CN105441425A - 一种提取rna的提取液和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域,涉及核酸的提取。具体而言,本发明提供一种可以用于水煮法提取RNA的提取液以及一种水煮法提取RNA的方法,用于提取病毒拭子、全血等样品中的RNA。本发明的RNA提取液包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应缓冲液等成分。利用本发明的RNA提取液和方法通过水煮法即可获得能够用于PCR反应的RNA,使得RNA的提取简单易行,成本降低。

Description

一种提取RNA的提取液和方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及核酸的提取。
背景技术
分子生物学实验经常需要从样品中提取核酸物质,用于后续的PCR扩增。目前,提取DNA通常采用水煮法,即,通过水煮10-20分钟裂解样品,利用EDTA、Chelex-100树脂等螯合剂螯合掉样品裂解后所释放的干扰后续PCR反应的金属离子,从而得到可用于PCR反应的DNA。水煮法具有简便、易操作、核酸提取率高等特点,广泛应用于疾控、法医等领域(杨电,刘超,徐曲毅,胡慧英.Chelex-100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究[J].刑事技术.2009(05);钱雪琴,张军,沈芳.Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较[J].中国卫生检验杂志.2008(08))。RNA通常用TRIzol法、硅胶柱和磁珠法等方法提取(Trizol:美国专利号5346994;钟海军,唐孝亮,曾刚毅.核酸纯化柱提取核酸定量检测丙型肝炎病毒RNA的临床应用[J].检验医学与临床.2008(13);何世成,林源,王昌建,刘道新,谭丹,唐小明,王卫国,鲁杏华,邱立新,何玉玲.五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较.[J].中国动物检疫.2014(8))。然而TRIzol法中使用的重蒸酚具有毒性;硅胶法、磁珠法等费用较高,且提取率不高;而普通的水煮法无法直接用于提取RNA,主要是因为样品中存在内源性的RNA酶,而这些RNA酶会将RNA降解。因此,本领域需要一种能够简便易操作且能够高效率提取RNA的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以用于水煮法提取RNA的提取液以及一种水煮法提取RNA的方法,以解决水煮法不能提取用于PCR的RNA的问题。
本发明的一个方面是提供一种RNA提取液,用于提取病毒(包括但不限于流感病毒)拭子、全血等样品中的RNA,所述提取液包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应缓冲液等成分,其中所述RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种的组合,所述阳离子螯合剂为EDTA、8-羟基喹啉螯合树脂、聚苯乙烯吡啶树脂、Chelex-100树脂、壳聚糖改性树脂、冠醚树脂和丝瓜络中的一种或几种的组合,所述去污剂是吐温20、Triton-X100和对羟基苯甲酸甲酯中的一种或几种的组合,所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋酸缓冲液、氯化钾/HCl缓冲液、甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。
优选地,所述尿素的浓度是1~4M;更优选地,尿素的浓度是2.2M。
优选地,所述氧钒核糖核酸复合物的浓度是10~100mM;更优选地,氧钒核糖核酸复合物的浓度是30mM。
优选地,所述EDTA的浓度是0.1~5mM;更优选地,所述EDTA的浓度是1.5mM。
优选地,所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是5%~10%W/V,更优选地,8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是8%W/V。
优选地,所述聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是5%~10%W/V,更优选地,聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是8%W/V。
优选地,所述Chelex-100树脂的浓度是5%~10%W/V,更优选地,Chelex-100树脂的浓度是8%W/V。
优选地,所述壳聚糖改性树脂的浓度是5%~10%W/V,更优选地,壳聚糖改性树脂的浓度是8%W/V。
优选地,所述冠醚树脂的浓度是5%~10%W/V,更优选地,冠醚树脂的浓度是8%W/V。
优选地,所述丝瓜络的浓度是5%~10%W/V,更优选地,丝瓜络的浓度是8%W/V。
优选地,所述吐温20的浓度是0.1%~2%W/V,更优选地,吐温20的浓度是0.5%W/V。
优选地,所述Triton-X100的浓度是0.1%~2%W/V,更优选地,Triton-X100的浓度是0.5%W/V。
优选地,所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1%~0.2%W/V,更优选地,对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1%W/V。
