CN104975003A - 核酸回收纯化试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸回收纯化试剂盒，包括溶胶液、磁珠液和结合液；溶胶液中含有浓度为3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍和浓度为20mol/L～30mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水；磁珠液中含有0.2mg/mL～3mg/mL的羟基磁珠，其余为水；结合液中含有浓度为40%～60%异丙醇和浓度为1mol/L～2mol/L的氯化钠，其余为水。本发明还涉及一种采用该试剂盒的核酸回收纯化方法。本发明的核酸回收纯化试剂盒及方法可以快速高效地回收纯化琼脂糖凝胶中的大片段核酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种对核酸进行回收纯化的试剂盒，以及该试剂盒的使用方法，属于生物技术领域。
背景技术
核酸纯化是分子生物学下游实验和核酸水平临床检测的重要前提，纯化总体原则是高纯度核酸样品的获得和保证核酸结构的完整性。现有核酸纯化方法包括酚-氯仿抽提，高盐沉淀，离子交换和选择性吸附等。但方法存在有毒试剂，操作繁琐，无法实现高通量，回收片段大小范围有限等缺点。纳微米超顺磁性复合微粒，在核酸纯化方面体现出较大优势，与现有核酸纯化技术相比，无需离心，操作简便快速，能够实现高通量，自动化。
目前，现有的琼脂糖凝胶回收纯化核酸，通常是首先将琼脂糖电泳上的目的片段切下，然后加溶胶液在恒温浴(如55℃)下溶胶，溶胶后的液体与选择性的吸附机制可逆的吸附结合，经过清洗后，洗脱得到纯化后的核酸。但是现有的琼脂糖凝胶回收核酸纯化方法步骤繁琐，历经时间较长，工作量大，回收片段范围较小，不利于大量样品的制备，不利于实现高通量。
发明内容
本发明解决的技术问题是，提出一种可以快速高效地回收纯化琼脂糖凝胶中大片段核酸的核酸回收纯化试剂盒，以及采用这种试剂盒的核酸回收纯化方法。
为了解决上述技术问题，本发明提出的一种技术方案是：一种核酸回收纯化试剂盒，包括溶胶液、磁珠液和结合液；所述溶胶液中含有浓度为3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍和浓度为20mol/L～30mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水；所述磁珠液中含有0.2mg/mL～3mg/mL的羟基磁珠，其余为水；所述结合液中含有浓度为40％～60％异丙醇和浓度为1mol/L～2mol/L的氯化钠，其余为水。
上述技术方案的一种优选是：上述所述溶胶液中异硫氰酸胍的浓度为3.2mol/L～3.6mol/L。
上述技术方案的一种优选是：上述溶胶液中Tris-Hcl缓冲液的浓度为23mol/L～28mol/L，用于配置溶胶液的Tris-Hcl缓冲液的PH值为8。
上述技术方案的一种优选是：上述结合液中异丙醇的浓度为45％～55％。
上述技术方案的一种优选是：上述结合液中氯化钠的浓度为1.2mol/L～1.8mol/L。
上述技术方案的一种优选是：上述核酸回收纯化试剂盒还包括浓度为75％～95％的乙醇水溶液。
为了解决上述技术问题，本发明提出的另一种技术方案是一种核酸回收纯化方法，用于琼脂糖凝胶中核酸的回收纯化，具体步骤如下：
A.切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入离心管中；
B.在离心管中加入琼脂块体积3倍～6倍的溶胶液，至琼脂块完全溶化；所述溶胶液中含有浓度为3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍和浓度为20mol/L～30mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水；
C.在离心管中加入适量的磁珠液，盖上离心管，混匀，室温放置5分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当磁珠被吸附在离心管壁上，吸去离心管中液体；所述磁珠液中含有0.2mg/mL～3mg/mL的羟基磁珠，其余为水；
