CN105441425A

CN105441425A - 一种提取rna的提取液和方法

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Publication number: CN105441425A
Application number: CN201510953561.8A
Authority: CN
Inventors: 李文娴
Original assignee: Individual
Current assignee: Shouke Lingfu (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: CN105441425B

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸的提取。具体而言，本发明提供一种可以用于水煮法提取RNA的提取液以及一种水煮法提取RNA的方法，用于提取病毒拭子、全血等样品中的RNA。本发明的RNA提取液包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应缓冲液等成分。利用本发明的RNA提取液和方法通过水煮法即可获得能够用于PCR反应的RNA，使得RNA的提取简单易行，成本降低。

Description

一种提取RNA的提取液和方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及核酸的提取。

背景技术

分子生物学实验经常需要从样品中提取核酸物质，用于后续的PCR扩增。目前，提取DNA通常采用水煮法，即，通过水煮10-20分钟裂解样品，利用EDTA、Chelex-100树脂等螯合剂螯合掉样品裂解后所释放的干扰后续PCR反应的金属离子，从而得到可用于PCR反应的DNA。水煮法具有简便、易操作、核酸提取率高等特点，广泛应用于疾控、法医等领域(杨电，刘超，徐曲毅，胡慧英.Chelex-100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究[J].刑事技术.2009(05)；钱雪琴，张军，沈芳.Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较[J].中国卫生检验杂志.2008(08))。RNA通常用TRIzol法、硅胶柱和磁珠法等方法提取(Trizol：美国专利号5346994；钟海军，唐孝亮，曾刚毅.核酸纯化柱提取核酸定量检测丙型肝炎病毒RNA的临床应用[J].检验医学与临床.2008(13)；何世成，林源，王昌建，刘道新，谭丹，唐小明，王卫国，鲁杏华，邱立新，何玉玲.五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较.[J].中国动物检疫.2014(8))。然而TRIzol法中使用的重蒸酚具有毒性；硅胶法、磁珠法等费用较高，且提取率不高；而普通的水煮法无法直接用于提取RNA，主要是因为样品中存在内源性的RNA酶，而这些RNA酶会将RNA降解。因此，本领域需要一种能够简便易操作且能够高效率提取RNA的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以用于水煮法提取RNA的提取液以及一种水煮法提取RNA的方法，以解决水煮法不能提取用于PCR的RNA的问题。

本发明的一个方面是提供一种RNA提取液，用于提取病毒(包括但不限于流感病毒)拭子、全血等样品中的RNA，所述提取液包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应缓冲液等成分，其中所述RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种的组合，所述阳离子螯合剂为EDTA、8-羟基喹啉螯合树脂、聚苯乙烯吡啶树脂、Chelex-100树脂、壳聚糖改性树脂、冠醚树脂和丝瓜络中的一种或几种的组合，所述去污剂是吐温20、Triton-X100和对羟基苯甲酸甲酯中的一种或几种的组合，所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋酸缓冲液、氯化钾/HCl缓冲液、甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。

优选地，所述尿素的浓度是1～4M；更优选地，尿素的浓度是2.2M。

优选地，所述氧钒核糖核酸复合物的浓度是10～100mM；更优选地，氧钒核糖核酸复合物的浓度是30mM。

优选地，所述EDTA的浓度是0.1～5mM；更优选地，所述EDTA的浓度是1.5mM。

优选地，所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是5％～10％W/V，更优选地，8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是8％W/V。

优选地，所述聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是5％～10％W/V，更优选地，聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是8％W/V。

优选地，所述Chelex-100树脂的浓度是5％～10％W/V，更优选地，Chelex-100树脂的浓度是8％W/V。

优选地，所述壳聚糖改性树脂的浓度是5％～10％W/V，更优选地，壳聚糖改性树脂的浓度是8％W/V。

优选地，所述冠醚树脂的浓度是5％～10％W/V，更优选地，冠醚树脂的浓度是8％W/V。

优选地，所述丝瓜络的浓度是5％～10％W/V，更优选地，丝瓜络的浓度是8％W/V。

优选地，所述吐温20的浓度是0.1％～2％W/V，更优选地，吐温20的浓度是0.5％W/V。

优选地，所述Triton-X100的浓度是0.1％～2％W/V，更优选地，Triton-X100的浓度是0.5％W/V。

优选地，所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1％～0.2％W/V，更优选地，对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1％W/V。

