CN1355319A - 利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法属于生物粒子快速分离技术领域,其特征在于:它用纳米磁性微球悬浮液或经特别处理的纤维膜作固相吸附介质来分离生物粒子中的细胞,再用细胞裂解液裂解细胞结构,通过固相吸附和解吸附以便直接从全血、血浆、唾液、尿液、细胞和组织培养液等生物样品中富集含有核酸的白细胞、病毒粒子、上皮细胞、培养细胞等的生物粒子,并获取核酸。这种方法简便快速,可用于各种不同规模和品种的样品制备,而且易于实现自动化、微型化装置的构建。
Description
技术领域
一种利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法属于快速分离并裂解生物粒子的细胞以获取核酸的技术领域。
背景技术
以生物芯片为基础，在微阵列的技术平台上集成了样品处理，生物反应及结果检测的“微型生物芯片实验室”是生物芯片技术的高级形式，目前对生化反应和结果检测装置的芯片构建已取得较大进展，但如何在芯片上构建自动化的样品制备装置仍然是一个难题。这是因为：从全血，血浆，唾液，尿液，细胞和组织培养液等生物样品中富集含有核酸，蛋白等目标分子的白细胞、病毒粒子、上皮细胞、培养细胞等生物粒子，再在细胞裂解液作用下裂解细胞，通过萃取沉淀的方法才能获得目标分子，其中要经过分离生物粒子，裂解细胞结构和分离目标分子共三个步骤。要想实现样品分离自动化和微型化的目标，操作方案必须同时满足以下要求：(1)样品和所用试剂的体积必须尽可能小，(2)尽量回避离心操作，(3)操作步骤尽可能少，(4)操作过程尽量避免引入污染，(5)分离方法有一定普遍适用性，但现有的制样方法难以达到这些要求，如传统的从全血中分离核酸的方法是苯酚—氯仿法，要使用离心分离法和有毒试剂。已有方法由于没有很好地解决细胞分离问题，大多需用离心操作；在核酸洗脱过程中有的还需升温，也制约了其全过程自动化。在分离高分子DNA时样品往往需要前处理，因而步骤多，难以实现微型化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用固相载体从生物样品中快速分离生物粒子，用细胞裂解液裂解细胞结构，用洗脱缓冲液分离核酸或者利用微珠-聚合酶链式反应(PCR)技术进行目标基因扩增，把扩增产物存于液相之中的提取分离核酸的方法。
本发明的特征在于，它依次含有以下步骤：
(1)在生物样品中加入可物理吸附含有核酸的细胞的固相吸附介质，它是一种悬浮状的粒径范围为5～10000nm且经有机包覆的纳米磁性微球，使它们旋转混匀后静置；
(2)分离出上述固相吸附介质，弃去上清液，用缓冲液洗涤；
(3)加入细胞裂解液使其和固相吸附介质旋转混匀并静置后结合缓冲液使细胞裂解；
(4)用洗脱缓冲液洗涤上述固相吸附介质，获得上述固相吸附介质--核酸的复合物；
(5)回收含有核酸的洗脱缓冲液并分离出核酸。
所述的第(4)步获得的复合物是一种“微珠—聚合酶链式反应(PCR)”技术中的目标基因扩增用的模板。
对于小分子核酸(RNA或质粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在弃去的上清液中再加入固相吸附介质，根据需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步骤(4)、(5)依次进行。
所述的固相吸附材料是在室温下用0.3mol/l NaOH液浸泡过夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡8小时经去离子水洗至PH值为中性的玻璃纤维膜。
所述的分离固相吸附介质和液体的方法是磁场分离法。
所述的细胞裂解液含有：2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸钠)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羟甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
所述的细胞裂解液组成为：15～20g GuSCN(异硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
所述的洗脱缓冲液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
使用证明：它达到了预期目的。
附图说明
图1：实施例3的人类基因组DNA电泳图谱。从300μl人全血中用15mg/ml磁球悬浮液提取的基因组DNA的琼脂糖电泳检测图。磁球悬浮液的量：1(图2中的标号，下同)和2，5μl；3和4，10μl；5和6，20μl；7和8，30μl；9和10，50μl；11和12，70μl；13，100μl；14，120μl；15，150μl；M：1μlλphage DNA(HindIII酶切)marker.