D.在离心管中加入适量的结合液，混匀，静置1分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当磁珠被吸附在离心管壁上，吸去离心管中液体；所述结合液中含有浓度为40％～60％异丙醇和浓度为1mol/L～2mol/L的氯化钠，其余为水；
E.在离心管中加入适量的浓度为75％～95％的乙醇水溶液，混匀，静置1分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当磁珠被吸附在离心管壁上，吸去离心管中液体；
F.重复步骤E，然后室温干燥；
G.在离心管中加入TE缓冲液或无菌水，混匀，室温放置2分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当确保磁珠被吸附在离心管壁上，吸取离心管中液体即为目的DNA片段。
上述技术方案的一种优选是：上述磁珠液的加入量是琼脂块体积的0.3倍～0.5倍；所述结合液的加入量是琼脂块体积的3倍～5倍；所述乙醇水溶液的加入量是琼脂块体积的4倍～8倍。
上述技术方案的一种优选是：上述步骤B中，在离心管中加入溶胶液后55℃震荡2分钟～5分钟。
上述技术方案的一种优选是：上述步骤G中加入的TE缓冲液或无菌水经过预热为65℃。
本发明具有积极的效果：
(1)本发明的核酸回收纯化试剂盒是专门针对琼脂糖凝胶中大片段核酸的快速回收纯化设计的。该试剂盒中的溶胶液组分包括异硫氰酸胍和Tris-Hcl缓冲液，溶胶液中的Tris-Hcl缓冲液可以保证DNA的稳定性。异硫氰酸胍是强离子剂，常用于酚氯仿抽提法分离核酸，需要与其他试剂协同作用才能起到很好的破碎细胞抽提DNA的效果。异硫氰酸胍单独作为溶胶液的主要成分可以大大缩短溶胶的时间，并且放宽了溶胶条件，室温震荡或55℃恒温5分钟以内即可溶胶，55℃恒温震荡2分钟左右即可溶胶。该试剂盒中的结合液组分包括异丙醇和氯化钠，异丙醇能够有效地降低表面张力，减少操作过程中产生的气泡，氯化钠的钠离子起到了阳离子桥的作用，可以中和核酸磷酸骨架上的负电荷，促使核酸磷酸基团有效地结合在羟基磁珠的表面。且结合液成分简单高效，没有镁、钾等离子的酶辅因子和其他复杂成分，不影响后续试验如PCR等试验。
(2)本发明的核酸回收纯化试剂盒中溶胶液和结合液配合磁珠液一起使用，可以回收100bp～40kb的核酸，可以完成大片段的回收纯化。纯化得到核酸作为模板用于PCR反应，能够扩增出目的片段，说明总核酸样品纯度高，不含抑制PCR反应的抑制剂；纯化得到的核酸片段可以上机测序，测序结果峰值较好，信号较强，说明纯化后的核酸质量较高，适用于测序。纯化后的核酸A260/280的值为1.7～2.0，直观说明纯化后的核酸质量较高。另外，拿纯化后的核酸电泳检测，结果条带单一，清晰。说明纯化后的核酸完整。
(3)本发明的核酸回收纯化试剂盒及方法，步骤简单，操作方便，扩大了核酸纯化片段大小范围，降低了纯化时间和成本，回收率高，实用性广，可靠性强，同时还能保证不影响下游工程。
附图说明
图1是大片段DNA回收纯化实验中样品1至9回收纯化后的产物的电泳图；
图2是琼脂糖凝胶回收纯化实验中样品1-1至1-6、样品2-1至2-6和样品3-1至3-6的电泳图；
图3是琼脂糖凝胶回收纯化实验中样品1-1至1-6、样品2-1至2-6和样品3-1至3-6回收纯化后的产物的电泳图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
本实施例的核酸回收纯化试剂盒包括溶胶液、磁珠液和结合液。溶胶液中含有浓度为3.5mol/L异硫氰酸胍和浓度为25mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水。用于配置溶胶液的Tris-Hcl缓冲液的PH值为8。磁珠液中含有1mg/mL的羟基磁珠，其余为水。羟基磁珠由英芮诚生化科技(上海)有限公司提供，产品型号为0501。结合液中含有浓度为50％异丙醇和浓度为1.5mol/L的氯化钠，其余为水。
采用本实施例的试剂盒，用于回收纯化琼脂糖凝胶的核酸时，具体步骤如下：
A.用琼脂糖凝胶电泳判断琼脂块中目的DNA片段的位置，然后用干净的手术刀切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL的离心管中。切下的琼脂块体积约为100μL。判断琼脂块中目的DNA片段的位置时，要尽可能使用波长较长的紫外线，紫外线照射的时间应尽可能短，尽可能将目的DNA片段和其他其它DNA片段分开。
B.在离心管中加入500μl的溶胶液，恒温55℃震荡，至琼脂块完全溶化，琼脂块溶化时间约为2分钟。恒温55℃震荡与置于室温相比可以有效缩短溶胶的时间。
