CN105671030A - 基于磁珠法的高效血浆细胞游离dna提取方法 - Google Patents

基于磁珠法的高效血浆细胞游离dna提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法。本发明所提供的高效血浆细胞游离DNA提取方法，包括：1)配置预处理液P对血浆样品进行预处理；2)配置结合液B，在两步温控条件下采用羟基磁珠特异性吸附样品中的DNA；3)配置洗涤液W1和W2对吸附有DNA的磁珠进行清洗；4)在物理强化作用辅助条件下实现样品高效洗脱。该方法能高效、快速地获得高质量的细胞游离DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。

Description

基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法
技术领域
本发明涉及一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，属于生物技术领域。
背景技术
血浆是血液除去血细胞和血小板外的液体组分，约占全血体积的50-60％。通过抗凝采血管采集血液，离心后收集到的上层淡黄色液体即为血浆。研究表明，在血浆中除了水分、血浆蛋白、氨基酸、糖类和无机盐等化学成分外，还存在游离于细胞之外的脱氧核糖核酸分子，称为血浆细胞游离DNA。近年来，血浆细胞游离DNA在医学诊断中的应用不断拓展，其广泛应用于无创产前筛查、肿瘤液体活检和肿瘤个体化用药指导等领域。
提取高质量的血浆细胞游离DNA是对其进行深入研究和进行医学诊断的基本前提。血浆细胞游离DNA由于其片段短(几十到几百bp不等)、丰度低(正常人体血浆中每毫升含量为几纳克至几十纳克)的特点，其提取难度大于体细胞的基因组DNA。在实际应用中，为了避免DNA片段信息的丢失，对于血浆细胞游离DNA的提取有着高效提取、避免损失的要求。目前用于提取血浆细胞游离DNA的方法主要有离心柱法和磁珠法两大类，但是在实际应用中均存在提取效率偏低、部分DNA片段易丢失、批次操作效果不均一的问题，这对于血浆细胞游离DNA的研究应用造成了不利影响。
发明内容
本发明公开了一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，该方法能高效、快速地获得高质量的细胞游离DNA，可以满足PCR扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验的要求。
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，具体包括如下步骤：
(1)预处理，取血浆样品置于离心管中，加入预处理液P，在50-60℃水浴中保存0.5-1h，预处理液P：0.5-3％(w/v)蛋白酶K，1-3mM氯化钙。由于血浆细胞游离DNA能与蛋白形成复合物，因此通过预处理降解血浆蛋白，有助于提高血浆细胞游离DNA的捕获效率和实验结果一致性。
(2)配置结合液B，在两步温控条件下采用羟基磁珠特异性吸附样品中的DNA，具体地，向经过预处理的样品中加入结合液B；漩涡振荡15-30s；在50-60℃水浴中反应3-5min；从水浴中取出离心管，漩涡振荡15-30s；使用旋转混合仪，在室温条件下反应5-10min；计时结束后，在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。上述用到的结合液B：92-98％(v/v)异丙醇，1-3％(v/v)非极性溶剂，1-5％(v/v)磁珠悬浮液，其中，磁珠悬浮液为20％(w/v)纳米磁珠，非极性溶剂为石油醚、正己烷、四氯化碳、苯中的一种或多种混合，添加非极性溶剂的目的是增加溶液环境的非极性，促进核酸分子被纳米磁珠吸附。
(3)洗涤，配置洗涤液W1和W2对吸附有DNA的磁珠进行清洗，具体地，首先盐洗涤去除杂质，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W1，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；然后进行醇洗涤去除盐分，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W2，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口室温放置10min以便乙醇挥发，洗涤液W1：5-20mM三羟甲基氨基甲烷，1-5mM乙二胺四乙酸，60-75％(v/v)乙醇；洗涤液W2：70-80％(v/v)乙醇。
(4)加入洗脱液T，在物理强化作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进行磁珠分离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA，所述的物理强化作用为漩涡震荡、超声波、高温中的一种或多种组合，其中，洗脱液T：8-10mM三羟甲基氨基甲烷，pH＝8.0。物理强化作用可以增加分子运动，促进核酸分子从纳米磁珠上的解吸。具体地，向完成第二步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗脱液T，将离心管漩涡振荡1-2min后置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30s，取出离心管，在50-60℃水浴中保存2-3min；再次将离心管置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30s，取出离心管，室温放置5-10min；计时结束后，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA。