图2：从人全血中用磁球提取的基因组DNA进行HLA-A等位基因PCR扩增后产物的琼脂糖电泳检测图。O：阴性对照，P：阳性对照。
图3：用磁性微球从全血中分离DNA的流程示意图。
具体实施方法
实施例1：高分子DNA的分离。以用纳米磁性微球吸附DNA片断为例：在高温消毒的小离心管(eppendorf)中加入15mg/ml的纳米磁性微球悬浮液40μl以及0.4μg/μl的双链入-DNA分子量标记(marker)(Hind III酶切)15μl，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，再加入4mol·L-1的NaI溶液80μl，轻微振荡15s后，静置3分钟。再加入助吸剂异丙醇100μl，轻微振荡5s，后静置2分钟。用磁性分离架把磁球固定，弃去上清液，用100μl、70％的乙醇洗涤已吸附DNA的纳米磁球2次。加入50μl、pH＝8.0的TE溶液(10mol·L-1Tris.Cl，1mmol·L-1EDTA)。在水浴中62℃恒温12分钟把DNA从磁球上洗脱下来。再把磁球与TE溶液分离，把得到的TE溶液用琼脂糖水平凝胶电泳检测分离的DNA片断。全部操作只需15min，DNA片断回收率为95％以上。
实施例2：用纳米磁性微球分离大肠杆菌的基因组的(genomic)DNA。
样品为培养过夜的不含质粒的E.Coli大肠杆菌菌株。取收获的细胞培养液300μl，再加入50μl纳米磁性微球悬浮液。振荡混合后采用磁性分离架分离磁球，弃去上清液。向磁球加入300μl细胞裂解液(3mol/l NaI，4mol/l尿素，30g/l Triton-100(三硝基甲苯)，10mmol/l EDTA(pH6.5)，25mmol/l Tris·HCl(pH6.5))(下同)，摇匀，室温静置5min。加入300μl异丙醇。在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，弃上清后，再用70％乙醇洗磁性微球2次。然后加上述100μlTE溶液(pH＝6.0)，室温静置10min。再用磁性分离架把磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。DNA产量约为30μg/ml，与传统的十二烷基硫酸钠(SDS)加蛋白酶K破胞，酚-氯仿抽提法相比，产量及纯度相当。
实施例3：用纳米磁性微球吸附分离全血中白细胞并提取其中DNA。
本试验所用全血由健康供血者提供，用血液1/6体积的ACD(23mmol/l柠檬酸，80mmol/l葡萄糖，45mmol/l柠檬酸钠)抗凝。取适量的血液300μl，加入50μl上述磁性微球溶液(用上述pH＝6.0的TE溶液悬浮)，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置3min后，用磁性分离架把磁球固定。弃其他部分。加入300μl细胞裂解液，振荡混匀，室温静置2min。再加入300μl异丙醇振荡混匀，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，弃上清液。用70％乙醇洗涤2次磁球后，加入上述pH6.0的TE溶液，10min后用磁性分离架把磁球固定，收集洗脱液，进行凝胶电泳分析，紫外分光分析。提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶(0.9％)电泳检测，电泳图谱见附图1。该方法建立了一种快速高效的从全血中制备基因组DNA的方法，它不用有毒试剂，操作安全。分别用在上述操作中所获的含人类基因组DNA的洗脱液或所获的吸附有基因组DNA的磁珠直接作模板进行公知的HLA-A(人类白细胞抗原)等位基因的PCR试验，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。电泳图谱见附图2。本试验建立了一种快速高效的HLA等位基因扩增的磁珠-PCR法(microsphere based PCR)，与传统制样方法相比更为简单，快速，模板制备仅需10min，并且排除了PCR抑制剂，且无非特异性扩增。图3是本发明的磁性分离法的流程示意图。1是白细胞，2是红细胞，3是磁球，4是DNA，5是磁铁。先使磁球3和生物样品人全血轻微振荡再静置，磁球3吸附白细胞1后被磁铁5吸附在管壁，弃去其余溶液。加入细胞裂解液后进入裂解白细胞结构的过程，破胞后，DNA4被磁球3吸附后，在磁铁5作用下吸附在管壁上，弃去其余溶液，用TE洗脱缓冲液把DNA从磁球上洗下后，将磁球通过磁铁5固定，将含DNA的TE溶液移至新管中。对300μl人全血，采用100μl磁球溶液(15μg/μl)可得到结果。
实施例4：用纳米磁性微球分离大肠杆菌的质粒DNA。
