KR20150054844A - 핵산 추출에서의 2가 이온, 프로테아제, 계면활성제, 및 낮은 pH의 사용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2가 염 및 산성 조건을 사용하여 생물학적 샘플로부터 표적 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.

Description

핵산 추출에서의 2가 이온, 프로테아제, 계면활성제, 및 낮은 pH의 사용{USE OF DIVALENT IONS, PROTEASES, DETERGENTS, AND LOW pH IN THE EXTRACTION OF NUCLEIC ACIDS}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 2012년 9월 19일에 출원된 미국 출원 제61/703,112호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
PCR-기반 진단 검정은 핵산 분석을 위한 강력한 도구로서, 심지어 표적 핵산 분자의 단일 카피의 검출도 가능하게 한다. 표적 핵산 서열은 PCR에 의해 증폭될 수 있으며, 증폭된 산물은 검출 및 정량화될 수 있다.
핵산-기반 진단 검정의 감도(sensitivity) 및 신뢰도(reliability)는 생물학적 샘플로부터 순수한 고품질 핵산을 추출하는 효율적인 비편향(unbiased) 방법에 좌우된다. 핵산을 분해하는 뉴클레아제 및 증폭 과정을 억제하는 물질이 생물학적 샘플 내에 존재한다. 예를 들어, DNase 또는 RNase는 표적 핵산을 분해하고, EDTA는 프로테아제 및 뉴클레아제 활성에 필수적인 2가 양이온, 예컨대 Mg2+를 킬레이트화하고, 헤파린, 페놀, 변성 알부민, 폴리아민, 다당류 및 칼슘 알기네이트와 같은 물질은 PCR을 억제한다.
특히 임상 샘플로부터의 핵산의 정제에서의 2가지 주요 과제는 용해(lysis) 및 비특이적 뉴클레아제 활성이다. 실제로, 정제 과정 동안에, 핵산의 추출 및 그의 분해 둘 모두는 동시에 일어난다. 비특이적 핵산 분해를 극복하기 위하여 다양한 접근이 시도되어 왔다. 가장 널리 사용되는 기술은, 완전한 용해를 보장하기 위하여 비특이적 프로테아제 및 다양한 이온성 및 비이온성 계면활성제(detergent)를 사용하는 것이다. 그러나, 프로테아제의 최적 성능을 위해서는 생리학적 pH 범위를 필요로 한다. 생물학적 pH 부근에서는, 마찬가지로 다양한 뉴클레아제가 활성이며, 이에 따라 표적 핵산의 손실로 이어진다.
효과적인 핵산 추출 방법은 뉴클레아제의 활성을 최소화하여야 하며, 그럼으로써 진단 검정에서 분석되는 핵산의 완전성(integrity)을 유지해야 한다. 유사하게, 바람직하게는 샘플 내에 존재하는 증폭 억제제도 증폭 방법에서 감소된다. 본 발명은 이들 및 다른 이점을 제공한다.
본 발명은 2가 이온, 프로테아제, 계면활성제, 및 낮은 pH 조건을 사용함으로써 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 방법 및 구성을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 세포 또는 미생물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 표적 핵산을 추출하기 위한 방법을 제공하며, 본 발명은
(a) 전이 금속 염, 알칼리 토금속 염, 또는 이들의 조합을 생물학적 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시키기에 충분한 양으로 생물학적 샘플에 첨가하는 단계;
(b) 추출 용액을 세포 또는 미생물을 용해시키기에 충분한 양으로 생물학적 샘플에 첨가함으로써 용해물(lysate)을 형성하는 단계;
(c) 산성 완충액을 용해물의 pH를 감소시키기에 충분한 양으로 용해물에 첨가하는 단계; 및
(d) 용해물로부터 표적 핵산을 분리하여 생물학적 샘플로부터 표적 핵산을 추출하는 단계를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명의 방법은 단계 (d) 후에 핵산 증폭을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산 증폭은 PCR을 사용하여 수행된다.
일 태양에서, 본 발명의 방법은 핵산 증폭으로부터 생성된 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 태양에서, 단계 (a)와 단계 (b)는 동시에 수행된다.
일부 태양에서, 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 타액, 소변, 대변, 세포, 또는 미생물이다.
일부 태양에서, 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 표적 핵산은 RNA이다. 일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 바이러스성 RNA이다.
일부 태양에서, 표적 핵산은 DNA이다. 일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 바이러스성 DNA이다.
일부 태양에서, 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액이다. 일부 실시예에서, 단계 (c)를 수행한 후의 (즉, 산성 완충액을 첨가한 후의) 용해물의 pH는 약 pH 1 내지 약 pH 5의 산성 범위 내에 있다.
일부 태양에서, 추출 용액은 프로테이나제 K, 계면활성제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 태양에서, 계면활성제는 양이온성 또는 비이온성 계면활성제이다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 계면활성제는 세트리모늄 브로마이드이다. 일부 실시 형태에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100이다. 일부 실시 형태에서, 비이온성 계면활성제는 NP-40이다. 다른 실시 형태에서, 계면활성제는 블록 공중합체(예를 들어, 플루로닉(pluronic) 용액)이다.
일부 태양에서, 예를 들어 샘플이 B형 간염 바이러스를 포함하는 경우, 본 발명의 방법은 용해물로부터 표적 핵산을 분리하기 전에 생물학적 샘플을 가열하는 단계를 추가로 포함한다. 전형적인 일 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 약 50℃ 내지 약 80℃, 통상 약 65℃ 내지 약 75℃의 온도로 가열된다. 가열하는 단계는 약 30초 내지 약 90초 동안 또는 약 50초 내지 약 70초 동안 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 가열하는 단계는 추출 용액을 첨가한 후에 그리고 산성 완충액을 첨가하기 전에 수행된다.
일부 태양에서, 단계 (d)는 자성 입자들을 단계 (c)에서의 용해물에 첨가하는 단계; 자성 미세입자 분리를 사용하여 용해물로부터 자성 미세입자들을 분리하는 단계; 세척 용액을 자성 미세입자들에 첨가하는 단계; 및 용리 완충액을 자성 미세입자들에 첨가하여 핵산을 용리시키는 단계에 의해 수행된다.
일 태양에서, 본 발명은 표적 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 샘플에서 증폭된 핵산 산물을 검출하기 위한 방법을 제공하며, 본 방법은
(a) 전이 금속 염, 알칼리 토금속 염, 또는 이들의 조합을 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시키기에 충분한 양으로 샘플에 첨가하는 단계;
(b) 산성 완충액을 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시키기에 충분한 양으로 샘플에 첨가하는 단계;
(c) 핵산 증폭 반응을 수행하여 표적 핵산으로부터 증폭된 핵산 산물을 생성하는 단계;
(d) 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계를 포함한다.
일 태양에서, 단계 (a)와 단계 (b)는 동시에 수행된다.
일 태양에서, 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 태양에서, 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액이다.
일부 태양에서, 핵산 증폭 반응은 PCR 과정이다.
일부 태양에서, 표적 핵산은 RNA이다. 일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 바이러스성 RNA이다.
일부 태양에서, 표적 핵산은 DNA이다. 일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 바이러스성 DNA이다.
일 태양에서, 본 발명은 핵산, 뉴클레아제 및 억제제를 포함하는 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 키트를 제공하며, 본 키트는
(a) 추출 용액;
(b) 전이 금속 염 용액, 알칼리 토금속 염 용액, 또는 이들의 조합;
(c) 산성 완충액; 및
(d) 세척 용액을 포함한다.
일부 태양에서, 추출 용액은 프로테이나제 K, 계면활성제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 태양에서, 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액이다.
일부 태양에서, 세척 용액은 트라이플루오로아세트산 용액 또는 염산 용액이다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점이 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1은 본 명세서에 기재된 본 발명의 일 실시 형태를 예시한다. 이는 2가 염을 사용하여 샘플로부터 RNA를 추출하는 단계들을 도시한다. 사전용해(prelysis) 단계들은 단계 1 및 단계 2를 포함한다. 용해 단계들은 단계 3 내지 단계 6을 포함한다. 2가 염, 예컨대 Mn2+ 및 RNA 추출 및 PCR 증폭의 다른 억제제의 제거는, 산성 완충액의 첨가를 갖는 단계 5로부터 핵산 포획용 자성 비드의 최종 세척 후인 단계 9까지 일어난다. RNA 용리 단계는 단계 10을 포함한다. PCR 증폭(예를 들어, RT-PCR)을 수행하기 전에, 용리된 RNA는 산, 예컨대 HCl에 의해 처리된다.
