CN113567206B - 基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法；包括如下步骤：S1、制备ZIF‑67悬液，使ZIF‑67纳米材料充分分散于NH4HCO3溶液；S2、将ZIF‑67悬液与细胞裂解液混合孵育，利用ZIF‑67与膜蛋白的疏水相互作用吸附膜蛋白及膜相关蛋白；S3、使用SDS洗脱膜蛋白及膜相关蛋白，并对其进行质谱分析。本发明根据ZIF‑67纳米材料和膜蛋白疏水结构域之间的相互作用，可以选择性地捕获膜蛋白及膜相关蛋白。本发明适用于细胞、组织、微生物中膜蛋白及膜相关蛋白的分离提取，是一种简单且高效的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，有助于膜蛋白及膜相关蛋白的生物医药应用。
Description
技术领域
本发明属于膜蛋白技术领域，涉及亚细胞组分分离提取新技术，具体涉及一种基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法。
背景技术
膜蛋白(MPs)是介导细胞膜众多功能的关键成分，在生物体内承担了包括物质运输、信号转导、细胞粘附和胞间交流等多种生理功能(Tan,S.,H.T.Tan and M.C.M.Chung(2008)."Membrane proteins and membrane proteomics."Proteomics 8(19)：3924-3932.)。膜蛋白也是一类重要的药物靶点，其异常表达往往与许多恶性疾病的发生发展相关，尤其是癌症(Hutchings,C.J.,M.Koglin,W.C.Olson and F.H.Marshall(2017)."Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein-coupledreceptors."Nature Reviews Drug Discovery 16(11)：787-810.)。因此，表征膜蛋白质组及其动态调节对于理解许多细胞过程和疾病至关重要。
膜蛋白固有的低丰度和疏水性增加了膜蛋白质组学鉴定的难度，阻碍了膜蛋白结构与功能相关研究的进展。因此，膜蛋白在蛋白质组学分析前往往需要富集，简单高效的膜蛋白富集方法有助于膜蛋白质组的深入研究。
疏水材料可以作为固相基质用于吸附膜蛋白及膜相关蛋白。膜蛋白通常包括一至多个跨膜结构域，这使其跨膜区具有较强的疏水性，为其与疏水材料的相互作用提供了可能。纳米金刚石(Pham,M.D.,T.C.Wen,H.C.Li,P.H.Hsieh,Y.R.Chen,H.C.Chang andC.C.Han(2016)."Streamlined membrane proteome preparation for shotgunproteomics analysis with triton X-100cloud point extraction and nanodiamondsolid phase extraction."Materials 9(5)：e385.)和石墨烯(Uzzaman,A.,Z.Shang,Z.Qiao,C.X.Cao and H.Xiao(2018)."Graphene and graphene oxide as a solidmatrix for extraction of membrane and membrane-associated proteins."Microchim Acta 185(2)：e123.)已被证明可有效富集膜蛋白及膜相关蛋白，在其富集过程中疏水相互作用是一重要驱动力。但目前基于疏水材料发展的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法尚存在一些不足。如纳米金刚石方法需要细胞起始量巨大(108个细胞)，不利于少量样品或珍贵样品的富集，同时操作流程较为复杂。石墨烯方法依赖于试剂盒，且膜蛋白鉴定数目相对较低。
金属有机骨架纳米材料ZIF-67是由Co2+和2-甲基咪唑形成的配位聚合物，具有良好的疏水性(Sarango,L.,L.Paseta,M.Navarro,B.Zornoza and J.Coronas(2018)."Controlled deposition of MOFs by dip-coating in thin film nanocompositemembranes for organic solvent nanofiltration."Journal Of Industrial And Engineering Chemistry 59：8-16.)。但在蛋白质组学研究中，目前还没有采用该材料富集膜蛋白的报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述技术中存在的不足，提供一种基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将ZIF-67纳米材料溶于NH4HCO3溶液，在0-8℃的条件下超声，制备ZIF-67悬液；
S2、将ZIF-67悬液与细胞裂解液混合，孵育(利用ZIF-67与膜蛋白的疏水相互作用吸附膜蛋白)，离心后得到沉淀即为ZIF-67-蛋白复合物；
S3、洗涤沉淀并使用SDS洗脱，离心得到上清即为膜蛋白和膜相关蛋白。
