JP2004008094A - 核酸抽出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸を抽出すべき生物材料から簡単かつ効率よく、しかも有害性の高い試薬を用いずに核酸を抽出することができる方法を提供し、特に、細胞を破壊することが難しく、従来核酸を抽出するために特別の操作が必要となっていた生物材料、例えばマイコバクテリウム属の細菌から、簡単かつ効率よく、しかも有害性の高い試薬を用いずに核酸を抽出することができる方法を提供する。
【解決手段】核酸を抽出すべき生物材料を、キレート試薬を含む溶液中で微粒子と攪拌することにより核酸を抽出する方法。例えば、前記キレート試薬としては、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似の試薬から選ばれる。
【選択図】 図７
【解決手段】核酸を抽出すべき生物材料を、キレート試薬を含む溶液中で微粒子と攪拌することにより核酸を抽出する方法。例えば、前記キレート試薬としては、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似の試薬から選ばれる。
【選択図】 図７
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を用いて各種の操作を行う場合の試料となる核酸を得るための核酸抽出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウィルス、細菌、真菌、原虫、植物、動物などの生物材料から核酸を抽出する一般的な方法として、リゾチームなどの酵素により細胞壁を分解し、溶液中に抽出する方法や、プロテネースなどの酵素によりタンパク質を分解し細胞を破壊し、溶液中に抽出する方法などが用いられている。溶液中に抽出された核酸はフェノール・クロロホルムによる夾雑物の変性と除去、及びエタノール沈殿法などによる濃縮精製がなされる。
【０００３】
しかし、上記の酵素処理による核酸抽出は、熟練した技術が要求されるものであり、また、時間もかかるため処理効率が悪いという問題がある。特に、この方法を、マイコバクテリウム属の細菌や真菌類であるカビの胞子などの細胞壁が堅いものに適用した場合は、菌体が壊れないために、核酸の抽出効率が極端に悪い。たとえば、菌体の破壊が難しいマイコバクテリウム属の細菌から核酸を抽出するために、Ｖａｒｙらの論文（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８（５）， ９３３−９３７， （１９９０））に記載された方法では、３種類の酵素で計４８時間におよぶ処理を行っている。
【０００４】
そこで、細胞壁が堅く、菌体破壊が難しいという問題を克服するために、フェノールと微粒子を用いて激しく撹拌する方法が知られている。例えば、Ｇｉｅｓｓｅｎらの論文（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３６（１９９２）， ２５５−２６３）では、マイコバクテリウム属の細菌を含む検体を、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）及びフェノール中で酸化ジルコニウムの微粒子と共に激しく攪拌することで菌体を破壊するという工夫をしている。また、アメリカ特許４，９１８，１７８号明細書にも同様の記載がある。
【０００５】
しかし、この方法では核酸抽出の効率は良くなる反面、フェノールという非常に有害性の高い試薬を用いることや、攪拌操作中にフェノールが実験室環境を汚染するという問題などがあり、実用性は低い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸を抽出すべき生物材料から簡単かつ効率よく、しかも有害性の高い試薬を用いずに核酸を抽出することができる方法を提供することにある。とくに本発明の目的は、細胞を破壊することが難しく、従来核酸を抽出するために特別の操作が必要となっていた生物材料、特にマイコバクテリウム属の細菌から、簡単かつ効率よく、しかも有害性の高い試薬を用いずに核酸を抽出することができる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討した結果、生物材料をキレート試薬を含む溶液中で微粒子と激しく攪拌することで、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、核酸を抽出すべき生物材料を、微粒子の存在下、キレート試薬を含む溶液中で攪拌することを特徴とする核酸抽出法である。
【０００９】
本発明は、前記キレート試薬は、ポリアミノカルボン酸及びその塩からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出法である。
【００１０】
本発明は、前記キレート試薬は、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似の試薬からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出法である。
【００１１】
本発明は、前記キレート試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランスー１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（ＴＰＥＮ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出法である。
【００１２】
本発明は、前記溶液中における前記キレート試薬の濃度が５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭであることを特徴とする、前記の核酸抽出法である。
【００１３】
本発明は、フェノールを用いないことを特徴とする、前記の核酸抽出法である。
