WO2022114917A1 - 중저 비유전율을 가진 화합물을 포함한 핵산 결합 완충액을 이용한 핵산 분리방법 - Google Patents

중저 비유전율을 가진 화합물을 포함한 핵산 결합 완충액을 이용한 핵산 분리방법 Download PDF

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김명일
박상령
이나영
구건우
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Definitions

  • the present invention is first an acidic binding buffer using a compound having a low dielectric constant, or relative permittivity compared to ethanol, secondly a binding buffer and a washing buffer and an elution buffer ) relates to a nucleic acid separation method using a change in the pH of the liver, wherein a biological sample containing nucleic acids is dissolved using an extraction buffer (lysis buffer), and then an acidic binding buffer containing a compound having a lower relative permittivity than ethanol and silica magnetic particles After binding the nucleic acids to the magnetic particles by adding It relates to a nucleic acid isolation method.
  • a conventionally acceptable nucleic acid separation technique must satisfy the conditions that impurities must not be included, the separation efficiency must be high, and the structure or properties of the nucleic acid must not be changed during the separation process.
  • Nucleic acid separation methods currently used include a method using a filter column and a method using magnetic particles. Commonly, by adding a chaotropic salt such as guanidine hydrochloride in the binding step, hydrogen bonds of nucleic acids are broken while electrostatic By attraction, negatively charged nucleic acids on the surface are bound to magnetic particles or silica on the surface of the column filter. Nucleic acid separation using the most popular filter column is QIAGEN's spin column type, and pressure or centrifugation is essential, and in this process, the nucleic acid is combined with the entire surface area of the filter in the column.
  • a chaotropic salt such as guanidine hydrochloride
  • nucleic acid is eluted using a certain amount of nucleic acid elution solution.
  • the filter column method when a high concentration of nucleic acid is required, it is difficult to efficiently separate nucleic acids because it is impossible to elute the entire nucleic acid bound to the column with only a small amount of eluent. It is difficult to apply to diagnostic automation that requires a process to simultaneously separate many different biological samples.
  • the method using magnetic particles is a method of selectively separating and purifying only nucleic acids or proteins bound to magnetic particles using an external magnetic field by inducing binding between nucleic acids or proteins and magnetic particles by adding magnetic particles to the cell mixture.
  • a method for separating plasmid DNA from genomic DNA using magnetic particles (US Patent No. 5665554) is disclosed, and a biological target material and silica magnetic particles using silica magnetic particles A method of separating a target material using a magnetic field after forming a binder of the (US Patent No. 6027945) has already been reported.
  • the MagListoTM Magnetic Separation Rack (Bioneer) has a tube into which a biological sample can be injected, a tube fixing part where the tube is fixed, and a magnet fixing part that can provide a magnetic field from an external position corresponding to the tube.
  • the provided magnetic fixing unit is also designed to be easily detachable from the tube fixing unit with a magnet, so that the user can easily separate nucleic acids or proteins from biological materials.
  • the method using the magnetic particles has a disadvantage in that it is difficult to obtain a high concentration of nucleic acid required for molecular diagnosis.
  • the ethanol remaining on the magnetic particles must be completely removed. For this reason, a process of drying the magnetic particles is absolutely necessary, which inevitably increases the time required for extraction.
  • PCR enzyme chain reaction
  • U.S. Patent No. 6,914,137 discloses a method of extracting nucleic acids and other biological molecules from a biological sample, particularly blood, in contact with a solid phase under a first pH so that the biological molecules bind to the solid phase.
  • a method comprising the step of, extracting a biological molecule bound to a solid phase by elution using an elution solvent under a second pH. It refers to a method of making the solid support to have a positive charge and creating an environment of negative charge so that the nucleic acid is easily eluted.
  • the relative permittivity is a measure of the charge separation within a material, and in the case of an ionizable material, such as acetic acid, which is used the most in the present invention, in fact, the charge separation within a molecule will be greater than that of an alcohol-based compound that hardly ionizes, so this
  • the inventors referred to this value to search for other substances that can be used as a binding buffer other than ethanol.
  • nucleic acid binds to magnetic silica particles and elutes from an elution buffer of high pH in an acidic binding buffer and an acid wash buffer of a concentration below or above a specific standard using silica magnetic particles generally used. was found, and it was confirmed that nucleic acids can be isolated quickly and efficiently using this. In addition, since ethanol is not used, it was confirmed that more accurate results can be obtained in subsequent experiments, and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid separation and purification kit developed by applying a nucleic acid extraction method using a pH difference between buffers.
  • the present invention is (a) by adding magnetic particles to a biological sample containing a binding buffer and nucleic acids containing several acidic compounds having a lower relative permittivity than ethanol, and adding nucleic acids to the magnetic particles. bonding; and (b) washing the magnetic particles bound to the nucleic acid with an acidic washing buffer; and (c) applying a magnetic field to separate magnetic particles and purifying the nucleic acid in a high pH elution buffer.
  • the present invention provides a kit for separation and purification of nucleic acids using a nucleic acid extraction method using the pH difference between the binding and washing buffer and the elution buffer.
  • FIGS. 1 and 2 are diagrams analyzed using the Agilent 5200 Fragment Analyzer System by extracting total RNA from subcultured HeLa cells in order to examine the effectiveness of gene extraction when the binding buffer containing the acidic compound selected in the present invention is used. is shown.
  • Figure 4 is an experiment to confirm the gene extraction performance equivalence of the kit released by the existing technology and the invented solution composition. After purifying the viral nucleic acid using two binding buffers, a real-time reverse transcription polymerase chain reaction (Real Time RT- PCR) was performed and the results of the analysis are shown in graphs and tables.
  • Real Time RT- PCR Real Time reverse transcription polymerase chain reaction
  • the present invention uses the similarity to the previously used ethanol binding technique, and with reference to the relative permittivity table, candidate substances that can be applied to the binding buffer are selected because they are less harmful and have acidity.
