JP5520376B2 - 改善された細菌(モリクテス綱)混入の検出 - Google Patents
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Description
(a)上記サンプルを処理して、処理済サンプルから核酸を精製するステップ;次に、
(b)PCR増幅反応のための組成物(反応混合物)を形成するステップであって、該組成物が、
−配列番号1の第1プライマー、
−配列番号2の第2プライマー、及び
−鋳型としての、ステップ(a)の精製された核酸又はその測定画分
である、上記ステップ;次いで
(c)ステップ(b)の組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施するステップ;続いて
(d)増幅された標的配列の存在又は非存在を検出するステップであって、ここで、該増幅された標的配列の存在は、上記サンプル中の細菌混入物の存在を示し、また、該増幅された標的配列の非存在は、上記サンプル中の細菌混入物の非存在を示すものである、上記ステップ
を含み、上記の改善が、上記サンプルの量に対して、CHO細胞由来の所定量のDNAを、(i)サンプル、又は(ii)ステップ(a)の処理済サンプル、又は(iii)ステップ(a)で得られた精製された核酸、又は(iv)ステップ(b)の組成物、に添加し、これにより、添加されたCHO細胞由来のDNAによって、ステップ(d)における非特異的増幅を低減することを特徴とする、上記方法である。本発明の第2の態様は、孵化卵由来の羊水とCHO細胞由来のDNAとを含む組成物である。本発明の第3の態様は、(i)羊水、真核細胞の懸濁液、及び真核細胞の懸濁液の上清からなる群より選択されるサンプル由来の精製された核酸と、(ii)原核生物DNAを含まないCHO細胞由来のDNAとを含む組成物である。本発明の第4の態様は、羊水、真核細胞の懸濁液、及び真核細胞の懸濁液の上清からなる群より選択されるサンプルから単離されたDNAから原核生物混入物のDNAを増幅するための方法における本発明の組成物の使用である。本発明の第5の態様は、(i)溶解試薬と、(ii)原核生物DNAを含まない、所定濃度のCHO細胞由来の精製DNAと、(iii)配列番号1の第1プライマー及び配列番号2の第2プライマーと、を別個の容器に含むキットである。本発明の第6の態様は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施するための改善された方法であって、約100bp〜約1,500bpの範囲のサイズの特異的増幅産物が、1対のオリゴヌクレオチドプライマーのDNAポリメラーゼ触媒伸長によって形成され、上記プライマーは各々、1以上の原核生物の16S-rRNAのゲノム相補配列に含まれる標的配列にハイブリダイズするものであり、上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、PCRにおいて第1鋳型からの特異的増幅鋳型産物を形成することができ、該PCRは、所定の組成物を含む反応混合物(Q)において所定の条件(R)下で実施され、第1鋳型は、第1真核生物のゲノムDNAと1以上の原核生物のゲノムDNAを含ものであり、また、PCRにおいて、上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、上記反応混合物(Q)において上記と同じ条件(R)下で第2鋳型から増幅産物を形成せず、第2鋳型には、1以上の原核生物のゲノムDNAは存在しないが、第1真核生物のゲノムDNAは含まれており、上記改善された方法は、以下のステップ:
(a)上記オリゴヌクレオチドプライマー対を用意するステップ;
(b)第1真核生物のゲノムDNAを用意するステップ;
(c)1以上の原核生物のゲノムDNAを含むことが疑われる第2真核生物のゲノムDNAを含む第3鋳型を用意するステップ;
(d)上記反応混合物(Q)において、(a)のプライマー対、(c)の第3鋳型、及び(b)の第1真核生物のゲノムDNAの測定量を混合して、上記条件(R)下でPCRを実施するステップ
を含み、非特異的PCR増幅産物の形成が抑制される、上記方法である。
いくつかの用語は、特定の意味で用いられるか、あるいは、本発明の説明において初めて定義される。本発明を目的として、用いられる用語は、その定義が、以下に記載する定義とコンフリクトするか、又は部分的にコンフリクトする場合を除いて、当分野で認容されている定義(存在する場合には)によって定義されるものとする。定義にコンフリクトがある場合には、用語の意味は、以下に記載する定義のいずれかによって第1に定義されるものとする。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施するための改善された方法であって、
約100bp〜約1500bpの範囲のサイズを有する特異的増幅産物が、1対のオリゴヌクレオチドプライマーのDNAポリメラーゼ触媒伸長(PCR)によって形成され、該プライマーは各々、1つ以上の原核生物の16S-rRNAのゲノム相補配列に含まれる標的配列にハイブリダイズすることができ、
