CN105886494A - 一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒及制备方法和应用 - Google Patents

一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒及使用方法。本发明试剂盒包含反转录引物混合物、反转录缓冲液、反转录酶、PCR扩增缓冲液及DNA聚合酶。本发明根据甲型流感病毒设计一条反转录引物和一对通用型扩增引物，采用反转录、PCR扩增2个步骤完成。该试剂盒可对所有亚型的甲型流感病毒的8个基因节段同时进行扩增，具有较强的广谱性，可在6小时内完成反应，扩增产物可用于分子克隆、测序反应等，为甲型流感病毒全基因组的扩增提供了简单快速的手段。

Description

一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒及制备方法和应用。
技术背景
甲型流感病毒是严重危害人类、禽和动物健康的重要病原体。该病毒为单股负链RNA病毒，有8个基因节段。由于RNA聚合酶缺乏复制保真性，病毒基因在免疫或药物等压力下不断发生突变。另外，不同亚型的甲型流感病毒8个基因节段也可发生重配。这些遗传特征的改变可影响病毒的流行、致病能力及抗病毒敏感性。因而，监测病毒基因组特征是发现病毒变异，预测预警人类感染可能的重要手段。
既往监测流感病毒基因组序列一般通过特异引物分片段进行多次PCR扩增，扩增产物进行测序，然而将各个测序片段进行拼接得到流感病毒的全基因组信息，该过程需要设计多套引物、进行多次PCR扩增，操作较为繁琐，不利于大规模监测应用。因而，迫切需要建立一种简单的一次可扩增整个流感病毒基因组的方法。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是：针对目前扩增甲型流感病毒基因组需要多套引物、进行多次PCR扩增，操作较为繁琐的缺点，提供一种能一次性扩增整个流感病毒基因组的试剂盒，该试剂盒可对所有亚型的甲型流感病毒进行扩增，操作简单快速。
本发明的技术原理是基于甲流流感病毒的8个节段的5’端及3’端存在保守序列，针对保守序列设计特异引物，利用特异引物进行反转录形成cDNA，再以一对特异引物PCR同时扩增流感病毒的8个节段见附图1。
本发明试剂盒由反转录引物混合物、反转录缓冲液、反转录酶、PCR扩增缓冲液及DNA聚合酶组成。其中反转录引物混合物含有反转录引物和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物(dNTPs)，反转录缓冲液包含反转录酶缓冲液、RNA酶抑制剂。反转录酶为AMV反转录酶。PCR扩增缓冲液含有PCR扩增引物混合物及DNA聚合酶反应缓冲液。DNA聚合酶为具有3′→5′Exonuclease活性(Proof reading活性)的耐热性DNA聚合酶。
反转录引物为针对所有亚型流感病毒8个节段的特异引物,序列为5’-AGCRAAAGCAGG-3’，R代表A或G碱基。
PCR扩增引物为针对所有亚型流感病毒8个节段的特异引物,序列为：
1：5’-CTGTACGGTATGTGCGAAACAGCRAAAGCAGG-3’
2：5’-TCGTAAGGCTATCAGTCAGGAGTAGAAACAAGG-3’
其中下划线部分为固定序列，在其5’端进行的任何修饰、变异体、加接头等序列均为本发明保护范围。
本发明提供的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
核酸提取：用于核酸提取的样本包括鼻咽拭子、痰液、粪便、环境拭子、污水、动物组织等。使用QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN公司)或High Pure RNA Isolation Kit(Roche公司)提取核酸，提取核酸放置于-80℃保存或立即使用。
单链cDNA合成：取一200ul EP管，标记为A管，取8ul提取的核酸，加入2ul反转录引物混合物加入A管，混匀后放入PCR仪，65℃,5min,4℃冷却2min,在65℃加热，同时在另一200ul EP管，标记为B管，加入9ul反转录缓冲液，1ul反转录酶，混匀后加入冷却的A管中，混匀后放入PCR仪50℃，1h，70℃，15min。
PCR扩增：在200ul PCR扩增管中加入29.5ul PCR扩增缓冲液，上述单链cDNA合成20ul，DNA聚合酶0.5ul。混匀后短暂离心，放入PCR仪，按照以下PCR条件进行扩增，94℃5mim，35cycles:94℃30s；58℃1min；72℃7min；最后72℃10min；扩增产物暂时4℃保存或-20℃保存。