【００１４】
本発明は、前記生物材料がウイルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物である、前記の核酸抽出法である。
本発明は、細菌がマイコバクテリウム属に属するものである、前記の核酸抽出法である。
本発明は、マイコバクテリウム属の細菌が、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ病菌、クローン病菌である、前記の核酸抽出法である。
【００１５】
本発明は、前記生物材料が、生物の組織、体液、分泌物、排泄物などの生物試料、又は土、水、空気などの環境試料に含まれる、前記の核酸抽出法である。
本発明は、生物試料が動物の糞、痰又は血液である、前記の核酸抽出法である。
【００１６】
本発明において核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方を意味する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明においては、生物材料を、微粒子の存在下、キレート試薬を含む溶液中で激しく撹拌することにより、溶液中に核酸を抽出する。
【００１８】
本発明において使用する生物材料は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物、動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、特に細胞の破壊が難しい真菌、マイコバクテリウム属の細菌などの生物材料に有用である。マイコバクテリウム属の細菌としては、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ菌（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クローン菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
これらの生物材料を含む試料としては、例えば、動物及び植物の生体組織、家畜や人などに由来する糞、痰、血液などの生物試料、土、水、空気などの環境試料などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明において用いるキレート試薬は、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似したポリアミノカルボン酸を用いると良い。具体的には、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｎｉｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｂｉｃｉｎｅ）、トランスー１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅ；ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（１，６−Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ；ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｋｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ；ＴＰＥＮ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”，Ｎ”−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＴＨＡ）などが挙げられる。これらのキレート試薬は、単独で用いても２種以上を併用しても良い。
【００２１】
細胞壁がその構造を維持する要因のひとつとして、カルシウムイオンの存在がある。これらキレート試薬はカルシウムイオンに配位しやすいものである。これらキレート試薬は、細胞壁のカルシウムイオンに配位し、細胞壁の構造を変成させることによりその構造を維持できない状態にし、細胞壁を破壊しやすくすると考えられる。
【００２２】
本発明において溶液中のキレート試薬は、例えば５ｍＭ〜２５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭの濃度で用いると良い。キレート試薬の濃度が５ｍＭ未満では細胞の破壊効率が低くなる傾向にあり、５００ｍＭより濃度が高いと、細胞破壊後の核酸精製や脱塩処理の過程で付加的な処理が必要になる場合がある。
【００２３】
本発明は、キレート試薬を用いて、細胞を破壊するために従来のフェノールなどの他の変成剤を用いなくとも良いのが特徴であり、このことがより簡便で安全な核酸抽出を可能としている。
【００２４】
また本発明では、細胞の破壊効率を上げるため、微粒子を加えて激しく攪拌する。この時に用いる微粒子は、通常、細胞懸濁液に対し生物学的に関与しないガラスビーズや酸化ジルコニウムの微粒子などが用いられる。通常、微粒子としては比重が２．０以上、例えば２．３〜６．３で、直径が０．０１ｍｍ〜０．９ｍｍのものが用いられるが、これに限定されない。直径１ｍｍ以上だと、細胞の破壊効率が悪くなる傾向にある。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２６】
［実験例１］
生物材料として、マイコバクテリア属の菌であり、ヨーネ病の原因菌であるＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（以下ヨーネ菌と略す）を含むヨーネ病に感染した牛に由来する糞便を用いた。
まず、ヨーネ菌感染牛に由来の糞便１ｇを蒸留水１０ｍＬに懸濁し、５分放置した後、上清５ｍＬを回収し遠心してヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。糞便ペレットを得るための一連の操作を、４回繰り返して４つの糞便ペレットを得た。