样品为培育过夜的含质粒的E.coli菌株，试验步骤为：取收获的细胞培育液300μl，然后加入50μl纳米磁性微球悬浮液(15μg/μl)，振荡混合后采用磁性分离架分离磁球，弃溶液，向磁球加入300μl细胞裂解液，摇匀，室温静置5min，再加入300μl异丙醇振荡混匀，室温静置5min。用磁性分离架把磁球固定，转移上清液至另一新管中，重新加入50μl纳米磁性微球悬浮液及300μl异丙醇，摇匀，室温静置5min，用磁性分离架把磁球固定，弃上清，再用70％乙醇洗涤磁球2次。然后加入上述pH6.0的TE溶液100μl，和适量RNA酶溶液，在适宜温度下降解RNA。再用磁性分离架将磁球固定，收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖电泳检测。质粒DNA产量约为5μg/ml，与传统的方法相比，产量及纯度相当。如果要用纳米磁性微球分离大肠杆菌的RNA，则可用DNA酶来代替上述的RNA酶，其余步骤相同。
实施例5：用经过处理的纤维膜吸附DNA片断。
在高温消毒的eppendorf管中加入剪成直径0.5厘米圆形膜片的处理后的玻璃纤维膜，再在纤维膜上加入0.4mg/μl的双链λ-DNAmarker(Hand III酶切)15μl，又加入5mol·L-1NaI溶液80μl，轻微振荡15s，然后静置1min。再加入助吸剂异丙醇100μl，轻微振荡5s，静置2min。用离心法除去上清液。用100μl、70％的乙醇洗涤吸附DNA的膜片2次。加入50μlTE溶液(pH＝8.0，10mmol·L-1Tris.Cl，1mmol.L-1EDTA)。在水溶中用62℃恒温12min，把DNA从膜片洗脱下来。然后用离心法把膜片与TE溶液分离，把得到的TE溶液用琼脂糖水平凝胶电泳检测分离的DNA片断。整个操作只需15min。
实施例6：用经过处理的纤维膜分离大肠杆菌的基因组DNA。
样品为培养过夜的不含质粒的E.Coli菌株。取收获的细胞培养液300μl，然后加入剪成宽0.3厘米的处理过的条状纤维膜膜片。振荡混匀后用吸管吸取再弃去上清液。加入300μl细胞裂解液(20gGuSCN，100ml TE(pH6.0)(10mmol·L-1 Tris.Cl，25mmol.L-1EDTA)，20gPEG8000)，摇匀，室温静置5min。加入300μl 70％乙醇，在旋涡振荡器上轻微振荡15s，室温静置5min。用吸管吸取后再弃去上清液，再用70％乙醇洗膜片2次。然后加pH＝6.0的上述100μl TE溶液，室温静置10min。收集洗脱液，进行紫外分析和琼脂糖凝胶电泳。DNA产量约为40μg/ml，与传统的SDS加蛋白酶K破胞，酚—氯仿抽提法相比，产量及纯度相当。
Claims (8)
1.一种利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，依次包含分离并裂解生物粒子的细胞结构并从中分离出核酸的步骤，其特征在于，它依次含有以下步骤：
(1)在生物样品中加入可物理吸附含有核酸的细胞的固相吸附介质，它是一种悬浮状的粒径范围为5～10000nm且经有机包覆的纳米磁性微球，使它们旋转混匀后静置；
(2)分离出上述固相吸附介质，弃去上清液，用缓冲液洗涤；
(3)加入细胞裂解液使其和固相吸附介质旋转混匀并静置后结合缓冲液使细胞裂解；
(4)用洗脱缓冲液洗涤上述固相吸附介质，获得上述固相吸附介质——核酸的复合物；
(5)回收含有核酸的洗脱缓冲液并分离出核酸。
2.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的第(4)步获得的复合物是一种“微珠—聚合酶链式反应(PCR)”技术中的目标基因扩增用的模板。
3.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：对于小分子核酸(RNA或质粒子DNA)而言，在第(3)步中，可在弃去的上清液中再加入固相吸附介质，根据需要用DNA裂解酶或RNA酶去消化不需要的小分子核酸后，再按步骤(4)、(5)依次进行。
4.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的固相吸附材料是在室温下用0.3mol/l NaOH液浸泡过夜，然后再用0.5mol/lBCl3·2H2O浸泡8小时经去离子水洗至PH值为中性的玻璃纤维膜。
5.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的分离固相吸附介质和液体的方法是磁场分离法。
6.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的细胞裂解液含有：2.5～4mol/l NaI，3～5mol/l尿素，30～50g/l Triton-100(三硝基甲苯)，8～12mmol/l EDTA(乙二胺四乙酸钠)(pH6.5)，15～30mmol/l Tris·HCl(三羟甲基氨基甲烷)(pH6.5)。
7.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的细胞裂解液组成为：15～20g GuSCN(异硫氰酸胍)，pH6.0的100ml TE(10mmol/lEDTA，25mmol/l Tris·HCl)，15～30gPEG8000(聚乙二醇)。
8.根据权利要求1的利用固相载体从生物粒子中分离核酸的方法，其特征在于：所述的洗脱缓冲液是TE溶液(10mmol/l Tris·HCl，1mmol/lEDTA)。