  • candidate substances that can be applied to the binding buffer are selected because they are less harmful and have acidity.
  • a biological sample containing nucleic acid is added to the binding buffer and silica magnetic particles searched in this way to bind the nucleic acid, separate the magnetic particles by applying a magnetic field, and purify the nucleic acid in a high pH elution buffer, the nucleic acid is caused by the pH change. It was confirmed that nucleic acids can be separated quickly and efficiently without using ethanol, a nucleic acid washing solution, and a centrifuge by separating nucleic acids using a magnetic field.
  • the present invention provides a method for binding a nucleic acid by adding magnetic silica particles to a mixture of (a) a sample containing a nucleic acid, a binding buffer consisting of an aqueous solution of 0.175 M or more of acetic acid or an aqueous solution of phosphoric acid having a concentration of 2.18 M or less; (b) washing the magnetic particles bound to the nucleic acid in an acidic pH buffer; and (c) separating the magnetic particles and eluting the nucleic acid in a basic pH elution buffer.
  • the separation method does not use an alcohol precipitation method.
  • the magnetic particles used for nucleic acid extraction have a particle size of 50 nm to 1 ⁇ m, and magnetic particles used by those skilled in the art to separate and purify nucleic acids, not special magnetic particles that must be synthesized in a complicated manner. It can be used extensively.
  • AccuNanoBead TM manufactured by Bioneer may be used, but is not limited thereto.
  • the magnetic particles may be coated with a material selected from the group containing a silicic acid material consisting of silica, quartz, silicon, and the like.
  • the nucleic acid is preferably DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid), and examples include genomic DNA, plasmid DNA, phage DNA, recombinant DNA, mRNA, rRNA, tRNA, recombinant RNA, micro RNA, etc. may be, but is not limited thereto.
  • a change in pH of the binding buffer, the acidic pH buffer, and the basic pH elution buffer may be used.
  • a binding buffer containing an acidic compound including acetic acid and magnetic particles are added to the nucleic acid-containing biological sample to bind the nucleic acid. After that, only the supernatant is removed using a magnet, washed with an acidic washing buffer, the supernatant is removed using a magnet, and magnetic particles bound with nucleic acids are dissolved in a basic elution buffer to recover nucleic acids.
  • the steps (b) and (c) may apply a magnetic field using a magnet.
  • a sample containing a nucleic acid may be mixed with an acidic buffer of pH 1 to pH 6, and magnetic particles may be added to bind the nucleic acid to the magnetic particles.
  • the supernatant in the step (b), after attaching the magnetic particles using a magnet, the supernatant may be removed and washed with an acidic solution of pH 4 - pH 6.5.
  • the nucleic acid in the step (c), can be recovered by removing the supernatant using a magnet and dissolving the magnetic particles to which the nucleic acid is bound in a basic solution of pH 8.0 - pH 10.0.
  • an acidic protease or protease K may be further included in the mixture of the binding buffer.
  • kits for separation and purification of nucleic acids using a nucleic acid extraction method using a pH difference between buffers can further use an acidic protease and/or protease K to dissolve a sample in an acidic extraction buffer and extract nucleic acids with a difference in pH of the buffer.
  • Example 1 Comparison of nucleic acid extraction efficiency according to the concentration of acetic acid and phosphoric acid contained in the binding buffer (total RNA extraction from HeLa cells and Fragment Analyzer analysis)
  • RNA from HeLa cells was purified using a binding buffer using two acids, and then analyzed using an Agilent 5200 Fragment Analyzer System. As a comparison group, MagListoTM 5M Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, K-3613) was used.
  • a buffer solution containing Proteinase K and guanidine hydrochloride was added to the counted cells as above, mixed, and then the cells were lysed at 60 °C.
  • an acidic solution for each concentration and magnetic silica particles were added and mixed, so that the nucleic acids and magnetic particles were bound.
  • a low-concentration acidic solution pH 4.5 - 5.0
  • the nucleic acid was recovered by dissolving the silica magnetic particles to which the nucleic acid was bound in 100 ⁇ l of a tris-hydrogen chloride solution (pH 9.0 - 10.0).
  • the recovered nucleic acid solution was analyzed using an Agilent 5200 Fragment Analyzer System.
  • the reagent used was the Fragment Analyzer RNA Kit (Agilent, DNF-471).
  • both acetic acid and phosphoric acid are effective as compounds to be added to the binding buffer for nucleic acid binding, and at a specific concentration, it was confirmed that the method using an ethanol solution and cell nucleic acid extraction performance are equivalent.
  • Example 2 Comparison of extraction efficiency according to the composition of binding, washing and elution buffers (viral nucleic acid extraction and real-time polymerization chain reaction)
  • the nucleic acid extraction efficiency was compared using buffers of the composition to be described later in order to search for the optimal composition and verify the invention.
  • a real time reverse transcription polymerase chain reaction (Real Time RT-PCR) was performed.
  • a binding buffer and magnetic silica particles were added to the cell lysis solution and mixed, and then the nucleic acids and magnetic particles were allowed to bind. After removing only the supernatant using a magnet, it was washed again with a washing buffer. After removing the supernatant using a magnet, the nucleic acid was recovered by dissolving the magnetic silica particles bound to the nucleic acid in 100 ⁇ l of the elution buffer.
  • the binding buffer contained ethanol or acetic acid solution (12.5 v/v%), respectively. Ethanol containing a low concentration basic (pH 8.0) buffer or a low concentration acidic solution (pH 4.5-5.0) was used as the washing buffer.
  • DEPC-DW or a low-concentration tris hydrogen chloride buffer (pH 9.0-10.0) was used.