【００２７】
次に、得られた各糞便ペレットに、以下に示す核酸抽出溶液を加え、更に直径０．１ｍｍのガラスビーズ（比重：２．５）８００ｍｇを加え、ＢＩＯＳＰＥＣ社のＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲを用いて攪拌（５，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した。ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲによる攪拌の後、遠心して上清５００μＬを回収し、一般的な精製及び脱塩濃縮法であるフェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行って、核酸ペレットを得た。
【００２８】
（核酸抽出溶液）
［実験例Ａ］ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ、フェノール
［実験例Ｂ］ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
［実験例Ｃ］ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）７５０μＬ、フェノール ７５０μＬ
［実験例Ｄ］ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）７５０μＬ
【００２９】
上記実験例Ａ〜Ｄで得られた各核酸ペレットを蒸留水５０μＬに溶解し、更に蒸留水を用いてペレット溶解液の２倍段階稀釈系列を調製した。得られた核酸の稀釈系列それぞれに、ヨーネ菌に特異的な遺伝子であるＩＳ９００の一部の領域を増幅するためのプライマー［塩基配列がＧＡＴＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧのもの（配列番号１）及びＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴのもの（配列番号２）］、Ｔａｑポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ及び緩衝溶液を添加し、９７℃−３０秒、６５℃−３０秒、７２℃−３０秒、４０サイクルの温度条件でＰＣＲ反応を行った。
【００３０】
ＰＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で反応産物を検出し、上記実験例Ａ〜Ｄの抽出効率の違いを検討した。
【００３１】
上記実験例Ａ〜Ｄによる反応産物の検出結果をそれぞれ図１〜図４に示した。この実験で使用したＰＣＲプライマーでは、ＩＳ９００遺伝子が存在すれば３６２塩基対（ｂｐ）の反応産物が得られる。レーン１（左端）は核酸ペレット溶解液５０μＬの内の２５μＬを、レーン２は１２．５μＬ、レーン３は６．３μＬ、レーン４は３．１μＬ、レーン５は１．６μＬ、レーン６は０．８μＬ、レーン７は０．４μＬ、レーン８は０．２μＬ含んでいる。なお、レーンＭは分子量マーカーでΦｘ１７４ ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて消化したものである。より少量の試料しか含まない右側のレーンまで反応産物が検出されている場合ほど抽出効率が良い。
【００３２】
実験例Ａ及び実験例Ｃにおいては有害なフェノールを用いたため、それぞれレーン５まで（図１）、レーン６まで（図３）反応産物が検出されており、抽出効率が良かった。実験例Ｂにおいては、用いたＥＤＴＡの濃度が１ｍＭと低いため核酸抽出にＥＤＴＡの効果はなく、レーン１に微弱なバンドが検出されたのみであった（図２）。実験例Ｄにおいては、フェノールもＥＤＴＡも用いなかったため、レーン２に微弱なバンドが検出されたのみであり、抽出効率は悪かった（図４）。
【００３３】
［実験例２］
まず、実験例１の場合と同様の操作で、３つのヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。次に、得られた各糞便ペレットに、以下に示す核酸抽出溶液を加え、更に直径０．１ｍｍのガラスビーズ（比重：２．５）８００ｍｇを加え、ＢＩＯＳＰＥＣ社のＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲを用いて攪拌（５，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した。実験例２においてはフェノールなどの変成剤はいっさい用いなかった。ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲによる攪拌の後、遠心して上清５００μＬを回収し、一般的な精製及び脱塩濃縮法であるフェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行って、核酸ペレットを得た。
【００３４】
（核酸抽出溶液）
［実験例Ｅ］ 溶液Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
［実施例Ｆ］ 溶液Ｆ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
［実施例Ｇ］ 溶液Ｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
【００３５】
得られた核酸ペレットを実験例１の場合と同様の方法で段階希釈、ＰＣＲ反応、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で処理し、Ｅ〜Ｇの場合の抽出効率の違いを検討した。
【００３６】