도 2는 HIV-1을 섞은 샘플의 바이러스성 RNA 추출에 대한 낮은 등몰 농도의 2가 이온들의 영향을 도시한다. RNA 추출 동안 40 mM MnCl2에 의한 처리는 40 mM MgCl2 또는 CaCl2에 의한 처리보다 더 많은 HIV-1 RNA를 생성하였다.
도 3은 HIV-1을 섞은 샘플의 바이러스성 RNA 추출에 대한 낮은 등몰 농도의 다가 이온들의 영향을 도시한다. 40 mM MnCl2 에 의해 처리된 샘플들은 CaCl2, MgCl2, NH4SO4, 또는 NH4Cl2에 의해 처리된 샘플들과 비교하여 더 많은 HIV-1 RNA를 생성하였다. 샘플에 대한 257.8 mM CaCl2의 첨가는 HIV-1 RNA 단리에 대해 또한 효과적이었다.
도 4는 HIV-1을 섞은 샘플의 바이러스성 RNA 추출에 대한 높은 등몰 농도의 다가 이온들의 영향을 도시한다. 하기에 의해 샘플을 처리하였다: 1.48 M의 CaCl2, NaCl, MgCl2, MnCl2, ZnCl2, NH4Cl, NH4(SO4)2, 229.6 M ZnCl2 또는 이온 없음. 이 데이터는 높은 등몰 농도에서는 알칼리 토금속 염 및 전이 금속 염이 유사하게 수행한다는 것을 밝혀내었다.
도 5는 HCV를 섞은 혈장 샘플의 바이러스성 RNA 추출에 대한 상이한 2가 염들의 비교를 도시한다. 정량적 PCR 데이터는, Mn(OAc)2를 사용한 추출이 Mg(OAc)2, Zn(OAc)2 또는 MnCl2에 의한 추출보다 우수하게 수행하였음을 보여준다. 이 결과는 또한 92.7 mM Zn(OAc)2에 의한 추출 방법이 효과적일 수 있음을 시사한다.
도 6은 RNA 추출의 시작시에 샘플에 대한 2가 이온들의 첨가가 사전용해 단계들(혈장에 대한 Mn(OAc)2의 첨가 전 및 Mn(OAc)2 첨가 후) 및 용해 단계들(계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100, 프로테아제, 예컨대 프로테이나제 K, 또는 자성 비드 결합 완충액, 예컨대 시트르산의 첨가) 동안 RNA 완전성을 보존할 수 있음을 예시한다.
도 7은 전이 금속 염이 EBV 바이러스를 섞은 혈장 샘플의 바이러스성 DNA 추출에 사용될 수 있음을 예시한다. MgCl2 또는 MnCl2를 사용하는 EBV DNA 추출 방법의 정량적 분석이 제시되어 있다.
도 8은 특정 2가 염들에 의해 처리된 샘플에서의 DNA의 정량적 비교를 도시한다. 정량적 PCR에 의해 결정된 Cp 값을 사용하여 DNA 수준을 비교하였다.
도 9는 HIV-1을 섞은 임상 혈장 샘플에 대한 다양한 농도의 CaCl2 또는 MnCl2의 첨가를 포함한 상이한 추출 방법들을 비교하는 실시간 정량적 PCR 결과를 도시한다.
도 10a, 도 10b, 및 도 10c는 HIV-1을 섞은 샘플로부터의 바이러스성 RNA의 단리를 위한 상이한 계면활성제들을 사용하는 다양한 추출 방법들의 비교를 도시한다. 도 10a는 HIV-1 공정 대조군(process control)에 대한 실시간 정량적 PCR 데이터를 도시한다. 10% 트리톤 X-100 또는 10% CTAB에 의한 바이러스성 RNA 추출이 비등하였다. 도 10b는 HIV-1 RNA 추출에 대한 Cp 값(Ct)에 의해 측정했을 때 10% 트리톤 X-100 및 10% CTAB가 가장 효과적이었음을 도시한다. 도 10c는 10% 트리톤 X-100, 10% NP-40 또는 10% NP-40 대체물의 첨가가 HIV-1을 섞은 샘플로부터의 HIV-RNA의 단리에 대해 동일하게 효과적이었음을 도시한다.
도 11은 50 내지 70초 동안 70 ℃ 인큐베이터 내에서 CaCl2를 함유하는 용해 혼합물을 인큐베이팅함으로써 혈장 샘플로부터의 HBV DNA의 추출이 개선됨을 도시한다.
도 12a 및 도 12b는 60초 동안 70 ℃ 인큐베이터 내에서 CaCl2를 함유하는 용해 혼합물을 인큐베이팅함으로써 혈청 샘플로부터의 70 IU HBV DNA(도 12a) 및 700,000 IU HBV DNA(도 12b)의 추출이 개선됨을 도시한다.
I. 서론
본 발명은, 핵산의 추출 동안, 낮은 pH와 함께, 전이 금속 염, 알칼리 금속 염, 또는 이들의 조합(본 명세서에서 "2가 염"으로 지칭됨)의 사용이 뉴클레아제 및 생물학적 샘플 내에 존재할 수 있는 증폭 억제제를 불활성화시킨다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 게다가, 본 발명의 방법은 샘플 내의 뉴클레아제를 추가로 불활성화시키기 위하여 (예를 들어, 세포를 함유하는 샘플을 위한) 프로테아제를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플로부터의 핵산의 추출 및/또는 증폭 동안 뉴클레아제를 효과적으로 불활성화시키기 위한 방법 및 구성을 제공한다. 본 발명은 또한, 생물학적 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시킴으로써, 증폭된 핵산 산물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 전형적으로 세포를 포함하는 샘플과 함께 사용된다. 그러한 방법에서는, 세포를 용해시키고 세포로부터 핵산을 방출시키기 위해 추출 용액이 사용된다. 그러한 과정에서는, 뉴클레아제 및 증폭 억제제가 동시에 방출될 수 있다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 전이 금속 염 및/또는 알칼리 금속 염은, 특히 포화 농도에서, 단백질 상의 특정 하전된 아미노산 잔기에 결합함으로써, 방출된 뉴클레아제를 일시적으로 불활성화시키는 것으로 관찰되어 왔다. 이어서, 샘플의 pH를 (예를 들어, 5 미만의 pH로) 낮춤으로써, 뉴클레아제에 대한 2가 이온의 친화성의 손실을 가져오고, 이에 따라 이러한 이온은 떨어져서 용액 중으로 다시 되돌아간다. 그러나, 낮은 pH에서, 뉴클레아제는 구조적으로 변형되고 후속 단계들 동안 세척되어 떨어져 나간다. 본 명세서에 논의된 바와 같이, 2가 이온에 의한 뉴클레아제 불활성 및 산성 pH에서의 (그리고 선택적으로 프로테아제의 첨가를 포함한) 단백질 변성의 사용은 다양한 생물학적 샘플로부터의 핵산의 추출을 개선한다.
II. 생물학적 샘플
본 발명에 유용한 생물학적 샘플은 뉴클레아제 및/또는 증폭 억제제와 함께 표적 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 임의의 샘플이다. 전형적인 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 미생물을 포함한다. 미생물에는 고세균, 세균, 진균, 원생생물 및 바이러스가 포함된다. 이러한 샘플은 다양한 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있다. 그러한 공급원에는, 대상체로부터의 생검 재료 및 흡인물을 포함한 전조직(whole tissue), 대변, 세포 외식편(cellular explant); 전혈, 적혈구, 백혈구, 및 체액, 예컨대 림프, 소변, 가래, 정액, 분비물, 눈 세척물 및 흡인물, 폐 세척물 및 흡인물이 포함된다. 샘플은 또한 1차 및 2차 세포, 및 형질전환된 세포주를 포함한 시험관내(in vitro) 배양 세포, 및 세포 배양 배지가 포함된다. 생물학적 샘플은 또한 식물 조직, 예컨대 잎, 뿌리, 또는 줄기로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 미생물(예를 들어, 세균, 진균, 조류, 원생동물 및 바이러스)이 생물학적 샘플 내에 존재할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 무세포(cell-free)이며 바이러스를 함유한다. 용어 "생물학적 샘플" 및 "샘플"은 상호교환적으로 사용된다.