  • the recovered nucleic acid solution was added to AccuPower ® HIV-1 Quantitative RT-PCR Kit to perform real-time reverse transcription polymerase chain reaction. After adding 50 ⁇ l of nucleic acid solution to AccuPower ® HIV Quantitative RT-PCR Kit, completely seal the top surface of the diagnostic kit using an adhesive sealing film and apply ExiSpin® (Bioneer, BS-010211-AAL). The diagnostic kit composition and the nucleic acid were perfectly mixed using The reaction conditions of Real-Time RT-PCR were the same as in Table 1, and Exicycler TM 96 (Bioneer, A-2060) was used for the real-time nucleic acid amplification reaction.
  • Example 3 Comparison of methods for extracting nucleic acids using an ethanol solution and an acidic solution (viral nucleic acid extraction and real-time polymerization chain reaction)
  • Nucleic acid using the existing viral nucleic acid extraction kit ( AccuPrep ® Viral RNA Extraction Kit, Bioneer, K-3033, described as 'ethanol solution') and acidic buffer (described as 'acid solution') released by the company Extraction efficiencies were compared.
  • a weakly acidic binding buffer containing a low concentration of acetic acid (12.5 v/v%) and magnetic silica particles were added to the cell lysis solution and mixed, and then the nucleic acids and the magnetic particles were allowed to bind. After removing only the supernatant using a magnet, it was washed again with a low concentration, weakly acidic (pH 4.5-5.0) wash buffer. After removing the supernatant using a magnet, the nucleic acid was recovered by dissolving the magnetic nucleic acid-bound silica particles in 100 ⁇ l of a low concentration tris hydrogen chloride buffer (pH 9.0-10.0).
  • the recovered nucleic acid solution was added to AccuPower ® HIV-1 Quantitative RT-PCR Kit to perform real-time reverse transcription polymerase chain reaction. After adding 50 ⁇ l of nucleic acid solution to AccuPower ® HIV Quantitative RT-PCR Kit, completely seal the top surface of the diagnostic kit using an adhesive sealing film and apply ExiSpin TM (Bioneer, BS-010211-AAL). The diagnostic kit composition and the nucleic acid were perfectly mixed using The reaction conditions of Real-Time RT-PCR were the same as in Table 1, and Exicycler TM 96 (Bioneer, A-2060) was used for the real-time nucleic acid amplification reaction.
  • Example 4 Comparison of extraction methods using acidic proteolytic enzyme (hereinafter, acid protease) and Proteinase K (viral nucleic acid extraction and real-time polymerization chain reaction)
  • acid protease acidic proteolytic enzyme
  • Proteinase K viral nucleic acid extraction and real-time polymerization chain reaction
  • E-gene RNA positive materials of SARS-CoV-2 were included, and the total volume was diluted in DEPC-DW so that 400 ⁇ l per test was used.
  • Proteinase K and Poly(A) were added to the extraction buffer containing the guanidine salt compound, and the above-described extraction buffer containing Proteinase K was mixed with the solution containing the positive material. The mixture to which Proteinase K was added was dissolved at 60 °C for 10 minutes.
  • an extraction buffer prepared by mixing guanidine salt compound with acetic acid first, acidic protease and Poly(A) were added, and an extraction buffer containing acidic protease was mixed with a solution containing a positive material. The mixture to which acidic protease was added was dissolved at room temperature for 10 minutes.
  • acetic acid solution and magnetic silica particles were added, and to the sample to which acidic protease was added, only silica magnetic particles were added and mixed, and then the nucleic acid and magnetic particles were combined. After removing only the supernatant using a magnet, it was washed again with a low-concentration acidic solution (pH 4.5 - 5.0). After removing the supernatant using a magnet, the nucleic acid was recovered by dissolving the silica magnetic particles to which the nucleic acid was bound in 100 ⁇ l of a tris-hydrogen chloride solution (pH 9.0 - 10.0).
  • the recovered nucleic acid solution was added to AccuPower ® SARS-CoV-2 Real-Time RT-PCR Kit to perform real-time reverse transcription polymerase chain reaction.
  • Prepare a tube for qPCR add 5 ⁇ l of nucleic acid solution to PCR mix of AccuPower ® SARS-CoV-2 Real-Time RT-PCR Kit, mix as described in the manual, mix by pipetting, and apply adhesive sealing film ) was used to completely seal the top surface of the diagnostic kit, and the diagnostic kit composition and nucleic acid were perfectly mixed using ExiSpin TM (Bioneer, BS-010211-AAL).
  • the reaction conditions of Real-Time RT-PCR were performed according to Table 2, and Exicycler TM 96 (Bioneer, A-2060) was used for the real-time nucleic acid amplification reaction.

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Abstract

본 발명은 초산이나 인산을 사용한 결합 완충액 및 결합, 세척 완충액과 용출 완충액 간의 pH 차이를 이용한 핵산 분리방법에 관한 것으로, 초산, 인산 등을 포함한 결합 완충액이 첨가된 핵산을 포함하는 생체시료에 실리카 자성입자를 첨가하여 자성입자에 핵산을 결합시키고 난 다음, 자기장을 인가하여 자성입자를 분리하고 염기성 pH 용출 완충액에서 핵산을 정제하는 pH 차이를 이용한 것으로, 원심분리법이나 중력분리법보다 핵산을 신속하고 효율적으로 분리할 수 있다. 또한 에탄올을 사용하지 않으므로 고순도의 핵산을 분리, 정제하여 후속 실험에서 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다.