Ｅ〜Ｇの場合の反応産物の検出結果をそれぞれ図５〜図７に示した。抽出時の溶液にＥＤＴＡを５ｍＭ用いた実験例Ｅにおいてはレーン５まで（図５）、ＥＤＴＡを１０ｍＭ用いた実験例Ｆはレーン６まで（図６）、ＥＤＴＡを１００ｍＭ用いた実験例Ｇにおいてはレーン８まで（図７）反応産物が検出されており、ＥＤＴＡの濃度が高くなるほど抽出効率が高いという結果が得られた。
【００３７】
［実験例３］
まず、実験例１の場合と同様の操作で、２つのヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。次に、得られた各糞便ペレットに、以下に示す核酸抽出溶液を加え、更に直径０．１ｍｍのガラスビーズ（比重：２．５）８００ｍｇを加え、ＢＩＯＳＰＥＣ社のＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲを用いて攪拌（５，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した。実験例３においてもフェノールなどの変成剤はいっさい用いなかった。ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲによる攪拌の後、遠心して上清５００μＬを回収し、一般的な精製及び脱塩濃縮法であるフェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行って、核酸ペレットを得た。
【００３８】
（核酸抽出溶液）
［実施例Ｈ］ 溶液Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＣｙＤＴＡ）７５０μＬ
［実施例Ｉ］ 溶液Ｉ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＧＴＡ）７５０μＬ
【００３９】
得られた核酸ペレットを実験例１の場合と同様の方法で段階希釈、ＰＣＲ反応、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で処理し、Ｈ及びＩの場合の抽出効率の違いを検討した。
【００４０】
Ｈ及びＩの場合の反応産物の検出結果をそれぞれ図８及び図９に示した。抽出時の溶液にＣｙＤＴＡを用いた実施例Ｈにおいてはレーン７まで（図８）、ＥＧＴＡを用いた実施例Ｉにおいてはレーン５まで（図９）反応産物が検出されており、これらＥＤＴＡに類似のポリアミノカルボン酸もＥＤＴＡと同様の高い抽出効率を示した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、核酸を抽出すべき生物材料から、有害な試薬を用いずとも効率よく核酸を抽出することができる。特に、マイコバクテリウム属の細菌などの、細胞を破壊することが難しく、核酸を抽出するために特別の操作が必要であった生物材料から、有害な試薬を用いずとも効率よく核酸を抽出することができる。
【配列表】
＜１１０＞ｓｈｉｍａｄｚｕ ｃｏｒｐ．
＜１２０＞ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ
＜１３０＞Ｋ１０２０２８３
＜１６０＞２
＜２１０＞１
＜２１１＞２３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞１
ｇａｔｃｇｇａａｃｇｔｃｇｇｃｔｇｇｔｃａｇｇ
＜２１０＞２
＜２１１＞２４
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞２
ａｃｇａｃｇａｃｇｃｇｃａｇｃｇａｔｔｇｃｔｃｔ
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸抽出溶液としてＴＥ ｂｕｆｆｅｒとフェノールとを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図２】核酸抽出溶液としてＴＥ ｂｕｆｆｅｒを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図３】核酸抽出溶液としてＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒとフェノールとを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図４】核酸抽出溶液としてＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図５】核酸抽出溶液として溶液Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図６】核酸抽出溶液として溶液Ｆ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図７】核酸抽出溶液として溶液Ｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図８】核酸抽出溶液として溶液Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＣｙＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図９】核酸抽出溶液として溶液Ｉ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＧＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を用いて各種の操作を行う場合の試料となる核酸を得るための核酸抽出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウィルス、細菌、真菌、原虫、植物、動物などの生物材料から核酸を抽出する一般的な方法として、リゾチームなどの酵素により細胞壁を分解し、溶液中に抽出する方法や、プロテネースなどの酵素によりタンパク質を分解し細胞を破壊し、溶液中に抽出する方法などが用いられている。溶液中に抽出された核酸はフェノール・クロロホルムによる夾雑物の変性と除去、及びエタノール沈殿法などによる濃縮精製がなされる。