C.在离心管中加入50ul的磁珠液，盖上离心管，混匀，室温放置5分钟。再将离心管放到磁力架上，静置1分钟，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体。
D.在离心管中加入500ul的结合液，混匀，静置1分钟。再将离心管放到磁力架上，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体。
E.在离心管中加入700ul的浓度为80％的乙醇水溶液，混匀，静置1分钟。再将离心管放到磁力架上，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体(尽可能吸净)。浓度为80％的乙醇水溶液的清洗效果最佳。
F.重复步骤E，然后室温干燥5分钟。
G.在离心管中加入预热65℃的100μL的TE缓冲液，混匀，室温放置2分钟。再将离心管放到磁力架上，静置1分钟，确保磁珠被吸附在离心管壁上，吸取离心管中液体即为目的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。TE缓冲液由Tris缓冲液和EDTA溶液配置而成。TE缓冲液与无菌水相比可以有效提高DNA的洗脱效率，预热65℃的TE缓冲液洗脱效率最高。
实施例2
本实施例的核酸回收纯化试剂盒包括溶胶液、磁珠液、结合液。溶胶液中含有浓度为3.2mol/L异硫氰酸胍和浓度为23mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水。用于配置溶胶液的Tris-Hcl缓冲液的PH值为8。磁珠液中含有0.5mg/mL的羟基磁珠，其余为水。结合液中含有浓度为45％异丙醇和浓度为1.2mol/L的氯化钠，其余为水。
采用本实施例的试剂盒，用于回收纯化琼脂糖凝胶的核酸时，具体步骤如下：
A.用琼脂糖凝胶电泳判断琼脂块中目的DNA片段的位置，然后用干净的手术刀切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL的离心管中。切下的琼脂块体积约为150μL。判断琼脂块中目的DNA片段的位置时，要尽可能使用波长较长的紫外线，紫外线照射的时间应尽可能短，尽可能将目的DNA片段和其他其它DNA片段分开。
B.在离心管中加入500μl的溶胶液，置于55℃，至琼脂块完全溶化，琼脂块溶化时间约为5分钟。
C.在离心管中加入50ul的磁珠液，盖上离心管，混匀，室温放置5分钟。再将离心管放到磁力架上，静置1分钟，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体。
D.在离心管中加入500ul的结合液，混匀，静置1分钟。再将离心管放到磁力架上，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体。
E.在离心管中加入700ul的浓度为75％的乙醇水溶液，混匀，静置1分钟。再将离心管放到磁力架上，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体(尽可能吸净)。
F.重复步骤E，然后室温干燥5分钟。
G.在离心管中加入预热65℃的100μL的无菌水，混匀，室温放置2分钟。再将离心管放到磁力架上，静置1分钟，确保磁珠被吸附在离心管壁上，吸取离心管中液体即为目的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
实施例3
本实施例的核酸回收纯化试剂盒包括溶胶液、磁珠液和结合液。溶胶液中含有浓度为3.6mol/L异硫氰酸胍和浓度为28mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水。用于配置溶胶液的Tris-Hcl缓冲液的PH值为8。磁珠液中含有2mg/mL的羟基磁珠，其余为水。结合液中含有浓度为55％异丙醇和浓度为1.8mol/L的氯化钠，其余为水。
采用本实施例的试剂盒，用于回收纯化琼脂糖凝胶的核酸时，具体步骤如下：
A.用琼脂糖凝胶电泳判断琼脂块中目的DNA片段的位置，然后用干净的手术刀切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5mL的离心管中。切下的琼脂块体积约为100μL。判断琼脂块中目的DNA片段的位置时，要尽可能使用波长较长的紫外线，紫外线照射的时间应尽可能短，尽可能将目的DNA片段和其他其它DNA片段分开。