Description

중저 비유전율을 가진 화합물을 포함한 핵산 결합 완충액을 이용한 핵산 분리방법
본 발명은 첫째로 에탄올에 비해 낮은 비유전율(dielectric constant, 혹은 relative permittivity)을 가진 화합물이 사용된 산성 결합 완충액(binding buffer), 둘째로 결합 완충액 및 세척 완충액(washing buffer)과 용출 완충액(elution buffer) 간의 pH 변화를 이용한 핵산 분리방법에 관한 것으로서, 핵산을 포함하는 생체시료를 추출 완충액(lysis buffer)을 사용하여 용해시킨 후, 에탄올보다 낮은 비유전율을 가진 화합물을 포함한 산성 결합 완충액과 실리카 자성입자를 첨가하여 자성입자에 핵산을 결합시키고 난 다음, 낮은 pH의 세척 완충액으로 세척을 진행하고 자기장을 인가하여 자성입자를 분리하고 높은 pH의 용출 완충액에서 핵산을 정제하는 단계를 포함하는 자성입자를 이용한 핵산 분리방법에 관한 것이다.
생물학적 물질에서 신속하게 고순도의 핵산을 분리, 정제하는 방법은 분자 생물학과 생화학을 바탕으로 하는 생물학 연구 및 질병을 진단하거나 감염 여부를 확인하는 진단 프로세스에 있어서 중요하다. 이를 위해 세포 용해 용액 내에 포함된 여러 종류의 물질들로부터 핵산을 선택적 및 효과적으로 재현성 있게 분리하는 방법에 대한 다양한 연구가 이루어져 온 바 있다. 통상적으로 받아들여질 만한 핵산 분리 기법은 불순물이 포함되지 말아야 하고 분리 효율이 높아야 하며, 분리하는 과정에서 핵산의 구조나 성질을 변화시키지 말아야 한다는 조건을 충족하여야만 한다.
생물학적 물질로부터 핵산을 분리하기 위해서는 세포를 용해하고 세포 용해액으부터 원하는 핵산만을 단리하고 마지막으로 핵산을 용출해야 하는데, 기존의 핵산 분리 방법으로는 페놀/클로로포름을 이용하는 방법, 실리카 수지를 이용하는 방법, 친화성 수지를 이용하는 방법, 이온 교환수지 크로마토그래피법 그리고 최근에 대두되고 있는 자성 입자를 사용하는 방법이 있다. 이러한 방법은 미국등록특허 제4,923,978호, 미국등록특허 제5,057,426호, 미국등록특허 제7,173,124호, 유럽등록특허 제0796327호 등에 기술되어 있으며, 주로 고체 지지체상에 핵산을 결합시킨 후 핵산을 분리하기 위해 특정 용매를 사용하는 방법이다.
현재 사용하고 있는 핵산 분리 방법으로는 필터 칼럼을 사용하는 방식과 자성입자를 사용하는 방식이 있으며, 공통적으로 구아니딘 염산 등의 chaotropic salt를 결합 단계에서 첨가함으로써, 핵산의 수소결합을 분쇄하는 한편 정전기적 인력으로 표면에 음전하를 띤 핵산과 자성입자 혹은 칼럼 필터 표면의 실리카를 결합시킨다. 가장 대중적으로 사용되는 필터 칼럼을 사용하는 핵산 분리는 QIAGEN 사의 스핀 컬럼 형식으로, 가압 또는 원심 분리의 과정이 필수적이고 이 과정에서 핵산이 칼럼 내 필터의 표면적 전체와 결합하게 된다. 이후 핵산을 용출해 내기 전 에탄올 처리를 하고 컬럼을 완벽하게 건조한 다음, 일정량의 핵산 용출 용액을 사용하여 핵산을 용출하는 것이다. 그러나 필터 컬럼 방식의 경우, 고농도의 핵산을 필요로 하는 경우 소량의 용출액만으로 컬럼에 결합된 핵산 전체를 용출시키지 못하므로 효율적으로 핵산을 분리하기 어려운 단점이 있으며, 핵산분리 시 원심분리 또는 가압 등의 과정이 필요하여 많은 다른 생체 시료를 동시에 분리해내야 하는 진단자동화에 적용하기에는 어려움이 있다.
자성입자를 이용한 방법은 세포 혼합물에 자성입자를 첨가해줌으로써 핵산 또는 단백질과 자성 입자 사이에 결합을 유도하여 결합하게 하고 외부 자기장을 이용하여 자성입자와 결합된 핵산 또는 단백질만을 선택적으로 분리 정제하는 방법으로, 게놈 DNA(genomic DNA)에서 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 자성 입자를 이용하여 분리하는 방법(미국 등록특허 제 5665554 호)이 개시되어 있고, 실리카 자성입자를 이용하여 생물학적 타겟 물질과 실리카 자성입자의 결합체를 형성한 후 자기장을 이용하여 타겟 물질을 분리하는 방법(미국 등록특허 제6027945 호) 등이 이미 보고되어 있다.
따라서, 자성입자를 이용하여 세포 혼합물에서 핵산 또는 단백질을 분리하는 연구가 활발히 진행 중이며(미국등록특허 제9,163,272호, WO2015/088201), 기존의 분리 방법들은 자동화하기 어려우나 자성 입자를 사용하는 경우에는 자동화 시스템을 적용하기 쉬워 자성입자를 이용하여 핵산 또는 단백질의 정제 및 분리를 자동화하는 시스템도 이미 개발되어 있다(한국등록특허 제1555534호, 한국등록특허 제1443727호). 자성입자를 이용한 방법은 세포 혼합물에 자성입자를 첨가함으로써 핵산과 자성입자 사이에 결합을 유도하여 결합체를 형성시킨 후 외부 자기장을 이용하여 자성입자와 결합된 핵산만을 선택적으로 분리시키는 방법으로 일반적으로 핵산만을 선택적으로 분리, 정제하는데 사용되는 자성입자의 크기는 수백 nm 정도가 적당하다고 알려져 있으나, 최근에는 수십 나노미터 이하 크기의 작은 자성입자를 사용하는 기법도 보고되고 있다.