【０００３】
しかし、上記の酵素処理による核酸抽出は、熟練した技術が要求されるものであり、また、時間もかかるため処理効率が悪いという問題がある。特に、この方法を、マイコバクテリウム属の細菌や真菌類であるカビの胞子などの細胞壁が堅いものに適用した場合は、菌体が壊れないために、核酸の抽出効率が極端に悪い。たとえば、菌体の破壊が難しいマイコバクテリウム属の細菌から核酸を抽出するために、Ｖａｒｙらの論文（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２８（５）， ９３３−９３７， （１９９０））に記載された方法では、３種類の酵素で計４８時間におよぶ処理を行っている。
【０００４】
そこで、細胞壁が堅く、菌体破壊が難しいという問題を克服するために、フェノールと微粒子を用いて激しく撹拌する方法が知られている。例えば、Ｇｉｅｓｓｅｎらの論文（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３６（１９９２）， ２５５−２６３）では、マイコバクテリウム属の細菌を含む検体を、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）及びフェノール中で酸化ジルコニウムの微粒子と共に激しく攪拌することで菌体を破壊するという工夫をしている。また、アメリカ特許４，９１８，１７８号明細書にも同様の記載がある。
【０００５】
しかし、この方法では核酸抽出の効率は良くなる反面、フェノールという非常に有害性の高い試薬を用いることや、攪拌操作中にフェノールが実験室環境を汚染するという問題などがあり、実用性は低い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸を抽出すべき生物材料から簡単かつ効率よく、しかも有害性の高い試薬を用いずに核酸を抽出することができる方法を提供することにある。とくに本発明の目的は、細胞を破壊することが難しく、従来核酸を抽出するために特別の操作が必要となっていた生物材料、特にマイコバクテリウム属の細菌から、簡単かつ効率よく、しかも有害性の高い試薬を用いずに核酸を抽出することができる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討した結果、生物材料をキレート試薬を含む溶液中で微粒子と激しく攪拌することで、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、核酸を抽出すべき生物材料を、微粒子の存在下、キレート試薬を含む溶液中で攪拌することを特徴とする核酸抽出法である。
【０００９】
本発明は、前記キレート試薬は、ポリアミノカルボン酸及びその塩からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出法である。
【００１０】
本発明は、前記キレート試薬は、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似の試薬からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出法である。
【００１１】
本発明は、前記キレート試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランスー１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（ＴＰＥＮ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）からなる群から選ばれる、前記の核酸抽出法である。
【００１２】
本発明は、前記溶液中における前記キレート試薬の濃度が５ｍＭ〜５００ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭであることを特徴とする、前記の核酸抽出法である。
【００１３】
本発明は、フェノールを用いないことを特徴とする、前記の核酸抽出法である。
【００１４】
本発明は、前記生物材料がウイルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物である、前記の核酸抽出法である。
本発明は、細菌がマイコバクテリウム属に属するものである、前記の核酸抽出法である。
本発明は、マイコバクテリウム属の細菌が、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ病菌、クローン病菌である、前記の核酸抽出法である。
【００１５】
本発明は、前記生物材料が、生物の組織、体液、分泌物、排泄物などの生物試料、又は土、水、空気などの環境試料に含まれる、前記の核酸抽出法である。
本発明は、生物試料が動物の糞、痰又は血液である、前記の核酸抽出法である。
【００１６】
本発明において核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方を意味する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明においては、生物材料を、微粒子の存在下、キレート試薬を含む溶液中で激しく撹拌することにより、溶液中に核酸を抽出する。
【００１８】
本発明において使用する生物材料は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、植物、動物などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、特に細胞の破壊が難しい真菌、マイコバクテリウム属の細菌などの生物材料に有用である。マイコバクテリウム属の細菌としては、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ菌（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クローン菌などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