其他ZIF材料，如ZIF-8在本发明的体系中存在一定程度水解，因而不适用。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述NH4HCO3溶液的浓度为10-100mM。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述超声的超声时间为3-30min。在一些实施例中，采用超声5min。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述ZIF-67纳米材料的粒径为100-500nm。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，ZIF-67悬液中ZIF-67纳米材料的浓度为10-100mg/mL。在一些实施例中，ZIF-67悬液浓度为64mg/mL。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，细胞裂解液中蛋白与ZIF-67纳米材料的质量比为1∶10-1∶100。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，混合孵育体系中含有10％-30％(v/v)乙醇和50-200mM NaCl，体系pH值为8.0-9.0。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，孵育方式为振荡孵育，操作温度为2-8℃；孵育时间为30-60min。
在一些实施例中，细胞裂解液中蛋白与ZIF-67纳米材料的质量比为1∶20，混合体系中含有20％乙醇和100mM NaCl，体系pH值为9.0，孵育方式为振荡孵育，操作温度为4℃，时间为30min。
作为本发明的一个实施方案，添加0-8℃50-200mM Na2CO3溶液2-8℃下振荡10-20min，在2-8℃，16000-21000g下离心20-60min，弃掉上清液；重复若干次。在一些实施例中，洗涤方法为：添加冰冷的100mM Na2CO3溶液4℃下振荡10min，在4℃，21000g下离心40min，弃掉上清液。重复该步骤2次。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述离心的条件为：4℃、21000g离心40min。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，所述SDS的浓度为0.1％-5％。在一些实施例中，选用的SDS浓度为2％。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，SDS洗脱是使用超声破碎仪冰上超声5min；所述离心的条件是：4℃、21000g离心40min。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，还包括对得到的膜蛋白及膜相关蛋白进行蛋白质组学分析的步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明利用ZIF-67固相提取方法代替传统超高速离心法获得膜蛋白提取物，所需细胞起始量大大降低，同时提取流程更为简单、省时、省力。
2、本发明利用ZIF-67与膜蛋白跨膜结构域的疏水相互作用捕获膜蛋白。
3、本发明可以得到较高的膜蛋白产量和鉴定数目。与一款市售膜蛋白提取试剂盒(Mem-PERTM plus Protein Extraction Kit)相比，本发明从HEK293T细胞系中得到的提取产量和鉴定数目分别提高了88.1％和29.2％。
4、应用于具有不同转移能力的肺癌细胞系95C和95D，发现本发明还可以富集到试剂盒难以提取的低丰度膜蛋白以及与肺癌细胞的增殖和迁移密切相关的膜蛋白。
5、本发明的方法可作为一种广泛应用的工具，有效全面地提取全细胞膜蛋白，为研究细胞膜蛋白质组的动态变化提供了一个新的视角。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1制备方法的步骤流程示意图；
图2为试剂盒方法和本方法从HEK293T细胞系中提取的膜蛋白产量及鉴定数目对比；其中，(a)为试剂盒方法和本方法从HEK293T细胞系中提取的膜蛋白产量；(b)为试剂盒方法和本方法在HEK293T细胞系中鉴定的蛋白及膜蛋白数量；
图3为提取方法得到膜蛋白的蛋白质组学分析；其中，(a)对照组和实验组中提取膜蛋白的分子量(MW)和总平均亲水系数(GRAVY)分布；(b)对照组和实验组中提取膜蛋白的跨膜域(TMs)和等电点(pI)分布；(c)本方法相比试剂盒方法显著上调MPs的KEGG富集通路图；
图4为本方法应用于肺癌细胞系中对低丰度和高丰度膜蛋白的富集情况；其中，(a)为95C细胞ZIF方法富集丰度前十膜蛋白和试剂盒方法富集丰度后十膜蛋白的倍数变化；(b)为95D细胞ZIF方法富集丰度前十膜蛋白和试剂盒方法富集丰度后十膜蛋白的倍数变化；
图5为使用试剂盒方法和本方法对人胚肺细胞MRC5的膜蛋白提取情况；其中，(a)为试剂盒方法和本方法从MRC5细胞系中提取的膜蛋白产量；(b)为试剂盒方法和本方法在MRC5细胞系中鉴定的蛋白及膜蛋白数量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
实施例1
图1为实施例1制备方法的步骤流程示意图；包括如下步骤：
步骤1，制备ZIF-67悬液。
称取32.6mg ZIF-67纳米材料，向其中小心加入512μL NH4HCO3溶液(50mM)，振荡混匀后冰浴超声5min，使ZIF-67均匀分散在溶液中。
步骤2，ZIF-67吸附膜蛋白，得到ZIF-67-蛋白复合物。
取对数生长期HEK293T细胞(3×106个)，PBS洗涤并用细胞刮棒刮下，4℃、300g离心5min收集细胞沉淀。加入适量含50mM NH4HCO3的6M尿素溶液，4℃裂解细胞10min随后冰上超声10min得到细胞全蛋白裂解液。采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。将ZIF-67悬液与细胞裂解液按照1∶20质量比混合，添加200μL无水乙醇和100μL 1M NaCl，补加适量ddH2O至体系终体积为1mL并调节体系pH值为9.0。样品置于涡旋震荡器4℃孵育30min。4℃、21000g离心40min后弃掉上清，得到沉淀即为ZIF-67-蛋白复合物。