생물학적 샘플이 유래되는 대상체는 인간, 상업적으로 중요한 포유류일 수 있는데, 이에는, 예를 들어 원숭이, 소, 또는 말이 포함된다. 샘플은 또한 애완동물로부터 획득될 수 있는데, 이에는, 예를 들어 개, 고양이 또는 새가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 질병의 동물 모델로서 사용되는 실험실용 동물로서, 예를 들어 마우스, 래트, 래빗, 기니아 피그, 또는 원숭이이다.
일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 RNA, 예컨대 인간 mRNA, 바이러스성 RNA, 세균성 RNA, 진균성 RNA, 조류성 RNA 또는 원생동물 RNA이다. 전형적인 일 실시 형태에서, 표적 RNA는 바이러스성 RNA이다.
일부 실시 형태에서, 표적 핵산은 DNA, 예컨대 인간 DNA, 바이러스성 DNA, 세균성 DNA, 진균성 DNA, 조류성 DNA 또는 원생동물 DNA이다. 전형적인 일 실시 형태에서, 표적 DNA는 바이러스성 DNA이다.
본 발명의 방법에서 불활성화되는 뉴클레아제는 핵산의 뉴클레오티드 하위단위들 사이의 인산다이에스테르 결합을 절단할 수 있는 임의의 효소일 수 있다. 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 또는 둘 모두로서 특징지어질 수 있다. DNAse의 비제한적인 예에는 DNase I, DNase II, DNase IV, 제한 엔도뉴클레아제, 다른 엔도뉴클레아제, 및 (뉴클레아제 활성을 유지하는) 이들의 단편이 포함된다. RNase의 비제한적인 예에는 RNase A 패밀리의 구성원, RNase B, RNase C, RNase 1, RNase T1, RNase T2, RNase L, RNase H 패밀리의 구성원, 안지오제닌 RNase 패밀리의 구성원, 호산구 RNase, 미구균(micrococcal) 뉴클레아제, 포유류 리보뉴클레아제 I 패밀리의 구성원, 리보뉴클레아제 2 패밀리의 구성원, 메신저 RNA 리보뉴클레아제, 5'-3' 엑소리보뉴클레아제, 3'-5' 엑소리보뉴클레아제, 디캡핑(decapping) 효소, 데아데닐라제(deadenylase), RNase P, RNase m, RNase E, RNase I,I* RNase HI, RNase HII, RNase M, RNase R, RNase IV, F; RNase P2,0, PIV, PC, RNase N, RNase II, PNPase, RNase D, RNase BN, RNase T, RNase PH, OligoRNase, RNase R, RNase Sa, RNase F1, RNase U2, RNase Ms, RNase St, 및 (뉴클레아제 활성을 유지하는) 이들의 단편이 포함된다.
상기에 기재된 바와 같이, 샘플은 또한 증폭 억제제를 포함할 수 있다. 그러한 억제제는 전형적으로 PCR 증폭 억제제이다. 증폭 억제제는 통상 표적 핵산과의 상호작용 또는 DNA 폴리머라제의 방해를 통해 그러한 검정에 영향을 준다. 억제제는 샘플 내의 핵산에 직접 결합함으로써 정제 절차 동안 제거되는 것을 피할 수 있다. 대안적으로, 억제제는 보조인자(예를 들어, Mg2+)의 이용가능성을 감소시킴으로써, 또는 아니면 DNA 폴리머라제와의 그의 상호작용을 방해함으로써 PCR을 억제할 수 있다. 예시적인 억제제에는 (혈액 중의) 헴, 헤모글로빈, 및 락토페린 및 면역글로빈; (배설물 중의) 담즙 염; (배설물 및 식물 재료 중의) 복합 다당류; (모발 및 피부 중의) 멜라닌; (우유 중의) 프로테이나제; (근육 조직 내의) 미오글로빈; (토양 및 식물 재료 중의) 부식산(humic acid); (조직 중의) 콜라겐; 및 (소변 중의) 우레아가 포함된다.
III. 핵산의 추출
상기에 기재된 바와 같이, 본 발명은 뉴클레아제 및/또는 증폭 억제제를 포함하는 생물학적 샘플로부터 표적 핵산을 추출하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 사용되는 2가 염은 베릴륨, 마그네슘, 칼슘, 스트론튬, 바륨 및 라듐과 같은 알칼리 토금속의 염일 수 있다. 2가 염은 또한 망간, 코발트, 니켈, 구리, 아연, 이트륨, 지르코늄, 니오븀, 몰리브덴, 테크네튬, 루테늄, 로듐, 팔라듐, 은, 카드뮴, 란탄, 하프늄, 탄탈, 텅스텐, 레늄 및 오스뮴과 같은 전이 금속의 염일 수 있다. 반대 이온은, 예를 들어 클로라이드, 아세테이트, 옥사이드, 하이드록사이드, 옥살레이트, 카르보네이트, 시트레이트, 및 트라이플루오로아세테이트일 수 있다.
본 발명에 유용한 예시적인 2가 염에는 염화마그네슘, 염화칼슘, 망간 아세테이트, 염화망간, 아연 아세테이트, 및 이들의 조합이 포함된다.
전형적인 일 실시 형태에서, 과잉몰(hypermolar) 농도, 예컨대 포화량의 2가 염이 편리하게 사용된다. 그러한 양은 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시키고, 그럼으로써 뉴클레아제가 표적 핵산을 분해하는 것을 방지하기에 충분하다. 이러한 양은 전형적으로 최종 농도가 적어도 약 250 mM 내지 약 400 mM, 및 종종 최대 약 500 mM일 것이다. 전형적인 일 실시 형태에서, 2가 염의 양은 약 250 mM 이상이다.
추출 방법은 또한 추출 용액을 세포를 용해시키기에 충분한 양으로 생물학적 샘플에 첨가함으로써 용해물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 추출 용액은 프로테아제, 계면활성제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 프로테아제는 용해 동안 세포로부터 방출되는 단백질(예를 들어, 뉴클레아제)을 효소분해(digest)시킨다. 이 목적에 유용한 프로테아제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 프로테아제는, 예를 들어 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 내의 펩타이드 결합의 절단을 촉매하는 임의의 효소일 수 있다. 예시적인 프로테아제에는 서브틸라제, 서브틸리신, 및 알칼리 세린 프로테아제가 포함된다. 서브틸라제는 원핵 및 진핵 생물, 예컨대 세균, 진균, 및 효모에서 발견되는 세린 프로테아제의 패밀리이다. 서브틸리신은 광범위한 기질 특이성을 갖는 세균성 서브틸라제이다. 서브틸리신은 카오트로프(chaotrope), 예컨대 우레아 및 구아니딘 하이드로클로라이드, 및 음이온성 계면활성제, 예컨대 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 의한 변성에 대해 비교적 내성을 나타낸다. 예시적인 서브틸리신에는 프로테이나제 K; 프로테이나제 R; 프로테이나제 T, 서브틸리신 A, 나가르제(Nagarse), 서브틸리신 B, 및 테르미타제(Thermitase)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 전형적인 일 실시 형태에서, 프로테이나제 K가 본 발명의 방법에 사용된다. 당업자는, 핵산 추출 방법에서의 프로테아제의 사용이 잘 알려져 있으며, 프로테아제의 적절한 농도는 사용되는 특정 프로테아제 및 분석되는 샘플을 포함한 다수의 인자들에 좌우될 것임을 인식할 것이다. 전형적인 일 실시 형태에서, 최종 프로테아제 농도는 약 20 U/ml 이상, 통상 최대 약 40 U/ml일 것이다.