电泳检测扩增产物：制作1％琼脂糖凝胶:1g AgeRose+100ml 1×TAE加热溶解，每100ml凝胶中加入5ul Goldview染料，待凝胶完全溶解后倒入已插好小孔排梳的凝胶槽，凝胶槽须水平放置以免凝胶厚度不均。冷却后，拔出排梳并将凝胶放入电泳槽中，胶孔位于负极，确保凝胶完全浸于电泳液(1×TAE)。取5ul PCR反应产物与1ul 6×loading buffer混合，用加样枪吸取5ul混合液缓慢加入胶孔，首孔中加入5000bp DNA Ladder Marker。加样完毕后，接通电泳仪，设定恒压110V，电泳时间15min左右。15min后取出凝胶，置于波长254nm的紫外灯下，对照扩增片段大小观察结果。
扩增产物应用：本扩增产物可切割条带克隆入克隆载体，挑选单克隆进行下游分析，如克隆测序、表达分析等，也可将产物进行纯化，用作高通量测序模板。
本发明的有益效果是：本发明所提供试剂盒能一次性扩增整个流感病毒基因组，可对所有亚型的甲型流感病毒进行扩增，为扩增不同亚型流感病毒的全基因组提供了简单快速的通用工具，可在6小时内完成反应。另外由于本试剂盒含有的引物为甲型流感病毒特异性引物，极大提高了测序模板的特异性。
附图说明
图1：甲型流感病毒基因节段两端保守序列
图2：不同亚型流感病毒扩增电泳图
图3：禽流感H7N9病毒扩增产物高通量测序覆盖率图
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，实施例用于说明本发明而不是限制本发明的保护范围。
实施例1利用本试剂盒扩增不同亚型流感病毒全基因组
样本：流感病毒不同亚型毒株包括季节性H1N1、H3N2、H1N1 09pdm、禽流感H5N1、H5N8、H5N6、H7N9、H9N2、H9N9、H6N6、欧洲类禽猪流感H1N1。
核酸提取：使用QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN公司)或High PureRNA Isolation Kit(Roche公司)提取核酸，提取核酸放置于-80℃保存或立即使用。
单链cDNA合成：取一200ul EP管，标记为A管，取8ul提取的核酸，加入2ul反转录引物混合物加入A管，混匀后放入PCR仪，65℃,5min,4℃冷却2min,在65℃加热同时在另一200ul EP管，标记为B管,加入9ul反转录缓冲液，1ul反转录酶，混匀后加入冷却的A管中，混匀后放入PCR仪50℃,1h；70℃,15min。
PCR扩增：在200ul PCR扩增管中加入29.5ul PCR扩增缓冲液，上述单链cDNA合成20ul，DNA聚合酶0.5ul。混匀后短暂离心，放入PCR仪，按照以下PCR条件进行扩增。94℃5mim；35cycles:94℃30s；58℃1min；72℃7min；最后72℃10min；扩增产物进行电泳检测。
电泳检测扩增产物：制作1％琼脂糖凝胶:1g Agarose+100ml 1×TAE加热溶解，每100ml凝胶中加入5ul Goldview染料，待凝胶完全溶解后倒入已插好小孔排梳的凝胶槽，凝胶槽须水平放置以免凝胶厚度不均。冷却后，拔出排梳并将凝胶放入电泳槽中，胶孔位于负极，确保凝胶完全浸于电泳液(1×TAE)。取5ul PCR反应产物与1ul 6×loadingbuffer混合，用加样枪吸取5ul混合液缓慢加入胶孔，首孔中加入5000bp DNA Ladder Marker。加样完毕后，接通电泳仪，设定恒压110V，电泳时间15min左右。15min后取出凝胶，置于波长254nm的紫外灯下对照扩增片段大小观察结果。结果发现不同亚型流感病毒在1000-2500bp范围内出现5-6条特异性扩增条带(图2)，提示本试剂盒可扩增多种亚型流感病毒全基因组。
实施例2利用本试剂盒扩增不同禽H7N9流感病毒全基因组用作高通量测序
核酸提取：一例H7N9毒株使用QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN公司)或High Pure RNA Isolation Kit(Roche公司)提取核酸，提取核酸放置于-80℃保存或立即使用。
单链cDNA合成：取一200ul EP管，标记为A管，取8ul提取的核酸，加入2ul反转录引物混合物加入A管，混匀后放入PCR仪，65℃,5min,4℃冷却2min,在65℃加热同时在另一200ul EP管，标记为B管,加入9ul反转录缓冲液，1ul反转录酶，混匀后加入冷却的A管中，混匀后放入PCR仪50℃,1h；70℃,15min。
PCR扩增：在200ul PCR扩增管中加入29.5ul PCR扩增缓冲液，上述单链cDNA合成20ul，DNA聚合酶0.5ul。混匀后短暂离心，放入PCR仪，按照以下PCR条件进行扩增。94℃5mim；35cycles:94℃30s；58℃1min；72℃7min；最后72℃10min；扩增产物进行电泳检测。