进一步地，步骤(2)中所使用的羟基磁珠为羟基修饰的超顺磁纳米磁珠，粒径为300-1000nm。
本发明在预处理过程中，为保证漩涡振荡混匀的效果，所提取的血浆样品量不得超过所使用离心管最大装液量的2/15。一般小量提取200μl血浆样品时，使用1.5ml离心管；大量提取2ml血浆时，使用15ml离心管。
作为优选的，本发明在预处理过程中，预处理液P的用量为血浆样品量的1/10～1/5。
本发明在吸附过程中，结合液B的用量为血浆样品量的3～4倍。
本发明在洗涤过程中，洗涤液W1的用量为血浆样品量的4～5倍，洗涤液W2的用量为血浆样品量的4～5倍。
本发明在洗脱过程中，洗脱液T的用量不少于20μl，以保证洗脱效率，所使用的超声清洗仪的工作频率为35000-40000Hz，工作功率为500-600W。
有益效果
1.本发明在结合液B中添加非极性组分，促进核酸分子被纳米磁珠的吸附，在两步温控吸附条件下，可以提升DNA的提取效率；
2.使用物理强化作用促进核酸分子从纳米磁珠上的解吸，增加洗脱效率。由于血浆细胞游离DNA的片段长度短(几十到几百bp)，因此物理强化作用对于DNA长片段的剪切破坏甚微，不影响所提取DNA的质量。
附图说明
图1为利用本方法提取的血浆细胞游离DNA产物经PCR后的凝胶电泳图。
图中：泳道1为使用体细胞基因组为模板的阳性对照，泳道2-4为三平行实验的扩增产物，泳道5为TAKARAD2000DNAmarker，泳道6为用无菌水为模板的阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA的提取方法，其特征是，具体步骤如下：
(1)预处理
设置三平行实验。取200μl来自健康人的新鲜血浆样品置于离心管中，加入20μl预处理液P，在50℃水浴中保存0.5h；
(2)吸附
向经过预处理的样品中加入800μl结合液B；漩涡振荡30s；在50℃水浴中反应5min；从水浴中取出离心管，漩涡振荡15s；使用旋转混合仪，在室温条件下反应10min；计时结束后，在4000g条件下离心30s，将离心管放在磁力架上，静置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；
(3)洗涤
第一步盐洗涤去除杂质。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入1000μl洗涤液W1，漩涡振荡3min；静置2min后在4000g条件下离心30s，将离心管放在磁力架上，静置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；
第二步醇洗涤去除盐分。向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入1000μl洗涤液W2，漩涡振荡3min；静置2min后在4000g条件下离心30s，将离心管放在磁力架上，静置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。
(4)在物理强化作用(超声)下辅助洗脱
向完成第二步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入50μl洗脱液T，将离心管漩涡振荡2min后置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机，设置工作频率为40000Hz，工作功率为500W反应15s，取出离心管，在50℃水浴中保存3min；再次将离心管置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15s，取出离心管，室温放置10min；计时结束后，将离心管放在磁力架上，静置2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA，样本于-20℃保存。
检测上述血浆游离DNA溶液，并将空白对照溶液作为对照，具体方法如下：
1)、DNA特异性结合荧光染料定量检测：
使用ThermoFisherQubit3.0荧光计及HSdsDNA定量试剂盒，对所提取的DNA进行定量检测，结果如表1所示。
表1血浆细胞游离DNA的提取结果
2)PCR-凝胶电泳检测：
取10μl提取的血浆细胞游离DNA作为模板，选择人体管家基因beta-actin设计引物F-primer：ACAAGATGAGATTGGCATGGCTTTAT和R-Primer：CAACAATGTGCAATCAAAGTCCTCGG，建立50μlPCR体系，扩增得到产物。使用DNA凝胶电泳对产物进行检测(图1)，泳道1为使用体细胞基因组为模板的阳性对照，泳道2-4为三平行实验的扩增产物，泳道5为TAKARAD2000DNAmarker，泳道6为用无菌水为模板的阴性对照。
DNA特异性结合荧光染料定量检测结果显示，从200μl中血浆中可以提取到2.72±0.13ngDNA，数据一致性良好；PCR-凝胶电泳检测结果显示所提取的细胞游离DNA质量良好，可以进行进一步的分子实验。
实施例2：
步骤(1)中配置结合液B时用等量异丙醇替代正己烷，其他步骤及用量与实施例1相同，进行三组替代对比试验，DNA得率下降约22.3％，结果如表2所示。
表2血浆细胞游离DNA的提取结果
实施例3：
步骤(2)中DNA吸附过程改为漩涡振荡30s；在室温条件下反应15min，其他步骤及用量与实施例1相同，进行三组替代对比试验，DNA得率下降约16.5％，结果如表3所示。
表3血浆细胞游离DNA的提取结果
实施例4：
步骤(4)改为加入50μl洗脱液T，将离心管于室温放置15min，其他步骤及用量与实施例1相同，进行三组替代对比试验，DNA得率下降。
表4血浆细胞游离DNA的提取结果