계면활성제는 전형적으로 바이러스성, 세균성, 세포성(예를 들어, 동물, 미생물, 식물, 인간으로부터 유래됨) 막을 파괴하고, 세포 또는 세균성 입자의 내부로부터 생물학적 분자, 예컨대 단백질, RNA 및 DNA를 방출시키기 위해 사용된다. 이렇게 형성된 용해물은 전형적으로 중성 pH(예를 들어, 약 pH 7)이거나 그 부근이다. 핵산 추출 방법에서의 계면활성제의 사용 또한 잘 알려져 있다. 당업자는 최종 계면활성제 농도가, 사용되는 특정 계면활성제 및 분석되는 샘플을 포함한 다수의 인자들에 좌우될 것임을 인식할 것이다. 전형적인 일 실시 형태에서, 최종 계면활성제 농도는 약 0.1% 이상, 통상 최대 약 5%일 것이다.
이 목적에 유용한 계면활성제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 계면활성제는 양이온성 표면활성제(surfactant)이다. 양이온성 표면활성제는 4차 아민 또는 3차 아민을 함유할 수 있다. 예시적인 양이온성 표면활성제에는 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 세틸트라이메틸암모늄 클로라이드(CTACl), 도데실트라이메틸암모늄 브로마이드(DTAB,), 도데실트라이메틸암모늄 클로라이드(DTACl), 옥틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드, 테트라데실트라이메틸암모늄 브로마이드(TTAB), 테트라데실트라이메틸암모늄 클로라이드(TTACl), 도데실에틸다이메틸암모늄 브로마이드(DEDTAB), 데실트라이메틸암모늄 브로마이드(D10TAB), 도데실트라이페닐포스포늄 브로마이드(DTPB), 옥타데실 트라이메틸 암모늄 브로마이드, 스테아로알코늄 클로라이드, 올레알코늄 클로라이드, 세트리모늄 클로라이드, 알킬 트라이메틸 암모늄 메토설페이트, 팔미타미도프로필 트라이메틸 클로라이드, 쿼터늄 84가 포함된다. 예시적인 3차 아민 표면활성제에는 옥틸다이메틸아민, 데실다이메틸아민, 도데실다이메틸아민, 테트라데실다이메틸아민, 헥사데실다이메틸아민, 옥틸데실다이메틸아민, 옥틸데실메틸아민, 다이데실메틸아민, 도데실메틸아민, 트라이아세틸암모늄 클로라이드, 세트리모늄 클로라이드, 및 알킬 다이메틸 벤질 암모늄 클로라이드가 포함된다. 양이온성 표면활성제의 추가 부류에는 포스포늄, 이미다졸린, 및 에틸화 아민 군들이 포함된다. 전형적인 일 실시 형태에서, 양이온성 계면활성제는 CTAB이다.
일부 실시 형태에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제이다. 비이온성 계면활성제의 비제한적인 예에는 NP-40, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, 트윈(Tween)-20, 트윈-80, 브리즈(Brij)-35, 브리즈-58, 옥틸 글루코사이드, 옥틸 티오글루코사이드, 블록 공중합체(예를 들어, 플루로닉 용액)가 포함된다. 전형적인 일 실시 형태에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100이다. 다른 실시 형태에서, 비이온성 계면활성제는 NP-40이다.
일부 실시 형태에서, 계면활성제는 쯔비터이온성(zwitterionic) 계면활성제이다. 쯔비터이온성 계면활성제의 비제한적인 예에는 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS), 3-[(3-콜아미도프로필)다이메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO), N-데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(설포베타인 3-10), N-테트라데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(설포베타인 3-14), N-도데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트(설포베타인 3-12), 아미도설포베타인-14, 아미도설포베타인-16, 4-n-옥틸벤조일아미도-프로필-다이메틸암모니오 설포베타인, 및 3-(1-피리디노)-1-프로판 설포네이트(비-계면활성제 설포베타인 201)가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 계면활성제는 거품억제제(소포제)와 함께 제형화된다. 거품억제제는 액체 중에서의 거품의 형성을 감소 및/또는 저지하는 화학 첨가제이다. 거품억제제의 비제한적인 예에는 유기 거품억제제(예를 들어, 거품억제제 204, 거품억제제 O-30) 및 실리콘계 거품억제제(예를 들어, 거품억제제 A, 거품억제제 B, 거품억제제 C, 거품억제제 Y-30)가 포함된다. 전형적인 일 실시 형태에서, 거품억제제의 최종 농도는 약 0.001% 이상, 통상 최대 약 0.5%일 것이다.
일부 실시 형태에서, 2가 염과 추출 용액은 생물학적 샘플에 동시에 첨가된다. 일부 실시 형태에서, 2가 염은, 추출의 사전용해 단계 동안, 추출 용액 또는 추출 용액의 임의의 성분을 첨가하기 전에 샘플에 첨가된다.
본 발명의 방법에서는, 산성 완충액을, pH를 약 pH 5 미만, 전형적으로는 약 4 미만으로, 통상 약 pH 3 미만으로, 그리고 종종 약 pH 1만큼 낮게 감소시키기에 충분한 양으로 용해물에 첨가한다. 낮은 pH 조건 하에서, 잔류 뉴클레아제는 추가로 변성되고, 불활성인 상태를 유지하고, 핵산을 분해할 수 없게 된다. 또한, 전이 금속 이온 및 알칼리 토금속 이온은 용해물 내의 뉴클레아제 및 다른 금속단백질(metalloprotein)에 대한 친화성을 손실하고, 용액 중으로 떨어져 나간다. 따라서, 낮은 pH 조건은 후속 세척 단계들 동안 금속 염 및 다른 억제제의 제거를 용이하게 한다. 당업자는 최종 산성 완충액 농도가, 사용되는 특정 완충액 및 분석되는 샘플을 포함한 다수의 인자들에 좌우될 것임을 인식할 것이다. 전형적인 일 실시 형태에서, 최종 산성 완충액 농도는 약 10 mM 이상, 통상 최대 250 mM일 것이다.
일부 실시 형태에서, 산성 완충액은 아세트산 완충액 또는 시트르산 완충액이다. 본 발명에 유용한 산성 완충액의 다른 예에는 10 mM 이상, 통상 최대 약 250 mM 농도의 옥살산, 불화수소산, 트라이플루오로아세트산, 글리신, 피루브산, 락트산, 및 임의의 산성 아미노산이 포함된다.
본 명세서에 제공된 실험 결과는, B형 간염 바이러스를 포함하는 샘플의 경우에, 본 발명의 방법 동안 생물학적 샘플을 가열함으로써 표적 핵산 추출이 추가로 개선될 수 있음을 보여준다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 용해물로부터 표적 핵산을 분리하기 전에 생물학적 샘플을 가열하는 단계를 추가로 포함한다. 전형적인 일 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 약 50℃ 내지 약 80℃, 통상 약 65℃ 내지 약 75℃의 온도로 가열된다. 가열하는 단계는 약 30초 내지 약 90초 동안 또는 약 50초 내지 약 70초 동안 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 가열하는 단계는 추출 용액을 첨가한 후에 그리고 산성 완충액을 첨가하기 전에 수행된다.
따라서, 일 태양에서, 본 발명은 세포를 포함하는 생물학적 샘플 내의 표적 핵산을 추출하는 동안 뉴클레아제를 불활성화시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 하기 단계들을 포함한다: (1) 전이 금속 염, 알칼리 토금속 염, 또는 이들의 조합의 첨가에 의해 뉴클레아제를 불활성화시키는 단계; (2) 계면활성제(예를 들어, 양이온성 또는 비이온성 계면활성제), 프로테이나제 K, 또는 이들의 조합을 사용하여 생물학적 샘플의 세포를 용해시켜 용해물을 형성하는 단계; (3) 산성 완충액을 사용하여 용해물의 pH를 약 1 내지 약 5의 pH로 감소시키는 단계; (4) 낮은 pH에서 표적 핵산을 포획하고 금속 염을 제거하는 단계; 및 (5) 낮은 pH에서 불순물(예를 들어, 뉴클레아제 및 PCR 증폭 또는 다른 하류 과정의 억제제)을 제거하는 단계; 및 (6) 알칼리 조건 하에서 표적 핵산을 방출시키는 단계. 일부 실시 형태에서, 이들 단계 중 적어도 2개는 동시에 일어날 수 있다. 일부 실시 형태에서, 2개 이상(예를 들어, 3개, 4개, 또는 5개)의 단계들이 동시에 일어날 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 동시에 일어날 수 있는 복수의 단계들에 이어서, 동시에 일어날 수 있는 다른 복수의 단계들을 포함한다.
