物に述べられるものに限らないが含まれる全てのＢ ＭＰは、ＢＭＰが特徴的生物学的活性、前述の刊行物（又、サムパス及びレディ 、ブロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス、ニ ーニスエイ、８０．６５９１−９５　（１９８３）参照）に記載されるローゼン ー修飾すムバスーレディラット骨形式アッセーで軟骨及び／又は骨形成を誘発す る能力を示し、特に厳重な条件下、開示されたＤＮＡに！シブリッド形成しうる ＤＮＡによりコード化される限り、本発明の方法に用いうることが意図される。

もちろん、天然に基因のイソタイプ又は種の異なるメンバーに起きるように、蛋 白での又はそれらのコード付は配列での対立遺伝子変種も含まれる。

好ましい形はＢＭＰ−２である。

活性成分としてＢＭＰの種を含む医薬組成物は、局所的に、系統的に、或いはイ ンブラント又は装置として局所的に投与しつる。投与されるとき、ＢＭＰ組成物 は、パイロ−ジエンフリー、生理的に許容しつる形であり、そして被膜に包まれ 、又は骨又は軟骨障害の部位への送付のための粘性形で注射され、或いはＢＭＰ を障害の部位に送付し、表面を与える能力を有するマトリックスを含み、発達す る骨又は軟骨について構造を支持する。至的条件で体内に再吸収されうる。かか るマトリックスは、他の医学インブラント応用への使用で現在材料に形成され、 この分野で知られている。

本発明の均−ＦＧＦ−４との組み合わせで用いる場合、ＢＭＰ医薬組成物は、前 、後又は同時にＦＧＦ−４と投与しうる。どの場合も治癒的に有効な用量は、望 ましい貴重量のダラム当たり、約１０ないし約１０６ナノグラムの範囲であるこ とが意図される。

ＦＧＦ家族の他のメンバーが論じた徴候の処置で前述の集落刺激因子又は骨形成 誘引因子と有効に組み合わせることも意図される。

本発明は以下の実施例においてさらに記載されるが、これらは発明を示すことを 意図するものであり、その範囲を限定するものではない。

実施例１：ｃＤＮＡサブクローニングとエシェリキア・コリの発現種々の異なっ た型のベクターと発現系が使用可能であるが、我々はｐＬプロモーターとｃｌＩ リポソーム結合領域の発現制御下にある、介在配列の少ないｃＤＮＡ配列をプロ グラムしているＦＧＦ−４を含むｐＡＹＬＣ／ＫＳＦ　（Ａ）−７８１という細 菌発現ベクターをデザインし構築した。ｃＤＮＡのコード配列は、第１表に示さ れたように本来の分泌性リーダー配列の代わりにＭＥＴコドンを含むように修飾 し、３°末端の暗号付けされていない配列は切りとった。加えて、この配列の初 めの３３コドンのうち３２までを、天然の配列の７８％から修飾された配列の４ ８％までＧ／Ｃ含量を減少するように修飾した。個々のヌクレオチド置換をそれ ぞれのコドンに挿入して示す；天然のヌクレオチドはコドンの上に示しである。

第１表 Ａ Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　 Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｐｒ。

ＡＧＧ ＧＩＹ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ工１ａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌ ａｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｉ、ａｕ　ＴｙｒＴＧＣＭＣＧＴＧ　ＧＧＣＡＴＣＧＧ ＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣＣＣＣＧＡＣＣｙｓ　Ａｓｎ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｙ工ＩＱ　Ｇｌｙ　Ｐｈａ　ＨＡｓＬａｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌａｕ 　Ｐｒｏ　ＡｓｐＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧ　ＣＡＣＧＣＧ　ＧＡ ＣＡＣＣＣＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧｌｙ　Ａｒｇ工ｌａ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＡｌ ａ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＬａｕＴｈｒ 　Ｈｉｓ　ＰｈｅＬａｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　−ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＣＣＴ 　ＣＧＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＣＣＴ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＣＧＡ　 ＧＧＧ　ＴＣＡＣＣＴ　ＴＧ ２番目の発現ベクター、ｐＡＹＬＣ／ＫＳＦ　（Ｐ）−７８１もまた、同様に作 成した。このベクターはイニシエーターのメチオニンコドンの後にプロリンコド ンを最初のコドンとして残して、ＦＧＦ−４コード領域から最初の成熟コドン（ Ａ１ａ＊）が欠失していることより親ベクターと異なる。第１表参照。