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Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004053115A1 (en) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | Tsinghua University | Magnetism based rapid cell separation |
| WO2004102196A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-25 | Chengdu Kuachang Medical Industrial Limited | Apparatus including nanostructures used for separation or analysis, and the preparation and application thereof |
| CN100507522C (zh) * | 2004-12-15 | 2009-07-01 | 中国科学院上海应用物理研究所 | Dna的荧光检测方法及其试剂盒 |
| CN101851617A (zh) * | 2010-04-28 | 2010-10-06 | 长春市博坤生物科技有限公司 | 可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法 |
| CN1764842B (zh) * | 2003-03-24 | 2012-01-11 | 索尼株式会社 | 微芯片、用于提取核酸的试剂盒以及核酸的提取方法 |
| CN101363045B (zh) * | 2007-09-10 | 2012-10-17 | 厦门致善生物科技有限公司 | 一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法 |
| CN105420818A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-03-23 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 基于磁珠绑定的二代测序文库快速构建方法 |
| CN105441425A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-30 | 李文娴 | 一种提取rna的提取液和方法 |
| CN107043767A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-08-15 | 谭淼 | 一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法 |
| CN108342312A (zh) * | 2017-01-24 | 2018-07-31 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 对流pcr扩增检测系统和对流pcr扩增检测方法 |
| CN109351301A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-19 | 中国化学赛鼎宁波工程有限公司 | 一种纳米生物医用材料的生产系统及其生产方法 |
| CN109382051A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-26 | 中国化学赛鼎宁波工程有限公司 | 一种纳米生物医用材料的生产系统及其生产工艺 |
| WO2019100620A1 (zh) * | 2017-11-24 | 2019-05-31 | 浙江今复康生物科技有限公司 | 痰液的保存方法和从痰液中快速提取核酸的方法 |
| CN110167952A (zh) * | 2016-07-25 | 2019-08-23 | Aj耶拿检疫有限公司 | 用于富集生物分子并且用于从生物样品中去除这些生物分子的方法 |
| WO2021164396A1 (zh) * | 2020-02-18 | 2021-08-26 | 南京农业大学 | 一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法 |
| CN113584128A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-02 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法 |
-
2001
- 2001-12-07 CN CN 01140445 patent/CN1304589C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7776580B2 (en) | 2002-12-09 | 2010-08-17 | Capitalbio Corporation | Magnetism based rapid cell separation |
| WO2004053115A1 (en) * | 2002-12-09 | 2004-06-24 | Tsinghua University | Magnetism based rapid cell separation |