산성 완충액의 첨가 후에, 표적 핵산은 당업자에게 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 용해물로부터 분리된다. 일부 실시 형태에서, (특이적으로 또는 비특이적으로) 표적 핵산을 결합시키는 자성 비드가 사용된다(예를 들어, 문헌[Rudi et al. BioTechniques 22(3) 506-511, 1997] 참조).
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 0.25 내지 2.5 mg 자성 미세입자들을 용해물에 첨가하는 단계; 자성 미세입자 분리를 사용하여 용해물로부터 자성 입자들을 분리하는 단계; 세척 용액을 자성 입자들에 첨가하는 단계; 및 용리 완충액을 자성 미세입자들에 첨가하여 핵산을 용리시키는 단계로 된 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이 단계는, 예를 들어 고상 가역적 고정화 상자성 비드-기반 기술을 사용하여 수행된다.
IV. 표적 핵산의 검출
표적 핵산을 검출 및 분석하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 상세히 설명되지 않는다. 전형적인 일 실시 형태에서, 표적 핵산은 추가의 분석 전에 증폭된다. 표적 핵산이 용해물로부터 분리되기 전이나 후에 증폭이 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 예시적인 실시 형태가 도 1에 예시되어 있으며, 하기 단계들을 포함한다: (1) 샘플을 얻는 단계; (2) MgCl2, CaCl2, Mn(OAc)2, MnCl2, Zn(OAc)2, 또는 이들의 조합을 최대 500 mM의 최종 농도로 생물학적 샘플에 첨가하는 단계; (3 및 4) 트리톤 X-100 또는 CTAB 및 프로테이나제 K를 각각 최대 10% 및 40 U/ml의 최종 농도로 첨가하는 단계; (5) 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 최대 160 mM의 최종 농도로 첨가함으로써, 생성된 용해물의 pH를 약 pH 5 미만으로 감소시키는 단계; (6) 2 mg의 자성 미세입자들을 첨가함으로써 고체 지지체 상에 표적 핵산을 포획하는 단계; (7) 제조업체의 사용설명서에 따라 자석을 사용하여 자성 미세입자들을 분리하고 폐기물을 제거하는 단계; (8) 자석으로부터 비드를 분리하고 자성 미세입자들을 세척 용액, 예컨대 900 μl의 1 내지 100 mM 트라이플루오로아세트산 용액 및/또는 1 내지 100 mM HCl(pH 1 내지 5)로 1회 이상 세척하는 단계; (9) 비드를 1 내지 100 mM HCl(pH 1 내지 5)로 1회 이상 세척하는 단계; (10) 용리 용액, 예컨대 25 μl의 75 mM NaOH 및 50 mM 트리스(Tris)(pH 8.0)를 사용하여 자성 미세입자들로부터 표적 핵산을 용리시키는 단계; (11) 표적 핵산을 포함하는 용리물(eluate)을 4 μl의 150 mM HCl로 중화시키는 단계; 및 (12) 용리물을 사용하여 정량적 핵산 증폭, 예컨대 실시간 정량적 PCR을 수행하는 단계.
어떠한 특정 이론으로도 구애됨이 없이, 단계 2에서의 2가 염의 첨가는 샘플 내에 존재하는 뉴클레아제의 일시적인 불활성화를 야기하는 것으로 여겨진다. 단계 5에서의 샘플에서의 낮은 pH로 인해, 2가 염은 뉴클레아제 및 다른 금속단백질에 대한 친화성을 손실한다. 이 단계 및 후속 단계 7 내지 단계 9는 2가 염 및 핵산 증폭 및 다른 하류 과정의 다른 억제제의 제거를 용이하게 한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 방법은 표적 핵산을 단리하는 단계 전이나 후에 핵산 증폭을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 핵산 증폭에는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 그의 변형(예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR, 어셈블리 PCR, 비대칭 PCR, 메틸화-특이적 PCR, 멀티플렉스-PCR, 네스티드(nested) PCR, 정량적 PCR, 가역적 전사 PCR, 및 실시간 정량적 PCR)이 포함된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 핵산 증폭은 PCR이다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 핵산 증폭으로부터 생성된 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서는, 증폭 과정 동안 생성된 신호가 모니터링되는데, 여기서 신호는 반응에서 증폭된 핵산 및/또는 표적 핵산의 양과 관련된다. 이 신호는 검출가능하고 정량화가능한 형광 또는 다른 방식일 수 있다.
예시적인 일 실시 형태에서, 핵산 증폭 및 생성된 증폭된 핵산 산물의 검출의 단계들은 PCR 시스템 내에서 수행된다. 그러한 시스템은 준비되고 밀봉된 반응 용기를 이용하고 완전한 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 분석을 수행하는데, 샘플을 다수 회 열 사이클링하고 각각의 사이클에서 방출된 형광의 강도를 보고한다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 핵산을 결정하기 위한 자동화 기기가 국제 출원 공개 WO 2012/012779호에 상세히 기술되어 있다. 따라서, 본 발명의 실시 형태는 생물학적 샘플 내의 특이적 표적 핵산 서열을 결정하기 위한 전자동화 랜덤 액세스 시스템을 포함한다. 이러한 시스템은 다양한 검정을 수행하는 데 필요한 시약을 포함하는 소모품, 반응 사이트, 및 전달 장치를 포함한다. 소모품을 위한 충분한 저장 공간이 시스템 상에 제공되어서, 연장된 시간 동안 작업자의 최소한의 개입으로 시스템이 작동될 수 있게 한다.
이러한 시스템은 2가지 기능, 즉 생물학적 샘플로부터 핵산을 단리한 형태로의 샘플 제조, 및 이러한 단리된 핵산 내의 특이적 표적 핵산 서열의 검출을 조합할 수 있다. 이러한 목적으로, 시스템은 적어도 2개의 구별되는 기능적 영역을 가질 수 있는데, 하나는 소모품을 사용하여 샘플을 처리하기 위한 기기장치(instrumentation)를 포함하고, 다른 하나는 핵산 증폭 및 검출을 위한 기기장치 및 시약을 포함한다. 이들은 샘플 취급, 핵산 단리, 및 증폭 및 검출의 주요 기능과, 공급 및 소모품 관리, 정보 관리, 및 유지보수의 지원 기능을 수행하는 시스템을 제공하도록 단일 유닛으로 일체화된다.
이들 기능을 고도로 자동화된 단일 자립형 시스템 내로 조합하는 것은 임상 실험실의 워크플로우 내로의 분자 진단학의 중단없는 통합을 제공한다. 그러한 시스템은 사용자 개입에 대한 필요성 없이 임상적으로 허용되는 결과를 생성하도록 당업자가 핵산 결정의 모든 단계들을 수행할 수 있게 한다. 이러한 시스템은 유리하게는, 시스템에 의해 부과되는 샘플 또는 분석물 주문에 대한 제약 없이, 샘플이 이용가능하게 될 때 사용자가 샘플을 로딩하고, 환자 및 그의 의사의 필요에 따라 그러한 샘플에 대해 측정을 수행할 수 있게 한다.