これらの生物材料を含む試料としては、例えば、動物及び植物の生体組織、家畜や人などに由来する糞、痰、血液などの生物試料、土、水、空気などの環境試料などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明において用いるキレート試薬は、ＥＤＴＡ又はＥＤＴＡに類似したポリアミノカルボン酸を用いると良い。具体的には、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｎｉｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ；Ｂｉｃｉｎｅ）、トランスー１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅ；ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）；ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（Ｏ，Ｏ’−Ｂｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（１，６−Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ；ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−Ｔｅｔｒａｋｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ；ＴＰＥＮ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”，Ｎ”−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＴＨＡ）などが挙げられる。これらのキレート試薬は、単独で用いても２種以上を併用しても良い。
【００２１】
細胞壁がその構造を維持する要因のひとつとして、カルシウムイオンの存在がある。これらキレート試薬はカルシウムイオンに配位しやすいものである。これらキレート試薬は、細胞壁のカルシウムイオンに配位し、細胞壁の構造を変成させることによりその構造を維持できない状態にし、細胞壁を破壊しやすくすると考えられる。
【００２２】
本発明において溶液中のキレート試薬は、例えば５ｍＭ〜２５０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭ〜２５０ｍＭの濃度で用いると良い。キレート試薬の濃度が５ｍＭ未満では細胞の破壊効率が低くなる傾向にあり、５００ｍＭより濃度が高いと、細胞破壊後の核酸精製や脱塩処理の過程で付加的な処理が必要になる場合がある。
【００２３】
本発明は、キレート試薬を用いて、細胞を破壊するために従来のフェノールなどの他の変成剤を用いなくとも良いのが特徴であり、このことがより簡便で安全な核酸抽出を可能としている。
【００２４】
また本発明では、細胞の破壊効率を上げるため、微粒子を加えて激しく攪拌する。この時に用いる微粒子は、通常、細胞懸濁液に対し生物学的に関与しないガラスビーズや酸化ジルコニウムの微粒子などが用いられる。通常、微粒子としては比重が２．０以上、例えば２．３〜６．３で、直径が０．０１ｍｍ〜０．９ｍｍのものが用いられるが、これに限定されない。直径１ｍｍ以上だと、細胞の破壊効率が悪くなる傾向にある。
【００２５】
【実施例】
以下に実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００２６】
［実験例１］
生物材料として、マイコバクテリア属の菌であり、ヨーネ病の原因菌であるＭｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（以下ヨーネ菌と略す）を含むヨーネ病に感染した牛に由来する糞便を用いた。
まず、ヨーネ菌感染牛に由来の糞便１ｇを蒸留水１０ｍＬに懸濁し、５分放置した後、上清５ｍＬを回収し遠心してヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。糞便ペレットを得るための一連の操作を、４回繰り返して４つの糞便ペレットを得た。
【００２７】
次に、得られた各糞便ペレットに、以下に示す核酸抽出溶液を加え、更に直径０．１ｍｍのガラスビーズ（比重：２．５）８００ｍｇを加え、ＢＩＯＳＰＥＣ社のＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲを用いて攪拌（５，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した。ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲによる攪拌の後、遠心して上清５００μＬを回収し、一般的な精製及び脱塩濃縮法であるフェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行って、核酸ペレットを得た。
【００２８】
（核酸抽出溶液）
［実験例Ａ］ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ、フェノール
［実験例Ｂ］ ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
［実験例Ｃ］ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）７５０μＬ、フェノール ７５０μＬ
［実験例Ｄ］ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）７５０μＬ
【００２９】