Claims (9)

1.一种基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是，具体包括如下步骤：
(1)预处理，取血浆样品置于离心管中，加入预处理液P，对血浆样品进行预处理；
(2)配置结合液B，在两步温控条件下采用羟基磁珠特异性吸附样品中的DNA；
(3)洗涤，配置洗涤液W1和W2对吸附有DNA的磁珠进行清洗；
(4)加入洗脱液T，在物理强化作用下辅助洗脱，经过充分混合洗脱后，进行磁珠分离，然后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA，所述的物理强化作用为漩涡震荡、超声波、高温中的一种或多种组合；其中，预处理液P：0.5-3％(w/v)蛋白酶K，1-3mM氯化钙；
磁珠悬浮液：20％(w/v)纳米磁珠；
结合液B：92-98％(v/v)异丙醇，1-3％(v/v)非极性溶剂，1-5％(v/v)磁珠悬浮液；
洗涤液W1：5-20mM三羟甲基氨基甲烷，1-5mM乙二胺四乙酸，60-75％(v/v)乙醇；
洗涤液W2：70-80％(v/v)乙醇；
洗脱液T：8-10mM三羟甲基氨基甲烷，pH＝8.0。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：
(1)预处理，取血浆样品置于离心管中，加入预处理液P，在50-60℃水浴中保存0.5-1h；
(2)吸附，向经过预处理的样品中加入结合液B；漩涡振荡15-30s；在50-60℃水浴中反应3-5min；从水浴中取出离心管，漩涡振荡15-30s；使用旋转混合仪，在室温条件下反应5-10min；计时结束后，在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；
(3)洗涤，首先盐洗涤去除杂质，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W1，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠；然后进行醇洗涤去除盐分，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液W2，漩涡振荡2-3min；静置1-2min后在3000-4000g条件下离心30-60s，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口室温放置10min以便乙醇挥发；
(4)洗脱，向完成第二步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗脱液T，将离心管漩涡振荡1-2min后置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30s，取出离心管，在50-60℃水浴中保存2-3min；再次将离心管置于盛有冰水的烧杯中，将烧杯放入超声清洗机反应15-30s，取出离心管，室温放置5-10min；计时结束后，将离心管放在磁力架上，静置1-2min进行磁珠分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的血浆细胞游离DNA。
3.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述的磁珠为羟基修饰的超顺磁纳米磁珠，粒径为300-1000nm。
4.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述步骤(1)预处理中，为保证漩涡振荡混匀的效果，所提取的血浆样品量不得超过所使用离心管最大装液量的2/15。
5.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述步骤(1)预处理中，预处理液P的用量为血浆样品量的1/10～1/5。
6.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述的步骤(2)吸附过程中，结合液B的用量为血浆样品量的3～4倍。
7.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述的所述步骤(3)洗涤过程中，洗涤液W1的用量为血浆样品量的4～5倍，洗涤液W2的用量为血浆样品量的4～5倍。
8.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述的步骤(4)洗脱过程中，洗脱液T的用量不少于20μl。
9.根据权利要求1所述的基于磁珠法的高效血浆细胞游离DNA提取方法，其特征是：所述的步骤(4)洗脱过程中，所使用的超声清洗仪的工作频率为35000-40000Hz，工作功率为500-600W。
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