B.在离心管中加入600μl的溶胶液，室温震荡，至琼脂块完全溶化，琼脂块溶化时间约为5分钟。琼脂糖凝胶的浓度较高(≥1.5％)时，需要多加入溶胶液，并延长溶胶时间。
C.在离心管中加入50ul的磁珠液，盖上离心管，混匀，室温放置5分钟。再将离心管放到磁力架上，静置1分钟，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体。
D.在离心管中加入500ul的结合液，混匀，静置1分钟。再将离心管放到磁力架上，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体。
E.在离心管中加入700ul的浓度为90％的乙醇水溶液，混匀，静置1分钟。再将离心管放到磁力架上，确保磁珠被吸附在离心管壁上。然后吸去离心管中液体(尽可能吸净)。
F.重复步骤E，然后室温干燥5分钟。
G.在离心管中加入50μL的无菌水，混匀，室温放置2分钟。再将离心管放到磁力架上，静置1分钟，确保磁珠被吸附在离心管壁上，吸取离心管中液体即为目的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
一、大片段DNA回收纯化实验。
1、实验步骤：
1)取人基因组DNA约200ul，条带大小为40kb。
2)取其中的20ul上样进行凝胶电泳，然后从得到的琼脂糖凝胶上切下含有目的条带的琼脂块，制成样品。一共制成9份样品，分别为样品1至9。
3)采用本发明实施例1的试剂盒及方法，分别对样品1至3进行回收纯化；采用AxyPrep的凝胶回收试剂盒，分别对样品4至6进行回收纯化；采用上海硕美生物科技有限公司的凝胶回收试剂盒，分别对样品7至9进行回收纯化。回收纯化后的产物定量结果如表1所示，回收纯化后的产物取2ul电泳定性结果如图1所示。
表1 样品1至9回收纯化后的产物定量结果
| 样品编号 | 试剂盒 | 浓度(ng/μl) | A260 | A280 | A260/280 | A260/230 |
| 1 | 实施例1 | 24.3 | 0.486 | 0.271 | 1.78 | 0.30 |
| 2 | 实施例1 | 13.3 | 0.267 | 0.153 | 1.74 | 0.29 |
| 3 | 实施例1 | 24.5 | 0.491 | 0.263 | 1.87 | 0.27 |
| 4 | AXY试剂盒 | 4.8 | 0.095 | 0.051 | 1.89 | 0.30 |
| 5 | AXY试剂盒 | 6.0 | 0.120 | 0.083 | 1.46 | 0.43 |
| 6 | AXY试剂盒 | 3.2 | 0.064 | 0.038 | 1.69 | 0.32 |
| 7 | 硕美试剂盒 | 10.0 | 0.200 | 0.108 | 1.85 | 0.05 |
| 8 | 硕美试剂盒 | 10.1 | 0.203 | 0.106 | 1.92 | 0.34 |
| 9 | 硕美试剂盒 | 12.2 | 0.244 | 0.166 | 1.47 | 0.20 |
2、实验结果分析：
由图1可知，样品1至3与样品4至9相比，样品1至3条带单一，清晰，说明纯化后的核酸完整。
由表1可知，采用本发明实施例1的试剂盒回收纯化后的平均浓度是20.3ng/ul，A260/280的平均值是1.81，都在1.7与2.0之间，纯度高；采用AXY试剂盒回收纯化后的平均浓度是4.7ng/ul，A260/280的平均值是1.68，纯度不够好；采用硕美试剂盒回收纯化后的平均浓度是10.7ng/ul，A260/280的平均值是1.75，纯度较高。
由此可知，本发明实施例1的试剂盒用于大片段DNA的回收时，回收率高，纯度好。
二、琼脂糖凝胶回收纯化实验。
1、实验步骤：
1)以人基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增片段大小为120bp，每个片段重复扩增12管，制得样品1-1至1-12。以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增片段大小分别为468bp，每个片段重复扩增12管，制得样品2-1至2-12。以16s全长质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增片段大小分别为1689bp，每个片段重复扩增12管，制得样品3-1至3-12。