优选地,所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20~500mM,更优选地,浓度是100mM;该缓冲液的pH值范围是4.0~5.5,更优选地,pH值是4.8。
优选地,所述氯化钾/HCl缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20~500mM,更优选地,浓度是100mM;该缓冲液pH值范围是4.0~5.5,更优选地,pH值是4.8。
优选地,所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度(甘氨酸浓度)是10~100mM,更优选地,浓度是50mM;该缓冲液pH值范围是4.0~5.5,更优选地,pH值是4.8。
优选地,所述HAc-NaAc缓冲液的浓度(钠离子浓度)是50~500mM,更优选地,浓度是200mM;该缓冲液的pH值范围是4.0~5.5,更优选地,pH值是4.8。
进一步地,一种优选的提取液的成分为:尿素2.2M,氧钒核糖核酸复合物30mM,EDTA1.5mM,Chelex-100树脂8%W/V,吐温200.5%W/V,TritonX-1000.5%W/V,对羟基苯甲酸甲酯0.1%W/V,甘氨酸/盐酸缓冲液(甘氨酸浓度)50mM,pH4.8。
本发明的第二个方面提供一种提取RNA的方法,包括:向样品中加入本发明的RNA提取液,样品与RNA提取液的体积比为3:1,95~100℃加热5~20min,取出后用振荡器剧烈振荡,12000~14000rpm离心15~30s。
本发明的第三个方面是提供一种提取RNA的试剂盒,所述试剂盒包含本发明的RNA提取液。
本发明的第四个方面是提供本发明的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。
本发明的方法中,依靠高温水煮来裂解样品并释放核酸。释放核酸的同时,会有一部分杂质阳离子也被释放出来,这部分离子会干扰实验,用阳离子螯合剂螯合掉;同时用去污剂去除样本中的脂质、脂蛋白等。缓冲液选择酸性条件的缓冲液,且不含磷酸根、柠檬酸根等可能与Mg离子结合沉淀的离子。释放核酸的同时,会有内源性RNA酶释放出来。选用合适的抑制剂,如尿素或氧钒核糖核酸复合物等,既能灭活RNA酶(尿素可以变性蛋白),又不会干扰后面的PCR反应(Taq酶可以耐受),从而避免RNA被降解,仅利用水煮法即可获得能够用于PCR反应的RNA,使得RNA的提取简单易行,成本降低。
附图说明
图1是TRIzol法(ThermoFisher货号:15596-026,按说明书操作)提取禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图;
图2是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图;
图3是TRIzol法(ThermoFisher货号:15596-026,按说明书操作)提取禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图;
图4是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图;
图5是阴性对照结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式说明本发明,但本发明的范围不限于此。
下述实施例中,如无特别说明,所使用的试剂、耗材为本领域常规试剂和耗材,可以从普通的化学和生物试剂商店或供货商处购买;所使用的方法为分子生物学领域的常规方法,本领域技术人员根据本领域常识可以明确知道如何进行所述实验。
分别取180μL禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司,2mL1xPBSpH7.4稀释)、禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司),用如下方法提取:
a)配制100mLRNA提取液,配方如下:
b)取1.5mLPCR管,加入待检样本液180μL;
c)加入提取液60μL,混匀,100℃水煮15~20min;
d)取出,剧烈振荡5~10s,12000rpm离心15s;
e)取上清液3~5μL作为RNA模版。
由于市场上并无水煮法提取RNA的方法,所以以Trizol试剂(ThermoFisher货号:15596-026),按说明书操作试剂,分别对禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原进行提取,作为对照。分别取180μL禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原、禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原,按如下步骤进行提取:
a)取1.5mLPCR管,加入待检样品液180μL;
b)加入400μLTRIzol和180μL氯仿,振荡,12000rpm离心10分钟,取上清液;
d)加入等体积异丙醇洗涤,振荡,12000rpm离心10分钟,弃上清液;
e)加入2倍体积的DEPC酒精洗涤,振荡,12000rpm离心10分钟,弃上清液;
f)超净工作台简单吹干,加入240μLDEPC水。
