CN105296468A - 一种dna提取的方法 - Google Patents

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dna
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magnetic
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刘宗伟
汤晓
吴渊虬
杨超
黄嘉伟
言梦非
管卫东
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Abstract

本发明公开了一种DNA提取的方法，该方法包括以下步骤：1)裂解；2)离心；3)加入吸附液；4)加入磁珠；5)DNA与磁珠结合；6)磁力架吸附；7)吸去吸附液；8)第一次洗涤；9)磁力架吸附；10)第二次洗涤；11)磁力架吸附；12)烘干磁珠；13)DNA洗脱等步骤，本发明方法采用移管过程取代手工DNA提取过程中采用的离心机离心步骤，充分去除残液，实现了DNA提取的自动化(非人工)，提高了DNA提取的效率。

Description

一种DNA提取的方法
技术领域
本发明涉及一种DNA提取的方法，具体是一种利用自动化平台进行DNA提取的方法。
背景技术
磁珠法提取DNA试剂盒要比传统的方法，例如CheLex100法、有机法、二氧化硅法、盐析法等更为简单、方便，转移离心管的次数较少，不易污染等特点，因此该方法得到大范围利用。
如专利文献CN104830833A公开的一种磁珠法结合离心套管提取DNA的方法，该方法包括以下步骤：1)将检材置入离心套管的内套管内，将TES缓冲液、十二烷基肌氨酸钠、蛋白酶K按体积比混匀后加入离心套管的内套管内，置金属浴上裂解；2)加入吸附液再次离心；3)去除内套管，加入吸附液，加入磁珠悬浊液置自动涡旋仪上吸附；4)置于磁力架上吸去上清后置离心机内离心再次吸去残液；5)加入冰乙醇涡旋后，置于磁力架上，充分吸去上清，置离心机内离心再次吸去残夜；6)烘干磁珠，加入洗脱液充分涡旋后置金属浴上孵化；7)PCR扩增液内扩增；本发明方法检出率高，最终模板保有量达50-70％，特别适用于微量检材的检验，可检出模板含量在100pg以上的现场DNA检材。
但是如上所述的提取DNA方法基本上均采用手工进行，手动提取DNA的过程需要采用离心机进行离心，用于去除残夜、抑制物，人工的效率较为低下，而且无法实现自动化。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA提取的方法，实现DNA提取的自动化，提高DNA提取的效率。
为了实现上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种DNA提取的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将检材放入2mL离心套装的离心套管内，加入裂解液，在56～99℃下进行裂解10～30分钟。
(2)在离心机上高速离心，离心后去离心套管，保留2mL离心管以及管内裂解后产物，将离心管放置在样品板上。
(3)利用吸头向离心管加入吸附液1～1.2mL。
(4)将10～16μL磁珠充分悬浊后分装到离心管中。
(5)将样品板置于振荡器上振荡15～20分钟，使检材内的DNA与磁珠充分吸附结合，所述振荡器每隔1分钟振荡1分钟，振速为1200rpm。振荡的目的使磁珠在混合液内始终处于悬浊状态，从而有利于其与DNA的吸附结合。
(6)DNA吸附结束后，通过机械手将样品板置于磁力架上吸附15～30秒，使磁珠充分贴壁。
(7)通过吸头将离心管内混合液体吸出；将样品板静置2～5分钟，再次通过吸头将离心管内残余的混合液体吸出，二次吸取步骤防止磁珠间少量吸附液去除不充分在磁珠贴壁后顺势渗出到管底。
(8)第一次洗涤：在离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀。
(9)将样品板置于磁力架上吸附15～30秒，使磁珠充分贴壁，吸去漂洗液保留磁珠。
(10)第二次洗涤：在离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀，将混合后的磁珠和漂洗液一起转入干净的离心管，转管的目的：消除原离心管中残留的混合液。本步骤是本发明方法的关键所在，取代了人工提取DNA的离心步骤。
(11)将新离心管置于磁力架吸附30秒，吸去溶液，保留磁珠。为保证磁珠无损失转移至新离心管，此步骤进行三次。
(12)第三次洗涤步骤：在新的离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀，磁力吸附，吸去溶液保留磁珠。
为了防止液体残留影响后续扩增，所述吸去溶液步骤进行两遍。
三次洗涤步骤中，加入漂洗液总量小于650～750μL。
(13)烘干磁珠：将放有新离心管的样品板置于45～56℃加热器上，使磁珠中残留漂洗溶液烘干；
(14)DNA洗脱：在各离心管中加入20～40μL洗脱液并充分振荡混匀，然后置于45～56℃加热器加热15～20分钟；每次振荡时间为10～30秒，每隔3分钟振荡一次。
(15)加热结束后，将提取好的DNA产物从加热器上移开置于平台待DNA扩增使用。
本发明方法利用自动化平台取代了人工DNA的提取，本发明方法核心是采用移管过程取代手工DNA提取过程中采用的离心机离心步骤，以充分去除残液，实现了DNA提取的自动化(非人工)，提高了DNA提取的效率。