V. 키트
본 발명의 방법에서 유용한 시약은 또한 키트의 형태로 생성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트를 정의하기 위해 본 발명의 방법에서 사용되는 시약에 대한 모든 논의가 필요한 부분만 약간 수정하여(mutatis mutandis) 적용된다. 그러한 키트는, 예를 들어 핵산, 뉴클레아제 및 억제제를 포함하는 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 기본적인 요소들을 포함하는 패키징된 조합이다. 키트는
(a) 추출 용액;
(b) 전이 금속 염 용액, 알칼리 토금속 염 용액, 또는 이들의 조합;
(c) 산성 완충액; 및
(d) 세척 용액을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 추출 용액은 프로테이나제 K, 계면활성제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 계면활성제는 양이온성 또는 비이온성 계면활성제이다. 일부 실시 형태에서, 양이온성 계면활성제는 세트리모늄 브로마이드이다. 일부 실시 형태에서, 비이온성 계면활성제는 트리톤 X-100이다.
일부 태양에서, 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 태양에서, 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액이다.
일부 태양에서, 세척 용액은 트라이플루오로아세트산 용액, 염산 용액, 옥살산 용액, 피루브산 용액, 락트산 용액, 또는 산성 아미노산을 포함하는 용액이다.
실시예
실시예 1: 2가 이온 및 다가 이온을 사용하는 RNA 추출 방법
이 실시예는 2가 이온, 프로테아제, 계면활성제 및 낮은 pH를 사용하여 샘플로부터 RNA를 추출하기 위한 본 명세서에 기재된 방법을 예시한다. 낮은 또는 높은 등몰 농도로 다가 염들을 포함하는 핵산 추출 방법들의 성능을 실시간 정량적 PCR에 의해 평가하였다. 이들 연구에서는, 평균 HIV-1 Ct, 평균 RFU 및/또는 공정 대조군 Ct를, 시험된 각각의 추출 방법에 대해 평가하였다. 더 낮은 평균 HIV-1 Ct 값 및/또는 더 낮은 공정 대조군 Ct 값은 추출된 HIV-1 RNA의 더 많은 존재와 상관된다.
혈장 샘플로부터 RNA를 추출하는 방법이 본 명세서에 기술되며, 도 1에 제시되어 있다. 간단히 말하면, ml당 4,000 카피의 HIV-1 및 1:10,000 희석률의 HIV-1 공정 대조군(예를 들어, 신드비스(Sindbis) HIV RNA 컨트롤)을 함유하는 K2-혈장 샘플들을, 시험되는 2가 염 조건들 중 하나로 처리하였다. 공정 대조군은 핵산 추출 및 PCR 증폭의 양성 대조군으로서의 역할을 한다. 다음으로, 트리톤 X-100 및 프로테이나제 K를 사용하여 샘플의 세포 및 미생물(HIV-1 바이러스)을 용해시켜서 용해물을 형성하였다. 이후에, 산성 완충액을 사용하여 용해물의 pH를 산성 pH로 감소시켰다. 자성 비드 및 결합 완충액, 예컨대 시트르산을 사용하여 핵산을 포획하였다. 트라이플루오로아세트산 또는 염산을 함유하는 세척 용액들에 의한 일련의 세척을 통해, 2가 이온 염뿐만 아니라 PCR 증폭 또는 다른 하류 과정의 억제제도 제거하였다. 알칼리 완충액, 예컨대 수산화나트륨을 사용하여 자성 비드로부터 포획된 핵산을 용리시켰다. 용리된 RNA를 PCR 증폭 전에 HCl로 처리하였다. 추출 방법의 성능을 실시간 정량적 PCR(RT-PCR)에 의해 평가하여 HIV-1 RNA의 존재를 정량화하였다. 도 1에서, RNA 추출의 단계들은 그래프의 x축 상에 묘사되어 있으며, 추출의 특정 과정의 활성(예를 들어, RNase 활성, 세포 용해, Mn2+ 및 다른 억제제의 제거, 및 RNA 용리)은 y축을 따라 그려져 있다.
낮은 등몰 농도의 상이한 다가 염들을 사용한 9개의 추출 방법을 비교하였다. 하기의 낮은 등몰 조건을 시험하였다: a) 40 mM CaCl2; b) 40 mM MgCl2; c) 40 mM MnCl2; d) 40 mM 염화암모늄(NH4Cl2); e) 40 mM 황산암모늄(NH4SO4); f) 40 mM CaCl2 및 40 mM NH4Cl; g) 257.8 mM CaCl2 및 40 mM NH4Cl; h) 257.8 mM CaCl2 및 175 mM NH4Cl; 및 i) 257.8 mM CaCl2. 다가 이온 염의 몰 농도는 결합 수준에서의 최종 농도를 지칭한다는 것을 알아야 한다.
도 2는 2가 염 조건, 예를 들어 40 mM의 CaCl2, MgCl2 및 MnCl2의 비교로부터 얻어진 결과를 예시한다. 낮은 2가 이온 농도에서, MnCl2는, 더 낮은 평균 HIV Ct 값 및 최고 평균 RFU에 의해 나타난 바와 같이, CaCl2 및 MgCl2보다 더 우수하게 수행하였다.
도 3은 시험된 9개의 모든 다가 염 조건들의 성능 결과를 도시한다. 성능 분석은 각각의 조건으로부터의 평균 HIV-1 Ct(HIV) 및 공정 대조군 Ct(HIVIC)에 기초하였다. 결과는 MnCl2에 의한 추출 방법이 최저 평균 HIV-1 Ct 및 공정 대조군 Ct를 생성하였음을 보여준다. 따라서, MnCl2를 사용한 추출 방법은 시험된 다른 방법들보다 더 우수하게 수행하였다.
다음으로, 높은 등몰 농도의 상이한 다가 염들을 사용한 9개의 추출 방법을 비교하였다. 낮은 등몰 농도의 다가 염들의 시험과 유사하게, 표준 농도의 공정 대조군(PC)과 함께 K2-혈장 ml당 4,000 카피의 HIV-1을 350 μl의 다양한 높은 등몰 농도의 다가 염들을 사용하여 추출하였다. 하기의 높은 등몰 조건을 사용하였다: 1) 1.48 M 염화칼슘(1.48 M CaCl2); 2) 1.48 M 염화나트륨(1.48 M NaCl); 3) 1.48 M 염화마그네슘(1.48 M MgCl2); 4) 1.48 M 염화망간(1.48 M MnCl2); 5) 229.6 mM 염화아연(229.6 M ZnCl2); 6) 1.48 M 염화아연(1.48 M ZnCl2); 7) 1.48 M 염화암모늄(1.48 M NH4Cl); 8) 1.48 M 황산암모늄(1.48 M NH4(SO4)2); 또는 9) 특정 이온 없음(이온 없음). 몰 농도는 사용된 스톡(stock) 농도를 지칭하며, 이에 따라 결합에서의 다가 염의 최종 농도는 5.74배 희석된다는 것을 알아야 한다. 상이한 농도의 다가 염들을 사용한 혈장의 핵산 추출의 성능은 각각의 조건으로부터의 최저 평균 HIV-1 Ct(HIV) 및 공정 대조군 Ct(HIVIC)에 기초하여 평가하였다. 결과는, 높은 등몰 농도에서, 알칼리 토금속 염과 전이 금속 염이 유사하게 수행하였음을 보여준다(도 4).
다가 염의 특정 금속 이온들이 표적 핵산의 추출을 개선했는지를 결정하기 위하여, 마그네슘 염, 망간 염 또는 아연 염을 포함한 방법들을 비교하였다. 표준 농도의 PC(신드비스)와 함께 K2-EDTA 혈장 ml당 2,000 카피의 C형 간염 바이러스(HCV)를 도 1에 묘사된 방법을 따라 추출하였다. 단계 2에서, 하기 염 농도들(최종 농도) 중 하나를 첨가하였다: a) 92.7 mM 마그네슘 아세테이트; b) 46.3 mM 염화마그네슘 및 140 mM 마그네슘 아세테이트; c) 46.3 mM 염화마그네슘 및 140 mM 아연 아세테이트; d) 46.3 mM 염화망간 및 140 mM 망간 아세테이트; e) 46 mM MnCl2; f) 93 mM MnCl2; g) 139 mM MnCl2; h) 140 mM 망간 아세테이트 및 46.3 mM 염화마그네슘; i) 140 mM 망간 아세테이트; 및 j) 92.7 mM 아연 아세테이트. 핵산 추출의 성능은 각각의 조건으로부터의 최저 평균 HCV Ct(HCV) 및 PC Ct(신드비스)에 기초하여 평가하였다. 결과는 전이 금속 염 또는 알칼리 토금속 염과 아세테이트 이온의 조합에 의한 RNA 추출 방법들이 최상으로 수행하였음을 보여준다(도 5).