上述PCR扩增的体系采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，25ul的反应体系，反应体系的组成如表2所示。
表2 PCR扩增的体系组分表
| 成分 | 用量 |
| 5×FastPfu Buffer | 5ul |
| dNTPs(2.5mM) | 2ul |
| Forward Primer(NF 5uM) | 1ul |
| Reverse Primer(NR 5uM) | 1ul |
| FastPfu Polymerase | 0.5ul |
| Template DNA | 10ng |
| dd H2O | 补足25ul |
上述PCR扩增采用ABI GeneAmp 9700型PCR扩增仪，PCR反应的参数如表3所示。
表3 PCR反应程序表
2)取各样品的2ul上样进行2％凝胶电泳检测PCR产物,以DL2K为分子标记，得到相应的琼脂糖凝胶。其中样品1-1至1-6、样品2-1至2-6和样品3-1至3-6的电泳图如图2所示。
3)从样品1-1至1-3、样品2-1至2-3和样品3-1至3-3的琼脂糖凝胶上切下含有目的条带的琼脂块采用上海硕美生物科技有限公司的凝胶回收试剂盒，进行回收纯化。从样品1-4至1-6、样品2-4至2-6和样品3-4至3-6的琼脂糖凝胶上切下含有目的条带的琼脂块采用本发明实施例1的试剂盒及方法，进行回收纯化。回收纯化后的产物定量结果如表4所示，回收纯化后的产物取2ul电泳定性结果如图3所示。
表4 凝胶回收纯化后的产物定量结果
| 样品编号 | 试剂盒 | 浓度(ng/μl) | A260 | A280 | A260/280 | A260/230 |
| 1-1 | 硕美试剂盒 | 7.1 | 0.143 | 0.062 | 2.31 | 0.02 |
| 1-2 | 硕美试剂盒 | 8.2 | 0.164 | 0.073 | 2.24 | 0.07 |
| 1-3 | 硕美试剂盒 | 7.9 | 0.158 | 0.072 | 2.21 | 0.05 |
| 1-4 | 实施例1 | 12.1 | 0.241 | 0.101 | 2.39 | 0.03 |
| 1-5 | 实施例1 | 12.2 | 0.244 | 0.111 | 2.2 | 0.03 |
| 1-6 | 实施例1 | 9.8 | 0.196 | 0.108 | 1.81 | 0.09 |
| 2-1 | 硕美试剂盒 | 23.0 | 0.461 | 0.233 | 1.98 | 0.06 |
| 2-2 | 硕美试剂盒 | 16.8 | 0.336 | 0.177 | 1.9 | 0.07 |
| 2-3 | 硕美试剂盒 | 16.6 | 0.333 | 0.17 | 1.96 | 0.06 |
| 2-4 | 实施例1 | 25.3 | 0.506 | 0.265 | 1.9 | 0.10 |
| 2-5 | 实施例1 | 22.8 | 0.456 | 0.239 | 1.91 | 0.12 |
| 2-6 | 实施例1 | 24.3 | 0.485 | 0.25 | 1.94 | 0.18 |
| 3-1 | 硕美试剂盒 | 2.7 | 0.054 | 0.026 | 2.08 | 0.01 |
| 3-2 | 硕美试剂盒 | 2.9 | 0.058 | 0.03 | 1.93 | 0.03 |
| 3-3 | 硕美试剂盒 | 2.4 | 0.048 | 0.024 | 2.03 | 0.02 |
| 3-4 | 实施例1 | 7.9 | 0.158 | 0.08 | 1.97 | 0.05 |
| 3-5 | 实施例1 | 7.8 | 0.155 | 0.081 | 1.92 | 0.05 |
| 3-6 | 实施例1 | 8.7 | 0.173 | 0.085 | 2.03 | 0.03 |
2、实验结果分析：
由表3可知，对于120bp的DNA片段，采用硕美试剂盒回收纯化后的平均浓度是7.7ng/ul，A260/280的平均值是2.25；采用本发明实施例1的试剂盒回收后的平均浓度是11.4ng/ul；A260/280的平均值是2.25；本发明实施例1的试剂盒回收浓度高，纯度好。
对于468bp的DNA片段，采用硕美试剂盒回收纯化后的平均浓度是18.8ng/ul，A260/280的平均值是1.94；采用本发明实施例1的试剂盒回收后的平均浓度是24.1ng/ul；A260/280的平均值是1.92；本发明实施例1的试剂盒回收浓度高，纯度好。
