CN108823201A - 一种rna核酸释放剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种RNA核酸释放剂及其用应用，该RNA核酸释放剂含有摩尔浓度为0.35‑50mM的多果定、体积份数为1‑10％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX‑100)、体积份数为1‑10％的乙基苄基聚乙二醇(NP‑40)、体积份数为0.1‑10％的Chelex‑100树脂和摩尔浓度为1‑200mM的醋酸钾，本发明以多果定代替胍盐或尿素，用于水煮法RNA提取，简化了RNA提取物在PCR之前的纯化过程，与使用胍盐或尿素进行RNA水煮法提取的方法相比较，使用该RNA核酸释放剂对RNA进行提取后扩增，在相同条件下，能够获得更好的扩增效果，降低了对初始检测样品中RNA浓度的要求。

Description

一种RNA核酸释放剂及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种RNA核酸释放剂 及其在水煮法提取RNA中的应用。
背景技术
自1869年Miescher发现核酸以来，涉及到核酸研究的分子生 物学实验成为了最常见的实验之一。而核酸提取是研究核酸的重要 手段。经过近150年的探索研究，已有多种核酸提取的方法被报道。 核酸提取主要包括DNA提取和RNA提取。
关于DNA的提取，最经典的方法为碱裂解法提取质粒DNA。该 方法提取的DNA纯度好，得率高，合适大部分分子生物学实验。但 是，该方法提取过程繁琐，耗时较长，需要用到苯酚氯仿等毒害性 较高的化学试剂。为了改进碱裂解法中出现的弱点，有大量的研究 根据不同的分子生物学实验，针对性开发出更加简便高效的核酸提 取方法。比如目前提取DNA通常采用水煮法，通过水煮10-20分钟 裂解样品，利用乙二胺四乙酸(EDTA)、Chelex-100树脂等螯合剂 螯合掉样品裂解后所释放的干扰后续PCR反应的金属离子，从而得 到可用于PCR反应的DNA。水煮法具有简便、易操作、核酸提取率 高等特点，广泛应用于疾控、法医等领域。
关于RNA的提取，由于RNA酶具有一定的稳定性，而且来源广 泛，RNA提取常会受到RNA酶的污染而失败。现行RNA提取常用异 硫氰酸胍或盐酸胍法。该类胍盐具有溶解蛋白质，导致细胞结构和 核蛋白二级结构破坏，使蛋白质从核酸上解离下来的功能。此外， RNA酶活性可被胍盐有效抑制。RNA提取实验中广泛使用的Trizol 试剂，即为胍盐配合吐温、苯酚等试剂配制而得。另外，在专利CN105441425A中，李文娴通过RNA酶抑制剂(尿素和氧钒核糖核酸复 合物中的一种或几种)、阳离子螯合剂(EDTA、8-羟基喹啉螯合树 脂、聚苯乙烯吡啶树脂、Chelex-100树脂、壳聚糖改性树脂、冠醚 树)，同时结合水煮方式，对RNA提取过程进行了简化。但该方法 裂解力度较温和，且尿素对RNA酶的抑制作用较弱，仅能对高浓度的RNA样本进行裂解和提取。
中国专利公布CN103068979A公开了一种用于从包含DNA和RNA 的生物样品中提取RNA的溶液，该溶液包含相对于溶液的总量超过 50％(V/V)的酚、相对于溶液总量为3-10％(V/V)的多元醇、相 对于溶液总量为0.5-2.0M浓度的胍盐、相对于溶液的总量为0.1- 0.5M浓度的硫氢酸盐和用于将溶液的pH值维持在4-6的缓冲剂。 虽然，胍盐的使用，极大提升了RNA提取的成功率，但是，胍盐对 逆转录酶或者DNA聚合酶活性具有严重的抑制作用。用胍盐法提取 的RNA必须经过严格的胍盐去除步骤，才能应用于下游的分子生物 学实验。这些繁琐的步骤，在一定程度上阻碍了分子生物学实验的 快速、顺利开展。而通过阳离子螯合剂结合水煮方式提取RNA，虽 然操作步骤简便，但是由于该方法裂解力度较温和，不能有效对样 本进行完全裂解，导致RNA提取得率较低，也不利于下游分子生物 学实验开展。
本发明提供一种可以传承胍盐提取RNA优点，同时能减弱对逆 转录酶或者DNA聚合酶活性抑制的，可以取代盐酸胍或异硫氰酸胍 的试剂，多果定(Dodine)。多果定又名十二烷基胍醋酸盐(结构 如化学式I所示)，是一种含胍基的特殊表面活性剂。本发明，以 多果定，代替传统的胍盐(异硫氰酸胍或盐酸胍)的使用，结合水 煮法，能快捷、有效地对样本进行裂解，释放其中的RNA，同时保 护已释放的RNA不被样本中未分离纯化掉的RNA酶降解。由于残留 在RNA样本中的多果定对逆转录酶或者DNA聚合酶活性等抑制较小， 所提取的RNA样本无需经过严格的纯化即能进行下游的qPCR(实时 荧光定量PCR)实验。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RNA核酸释放剂，所述RNA可以是 细胞或病原体的RNA。而且，本发明进一步提供了应用该RNA核酸 提取剂进行RNA提取的方法，该方法在细胞或病原体RNA检测领域， 具有广泛的应用前景。
本发明公开了一种RNA核酸释放剂，所述释放剂含有摩尔浓度 为0.35-50mM的多果定、体积份数为1-10％的聚乙二醇辛基苄基醚 (TritonX-100)、体积份数为1-10％的乙基苄基聚乙二醇(NP- 40)、体积份数为0.1-10％的Chelex-100树脂和摩尔浓度为1- 200mM的醋酸钾。