| CN1764842B (zh) * | 2003-03-24 | 2012-01-11 | 索尼株式会社 | 微芯片、用于提取核酸的试剂盒以及核酸的提取方法 |
| WO2004102196A1 (en) * | 2003-04-30 | 2004-11-25 | Chengdu Kuachang Medical Industrial Limited | Apparatus including nanostructures used for separation or analysis, and the preparation and application thereof |
| CN100507522C (zh) * | 2004-12-15 | 2009-07-01 | 中国科学院上海应用物理研究所 | Dna的荧光检测方法及其试剂盒 |
| CN101363045B (zh) * | 2007-09-10 | 2012-10-17 | 厦门致善生物科技有限公司 | 一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法 |
| CN101851617B (zh) * | 2010-04-28 | 2012-11-21 | 长春市博坤生物科技有限公司 | 可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法 |
| CN101851617A (zh) * | 2010-04-28 | 2010-10-06 | 长春市博坤生物科技有限公司 | 可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法 |
| CN105420818A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-03-23 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 基于磁珠绑定的二代测序文库快速构建方法 |
| CN105441425B (zh) * | 2015-12-18 | 2019-03-05 | 河北蓝梦生物医药科技有限公司 | 一种提取rna的提取液和方法 |
| CN105441425A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-30 | 李文娴 | 一种提取rna的提取液和方法 |
| CN110167952A (zh) * | 2016-07-25 | 2019-08-23 | Aj耶拿检疫有限公司 | 用于富集生物分子并且用于从生物样品中去除这些生物分子的方法 |
| CN108342312A (zh) * | 2017-01-24 | 2018-07-31 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 对流pcr扩增检测系统和对流pcr扩增检测方法 |
| CN108342312B (zh) * | 2017-01-24 | 2020-09-18 | 北京万泰生物药业股份有限公司 | 对流pcr扩增检测系统和对流pcr扩增检测方法 |
| CN107043767A (zh) * | 2017-05-05 | 2017-08-15 | 谭淼 | 一种基于纳米多向层析固相载体提取核酸的方法 |
| WO2019100620A1 (zh) * | 2017-11-24 | 2019-05-31 | 浙江今复康生物科技有限公司 | 痰液的保存方法和从痰液中快速提取核酸的方法 |
| CN109382051A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-26 | 中国化学赛鼎宁波工程有限公司 | 一种纳米生物医用材料的生产系统及其生产工艺 |
| CN109351301A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-02-19 | 中国化学赛鼎宁波工程有限公司 | 一种纳米生物医用材料的生产系统及其生产方法 |
| CN109382051B (zh) * | 2018-11-13 | 2020-12-18 | 中国化学赛鼎宁波工程有限公司 | 一种纳米生物医用材料的生产系统及其生产工艺 |
| WO2021164396A1 (zh) * | 2020-02-18 | 2021-08-26 | 南京农业大学 | 一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法 |
| CN113584128A (zh) * | 2021-07-29 | 2021-11-02 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1304589C (zh) | 2007-03-14 |
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