步骤3，SDS洗脱膜蛋白，进行蛋白质组学分析。
使用冰冷的100mM Na2CO3溶液洗涤沉淀2次去除亲水性蛋白及囊泡内蛋白；所述洗涤是在4℃下振荡10min，在4℃，12000g下离心40min，弃掉上清液。向沉淀中加入300μL 2％SDS溶液，使用超声破碎仪冰上超声5min(200w超声2s、暂停10s)，于4℃、21000g下离心40min，得到上清即为膜蛋白及膜相关蛋白，利用质谱技术进行免标记定量蛋白质组学分析。如图2(a-b)可知，本方法提取的膜蛋白产量为385.42μg，共鉴定到876种蛋白质，其中包含465种膜蛋白。由图3(a-b)可知，本发明的方法更倾向于富集高疏水性和含多跨膜域的膜蛋白，相比试剂盒方法显著富集的膜蛋白参与了RNA转运、紧密连接等膜相关通路，如图3(c)，这些说明了本发明方法的有效性和可靠性。
实施例2
本实施例涉及一种基于金属有机骨架材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，与实施例1的区别之处在于将该方法应用于具有不同转移能力的肺癌细胞系95C和95D。如图4(a-b)所示，本方法从95C和95D细胞中得到的膜蛋白提取产量分别为521.27μg和524.06μg，鉴定蛋白数量分别为3263种和3296种，其中分别包括1711种和1732种膜蛋白。这说明本方法可以富集到可观的膜蛋白产量及鉴定数目。
实施例3
本实施例涉及一种基于金属有机骨架材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，与实施例1的区别之处在于将该方法应用于人胚肺细胞MRC5。如图5所示，本发明的方法从MRC5细胞系中得到的膜蛋白产量为190.79μg。本方法共鉴定到488种蛋白质，其中包括290种膜蛋白。
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于：使用试剂盒(Mem-PERTM plus ProteinExtraction Kit)提取HEK293T细胞系中的膜蛋白。
使用试剂盒方法和本方法在HEK293T细胞系中的膜蛋白提取情况，如图2(a-b)所示，试剂盒方法得到的膜蛋白产量为204.89μg，共鉴定到632种蛋白质，其中包括360种膜蛋白。相比于试剂盒方法，本方法得到的膜蛋白产量及鉴定数目分别显著提高了88.1％和29.2％。
对比例2
本对比例与实施例2的不同之处在于：使用试剂盒(Mem-PERTM plus ProteinExtraction Kit)提取肺癌细胞系95C和95D中的膜蛋白。
使用试剂盒方法和本方法提取不同转移能力肺癌细胞系95C和95D中的膜蛋白，对低丰度和高丰度膜蛋白的富集情况如图4(c-d)所示，对于95C和95D细胞，本方法提取丰度排名前十的膜蛋白中分别有8种和9种相比试剂盒方法得到富集，试剂盒方法提取丰度排名后十的膜蛋白中分别有8种和10种通过本方法得到富集。这说明本方法在两种肺癌细胞系中均可以显著富集对照方法中的低丰度膜蛋白。
对比例3
本对比例与实施例3的不同之处在于：使用试剂盒(Mem-PERTM plus ProteinExtraction Kit)提取人胚肺细胞MRC5中的膜蛋白。
使用试剂盒方法和本方法对人胚肺细胞MRC5的膜蛋白提取情况，如图5(a-b)所示。本发明的方法得到的膜蛋白产量(190.79μg)相比试剂盒方法(131.46μg)显著提高了45.1％。试剂盒方法和本方法分别鉴定到376和488种蛋白质，其中分别包括236和290种膜蛋白。与试剂盒方法相比，本发明的方法得到的膜蛋白鉴定数目显著提高了22.9％。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (4)
1.一种基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将ZIF-67纳米材料溶于NH4HCO3溶液，在0-8℃条件下冰浴超声5 min，制备ZIF-67悬液；
S2、将ZIF-67悬液与细胞裂解液按照1∶20质量比混合，添加200 μL无水乙醇和100 μL1 M NaCl，补加适量ddH2O至体系终体积为1 mL并调节体系pH值为9.0；样品置于涡旋震荡器4°C孵育30 min，21000 g离心40 min后得到沉淀即为ZIF-67-蛋白复合物；
S3、使用冰冷的100 mM Na2CO3溶液洗涤沉淀2次去除亲水性蛋白及囊泡内蛋白；所述洗涤是在4℃下振荡10 min，在4℃，12000g下离心40 min，弃掉上清液，重复若干次；向沉淀中加入300 μL 2%SDS溶液，使用超声破碎仪冰上超声5 min，离心得到上清即为膜蛋白和膜相关蛋白。
2.根据权利要求1所述的金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述NH4HCO3溶液的浓度为10-100 mM。
3.根据权利要求1所述金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，其特征在于，步骤S1中，所述ZIF-67纳米材料的粒径为100-500 nm；ZIF-67悬液中ZIF-67纳米材料的浓度为10-100 mg/mL。
4.根据权利要求1所述金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法，其特征在于，步骤S3中，还包括对得到的膜蛋白及膜相关蛋白进行蛋白质组学分析的步骤。
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