对于1689bp的DNA片段，采用硕美试剂盒回收纯化后的平均浓度是2.7ng/ul，A260/280的平均值是2.01；采用本发明实施例1的试剂盒回收后的平均浓度是8.1ng/ul；A260/280的平均值是1.97；本发明实施例1的试剂盒回收浓度高，纯度好。
由此可知，本发明实施例1的试剂盒，在DNA片段大小为100bp至1689bp的范围内，回收效果好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种核酸回收纯化试剂盒，其特征在于：包括溶胶液、磁珠液和结合液；
所述溶胶液中含有浓度为3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍和浓度为20mol/L～30mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水；
所述磁珠液中含有0.2mg/mL～3mg/mL的羟基磁珠，其余为水；
所述结合液中含有浓度为40%～60%异丙醇和浓度为1mol/L～2mol/L的氯化钠，其余为水。
2.根据权利要求1所述的核酸回收纯化试剂盒，其特征在于：所述所述溶胶液中异硫氰酸胍的浓度为3.2mol/L～3.6mol/L。
3.根据权利要求1所述的核酸回收纯化试剂盒，其特征在于：所述溶胶液中Tris-Hcl缓冲液的浓度为23mol/L～28mol/L，用于配置溶胶液的Tris-Hcl缓冲液的PH值为8。
4.根据权利要求1所述的核酸回收纯化试剂盒，其特征在于：所述结合液中异丙醇的浓度为45%～55%。
5.根据权利要求1所述的核酸回收纯化试剂盒，其特征在于：所述结合液中氯化钠的浓度为1.2mol/L～1.8mol/L。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸回收纯化试剂盒，其特征在于：还包括浓度为75%～95%的乙醇水溶液。
7.一种核酸回收纯化方法，其特征在于，用于琼脂糖凝胶中核酸的回收纯化，具体步骤如下：
A．切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入离心管中；
B．在离心管中加入琼脂块体积3倍～6倍的溶胶液，至琼脂块完全溶化；所述溶胶液中含有浓度为3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍和浓度为20mol/L～30mol/L的Tris-Hcl缓冲液，其余为水；
C．在离心管中加入适量的磁珠液，盖上离心管，混匀，室温放置5分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当磁珠被吸附在离心管壁上，吸去离心管中液体；所述磁珠液中含有0.2mg/mL～3mg/mL的羟基磁珠，其余为水；
D．在离心管中加入适量的结合液，混匀，静置1分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当磁珠被吸附在离心管壁上，吸去离心管中液体；所述结合液中含有浓度为40%～60%异丙醇和浓度为1mol/L～2mol/L的氯化钠，其余为水；
E．在离心管中加入适量的浓度为75%～95%的乙醇水溶液，混匀，静置1分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当磁珠被吸附在离心管壁上，吸去离心管中液体；
F．重复步骤E，然后室温干燥；
G．在离心管中加入TE缓冲液或无菌水，混匀，室温放置2分钟以上，再将离心管放到磁力架上，当确保磁珠被吸附在离心管壁上，吸取离心管中液体即为目的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的核酸回收纯化方法，其特征在于：所述磁珠液的加入量是琼脂块体积的0.3倍～0.5倍；所述结合液的加入量是琼脂块体积的3倍～5倍；所述乙醇水溶液的加入量是琼脂块体积的4倍～8倍。
9.根据权利要求7所述的核酸回收纯化方法，其特征在于：所述步骤B中，在离心管中加入溶胶液后55℃震荡2分钟～5分钟。
10.根据权利要求7所述的核酸回收纯化方法，其特征在于：所述步骤G中加入的TE缓冲液或无菌水经过预热为65℃。
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