上記実験例Ａ〜Ｄで得られた各核酸ペレットを蒸留水５０μＬに溶解し、更に蒸留水を用いてペレット溶解液の２倍段階稀釈系列を調製した。得られた核酸の稀釈系列それぞれに、ヨーネ菌に特異的な遺伝子であるＩＳ９００の一部の領域を増幅するためのプライマー［塩基配列がＧＡＴＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＧのもの（配列番号１）及びＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＧＣＡＧＣＧＡＴＴＧＣＴＣＴのもの（配列番号２）］、Ｔａｑポリメラーゼ酵素、ｄＮＴＰ及び緩衝溶液を添加し、９７℃−３０秒、６５℃−３０秒、７２℃−３０秒、４０サイクルの温度条件でＰＣＲ反応を行った。
【００３０】
ＰＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で反応産物を検出し、上記実験例Ａ〜Ｄの抽出効率の違いを検討した。
【００３１】
上記実験例Ａ〜Ｄによる反応産物の検出結果をそれぞれ図１〜図４に示した。この実験で使用したＰＣＲプライマーでは、ＩＳ９００遺伝子が存在すれば３６２塩基対（ｂｐ）の反応産物が得られる。レーン１（左端）は核酸ペレット溶解液５０μＬの内の２５μＬを、レーン２は１２．５μＬ、レーン３は６．３μＬ、レーン４は３．１μＬ、レーン５は１．６μＬ、レーン６は０．８μＬ、レーン７は０．４μＬ、レーン８は０．２μＬ含んでいる。なお、レーンＭは分子量マーカーでΦｘ１７４ ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｃＩＩを用いて消化したものである。より少量の試料しか含まない右側のレーンまで反応産物が検出されている場合ほど抽出効率が良い。
【００３２】
実験例Ａ及び実験例Ｃにおいては有害なフェノールを用いたため、それぞれレーン５まで（図１）、レーン６まで（図３）反応産物が検出されており、抽出効率が良かった。実験例Ｂにおいては、用いたＥＤＴＡの濃度が１ｍＭと低いため核酸抽出にＥＤＴＡの効果はなく、レーン１に微弱なバンドが検出されたのみであった（図２）。実験例Ｄにおいては、フェノールもＥＤＴＡも用いなかったため、レーン２に微弱なバンドが検出されたのみであり、抽出効率は悪かった（図４）。
【００３３】
［実験例２］
まず、実験例１の場合と同様の操作で、３つのヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。次に、得られた各糞便ペレットに、以下に示す核酸抽出溶液を加え、更に直径０．１ｍｍのガラスビーズ（比重：２．５）８００ｍｇを加え、ＢＩＯＳＰＥＣ社のＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲを用いて攪拌（５，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した。実験例２においてはフェノールなどの変成剤はいっさい用いなかった。ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲによる攪拌の後、遠心して上清５００μＬを回収し、一般的な精製及び脱塩濃縮法であるフェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行って、核酸ペレットを得た。
【００３４】
（核酸抽出溶液）
［実験例Ｅ］ 溶液Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
［実施例Ｆ］ 溶液Ｆ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
［実施例Ｇ］ 溶液Ｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）７５０μＬ
【００３５】
得られた核酸ペレットを実験例１の場合と同様の方法で段階希釈、ＰＣＲ反応、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で処理し、Ｅ〜Ｇの場合の抽出効率の違いを検討した。
【００３６】
Ｅ〜Ｇの場合の反応産物の検出結果をそれぞれ図５〜図７に示した。抽出時の溶液にＥＤＴＡを５ｍＭ用いた実験例Ｅにおいてはレーン５まで（図５）、ＥＤＴＡを１０ｍＭ用いた実験例Ｆはレーン６まで（図６）、ＥＤＴＡを１００ｍＭ用いた実験例Ｇにおいてはレーン８まで（図７）反応産物が検出されており、ＥＤＴＡの濃度が高くなるほど抽出効率が高いという結果が得られた。
【００３７】
［実験例３］
まず、実験例１の場合と同様の操作で、２つのヨーネ菌を含む糞便ペレットを得た。次に、得られた各糞便ペレットに、以下に示す核酸抽出溶液を加え、更に直径０．１ｍｍのガラスビーズ（比重：２．５）８００ｍｇを加え、ＢＩＯＳＰＥＣ社のＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲを用いて攪拌（５，０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）した。実験例３においてもフェノールなどの変成剤はいっさい用いなかった。ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲによる攪拌の後、遠心して上清５００μＬを回収し、一般的な精製及び脱塩濃縮法であるフェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿を行って、核酸ペレットを得た。
【００３８】
（核酸抽出溶液）
［実施例Ｈ］ 溶液Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＣｙＤＴＡ）７５０μＬ
［実施例Ｉ］ 溶液Ｉ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＧＴＡ）７５０μＬ
【００３９】