上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、PCRにおいて、第1鋳型から特異的増幅産物を形成することができ、該PCRは、所定の組成物を含む反応混合物(Q)において所定の条件(R)下で実施され、第1鋳型は、第1真核生物のゲノムDNAと1つ以上の原核生物のゲノムDNAとを含むものであり、
上記PCRにおいて、上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、上記反応混合物(Q)において同じ条件(R)下で第2鋳型から増幅産物を形成せず、第2鋳型には、1つ以上の原核生物のゲノムDNAは存在しないが、第1真核生物のゲノムDNAは含まれており、
上記改善された方法は、以下のステップ:
(a)上記オリゴヌクレオチドプライマー対を用意するステップと;
(b)第1真核生物のゲノムDNAを用意するステップと;
(c)1以上の原核生物のゲノムDNAを含むことが疑われる第2真核生物のゲノムDNAを含む第3の鋳型を用意するステップと;
(d)上記反応混合物(Q)において、(a)のプライマー対、(c)の第3鋳型、及び(b)の第1真核生物のゲノムDNAの測定量を混合し、上記条件(R)下でPCRを実施するステップ
を含み、非特異的PCR増幅産物の形成が抑制される方法である。
1.液体サンプル中の細菌混入物の存在又は非存在を決定するための改善された方法であって、以下のステップ:
(a)上記サンプルを処理して、処理済サンプルから核酸を精製するステップ;次に、
(b)PCR増幅反応のための組成物を形成するステップであって、該組成物が、
−配列番号1の第1プライマー、
−配列番号2の第2プライマー、及び
−鋳型としての、ステップ(a)の精製された核酸又はその測定画分
を含む、上記ステップ;次に
(c)ステップ(b)の組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施し、これにより、原核生物16S-rRNA遺伝子に含まれる標的配列が鋳型に存在する場合には該標的配列を増幅するステップ;続いて
(d)増幅された標的配列の存在又は非存在を検出するステップであって、ここで、該増幅された標的配列の存在は、上記サンプル中の細菌混入物の存在を示し、また、該増幅された標的配列の非存在は、上記サンプル中の細菌混入物の非存在を示すものである、上記ステップ
を含み、
上記の改善が、上記サンプルの量に対して、CHO細胞由来の所定量のDNAを、(i)サンプル、又は(ii)ステップ(a)の処理済サンプル、又は(iii)ステップ(a)で得られた精製された核酸、又は(iv)ステップ(b)の組成物、に添加し、これにより、添加されたCHO細胞由来のDNAによって、ステップ(d)における非特異的増幅を低減させることを特徴とする、上記方法。
約100bp〜約1,500bpの範囲のサイズの特異的増幅産物が、1対のオリゴヌクレオチドプライマーのDNAポリメラーゼ触媒伸長によって形成され、上記プライマーは各々、1以上の原核生物の16S-rRNAのゲノム相補配列に含まれる標的配列にハイブリダイズするものであり、
上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、PCR(P)において第1鋳型からの特異的増幅産物を形成することができ、該PCR(P)は、所定の組成物を含む反応混合物(Q)において所定の条件(R)下で実施され、第1鋳型は、第1真核生物のゲノムDNAと1以上の原核生物のゲノムDNAを含むものであり、
また、Pにおいて、上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、上記反応混合物(Q)において上記と同じ条件(R)下で第2鋳型から増幅産物を形成せず、第2鋳型には、1以上の原核生物のゲノムDNAは存在しないが、第1真核生物のゲノムDNAは含まれており、
上記改善された方法は、以下のステップ:
(a)上記オリゴヌクレオチドプライマー対と、第1真核生物のゲノムDNAを用意するステップ;
(b)1以上の原核生物のゲノムDNAを含むことが疑われる第2真核生物のゲノムDNAを含む第3鋳型を用意するステップ;
(c)上記反応混合物(Q)において、(a)のプライマー対、(b)の第3鋳型、及び第1真核生物のゲノムDNAの測定量を混合し、上記条件(R)下でPCRを実施するステップ
を含み、非特異的PCR増幅産物の形成が抑制される、上記方法。
配列番号1:マイコプラズマ及び関連種の検出のためのユニバーサルプライマー(フォワード);以前、Wong-Lee,J.G.,及びLovett, M., “Rapid and sensitive PCR method for identification of Mycoplasma species in tissue culture” Diagnostic molecular microbiology - principles and applications; Persing, DH, Smith, TF, Tenover,FC, White, TJ (編者)Washington, DC, American Society for Microbiology (1993) 257-260, 及びEldering, J.A.,ら、Biologicals 32 (2004) 183-193に開示されたもの。