バクテリアの宿主細胞としては、チミンまたはチミジンを供給しない培地での増 殖にｐＡＹＬＣ／ＫＳＦ　（Ａ）−７８１またはｐＡＹＬＣ／ＫＳＦ　（Ｐ）− ７８１に依存する、遺伝子操作されたエシェリキア・コリ　Ｗ３１１０株である ＧＩ５９５を用いた。０１５９５株からのｐＡＹＬＣ／ＫＳＦ　（Ａ）−７８１ ベクターを用いたＦＧＦ−４の発現は、チミンまたはチミジンの欠乏した培地中 で３０℃で対数増殖中期まで細胞を増殖させることにより達成した。この温度で はｃ１８５６λ−抑制因子はｐＬプロモーターからの転写抑制に有効である。培 養はその後ｐＬからＦＧＦ−４遺伝子転写を誘導するために４０℃に変えた。糖 付加していないＦＧＦ−４は回収前に４０℃での培養を維持することにより蓄積 させた。細胞は回収し一８０℃で保存した。

りＡＹＬＣ／ＫＳＦ　（Ｐ）−７８１を用いたＦＧＦ−４の発現も同様の方法で 行うことが出来る。

実施例２：　精製 上記実施例１のようにして回収し保存した、凍結エシェリキア・コリ細胞材料１ ００ｇを０．　５リツトルのブレーク緩衝液（トリス６、Ｏｇ／Ｉ、ＨＣＩでｐ Ｈを７．０に調節、１．９ｇ／ＩＥＤＴＡ、１．７ｇ／ＩＰＭＳＦ、１．０ｇ／ １ｐＡＢＡ　（ｐ−アミノベンズアミジン）そして５０ｍ１／１グリセリン）を ４Ｉワ一リング工業用混合機中で配合した。凍った細胞材料は窒素置換し、最高 の出力で約１分程度かきまぜた。細胞懸濁液は、冷やしておいた（４℃で１２時 間）モデル１５Ｍガラリン研究室用ホモジナイザーのサンプル貯蔵容器に移した 。細胞は圧差を８０００から９０００ＰＳＩにしたホモジナイザーで、３回処理 した。細胞の破壊は位相差顕微鏡１０００倍で肉眼で観察した。溶解した細胞材 料は液体窒素で満たした１０リツトルのナルゲン寒冷デーワーに３回直接通した 後ホモジナイザーから排出した。

１５０ｇの溶解細胞材料がデーワーから回収された。この溶解質に５ｍＭｐＡＢ Ａ、５ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭＰＭｓＦを含む５０ｍ１の５０ｍＭＨｅｐｅｓ 、ｐＨ７，５を加え、この混合物を１時間４℃でかきまぜた。この懸濁液は６０ ｍ１のシリンジを用い２３ゲージの針を強制的に通し、２５０００ｘｇで５０分 間遠心した。

この上清は廃棄した。この沈澱に５ｍＭｐＡＢＡ、５ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍ１の５０ｍＭＨｅｐｅｓ、１゜０ｍＮａＣ１，ｐＨ７，５ を加えた。これを１５時間４℃でかきまぜた。けんだく液を４℃で４５分間、２ ５０００ｘｇで遠心した。

上清は傾斜し、４℃で２．０リツトルの５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５に対し て透析した。この透析物は４℃で３０分間、１１００００Ｘで遠心した。上清は 廃棄し、沈澱物を再び２００ｍ１の５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７，５に４℃で６ 時間かきまぜて溶解し、４℃で３０分間、２５０００Ｘｇで遠心した。得られた 上清を４００ｍ１の５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７，５を加えて希釈し、先に５０ ｍ１Ｈｅｐｅｓ、０．２５ＭＮａＣ１，ｐＨ７，５で平衡化したＱトーヨーパー ルカラム（７，５Ｘ２．５ｃｍ）に１．２５ｍ１／分で通した。約６５０ｍ１の 溶出液は回収し、固形ＮａＣ１を加えることによりＮａＣ１の濃度を０．７５Ｍ に上昇させた。この溶液をヘパリン−セファロースカラム（１０，Ｑｘｌ、５ｃ ｍ）に４℃で通し、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７，５中のＮａＣＩ濃度０．７５ から１．５Ｍの勾配で溶出させた。ＦＧＦ−４は約１，１ＭＮａＣ１で溶出し、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマノ−ブルー染色および別の確認実験により均質である ことがわかった。

この実施例に特定材料として列挙した物は他の材料に置き換えることが出来る。

例えば平衡化した強アニオン樹脂のカラムはＱトーヨーバール力ラムと置き換え ることができ、そしてヘパリン系親和性カラムも使用できる。このような材料の 置換は当技術水準に含まれる。