以上实验和对照,每组设置4次重复,全部提取完之后,使用AIV-MatrixReagents(lifetechnology)进行扩增,扩增条件为45℃15min,95℃15min;95℃15s,58℃45s,40个循环。扩增结果如下:
使用TRIzol法提取的禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原,4个重复的CT值分别为16.75、15.97、16.39、14.8(图1);使用水煮法提取RNA的4个重复,CT值分别为15.97、14.75、14.36、15.71(图2)。结果证实,水煮法可以提取出禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原,并且其灵敏度高于TRIzol法。
使用TRIzol法提取的禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原,4个重复的CT值分别为21.73、21.06、22.18、20.71(图3);使用水煮法提取RNA的4个重复,CT值分别为18.96、19.49、16.81、18.68(图4)。结果证实,水煮法可以提取出禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原,并且其灵敏度高于TRIzol法。
以上实验以H7N9阴性的鸡囊胚液作为阴性对照,按照上述方法进行相同的实验,结果均成立(图5)。

Claims (10)

1.一种RNA提取液,包含RNA酶抑制剂、阳离子螯合剂、去污剂和反应缓冲液,其中所述RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种的组合,所述阳离子螯合剂为EDTA、8-羟基喹啉螯合树脂、聚苯乙烯吡啶树脂、Chelex-100树脂、壳聚糖改性树脂、冠醚树脂和丝瓜络中的一种或几种的组合,所述去污剂是吐温20、Triton-X100和对羟基苯甲酸甲酯中的一种或几种的组合,所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋酸缓冲液、氯化钾/HCl缓冲液、甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。
2.根据权利要求1所述的RNA提取液,其中,所述尿素的浓度是1~4M,优选为2.2M;所述氧钒核糖核酸复合物的浓度是10~100mM,优选为30mM。
3.根据权利要求1所述的RNA提取液,其中,所述EDTA的浓度是0.1~5mM,优选为1.5mM;所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是5%~10%W/V,优选为8%W/V;所述聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是5%~10%W/V,优选为8%W/V;所述Chelex-100树脂的浓度是5%~10%W/V,优选为8%W/V;所述壳聚糖改性树脂的浓度是5%~10%W/V,优选为8%W/V;所述冠醚树脂的浓度是5%~10%W/V,优选为8%W/V;所述丝瓜络的浓度是5%~10%W/V,优选为8%W/V。
4.根据权利要求1所述的RNA提取液,其中,所述吐温20的浓度是0.1%~2%W/V,优选为0.5%W/V;所述Triton-X100的浓度是0.1%~2%W/V,优选为0.5%W/V;所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.1%~0.2%W/V,优选为0.1%W/V。
5.根据权利要求1所述的RNA提取液,其中,所述反应缓冲液的pH值范围是4.0~5.5,优选为4.8。
6.根据权利要求5所述的RNA提取液,其中,所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度以钾离子计算是20~500mM,优选为100mM;所述氯化钾/HCl缓冲液的浓度以钾离子计算是20~500mM,优选为100mM;所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度以甘氨酸计算是10~100mM,优选为50mM;所述HAc-NaAc缓冲液的浓度以钠离子计算是50~500mM,优选为200mM。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的RNA提取液,其成分为2.2M尿素、30mM氧钒核糖核酸复合物、1.5mMEDTA、8%W/VChelex-100树脂、0.5%W/V吐温20、0.5%W/VTritonX-100、0.1%W/V对羟基苯甲酸甲酯、以甘氨酸计算浓度为50mM的甘氨酸/盐酸缓冲液、pH4.8。
8.一种提取RNA的方法,包括:向样品中加入权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液,样品与RNA提取液的体积比为3:1,95~100℃加热5~20min,剧烈振荡,12000~14000rpm离心15~30s。
9.一种提取RNA的试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液。
10.权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。
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