优选地，所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20～500mM，更优选地，浓度是100mM；该缓冲液的pH值范围是4.0～5.5，更优选地，pH值是4.8。

优选地，所述氯化钾/HCl缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20～500mM，更优选地，浓度是100mM；该缓冲液pH值范围是4.0～5.5，更优选地，pH值是4.8。

优选地，所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度(甘氨酸浓度)是10～100mM，更优选地，浓度是50mM；该缓冲液pH值范围是4.0～5.5，更优选地，pH值是4.8。

优选地，所述HAc-NaAc缓冲液的浓度(钠离子浓度)是50～500mM，更优选地，浓度是200mM；该缓冲液的pH值范围是4.0～5.5，更优选地，pH值是4.8。

进一步地，一种优选的提取液的成分为：尿素2.2M，氧钒核糖核酸复合物30mM，EDTA1.5mM，Chelex-100树脂8％W/V，吐温200.5％W/V，TritonX-1000.5％W/V，对羟基苯甲酸甲酯0.1％W/V，甘氨酸/盐酸缓冲液(甘氨酸浓度)50mM，pH4.8。

本发明的第二个方面提供一种提取RNA的方法，包括：向样品中加入本发明的RNA提取液，样品与RNA提取液的体积比为3:1，95～100℃加热5～20min，取出后用振荡器剧烈振荡，12000～14000rpm离心15～30s。

本发明的第三个方面是提供一种提取RNA的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的RNA提取液。

本发明的第四个方面是提供本发明的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。

本发明的方法中，依靠高温水煮来裂解样品并释放核酸。释放核酸的同时，会有一部分杂质阳离子也被释放出来，这部分离子会干扰实验，用阳离子螯合剂螯合掉；同时用去污剂去除样本中的脂质、脂蛋白等。缓冲液选择酸性条件的缓冲液，且不含磷酸根、柠檬酸根等可能与Mg离子结合沉淀的离子。释放核酸的同时，会有内源性RNA酶释放出来。选用合适的抑制剂，如尿素或氧钒核糖核酸复合物等，既能灭活RNA酶(尿素可以变性蛋白)，又不会干扰后面的PCR反应(Taq酶可以耐受)，从而避免RNA被降解，仅利用水煮法即可获得能够用于PCR反应的RNA，使得RNA的提取简单易行，成本降低。

附图说明

图1是TRIzol法(ThermoFisher货号：15596-026，按说明书操作)提取禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图；

图2是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图；

图3是TRIzol法(ThermoFisher货号：15596-026，按说明书操作)提取禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图；

图4是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图；

图5是阴性对照结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式说明本发明，但本发明的范围不限于此。

下述实施例中，如无特别说明，所使用的试剂、耗材为本领域常规试剂和耗材，可以从普通的化学和生物试剂商店或供货商处购买；所使用的方法为分子生物学领域的常规方法，本领域技术人员根据本领域常识可以明确知道如何进行所述实验。

分别取180μL禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司,2mL1xPBSpH7.4稀释)、禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)，用如下方法提取：

a)配制100mLRNA提取液，配方如下：

b)取1.5mLPCR管，加入待检样本液180μL；

c)加入提取液60μL，混匀，100℃水煮15～20min；

d)取出，剧烈振荡5～10s，12000rpm离心15s；

e)取上清液3～5μL作为RNA模版。

由于市场上并无水煮法提取RNA的方法，所以以Trizol试剂(ThermoFisher货号：15596-026)，按说明书操作试剂，分别对禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原进行提取，作为对照。分别取180μL禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原，按如下步骤进行提取：

a)取1.5mLPCR管，加入待检样品液180μL；

b)加入400μLTRIzol和180μL氯仿，振荡，12000rpm离心10分钟，取上清液；

d)加入等体积异丙醇洗涤，振荡，12000rpm离心10分钟，弃上清液；

e)加入2倍体积的DEPC酒精洗涤，振荡，12000rpm离心10分钟，弃上清液；

f)超净工作台简单吹干，加入240μLDEPC水。

以上实验和对照，每组设置4次重复，全部提取完之后，使用AIV-MatrixReagents(lifetechnology)进行扩增，扩增条件为45℃15min，95℃15min；95℃15s，58℃45s，40个循环。扩增结果如下：