电泳检测扩增产物：制作1％琼脂糖凝胶:1g Agarose+100ml 1×TAE加热溶解，每100ml凝胶中加入5ul Goldview染料，待凝胶完全溶解后倒入已插好小孔排梳的凝胶槽，凝胶槽须水平放置以免凝胶厚度不均。冷却后，拔出排梳并将凝胶放入电泳槽中，胶孔位于负极，确保凝胶完全浸于电泳液(1×TAE)。取5ul PCR反应产物与1ul 6×loading buffer混合，用加样枪吸取5ul混合液缓慢加入胶孔，首孔中加入5000bp DNA Ladder Marker。加样完毕后，接通电泳仪，设定恒压110V，电泳时间15min左右。15min后取出凝胶，置于波长254nm的紫外灯下对照扩增片段大小观察结果。出现扩增条带后进行产物纯化。
PCR产物纯化：使用Roche公司High Pure PCR Product Purification Kit，按试剂盒操作说明纯化PCR扩增产物，纯化产物定量后可直接用作高通量测序模板。
文库构建与测序：将PCR产物准确定量后，稀释成0.2ng/μl，以5μl作为测序模板，按照Nextera XT DNA Sample Preparation Kit说明构建测序文库。主要步骤包括：DNA的Tagmentation、PCR扩增、纯化、文库标化及混合。取600μl混合样加入MiSeq测序试剂样品孔，进行2×150bp配对末端测序。
序列分析：MiSeq高通量测序产生的数据以参考基因组进行Mapping拼接。
高通量测序结果显示:使用本试剂盒扩增的模板高通量测序可获得完整的病毒8个基因节段的序列，即全基因组序列。8个节段测序覆盖率图3如下。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种扩增甲型流感病毒全基因组的试剂盒，其特征是由反转录引物混合物、反转录缓冲液、反转录酶、PCR扩增缓冲液及DNA聚合酶组成，其中反转录引物混合物含有反转录引物和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物dNTPs，反转录缓冲液包含反转录酶缓冲液、RNA酶抑制剂；反转录酶为AMV反转录酶；PCR扩增缓冲液含有PCR扩增引物混合物及DNA聚合酶反应缓冲液；DNA聚合酶为具有3′→5′Exonuclease活性或Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶；
反转录引物为针对所有亚型流感病毒8个节段的特异引物,序列为5’-AGCRAAAGCAGG-3’，R代表A或G碱基；
PCR扩增引物为针对所有亚型流感病毒8个节段的特异引物，序列为：
1：5’-CTGTACGGTATGTGCGAAACAGCRAAAGCAGG-3’
2：5’-TCGTAAGGCTATCAGTCAGGAGTAGAAACAAGG-3’
其中下划线部分为固定序列，在其5’端进行的任何修饰或变异体或加接头序列均为本发明保护范围。
2.根据权利要求1所述一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒的制备方法，其特征是由以下步骤构成
(1)核酸提取：用于核酸提取的样本为鼻咽拭子或痰液或粪便或环境拭子或污水或动物组织，使用QIAamp Viral RNA mini kit或HighPure RNA Isolation Kit提取核酸，提取核酸放置于-80℃保存或立即使用；
(2)单链cDNA合成：取一200ul EP管，标记为A管，取8ul(1)提取的核酸，加入2ul反转录引物混合物加入A管，混匀后放入PCR仪，65℃,5min,4℃冷却2min,在65℃加热，同时在另一200ul EP管，标记为B管，加入9ul反转录缓冲液，1ul反转录酶，混匀后加入冷却的A管中，混匀后放入PCR仪50℃，1h，70℃，15min；
(3)PCR扩增：在200ul PCR扩增管中加入29.5ul PCR扩增缓冲液，上述(2)单链cDNA合成20ul，DNA聚合酶0.5ul；混匀后短暂离心，放入PCR仪，按照以下PCR条件进行扩增，94℃5mim，35cycles:94℃30s；58℃1min；72℃7min；最后72℃10min；扩增产物暂时4℃保存或-20℃保存；
(4)电泳检测扩增产物：制作1％琼脂糖凝胶:1g AgeRose+100ml1×TAE加热溶解，每100ml凝胶中加入5ul Goldview染料，待凝胶完全溶解后倒入已插好小孔排梳的凝胶槽，凝胶槽须水平放置以免凝胶厚度不均；冷却后，拔出排梳并将凝胶放入电泳槽中，胶孔位于负极，确保凝胶完全浸于1×TAE的电泳液；取5ul PCR反应产物与1ul6×loading buffer混合，用加样枪吸取5ul混合液缓慢加入胶孔，首孔中加入5000bp DNA Ladder Marker；加样完毕后，接通电泳仪，设定恒压110V，电泳时间15min左右，15min后取出凝胶，置于波长254nm的紫外灯下，对照扩增片段大小观察结果。
3.权利要求1所述一种扩增甲型流感病毒全基因组试剂盒的应用，其特征是扩增产物可切割条带克隆入克隆载体，挑选单克隆进行克隆测序或表达分析，也可将产物进行纯化，用作高通量测序模板。
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