생물학적 시료에서 자성입자와 결합된 핵산을 신속하게 분리하기 위해 외부에서 자기장을 보다 손쉽게 제공해주기 위한 다양한 제품도 출시되고 있다. 일례로 MagListo™ Magnetic Separation Rack(바이오니아 사)은 생물학적 시료를 주입할 수 있는 튜브와 튜브가 고정되는 튜브고정부가 있으며 튜브와 상응하는 외부 위치에서 자기장을 제공할 수 있는 자석고정부가 있다. 이때 제공되는 자석고정부도 튜브고정부와 용이하게 자석으로 탈부착이 가능하게 설계되어 있어 사용자가 손쉽게 생물학적 물질에서 핵산 또는 단백질을 분리할 수 있는 장점이 있다.
그러나 상기 자성입자를 사용하는 방법에는 분자진단에 필요한 고농도의 핵산을 수득하기 어렵게 하는 단점이 존재하는데, 핵산 분리 과정에서 에탄올이 포함된 세척 용액을 사용한 후에는 핵산 추출의 가장 일반적인 목적 중 하나인 중합효소연쇄반응(PCR)이 저해되는 것을 방지하기 위해 자성입자에 잔류한 에탄올을 완전히 제거해야만 한다. 이 때문에 자성입자를 건조시키는 과정이 반드시 필요하며, 이는 추출에 소요되는 시간을 필연적으로 늘린다. 또한 이 과정에서 에탄올이 완벽하게 제거되지 않을 경우, PCR이 이루어지지 않아 정확한 결과를 얻을 수 없을 뿐 아니라 생체시료의 손실이 따르게 된다.
위에서 언급한 자성입자의 단점을 개선하기 위하여 미국등록특허 제6,914,137호에서는 생물학적 시료, 특히 혈액으로부터 핵산 및 기타 다른 생물학적 분자를 추출하는 방법으로 제1 pH 하에서 고체상과 접촉시켜 생물학적 분자가 고체상에 결합하도록 하는 단계, 제2 pH 하에서 용출 용매를 사용하는 용출에 의해 고체상에 결합된 생물학적 분자를 추출하는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있으며, 미국등록특허 제8,067,579호에도 고형 지지체로 핵산이 쉽게 결합할 수 있도록 고형 지지체가 양전하(positive charge)를 띄도록 하고, 핵산이 쉽게 용출되도록 음전하(negative charge)의 환경을 만들어주는 방법에 대해 언급하고 있다.
이외에 본 발명자들은 핵산 결합 완충액에 혼합되는 화합물의 비유전율 수치에 주목하였다. 비유전율은 한 물질 내의 전하 분리를 나타내는 척도로, 이온화될 수 있는 물질, 가령 본 발명에서 가장 많이 사용한 초산의 경우 실제로 분자 내의 전하 분리는 거의 이온화되지 않는 알코올 계열의 화합물에 비해 더 커질 것이므로, 본 발명자들은 이 수치를 에탄올 외에 결합 완충액으로 사용할 수 있는 다른 물질을 탐색하기 위해 참고하였다. 기존에 핵산 결합용 시약으로서 일반적으로 사용하는 에탄올 혹은 이소프로판올의 비유전율을 찾아보고, 이들에 비해 낮은 비유전율을 가지면서 진단용으로 사용할 수 있을 만큼 유해하지 않은 몇 가지 후보물질을 선정하여 실험에 이용하였다. 이 수치는 핵산 결합 정도의 절대적 척도로 간주되거나 검증된 것은 아니며, 결합 완충액에 사용할 화합물의 탐색에 참고하기 위해서만 이용되었다.
결론적으로 본 발명자들은 일반적으로 사용하는 실리카 자성입자를 이용하여 특정 기준 이하, 혹은 이상 농도의 산성 결합 완충액 및 산성 세척 완충액 하에서 핵산이 실리카 자성입자에 결합하고 높은 pH의 용출 완충액에서 핵산이 용출되는 현상을 발견하였으며, 이를 이용하여 핵산을 신속하고 효율적으로 분리할 수 있음을 확인하였다. 또한 에탄올을 사용하지 않으므로 후속 실험에서 보다 정확한 결과를 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 완충액들 간의 pH 차이를 이용한, 생체 시료로부터 핵산을 종전보다 신속하고 효율적으로 분리할 수 있는 핵산 추출법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 완충액들 간의 pH 차이를 이용한 핵산 추출법을 적용하여 개발한 핵산 분리 정제용 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은(a) 에탄올에 비해 낮은 비유전율을 가졌던 몇 가지의 산성 화합물을 포함하고 있는 결합 완충액과 핵산을 포함하는 생체시료에 자성입자를 첨가하여 자성입자에 핵산을 결합시키는 단계; 및 (b) 핵산과 결합되어 있는 자성입자를 산성 세척 완충액으로 세척하는 단계; 및 (c) 자기장을 인가하여 자성입자를 분리하고 높은 pH의 용출 완충액에서 핵산을 정제하는 단계를 포함하는 완충액의 pH 차이를 이용한 핵산 분리방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 결합 및 세척 완충액과 용출 완충액의 pH 차이를 이용한 핵산 추출법을 이용한 핵산 분리 정제용 키트를 제공한다.
도 1 및 도 2는 본 발명에서 선정한 산성 화합물을 도입한 결합 완충액을 사용했을 경우의 유전자 추출 유효성을 알아보기 위하여 계대배양한 HeLa 세포에서 total RNA를 추출하여 Agilent 5200 Fragment Analyzer System을 이용해 분석한 그림을 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 조성의 결합, 세척, 용출 완충액을 이용하여 산성 결합-산성 세척-염기성 용출 가설의 유효성을 검증하기 위한 실험으로, 총 여덟 가지 완충액 조합을 이용하여 바이러스 핵산을 추출, 정제한 후 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real Time RT-PCR)을 수행한 분석 결과를 그래프 및 표로 나타낸 것이다.