使用TRIzol法提取的禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原，4个重复的CT值分别为16.75、15.97、16.39、14.8(图1)；使用水煮法提取RNA的4个重复，CT值分别为15.97、14.75、14.36、15.71(图2)。结果证实，水煮法可以提取出禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原，并且其灵敏度高于TRIzol法。

使用TRIzol法提取的禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原，4个重复的CT值分别为21.73、21.06、22.18、20.71(图3)；使用水煮法提取RNA的4个重复，CT值分别为18.96、19.49、16.81、18.68(图4)。结果证实，水煮法可以提取出禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原，并且其灵敏度高于TRIzol法。

以上实验以H7N9阴性的鸡囊胚液作为阴性对照，按照上述方法进行相同的实验，结果均成立(图5)。

Claims

1.一种RNA提取液，包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应缓冲液，其中所述RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种的组合，所述阳离子螯合剂为EDTA、8-羟基喹啉螯合树脂、聚苯乙烯吡啶树脂、Chelex-100树脂、壳聚糖改性树脂、冠醚树脂和丝瓜络中的一种或几种的组合，所述去污剂是吐温20、Triton-X100和对羟基苯甲酸甲酯中的一种或几种的组合，所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋酸缓冲液、氯化钾/HCl缓冲液、甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。

2.根据权利要求1所述的RNA提取液，其中，所述尿素的浓度是1～4M，优选为2.2M；所述氧钒核糖核酸复合物的浓度是10～100mM，优选为30mM。

3.根据权利要求1所述的RNA提取液，其中，所述EDTA的浓度是0.1～5mM，优选为1.5mM；所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是5％～10％W/V，优选为8％W/V；所述聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是5％～10％W/V，优选为8％W/V；所述Chelex-100树脂的浓度是5％～10％W/V，优选为8％W/V；所述壳聚糖改性树脂的浓度是5％～10％W/V，优选为8％W/V；所述冠醚树脂的浓度是5％～10％W/V，优选为8％W/V；所述丝瓜络的浓度是5％～10％W/V，优选为8％W/V。

4.根据权利要求1所述的RNA提取液，其中，所述吐温20的浓度是0.1％～2％W/V，优选为0.5％W/V；所述Triton-X100的浓度是0.1％～2％W/V，优选为0.5％W/V；所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1％～0.2％W/V，优选为0.1％W/V。

5.根据权利要求1所述的RNA提取液，其中，所述反应缓冲液的pH值范围是4.0～5.5，优选为4.8。

6.根据权利要求5所述的RNA提取液，其中，所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度以钾离子计算是20～500mM，优选为100mM；所述氯化钾/HCl缓冲液的浓度以钾离子计算是20～500mM，优选为100mM；所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度以甘氨酸计算是10～100mM，优选为50mM；所述HAc-NaAc缓冲液的浓度以钠离子计算是50～500mM，优选为200mM。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的RNA提取液，其成分为2.2M尿素、30mM氧钒核糖核酸复合物、1.5mMEDTA、8％W/VChelex-100树脂、0.5％W/V吐温20、0.5％W/VTritonX-100、0.1％W/V对羟基苯甲酸甲酯、以甘氨酸计算浓度为50mM的甘氨酸/盐酸缓冲液、pH4.8。

8.一种提取RNA的方法，包括：向样品中加入权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液，样品与RNA提取液的体积比为3:1，95～100℃加热5～20min，剧烈振荡，12000～14000rpm离心15～30s。

9.一种提取RNA的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液。

10.权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。