优选地，所述释放剂含有摩尔浓度为1-40mM的多果定、体积份 数为1-8％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为3-9％ 的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为0.5-8％的Chelex-100 树脂和摩尔浓度为5-150mM的醋酸钾。
进一步优选地，所述释放剂含有摩尔浓度为5-35mM的多果定、 体积份数为2-5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份 数为5-8％的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为2-6％的 Chelex-100树脂和摩尔浓度为30-100mM的醋酸钾。
更优选地，所述释放剂含有摩尔浓度为10-30mM的多果定、体 积份数为3-5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数 为6-8％的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为3-5％的 Chelex-100树脂和摩尔浓度为40-90mM的醋酸钾。
本发明公开了一种用所述释放剂进行RNA提取的方法。
所述的提取方法，可以用来提取细胞中的RNA。
所述的提取方法，可以用来提取病毒中的RNA。
所述的提取方法中包括将含有待提取RNA的样品和RNA核酸释 放剂的混合液进行水煮的步骤
所述的水煮温度为100℃。
本发明还公开了所述释放剂在制备提取RNA试剂盒中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供一种细胞或病原体RNA核酸释放剂，使细胞或 病原体RNA充分释放且本身不干扰后续PCR的扩增。
(2)本发明提取RNA的方法不需要像传统的核酸提取试剂盒一 样进行裂解、洗涤、洗脱等繁琐的提取步骤，极大提高实验室工作 效率。
(3)本发明提取RNA的方法有效避免了实验操作过程中可能发 生污染的环节，同时还减少医疗废弃物的产生，减少了提取过程中 细胞或病原体RNA的损失。
附图说明
图1为应用本发明实施例5的方法扩增血清中HIV-1 RNA的实 时荧光定量检测方法检测HIV-1 RNA滴度为20IU/mL的血清标准品 的效果。
图2为应用本发明实施例5的方法扩增血清中HIV-1 RNA的实 时荧光定量检测方法检测HIV-1 RNA滴度为50IU/mL的血清标准品 的效果。
图3为应用本发明实施例5的方法扩增血清中HIV-1 RNA的实 时荧光定量检测方法检测HIV-1 RNA滴度为50000000、5000000、 500000、50000、5000、500、50IU/mL的梯度稀释血清标准品的效 果，其中①是50000000IU/mL的扩增效果，②是5000000IU/mL的扩 增效果，③是500000IU/mL的扩增效果，④是50000IU/mL的扩增效 果，⑤是5000IU/mL的扩增效果，⑥是500IU/mL的扩增效果,⑦是 50IU/mL的扩增效果。
图4为应用本发明实施例5的方法扩增血清中HIV-1 RNA的实 时荧光定量检测方法检测HCV RNA、HBV DNA、TB DNA的特异性实验 的结果。
图5为应用本发明实施例5的方法扩增血清中HIV-1 RNA的实 时荧光定量检测方法检测HIV-1 RNA滴度为100、50、25、10 IU/mL的血清标准品的效果，其中A是100IU/mL的扩增效果，B是 50IU/mL的扩增效果，C是25IU/mL的扩增效果，D是10IU/mL 的扩增效果。
图6为应用CN105441425A专利方法提取扩增血清中HIV-1 RNA 的实时荧光定量检测方法检测HIV-1 RNA滴度为100、50、25、 10IU/mL的血清标准品的效果，其中其中a是100IU/mL的扩增效果， b是50IU/mL的扩增效果，c是25IU/mL的扩增效果，d是10IU/mL 的扩增效果。
具体实施方式
实施例1
一种RNA核酸释放剂含有摩尔浓度为0.40mM的多果定、体积份 数为1.5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为1.5％ 的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为0.2％的Chelex-100树 脂和摩尔浓度为2mM的醋酸钾。
实施例2
一种RNA核酸释放剂含有摩尔浓度为48mM的多果定、体积份数 为9.5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为9％的 乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为9％的Chelex-100树脂和 摩尔浓度为198mM的醋酸钾。