具体实施方式
将检材放入2mL离心套装(包括离心管和离心套管)的离心套管内，加入裂解液，在56℃下进行裂解15分钟。检材和离心套装的离心套管均为多个，自动化平台一次可以处理多个检材。
在离心机上高速离心，离心后去各个离心套管，保留2mL离心管以及管内裂解后产物，将各个离心管放置在样品板上。
利用吸头向各个离心管加入吸附液1mL。
将磁珠充分悬浊后分装到离心管中，每个离心管中装16μL。
将样品板置于振荡器上振荡，振荡器每隔1分钟振荡1分钟，振速为1200rpm，共振荡15分钟，振荡的目的使磁珠在混合液内始终处于悬浊状态，从而有利于其与DNA的吸附结合。
DNA吸附结束后，通过机械手将样品板置于磁力架上吸附30秒，使磁珠充分贴壁。
通过吸头将离心管内混合液体吸出；将样品板静置2分钟，再次通过吸头将离心管内残余的混合液体吸出，二次吸取步骤防止磁珠间少量吸附液去除不充分在磁珠贴壁后顺势渗出到管底。
第一次洗涤：在离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀。
将样品板置于磁力架上吸附30秒，使磁珠充分贴壁，吸去漂洗液保留磁珠。
第二次洗涤：在离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀，将混合后的磁珠和漂洗液一起转入干净的离心管，转管的目的：消除原离心管中残留的混合液。
将新离心管置于磁力架吸附30秒，吸去溶液，保留磁珠。为保证磁珠无损失转移至新离心管，此步骤进行三次。
第三次洗涤步骤：在新的离心管中加入漂洗液(三次洗涤步骤中，加入漂洗液总量小于750μL)，然后充分振荡混匀，磁力吸附，多次吸去溶液保留磁珠。
烘干磁珠：将放有新离心管的样品板置于56℃加热器上，使磁珠中残留漂洗溶液烘干。
DNA洗脱：在各离心管中加入40μL洗脱液并充分振荡混匀，然后置于56℃加热器加热15分钟；每次振荡时间为30秒，每隔3分钟振荡一次。
加热结束后，将提取好的DNA产物从加热器上移开置于平台待DNA扩增使用，实现DNA提取的自动化。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种DNA提取的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将检材放入2mL离心套装的离心套管内，加入裂解液，在56～99℃下进行裂解10～30分钟；
(2)在离心机上高速离心，离心后去离心套管，保留2mL离心管以及管内裂解后产物，将离心管放置在样品板上；
(3)利用吸头向离心管加入吸附液1～1.2mL；
(4)将10～16μL磁珠充分悬浊后分装到离心管中；
(5)将样品板置于振荡器上振荡15～20分钟，使检材内的DNA与磁珠充分吸附结合；
(6)DNA吸附结束后，通过机械手将样品板置于磁力架上吸附15～30秒，使磁珠充分贴壁；
(7)通过吸头将离心管内混合液体吸出；
(8)第一次洗涤：在离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀；
(9)将样品板置于磁力架上吸附15～30秒，使磁珠充分贴壁，吸去漂洗液保留磁珠；
(10)第二次洗涤：在离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀，将混合后的磁珠和漂洗液一起转入干净的离心管；
(11)将新离心管置于磁力架吸附30秒，吸去溶液，保留磁珠；
(12)烘干磁珠：将放有新离心管的样品板置于45～56℃加热器上，使磁珠中残留漂洗溶液烘干；
(13)DNA洗脱：在各离心管中加入20～40μL洗脱液并充分振荡混匀，然后置于45～56℃加热器加热15～20分钟；
(14)加热结束后，将提取好的DNA产物从加热器上移开置于平台待DNA扩增使用。
2.根据权利要求1所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，所述振荡器每隔1分钟振荡1分钟，振速为1200rpm。
3.根据权利要求1所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：在步骤(7)和(8)之间还包括步骤：将样品板静置2～5分钟，再次通过吸头将离心管内残余的混合液体吸出。
4.根据权利要求1所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：在步骤(11)和(12)之间还包括第三次洗涤步骤：在新的离心管中加入漂洗液，然后充分振荡混匀，磁力吸附，吸去溶液保留磁珠。
5.根据权利要求4所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：所述吸去溶液步骤进行两遍。
6.根据权利要求4所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：三次洗涤步骤加入漂洗液总量小于650～750μL。
7.根据权利要求1所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：所述步骤(13)中，每次振荡时间为10～30秒，每隔3分钟振荡一次。
8.根据权利要求1所述的一种DNA提取的方法，其特征在于：所述步骤(11)进行三次。
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