실시예 2: 용해 단계들 동안의 RNA 완전성의 분석
이 실시예는 Mn(OAc)2로 처리된 K2 혈장 샘플들의 RNA 추출 동안 HIV-1 게놈성 RNA의 RNA 완전성에 대한 영향을 예시한다. 이 연구에서는, 20,000 카피의 HIV 게놈성 RNA를 추출의 상이한 단계들에 첨가하였다. RNA 완전성은 실시간 RT-PCR에 의해 평가하였다. 결과는 RNA 추출의 시작시에 샘플에 대한 Mn(OAc)2의 첨가가 사전용해 단계들(혈장에 대한 Mn(OAc)2의 첨가 전 및 Mn(OAc)2 첨가 후) 및 용해 단계들(계면활성제, 예컨대 트리톤 X-100, 프로테아제, 예컨대 프로테이나제 K, 또는 자성 비드 결합 완충액, 예컨대 시트르산의 첨가) 동안 RNA 완전성을 보존하였음을 보여준다. Mn(OAc)2에 앞서 게놈성 RNA의 첨가는, 4 Ct 지연으로부터 계산된 바와 같이, RNA의 94% 손실을 가져왔다(도 6). 그렇지만, Mn(OAc)2 후의 첨가는, 2.5 내지 3.5 Ct 차이에 의해 결정된 바와 같이, 게놈성 RNA의 82% 보호로 이어졌다. 샘플에 PK 후에 RNA를 섞었을 때 RNA 완전성은 최고였는데, 이는 RNA의 90%가 보존된 바와 같다.
실시예 3: DNA 추출에서의 2가 염의 사용
이 실시예는 전이 금속 염이 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV)를 섞은 혈장 샘플들의 바이러스성 DNA 추출에 효과적임을 예시한다. DNA 추출의 초기 단계 동안 엡스타인-바르 바이러스(ml당 4,000 카피) 및 공정 대조군을 섞은 혈장 샘플에 대한 염화망간 또는 염화마그네슘(최종 농도 또는 257 mM)의 첨가 효과를 실시간 정량적 PCR에 의해 평가하였다. 이 데이터는, EBV 및 공정 대조군(EBVIC)에 대한 Ct 값에 의해 결정된 바와 같이, 바이러스성 DNA를 추출하는 데 있어서 MnCl2가 MgCl2보다 더 효과적이었음을 보여준다. 도 7은 MgCl2 및 MnCl2에 의한 EBV DNA 추출 방법들을 비교하는 정량적 분석을 예시한다.
실시예 4: 생물학적 샘플로부터의 C. 디피실레( C. difficile ) DNA의 추출
이 실시예는 세균을 함유하는 샘플들로부터의 세균성 DNA의 추출에 2가 염들이 사용될 수 있음을 예시한다. 샘플들은 250 μl 의 합성 대변 스왑(대변) 또는 트리스 EDTA 완충액(TE) 중 100개의 세포의 C. 디피실레 027(NCTC 13366)로 구성되었다. 추출 용액의 첨가 전에, 1.48 M의 CaCl2, MgCl2 또는 MnCl2를 샘플들에 첨가하였다. 자동화 핵산 추출 시스템을 사용하여 샘플들로부터 DNA를 추출하였다. 정량적 PCR 증폭을 사용하여 표적 C. 디피실레 DNA를 측정하였다. 결과는 CaCl2 및 MnCl2에 의해 처리된 샘플들이 MgCl2에 의해 처리된 샘플들과 비교하여 더 낮은 Ct 값을 가짐을 보여준다(도 8 참조). 이 데이터는 샘플에 대한 CaCl2 또는 MnCl2의 첨가가, 샘플 내에 제한적인 양으로 존재하는 세균성 DNA를 추출하는 데 효과적임을 보여준다.
실시예 5: RNA 추출을 위한 MnCl 2 및 CaCl 2 의 적정
이 실시예는 알칼리 토금속 염 또는 전이 금속 염이 임상 샘플들로부터 RNA를 추출하는 데 사용될 수 있음을 예시한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 혈장 ml당 5,000 카피의 HIV-1을 섞은 임상 샘플들의 HIV-1 RNA 추출에 대한 다양한 농도들(예를 들어, 64.6 mM, 128.9 mM, 180 mM 및 257.8 mM의 최종 농도)의 CaCl2 및 MnCl2의 영향을 비교하였다. 이들 2가 염을 추출 용액에 앞서 임상 샘플에 첨가하였다.
실시간 정량적 PCR을 수행하여, 각각의 조건으로부터 단리된 추출된 HIV-1 RNA의 수준을 측정하였다. HIV RNA로 구성된 HIV-1 공정 대조군을 RNA 추출 및 PCR 증폭의 양성 대조군으로서 사용하였다. 결과는, RNA 추출에 있어서, 64 mM MnCl2가 64 mM CaCl2보다 더 효과적이었음을 보여준다(도 9 참조). 더 높은 농도(예를 들어, 128.9 mM 및 180 mM)에서, 이들 2가 염은 유사하게 수행하였다. 그렇지만, 최고 염 농도에서, 공정 대조군(HIVIC)의 Ct 값은 CaCl2보다 MnCl2의 경우가 더 높았다.
실시예 6: HIV RNA 제조에서의 CTAB의 사용
이 실시예는 HIV-1을 함유하는 샘플들의 바이러스성 RNA 추출에 대한 다양한 계면활성제들의 영향을 예시한다. 제1 검정에서는, 이온성 및 양이온성 계면활성제를 비교하였다. HIV-1 RNA 공정 대조군(예를 들어, 신드비스/HIV RNA)과 함께 ml당 2,000 카피의 HIV-1을 샘플들에 섞었다. 2,010 μl의 총 샘플 부피에서 200 μl의 10% 트리톤 X-100, 1% 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 5% CTAB, 10% CTAB, 또는 계면활성제 없음에 의해 RNA를 추출하였다. 상이한 추출 조건들의 성능을 실시간 정량적 PCR 분석에 기초하여 평가하였다. 특히, 낮은 평균 HIV-1 및 HIV 공정 대조군 Ct 값(각각 HIV Cp 및 HIV PC Cp), 및 HIV-1 및 HIV-1 공정 대조군의 높은 평균 진폭(각각 HIV RFU 및 HIV PCR RFU)은 효과적인 바이러스성 RNA 추출을 나타낸다. 결과는 10% 트리톤 X-100 또는 10% CTAB에 의한 추출 조건들이 유사하게 수행하였으며, 시험된 다른 조건들과 비교하여 가장 효과적이었음을 보여준다(도 10a 및 도 10b 참조).
제2 검정에서는, 다양한 비이온성 계면활성제들의 성능을 분석하였다. 샘플 ml당 10,000 카피의 HIV 및 1:10,000 희석률의 HIV-1 공정 대조군을 섞은 샘플들로부터 HIV-1 RNA를 추출하였다. 비이온성 계면활성제에는 10% 트리톤 X-100, 10% NP-40, 10% NP-40 대체물, 2% 트윈, 5% 트윈, 10% 트윈-80, 및 계면활성제 없음이 포함되었다. 이 데이터는 10% 트리톤 X-100, 10% NP-40 및 10% NP-40 대체물에 의한 바이러스성 RNA 추출이 비등하였음을 보여준다(도 10c 참조). 이들 추출 방법은, Ct 값에 의해 결정된 바와 같이, 유사한 수준의 HIV-RNA를 단리하였다.