도 4는 기존 기술로 출시한 키트와 발명한 용액 조성의 유전자 추출 성능 동등성을 확인하기 위한 실험으로, 두 가지 결합 완충액을 이용하여 바이러스 핵산을 정제한 후 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real Time RT-PCR)을 수행한 분석 결과를 그래프 및 표로 나타낸 것이다.
도 5는 산성 프로테아제를 사용하여 시료를 용해하였을 때의 추출 효율을 단백분해효소 K와 비교하여 확인하기 위한 실험으로, 이를 이용하여 바이러스 핵산을 정제한 후 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행한 분석 결과를 그래프 및 표로 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 기존에 사용하던 에탄올 결합 기법과의 유사성을 이용한 것으로, 비유전율 표를 참조하여, 유해성이 적으며 산성을 띠고 있어 결합 완충액에 적용할 수 있는 후보 물질들을 선정하였다. 이렇게 탐색한 결합 완충액과 실리카 자성입자에 핵산을 함유한 생체시료를 첨가하여 핵산을 결합시키고, 자기장을 인가하여 자성입자를 분리하고 높은 pH의 용출 완충액에서 핵산을 정제할 경우, pH 변화에 의해 핵산을 분리해낼 수 있으며, 자기장을 이용하여 핵산을 분리함으로써 핵산 세척 용액인 에탄올과 원심분리기 등을 사용하지 않아 핵산을 신속하고 효율적으로 분리할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 핵산이 포함된 시료, 0.175 M 이상의 초산 수용액 혹은 2.18 M 이하 농도의 인산 수용액으로 이루어진 결합 완충액의 혼합물에 실리카 자성 입자를 첨가하여 핵산을 결합하는 단계; (b) 핵산과 결합된 자성입자를 산성 pH 완충액에서 세척하는 단계; 및 (c) 자성입자를 분리하고 염기성 pH 용출 완충액에서 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 완충액 간의 pH 차이를 이용한 핵산 분리방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 분리법은 알코올 침전법을 사용하지 않는다.
본 발명에 있어서, 핵산 추출에 사용되는 자성입자는 입자크기가 50 nm 내지 1 ㎛이며, 복잡한 방식으로 합성해야만 하는 특수한 자성입자가 아니라 통상의 기술자들이 핵산을 분리, 정제하기 위해 사용하는 자성입자를 광범위하게 사용할 수 있다. 특히, 바이오니아에서 제조되는 AccuNanoBead™을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 자성입자는 실리카, 석영, 실리콘 등으로 구성된 규산 물질을 함유한 군에서 선택된 물질로 코팅될 수 있다.
상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid)가 바람직하며, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, 유전자 재조합 DNA, mRNA, rRNA, tRNA, 유전자 재조합 RNA, 마이크로 RNA(micro RNA) 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 완충액 및 상기 산성 pH 완충액과 상기 염기성 pH 용출 완충액의 pH 변화를 이용할 수 있다.
이 핵산 함유 생체시료에 초산을 비롯한 산성 화합물을 포함하고 있는 결합 완충액과 자성입자를 첨가하여 핵산을 결합시킨다. 그 후에 자석을 이용하여 상등액만 제거하고 산성 세척 완충액으로 세척한 다음, 자석을 이용하여 상등액을 제거하고 핵산이 결합된 자성입자를 염기성 용출 완충액에 녹여 핵산을 회수할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계는 자석을 이용하여 자기장을 인가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 핵산이 포함된 시료를 pH 1 ~ pH 6의 산성 완충액과 혼합하고, 자성입자를 첨가하여 핵산을 자성입자에 결합시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 자석을 이용하여 자성입자를 부착한 뒤 상등액을 제거하고 pH 4 - pH 6.5의 산성용액으로 세척할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 자석을 이용하여 상등액을 제거하고 핵산이 결합된 자성입자를 pH 8.0 - pH 10.0의 염기성 용액에 녹여 핵산을 회수할 수 있다.
본 발명에 잇어서, 상기 결합 완충액의 혼합물에 산성 프로테아제 또는 프로테아제 K를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 관점은 완충액들 간의 pH 차이를 이용한 핵산 추출법을 이용한 핵산 분리 정제용 키트에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 키트는 산성 프로테아제 및/또는 프로테아제 K를 추가로 사용하여 산성 추출 완충액에서 시료를 용해하고 완충액의 pH 차이로 핵산을 추출할 수 있다.
이하의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 실시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 결합 완충액에 포함된 초산과 인산의 농도에 따른 핵산 추출 효율의 비교(HeLa 세포에서의 total RNA 추출 및 Fragment Analyzer 분석)
결합 완충액으로서 사용할 후보물질로 선정된 초산 및 인산의 유효성을 확인하기 위하여 산성 용액 제조에 초산 및 인산을 사용하였을 경우, 또 그 농도를 달리하였을 경우의 핵산 추출 효율을 비교하였다. 두 가지 산을 사용한 결합 완충액을 사용하여 HeLa 세포의 total RNA를 정제한 후 Agilent 5200 Fragment Analyzer System을 사용하여 분석하였다. 비교군으로는 MagListo™ 5M Universal RNA Extraction Kit(Bioneer, K-3613)가 사용되었다.
생체 시료로는 Hela 세포를(써나젠테라퓨틱스 연구소로부터 분양) 계대배양하여 세포 1,000,000개를 계수하여 사용하였다. 세포 계대배양에는 MEM Eagle with EBSS and L-Glutamine(Lonza, 12-511F), 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, WELGENE, S001-01), DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, WELGENE, LB 001-01), TrypLE™ Express(Gibco, 12605-010)을 사용하였으며 배양은 37 ℃의 이산화탄소 인큐베이터에서 이루어졌다.