实施例3
一种RNA核酸释放剂含有摩尔浓度为1mM的多果定、体积份数 为9.5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为9％的 乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为9％的Chelex-100树脂和 摩尔浓度为198mM的醋酸钾。
实施例4
一种RNA核酸释放剂含有摩尔浓度为48mM的多果定、体积份数 为9.5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为9％的 乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为9％的Chelex-100树脂和 摩尔浓度为2mM的醋酸钾。
实施例5
(1)取HIV-1 RNA滴度为20IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA 滴度为50IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为500IU/mL的血清 标准品、HIV-1 RNA滴度为5000IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴 度为50000IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为500000IU/mL的 血清标准品、HIV-1 RNA滴度为5000000IU/mL的血清标准品、HIV- 1 RNA滴度为50000000IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为 100IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为25IU/mL的血清标准品、 和HIV-1 RNA滴度为10IU/mL的血清标准品各10μL，置于溶剂为 0.2mL的八连排管中；
(2)向步骤(1)所得的溶液中分别加入5μL实施例2制备的 RNA核酸释放剂，涡旋混匀，100℃水煮5min；
(3)取10μL步骤(2)所得的RNA作为模板，加入含有 Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl100mM、明胶0.2mg/mL、dATP、dGTP、 dCTP、dUTP各0.4mM、MgCl2 6mM的RT-PCR反应液12.5μL，含有 逆转录酶3U/μL、Taq DNA聚合酶2U/μL、UNG酶1U/μL的RT- PCR酶混合物0.5μL，和含有HIV-1 RNA上、下游引物各6.25μM、 HIV-1 RNA探针3.1μM的探针引物液2μL进行PCR扩增，其中 HIV-1 RNA上游引物为5’-TCTGGTAACTAGAGATCCCTCA-3’、HIV-1 RNA下游引物为5’-CTGTTCGGGCGCCACTGCTAG-3’、HIV-1 RNA探针 为5’FAM-ACCAITCTAGTCAGTGTGGAAAATC-TAMRA3’，反应程序为:37℃ 10min,50℃15min,95℃2min；94℃10s,60℃45s；扩增45个循环。
(4)采用PCR荧光探针法对HIV-1 RNA的扩增效果进行检测。
实施例6
(1)取HIV-1 RNA滴度为100IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA 滴度为50IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为25IU/mL的血清 标准品、和HIV-1 RNA滴度为10IU/mL的血清标准品各10μL，置 于溶剂为0.2mL的八连排管中；
(2)向步骤(1)所得的溶液中分别加入5μL实施例3制备的 RNA核酸释放剂，涡旋混匀，100℃水煮5min；
(3)采用和实施例5相同的条件对提取的HIV-1 RNA进行逆转 录和扩增。
(4)采用和实施例5相同的条件对HIV-1 RNA的扩增效果进行 检测。
实施例7
(1)取HIV-1 RNA滴度为100IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA 滴度为50IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为25IU/mL的血清 标准品、和HIV-1 RNA滴度为10IU/mL的血清标准品各10μL，置 于溶剂为0.2mL的八连排管中；
(2)向步骤(1)所得的溶液中分别加入5μL实施例4制备的 RNA核酸释放剂，涡旋混匀，100℃水煮5min；
(3)采用和实施例5相同的条件对提取的HIV-1 RNA进行逆转 录和扩增。
(4)采用和实施例5相同的条件对HIV-1 RNA的扩增效果进行 检测。