実施例３・分子量測定 実施例２で得られた蛋白試料を、レムリ、ネイチャー、２２（２５９）：６８０ −８５　（１９７０）に記載のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル を用いて分析した。分子量測定は５ＤＳ−ＰＡＧＥにより以下のように行った： 蛋白１０マイクログラムを含む部分を１２５ｍＭｈリス、ｐＨ５８，４％ドデテ ン硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、１０％２−メルカブトエタノールおよび ０．０５％ブロモフェノールブルーからなる試料用緩衝液に添加した。試料は３ 分間煮沸し、４％濃縮用ゲルを含む１２５％ポリアクリルアミドゲル平板（０， ，７５ｍｍ）にかけた。２−メルカプトエタノールを緩衝液から除き、試料を煮 沸しない以外は、非還元条件下の電気泳動を同一の方法で行った。

１標準当たり１０マイクログラムを含む蛋白標準混合物もまた各々のゲルにかけ た。５ＤＳ−ＰＡＧＥはおよそ２１ｋＤのみかけ分子量を有する単一成分を現し た。

実施例４．逆相ＨＰＬＣ 実施例２からの生成物質的０２ｍ１をＣ−４バイダックＲ−ＰＨＰＬＣカラム（ ２５Ｘ０．４５ｃｍ）に注入し、第２表に記載の匂配条件を用いて逆相ＨＰＬＣ により分画した。図に示すように、単一の蛋白ピークを２８０ｎｍのＵＶ吸収に より検出した。ＦＧＦ−４の同一性−５ＤＳ−ＰＡＧＥの挙動およびＮ−末端ア ミノ酸配列決定により確認された。

第２表 ポンプＡ　水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ポンプＢ　水中領１％ＴＦ Ａ中９５％アセトニトリル匂配時分（分）　Ｂ％　時間 蛋白の均一性はこの操作により確認した。しかし、生物学的活性の顕著な損失が 見られた。

最も良好な結果を得るために、蛋白は実施例２において精製され得る。

実施例５：クームシ−・ブルー染色 実施例３のゲル平板をクームノー・ブルーＲ−２５０を用いて以下のように染色 した。２５％イソプロパツール、１０％酢酸中０゜０５％クームシ−・ブルーＲ −２５０のおよそ２５０ｍ１を６０℃に加熱した。ゲルをこの溶液中にゆるやか に揺らしながら１時間浸漬した。ゲルを１０％イソプロパツール、１０％酢酸の ２５０ｍ１で、地色が透明になり、青色を示さなくなるまで数回脱色した。脱色 により単一のバンドが現れた。

実施例６：３Ｈ−チミジン取り込み試験実施例２と同様にして得られたＦＧＦ− ４を、３Ｈ−チミジン取り込み試験法を用いて、バルブＣ−３７３細胞に対する 分裂促進作用を調べた。細胞を９６ウエルプレート中のＤＭＥ　（イーグル培地 のダルベコ修飾培地［ハゼルトン］）、１ｍＭグルタミンおよび１０％子牛血清 （ギブコ）中で集密化近（まで生長させ、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥ、１ｍＭグル タミンおよび０，５％子牛血清中で２ｍ３日断食させた。ＦＧＦ−４をトリプリ ケートでウェル中の連続希釈液に加え、プレートを、２０時間インキュベートし 、ウェル当たリ３Ｈ−チミジン１マイクロキュリーを添加した。添加４時間後、 細胞にトリプシンを１％まで添加してプレートから細胞を分離させた。細胞をセ ル・ハーベスタ−・１２９５−００１型［ＬＫＢ］を用いたフィルターに移し、 水で洗浄し、最終的に７０％エタノールで洗浄した。３Ｈ−チミンン取り込みは ベータプレート１２０５型／ンチレーンヨン計数管で測定し、結果をグラフにプ ロットし、３Ｈ−チミジンの最大取り込みの５０％になるＦＧＦ−４の濃度を測 定した。測定するとこの試験法で１ｍｌ当たりＦＧＦ−４約０５ナノグラムであ った。

実施例７：溶解性 実施例２の塩析方法を用いて、およそ５０％程度まで部分的に精製された、非グ リコノル化ＦＧＦ−４の溶解性を、蛋白不純物およびパイロツエンを除去するた めに、トーヨーパールおよびヘパリン−セファローズ力ラムクロマトグラフイー を用いてさらに精製した、この実施例の均質、非グリコノル化ＦＧＦ−４の溶解 性と比較した。

部分的精製ＦＧＦ−４の溶解性はイオン強度（５０〜１０００ｍ１００Ｏｌ）に よって変化し、ｐＨ（ｐＨ７，５〜９．０）によって変化しないことが判明した 。０５〜１．５ＭＮａＣｌ間では溶解性に大きな改善はなかった。観察された最 大溶解度はおよそ（ｍｇ／ｍ１）であった。