위 개수만큼 계수된 세포에 Proteinase K, 구아니딘 염산을 포함한 완충액을 첨가하여 혼합한 후 60 ℃에서 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해 용액에 각 농도별 산성 용액과 실리카 자성입자를 첨가하여 섞어준 후 핵산과 자성입자가 결합하도록 하였다. 자석을 이용하여 상등액만 제거한 후 저농도의 산성 용액(pH 4.5 - 5.0)을 이용해 다시 한 번 씻어 주었다. 자석을 이용하여 상등액을 제거한 후 핵산이 결합된 실리카 자성입자를 100 ㎕의 트리스염화수소 용액(pH 9.0 - 10.0)에 녹여 핵산을 회수하였다.
회수한 핵산 용액은 Agilent 5200 Fragment Analyzer System을 이용하여 분석하였다. 사용된 시약은 Fragment Analyzer RNA Kit(Agilent, DNF-471)이었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 핵산 결합을 위해 결합 완충액에 첨가할 화합물로서 초산, 인산 모두 유효하며, 특정 농도에서는 에탄올 용액을 사용하는 방법과 세포 핵산 추출 성능 면에서 동등함을 확인하였다.
실시예 2: 결합, 세척, 용출 완충액의 조성에 따른 추출 효율 비교(바이러스 핵산 추출 및 실시간 중합연쇄반응)
최적의 조성을 탐색하고, 발명 내용을 검증하기 위해 후술할 조성의 완충액들을 사용하여 핵산 추출 효율을 비교하였다. 결합 완충액, 세척완충액, 용출 완충액을 각각 2종류씩 이용하여 만들어진 완충액 조합 8종류를 사용하여서 바이러스 핵산을 정제한 후 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real Time RT-PCR)을 수행하였다.
생체 시료로는 사람의 혈청인 정상 인간 혈청(Normal Human Serum, Merck사, S1-LITER)과 HIV-1(WHO International Standard 3rd HIV-1 International Standard, NIBSC사, NIBSC code: 10/152)을 사용하였다.
혈청 100 ㎕에 HIV-1 1000 및 200 I.U.(International Unit)가 포함되도록 혼합한 후 상기 혼합물에 구아니딘 염산과 Proteinase K를 첨가하여 60 ℃에서 세포를 용해시켰다.
상기 세포 용해 용액에 결합 완충액과 실리카 자성입자를 첨가하여 섞어준 후 핵산과 자성입자가 결합하도록 하였다. 자석을 이용하여 상등액만 제거한 후 세척 완충액을 이용해 다시 한 번 씻어 주었다. 자석을 이용하여 상등액을 제거한 후 핵산이 결합된 실리카 자성입자를 100 ㎕의 용출 완충액에 녹여 핵산을 회수하였다. 결합 완충액은 각각 에탄올 혹은 초산 용액(12.5 v/v%)을 포함하고 있었다. 세척 완충액으로는 저농도의 염기성(pH 8.0) 완충액을 포함한 에탄올 혹은 저농도의 산성 용액(pH 4.5-5.0)을 사용하였다. 용출 완충액으로는 DEPC-DW 혹은 저농도의 트리스염화수소 완충액(pH 9.0-10.0)을 사용하였다.
회수한 핵산 용액은 AccuPower ® HIV-1 Quantitative RT-PCR Kit에 첨가하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. AccuPower ® HIV Quantitative RT-PCR Kit에 핵산 용액 50㎕를 첨가 후 접착 실링필름(adhesive sealing film)을 이용하여 진단 키트 상단면을 완전히 실링(sealing)하고 ExiSpin쪠(Bioneer, BS-010211-AAL)을 이용하여 진단키트 조성물과 핵산을 완벽하게 혼합하였다. Real-Time RT-PCR의 반응 조건은 표 1와 동일하게 진행되었으며, 실시간 핵산 증폭 반응을 위해서는 Exicycler™ 96(Bioneer, A-2060)을 이용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 산성 결합 완충액, 산성 세척 완충액, 염기성 용출 완충액으로 핵산을 결합하는 방법이 바이러스 핵산 추출 성능면에서 다른 모든 조성에 비해 우월함을 확인하였다.
Figure PCTKR2021017860-appb-img-000001
실시예 3: 에탄올 용액과 산성 용액을 사용하여 핵산을 추출하는 방법의 비교(바이러스 핵산 추출 및 실시간 중합연쇄반응)
자사에서 출시한 기존 바이러스 핵산 추출키트(AccuPrep ® Viral RNA Extraction Kit, Bioneer, K-3033, '에탄올 용액'으로 기술함)과 산성 완충액을 기용한 조성을('산성 용액'으로 기술함) 사용하여 핵산 추출 효율을 비교하였다.
생체 시료로는 사람의 혈청인 정상 인간 혈청(Normal Human Serum, Merck사, S1-LITER)과 HIV-1(WHO International Standard 3rd HIV-1 International Standard, NIBSC사, NIBSC code: 10/152)을 사용하였다.
혈청 100 ㎕에 HIV-1 1000 및 200 I.U.(International Unit)가 포함되도록 혼합한 후 상기 혼합물에 구아니딘 염산과 Proteinase K를 첨가하여 60 ℃에서 세포를 용해시켰다.
상기 세포 용해 용액에 저농도의 초산을(12.5 v/v%) 포함한 약산성 결합 완충액과 실리카 자성입자를 첨가하여 섞어준 후 핵산과 자성입자가 결합하도록 하였다. 자석을 이용하여 상등액만 제거한 후 저농도, 약산성의(pH 4.5-5.0) 세척 완충액을 이용해 다시 한 번 씻어 주었다. 자석을 이용하여 상등액을 제거한 후 핵산이 결합된 실리카 자성입자를 100 ㎕의 저농도의 트리스염화수소 완충액(pH 9.0-10.0)에 녹여 핵산을 회수하였다.