在血清标准品中HIV-1 RNA滴度相同的情况下，将实施例5-7 的实验数据进行比较，可以发现在扩增次数相同时，采用实施例5 中的Rn值最高，获得了最多的扩增产物，虽然当血清标准品中 HIV-1 RNA滴度为25IU/mL时，实施例6-7可以获得明显的扩增图 谱，但是，实施例6-7扩增得到的产物数量明显少于实施例5所得 到的产物数量。实施例5-7的区别在于RNA核酸释放剂中多果定和 醋酸钾的比例不同，实施例5中多果定和醋酸钾的物质量的比为 1:4.1，实施例6中多果定和醋酸钾的物质量的比为1:198，实施例 7中多果定和醋酸钾的物质量的比为1:0.04，结合实施例5获得了 最多的扩增产物这一实验结果，可知随着多果定和醋酸钾添加比的 升高，扩增产物的数量，先增多后减少。
对比例1
采用中国专利公布CN105441425A具体实施方式中的RNA提取液 和提取方法，对HIV-1 RNA滴度为100IU/mL的血清标准品、HIV-1 RNA滴度为50IU/mL的血清标准品、HIV-1RNA滴度为25IU/mL的血 清标准品和HIV-1 RNA滴度为10IU/mL的血清标准品进行RNA提取，采用和实施例5相同的条件对提取的HIV-1 RNA进行逆转录、扩增 和检测。
实施例5中HIV-1 RNA提取后的扩增效果如图1-6所示。图1- 3的实验数据显示采用本发明的释放剂对HIV-1 RNA进行提取后， 可以对HIV-1 RNA滴度为20-50000000IU/mL的血清标准品中的 HIV-1 RNA进行很好地扩增。图4中实验数据显示，采用本发明实 施例2的RNA核酸释放剂对HIV-1 RNA进行提取后，经过PCR扩增， 不存在HCV RNA、HBV RNA和TBDNA的检出，这说明采用本发明的 方法，不存在HCV RNA、HBV RNA和TB DNA对提取的HIV-1RNA扩 增和检测的影响，保证了检测结果的准确性。将图5和图6的实验 结果进行比较，可以发现，采用本发明是实施例2的释放剂，对 HIV-1 RNA进行提取，即使血清标准品中HIV-1RNA滴度为25IU/mL， 依旧可以实现对HIV-1 RNA较好的提取和扩增，而使用中国专利公 布CN105441425A中的实验方法，当血清标准品中HIV-1 RNA滴度为 25IU/mL时，无法实现对HIV-1 RNA的有效提取和扩增。当血清标 准品中HIV-1 RNA滴度为大于25IU/mL时，使用本发明的实施例5 的方法，能够获得更好的扩增效果，提高了相同条件下的扩增和检 测效率。

Claims (10)

1.一种RNA核酸释放剂，其特征在于，含有摩尔浓度为0.35-50mM的多果定、体积份数为1-10％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为1-10％的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为0.1-10％的Chelex-100树脂和摩尔浓度为1-200mM的醋酸钾。
2.根据权利要求1所述的RNA核酸释放剂，其特征在于，含有摩尔浓度为1-40mM的多果定、体积份数为1-8％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为3-9％的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为0.5-8％的Chelex-100树脂和摩尔浓度为5-150mM的醋酸钾。
3.根据权利要求1所述的RNA核酸释放剂，其特征在于，含有摩尔浓度为5-35mM的多果定、体积份数为2-5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为5-8％的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为2-6％的Chelex-100树脂和摩尔浓度为30-100mM的醋酸钾。
4.根据权利要求1所述的RNA核酸释放剂，其特征在于，含有摩尔浓度为10-30mM的多果定、体积份数为3-5％的聚乙二醇辛基苄基醚(TritonX-100)、体积份数为6-8％的乙基苄基聚乙二醇(NP-40)、体积份数为3-5％的Chelex-100树脂和摩尔浓度为40-90mM的醋酸钾。
5.一种使用权利要求1所述的RNA核酸释放剂对RNA进行提取的方法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用来提取细胞中的RNA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用来提取病毒中的RNA。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括将含有待提取RNA的样品和RNA核酸释放剂的混合液进行水煮的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的水煮温度为100℃。
10.一种RNA提取试剂盒，其特征在于：所述的RNA提取试剂盒包含权利要求1-4任意一项所述的RNA核酸释放剂。
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