得られた核酸ペレットを実験例１の場合と同様の方法で段階希釈、ＰＣＲ反応、アガロースゲル電気泳動、エチジウム染色、トランスイルミネータによる写真撮影の手順で処理し、Ｈ及びＩの場合の抽出効率の違いを検討した。
【００４０】
Ｈ及びＩの場合の反応産物の検出結果をそれぞれ図８及び図９に示した。抽出時の溶液にＣｙＤＴＡを用いた実施例Ｈにおいてはレーン７まで（図８）、ＥＧＴＡを用いた実施例Ｉにおいてはレーン５まで（図９）反応産物が検出されており、これらＥＤＴＡに類似のポリアミノカルボン酸もＥＤＴＡと同様の高い抽出効率を示した。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、核酸を抽出すべき生物材料から、有害な試薬を用いずとも効率よく核酸を抽出することができる。特に、マイコバクテリウム属の細菌などの、細胞を破壊することが難しく、核酸を抽出するために特別の操作が必要であった生物材料から、有害な試薬を用いずとも効率よく核酸を抽出することができる。
【配列表】
＜１１０＞ｓｈｉｍａｄｚｕ ｃｏｒｐ．
＜１２０＞ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ
＜１３０＞Ｋ１０２０２８３
＜１６０＞２
＜２１０＞１
＜２１１＞２３
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞１
ｇａｔｃｇｇａａｃｇｔｃｇｇｃｔｇｇｔｃａｇｇ
＜２１０＞２
＜２１１＞２４
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞２
ａｃｇａｃｇａｃｇｃｇｃａｇｃｇａｔｔｇｃｔｃｔ
【図面の簡単な説明】
【図１】核酸抽出溶液としてＴＥ ｂｕｆｆｅｒとフェノールとを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図２】核酸抽出溶液としてＴＥ ｂｕｆｆｅｒを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図３】核酸抽出溶液としてＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒとフェノールとを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図４】核酸抽出溶液としてＴｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図５】核酸抽出溶液として溶液Ｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図６】核酸抽出溶液として溶液Ｆ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図７】核酸抽出溶液として溶液Ｇ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図８】核酸抽出溶液として溶液Ｈ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＣｙＤＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
【図９】核酸抽出溶液として溶液Ｉ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＧＴＡ）を用いた場合のＰＣＲ反応産物の、アガロースゲル電気泳動による検出結果である。
Claims (11)
- 核酸を抽出すべき生物材料を、微粒子の存在下、キレート試薬を含む溶液中で攪拌することを特徴とする核酸抽出法。
- 前記キレート試薬は、ポリアミノカルボン酸及びその塩からなる群から選ばれる、請求項１に記載の核酸抽出法。
- 前記キレート試薬は、ＥＤＴＡ及びＥＤＴＡに類似の試薬からなる群から選ばれる、請求項１に記載の核酸抽出法。
- 前記キレート試薬は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランスー１，２−ジアミノシクロヘキサン−エチレンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノー２−ヒドロキシプロパン−エチレンジアミン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロパン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（ＴＰＥＮ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸抽出法。
- 前記溶液中におけるキレート試薬の濃度が５ｍＭ〜５００ｍＭである、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の核酸抽出法。
- フェノールを用いないことを特徴とする、請求項１〜５のうちいずれか１項に記載の核酸抽出法。
- 前記生物材料がウイルス、細菌、真菌、原虫、植物又は動物である、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の核酸抽出法。
- 前記細菌がマイコバクテリウム属に属するものである、請求項７に記載の核酸抽出法。
- 前記マイコバクテリウム属の細菌が、結核菌、非定型抗酸菌、癩菌、ヨーネ病菌又はクローン病菌である、請求項８に記載の核酸抽出法。
- 前記生物材料は、生物の組織、体液、分泌物、排泄物などの生物試料、又は土、水、空気などの環境試料に含まれる、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の核酸抽出法。
- 前記生物試料が動物の糞、痰又は血液である、請求項１０に記載の核酸抽出法。
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