실시예 7: 생물학적 샘플로부터의 B형 간염 DNA의 추출
이 실시예는 CaCl2가 B형 간염 바이러스를 함유하는 샘플들로부터의 B형 간염 바이러스성 DNA의 추출에 사용될 수 있으며, CaCl2를 사용한 추출로부터의 DNA 수율이 열과 조합하여 사용될 때 증가될 수 있음을 예시한다. 샘플들은 700 μl의 K2EDTA 혈장 중 7 국제 단위(IU) B형 바이러스로 구성되었다(도 11). 1.48 M CaCl2, 10% 트리톤-X 100 및 800 단위/μl 프로테아제를 첨가함으로써 B형 간염 바이러스의 용해를 달성하였다. 이 혼합물을 70 ℃로 설정된 가열기 내에서 0초, 50초, 60초 또는 70초 동안 인큐베이팅하고, 이어서 4.7 M 아세테이트 완충액에 이어 2 mg/ml의 자성 입자들을 첨가하였다. 입자들에 결합된 DNA를 3회 세척에 의해 정제하고, 이어서, 가열된 75 mM NaOH의 첨가에 의해 입자들로부터 해리하였다. B형 간염 DNA의 상기 언급된 추출 및 정제는 자동화 핵산 추출 시스템에서 수행하였다. 정량적 PCR 증폭을 사용하여 표적 B형 간염 DNA를 측정하였다. 결과는 CaCl2 및 열에 의해 처리된 샘플들이, 열의 부재 하에서 추출된 샘플들과 비교하여 더 낮은 Ct 값과 관련됨을 보여준다(도 11 참조). 이 데이터는 CaCl2의 사용이, 생물학적 샘플 내에 제한적인 양으로 존재하는 바이러스성 DNA를 추출하는 데 효과적임을 보여준다. 게다가, 이 데이터는 CaCl2와 조합된 열의 사용이 추출의 유효성을 증가시키며, 그 결과 더 큰 DNA 수율을 가져옴을 보여준다.
전술된 화학적 과정은 또한 혈청으로부터 B형 간염 DNA를 추출하는 데 사용될 수 있다. 샘플들은 700 μl 혈청 중 70 또는 700,000 국제 단위 B형 간염 바이러스로 구성되었다(각각 도 12a 및 도 12b). 70 ℃ 가열기 내에서 60초 인큐베이션 시간을 사용하여, 전술된 것과 동일한 화학적 과정에 의해 B형 간염 바이러스의 용해를 달성하였다. 결과는 CaCl2 및 열에 의해 처리된 샘플들이, 열의 부재 하에서 추출된 샘플들과 비교하여 더 낮은 Ct 값과 관련됨을 보여준다(도 12 참조). 이 데이터는 CaCl2의 사용이, 혈청 샘플 내에 제한적인 양 또는 풍부한 양으로 존재하는 바이러스성 DNA를 추출하는 데 효과적임을 보여준다. 게다가, 이 데이터는 CaCl2와 조합된 열의 사용이 추출의 유효성을 증가시키며, 그 결과 더 큰 DNA 수율을 가져옴을 보여준다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은, 마치 각각의 개개의 간행물 또는 특허 출원이 전체적으로 참고로 포함된 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 지시되어 있는 것처럼, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
전술된 발명이 명확한 이해를 위하여 예시로서 그리고 예로서 다소 상세하게 기술되어 있지만, 당업자는 첨부된 특허청구범위의 범주 내에서 소정의 변경 및 변형이 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 게다가, 본 명세서에 제공된 각각의 참고문헌은, 마치 각각의 참고문헌이 참고로 개별적으로 포함되어 있는 것처럼 그와 동일한 정도로 전체적으로 참고로 포함된다.

Claims (38)

  1. 세포 또는 미생물을 포함하는 생물학적 샘플로부터 표적 핵산을 추출하기 위한 방법으로서,
    (a) 전이 금속 염, 알칼리 토금속 염, 또는 이들의 조합을 상기 생물학적 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시키기에 충분한 양으로 상기 생물학적 샘플에 첨가하는 단계;
    (b) 추출 용액을 상기 세포 또는 미생물을 용해시키기에 충분한 양으로 상기 생물학적 샘플에 첨가함으로써 용해물(lysate)을 형성하는 단계;
    (c) 산성 완충액을 상기 용해물의 pH를 감소시키기에 충분한 양으로 상기 용해물에 첨가하는 단계; 및
    (d) 상기 용해물로부터 상기 표적 핵산을 분리하여 상기 생물학적 샘플로부터 상기 표적 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (d) 후에 핵산 증폭을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 핵산 증폭은 PCR인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 핵산 증폭으로부터 생성된 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)와 단계 (b)는 동시에 수행되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 가래, 타액, 대변, 또는 조직인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 RNA인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 핵산은 바이러스성 RNA인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)를 수행한 후의 상기 용해물의 pH는 pH 1 내지 pH 5의 산성 범위 내에 있는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출 용액은 프로테이나제 K, 계면활성제(detergent), 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 계면활성제는 양이온성 또는 비이온성 계면활성제인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 세트리모늄 브로마이드인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 트리톤(Triton) X-100인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)는 자성 입자들을 단계 (c)에서의 상기 용해물에 첨가하는 단계; 자성 미세입자 분리를 사용하여 상기 용해물로부터 상기 자성 미세입자들을 분리하는 단계; 세척 용액을 상기 자성 미세입자들에 첨가하는 단계; 및 용리 완충액을 상기 자성 미세입자들에 첨가하여 상기 핵산을 용리시키는 단계에 의해 수행되는 방법.
  19. 표적 핵산 및 뉴클레아제를 포함하는 샘플에서 증폭된 핵산 산물을 검출하기 위한 방법으로서,
    (a) 전이 금속 염, 알칼리 토금속 염, 또는 이들의 조합을 상기 샘플 내의 상기 뉴클레아제를 불활성화시키기에 충분한 양으로 상기 샘플에 첨가하는 단계;
    (b) 산성 완충액을 용해물의 pH를 감소시키기에 충분한 양으로 상기 샘플에 첨가하는 단계;
    (c) 핵산 증폭 반응을 수행하여 상기 표적 핵산으로부터 상기 증폭된 핵산 산물을 생성하는 단계;
    (d) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 단계 (a)와 단계 (b)는 동시에 수행되는 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액인 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 증폭 반응은 PCR 과정인 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 RNA인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 표적 핵산은 바이러스성 RNA인 방법.
  27. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산은 DNA, 선택적으로 바이러스성 DNA인 방법.
  28. 핵산, 뉴클레아제 및 억제제를 포함하는 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하기 위한 키트로서,
    (a) 추출 용액;
    (b) 전이 금속 염 용액, 알칼리 토금속 염 용액, 또는 이들의 조합;
    (c) 산성 완충액; 및
    (d) 세척 용액을 포함하는 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 추출 용액은 프로테이나제 K, 계면활성제, 또는 이들의 조합을 포함하는 키트.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 전이 금속 염은 망간 염 또는 아연 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알칼리 토금속 염은 마그네슘 염 또는 칼슘 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 키트.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 완충액은 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액인 키트.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 용액은 트라이플루오로아세트산 용액 또는 염산 용액인 키트.
  34. B형 간염 바이러스를 포함하는 생물학적 샘플로부터 표적 B형 간염 바이러스성 핵산을 추출하기 위한 방법으로서,
    (a) 전이 금속 염, 알칼리 토금속 염, 또는 이들의 조합을 상기 생물학적 샘플 내의 뉴클레아제를 불활성화시키기에 충분한 양으로 상기 생물학적 샘플에 첨가하는 단계;
    (b) 추출 용액을 상기 세포 또는 미생물을 용해시키기에 충분한 양으로 상기 생물학적 샘플에 첨가함으로써 용해물을 형성하는 단계;
    (c) 산성 완충액을 상기 용해물의 pH를 감소시키기에 충분한 양으로 상기 용해물에 첨가하는 단계;
    (d) 상기 샘플을 가열하는 단계; 및
    (e) 상기 용해물로부터 상기 표적 핵산을 분리하여 상기 생물학적 샘플로부터 상기 표적 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 약 50℃ 내지 약 80℃의 온도로 가열되는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 약 65℃ 내지 약 75℃의 온도로 가열되는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기 가열하는 단계는 약 30초 내지 약 90초 동안 수행되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 가열하는 단계는 약 50초 내지 약 70초 동안 수행되는 방법.
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