회수한 핵산 용액은 AccuPower ® HIV-1 Quantitative RT-PCR Kit에 첨가하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. AccuPower ® HIV Quantitative RT-PCR Kit에 핵산 용액 50㎕를 첨가 후 접착 실링필름(adhesive sealing film)을 이용하여 진단 키트 상단면을 완전히 실링(sealing)하고 ExiSpin™(Bioneer, BS-010211-AAL)을 이용하여 진단키트 조성물과 핵산을 완벽하게 혼합하였다. Real-Time RT-PCR의 반응 조건은 표 1와 동일하게 진행되었으며, 실시간 핵산 증폭 반응을 위해서는 Exicycler™ 96(Bioneer, A-2060)을 이용하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 산성 용액 조성을 사용하여 핵산을 추출하는 방법이 바이러스 핵산 추출 성능면에서 에탄올을 사용한 방법과 동등하거나 좋은 효율을 보임을 확인하였다.
실시예 4: 산성 단백질 가수분해 효소(이하 산성 프로테아제)와 Proteinase K를 사용한 추출 방법의 비교(바이러스 핵산 추출 및 실시간 중합연쇄반응)
산성 프로테아제와 Proteinase K를 사용하였을 때의 추출 효율을 비교하였다. 두 가지 단백질 분해 효소를 첨가한 용해 완충액을 이용하여 바이러스 핵산을 정제한 후 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real Time RT-PCR)을 수행하였다.
시료로는 SARS-CoV-2의 E-gene RNA 양성물질 40000 개가 포함되도록 하여, 총 부피가 시험당 400 ㎕이 되도록 DEPC-DW에 희석시켜 사용하였다. 구아니딘염 화합물이 포함된 추출 완충액에 Proteinase K와 Poly(A)를 첨가하여, 양성물질이 포함된 용액에 상기한 Proteinase K가 포함된 추출 완충액을 혼합하였다. Proteinase K를 첨가한 혼합물을 60 ℃에서 10분간 용해시켰다. 한편 구아니딘염 화합물에 초산을 먼저 혼합한 추출 완충액을 준비하여 산성 프로테아제와 Poly(A)를 첨가하였으며, 양성물질이 포함된 용액에 산성 프로테아제가 포함된 추출 완충액을 혼합하였다. 산성 프로테아제를 첨가한 혼합물은 상온에서 10분간 용해시켰다.
상기 세포 용해 용액에 단백분해효소 K를 첨가한 샘플은 초산용액과 실리카 자성입자를, 산성 프로테아제를 첨가한 샘플은 실리카 자성입자만을 첨가하여 섞어준 후 핵산과 자성입자가 결합하도록 하였다. 자석을 이용하여 상등액만 제거한 후 저농도의 산성 용액(pH 4.5 - 5.0)을 이용해 다시 한 번 씻어 주었다. 자석을 이용하여 상등액을 제거한 후 핵산이 결합된 실리카 자성입자를 100 ㎕의 트리스염화수소 용액(pH 9.0 - 10.0)에 녹여 핵산을 회수하였다.
회수한 핵산 용액은 AccuPower ® SARS-CoV-2 Real-Time RT-PCR Kit에 첨가하여 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. qPCR용 튜브를 준비하고, 매뉴얼에 기재된 대로 혼합한 AccuPower ® SARS-CoV-2 Real-Time RT-PCR Kit의 PCR mix에 핵산 용액 5 ㎕를 첨가하여 파이펫팅으로 혼합하고 접착 실링필름(adhesive sealing film)을 이용하여 진단 키트 상단면을 완전히 실링(sealing)하고 ExiSpin™(Bioneer, BS-010211-AAL)을 이용하여 진단키트 조성물과 핵산을 완벽하게 혼합하였다. Real-Time RT-PCR의 반응 조건은 표 2를 따라 진행되었으며, 실시간 핵산 증폭 반응을 위해서는 Exicycler™ 96(Bioneer, A-2060)을 이용하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 산성 프로테아제를 사용하여 시료를 용해하는 방법이 Proteinase K를 사용하는 방법과 바이러스 핵산 추출 성능 면에서 동등함을 확인하였다.
Figure PCTKR2021017860-appb-img-000002
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는, 완충액 간의 pH 차이를 이용한 핵산 분리방법:
    (a) 핵산이 포함된 시료, 0.175 M 이상의 초산 수용액 혹은 2.18 M 이하 농도의 인산 수용액으로 이루어진 결합 완충액의 혼합물에 실리카 자성 입자를 첨가하여 핵산을 결합하는 단계;
    (b) 핵산과 결합된 자성입자를 산성 pH 완충액에서 세척하는 단계; 및
    (c) 자성입자를 분리하고 염기성 pH 용출 완충액에서 핵산을 용출하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 분리법은 알코올 침전법을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 자성입자는 크기가 50nm 내지 1㎛이고, 실리카, 석영 및 실리콘으로 구성된 군에서 선택된 규산물질을 함유한 물질로 코팅된 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA이고, 상기 결합 완충액 및 상기 산성 pH 완충액과 상기 염기성 pH 용출 완충액의 pH 변화를 이용하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 및 (c) 단계는 자석을 이용하여 자기장을 인가하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 핵산이 포함된 시료를 pH 1 ~ pH 6의 산성 완충액과 혼합하고, 자성입자를 첨가하여 핵산을 자성입자에 결합시키는 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 자석을 이용하여 자성입자를 부착한 뒤 상등액을 제거하고 pH 4 - pH 6.5의 산성용액으로 세척하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 자석을 이용하여 상등액을 제거하고 핵산이 결합된 자성입자를 pH 8.0 - pH 10.0의 염기성 용액에 녹여 핵산을 회수하는 것을 특징으로 하는 핵산 분리방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 결합 완충액의 혼합물에 산성 프로테아제 또는 프로테아제 K를 추가로 포함하는 핵산 분리방법.
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