実施例２で精製した精製パイロンエン無含有ＦＧＦ−４の溶解態様は部分的精製 蛋白と非常に異なった。５００−８００マイクログラム／ｍｌの濃度が添加塩の 不存在下（５０ｍＭへペス、ｐＨ７゜５）精製蛋白につき観察された。

実施例８・創傷治癒における使用 実施例２の均質ＦＧＦ−４をウィンターのブタ創傷治癒モデルーエピデルマル・ ラウンド・ヒーリング、７１−１１２頁（メイノくソチ、Ｈｌおよびロビー、Ｄ Ｔ編集）、イヤー・ブ・ツク・メディカル・パブリッノヤー・インコーホレイテ ッド、シカゴを、イーグルスティンおよびメルフ、ジャーナル・オブ・インベス チゲーション・デルマトロノー、７１　：３８２−８４　（１９７８）により修 正したモデルを用いて、創傷治癒剤としての使用につき評価した。５匹の若い白 色ヨークンヤー・ブタ、各２０−３０ポンド、およそ２〜３月令を用いた。各動 物の背中および両側の毛を標準的動物毛刈機を用いて刈り、露出した皮膚を弱い 石鹸および水で洗浄しす丁いた。ブタをケタミン（３００ｍｇ筋肉内）およびハ ロタン（３０％開放マスク）で麻酔した。各動物の胸部および腰部を柱傍領域中 に２００個の７ＸＩＱｍｍの長方形、深さ０．３ｍｍの創傷をカストロービエホ 皮膚採取器でつけた。各動物の創傷を５個の処理部位に分割し、（１処理部位当 たり４０個の創傷）、各動物の処理部位を第Ｏ日用に次のいずれかで処理した。

Ｃ空気暴露対照、非処理 ＴＩ　ＦＧＦ−４１０マイクログラム／水性媒体２０マイクロリットル／傷 Ｔ２　ＦＧＦ−４１マイクログラム／水性媒体２０マイクロリットル／傷 ７３　Ｋ−ＦＧＳ　Ｏ，１マイクログラム／水性媒体２０マイクロリットル／傷 Ｖ　５ＱｍＭヘベス、ｐＨ７５および１２５ｍＭＮａＣ１からなる水性媒体のみ ２０マイクロリツトル／傷 均−な分配を考慮して、前述の処理は各動物につき異なる処理部位に行った。

水溶液処理は局所的に行い、３０分間は静かにさせて創傷床に完全に吸収される ようにした。３日から７日まで毎日、各動物の各処理部位の任！に選んだ５個の 傷からカストロービエホ皮膚採取器により、創傷試料を抽出した（２２Ｘ３３ｍ ｍ、全創傷床および幾分の周囲の非処理組織を含む深さ）。メルフら、スウイン ・／くイオケミカル・リサーチ、２９１−３０２頁（タムブルソン、ＭＥＷ集） 、プリラム・プレス、ニューヨークの方法に従って、試料を評価した。

この発明の均質ＦＧＦ−４は、非処理対照に対して、約１０〜２０％の相対的治 癒率の増大を惹起した。

＋＋＋ＷＡ、’−”−”−ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６７０２国際調査報告 ＰＣＴ／Ｕｊ　９０１０６７０２ Ｓ＾　４２５２１

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して約２１，０００ダルトンの 分子量、 （ｂ）ポリペプチドに結合するオリゴ糖部分の不存在、および （ｃ）３Ｈ−チミジンとり込みアッセイにおけるＢａｌｂ−Ｃ−３Ｔ３細胞に対 するマイトジェン活性 を特徴とする、ＦＧＦ−４ポリペプチド。
2. （２）（ａ）還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バンドの外見、（ｂ）逆相高速液 体クロマトグラフィー上での単一ピークとしての移動、 （ｃ）還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して約２１，０００ダルトンの分子量 、 （ｄ）ポリペプチドに結合するオリゴ糖部分の不存在、および （ｅ）３Ｈ−チミジンとり込みアッセイにおけるＢａｌｂ−Ｃ−３Ｔ３細胞に対 するマイトジェン活性 を特徴とする、均質ＦＧＦ−４ポリペプチド。
3. （３）軟部組織損傷または筋・骨格障害の処置に適する医薬組成物の製造のため の請求項１または２記載のＦＧＦ−４ポリペプチドの使用。
4. （４）皮ふ科的に許容される局所用媒質中に請求項１または２記載のＦＧＦ−４ ポリペプチドの有効量を含む、軟部組織損傷の処置用局所用製剤。
5. （５）発熱性物質を含有しない非経口投与的に許容される媒質中に請求項１また は２記載のＦＧＦ−４ポリペプチドの有効量を含む、軟部組織損傷または筋・骨 格障害の処置用注射用製剤。