配列番号2:マイコプラズマ及び関連種の検出のためのユニバーサルプライマー(リバース);以前、Wong-Lee,J.G.,ら(前掲)及びEldering, J.A.,ら(前掲)に開示されたもの。
配列番号3:グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子における標的配列(対照配列)に特異的なフォワードプライマー。
配列番号4:グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子における標的配列(対照配列)に特異的なリバースプライマー。
図1:レーン:コメント/希釈
1〜5:GAPDH対照PCR;MDCK細胞から単離されたDNA、CHO細胞DNAなし、アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入(spike)
1:非希釈
2:10-1
3:10-2
4:10-3
5:10-4
6:サイズマーカー(50bpステップ)
7〜11:GAPDH対照PCR;MDCK細胞から単離されたDNA、CHO細胞DNAなし、混入なし
7:10-1
8:10-2
9:10-3
10:10-4
11:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜5:GAPDH対照PCR;MDCK細胞から単離されたDNA、CHO細胞DNA添加、アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入
1:非希釈
2:10-1
3:10-2
4:10-3
5:10-4
6:サイズマーカー(50bpステップ)
7〜11:GAPDH対照PCR;MDCK細胞から単離されたDNA、CHO細胞DNAなし、混入なし
7:10-1
8:10-2
9:10-3
10:10-4
11:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;ASCから単離されたDNA、マイコプラズマ・オラーレDNAを混入、CHO細胞DNAなし
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;8つの独立に抜き出したアリコートを用いたPCR
6:バンドのサイズは、特異的標的DNA増幅産物について観測されたサイズ範囲と一致している。
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;ASCから単離されたDNA、マイコプラズマ・オラーレDNAを混入、CHO細胞DNAを添加
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;8つの独立に抜き出したアリコートを用いたPCR
9〜12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;バッファー(「鋳型なし」対照)を用いたPCR
13:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入したトリスバッファー、CHO細胞DNAなし
1〜4:10cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:1cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
9〜12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、混入なし、CHO細胞DNAなし
13、14:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、CHO細胞DNAなし
15:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入したトリスバッファー、CHO細胞DNAを添加
1〜4:10cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:1cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
9〜12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、混入なし、CHO細胞DNAを添加
13、14:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、CHO細胞DNAを添加
15:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜4:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入したベロ細胞懸濁液、CHO細胞DNAなし
1〜4:10cfu アコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;ベロ細胞懸濁液、混入なし、CHO細胞DNAなし
9、10:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、CHO細胞DNAなし
11、12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;バッファー(「鋳型なし」対照)を用いたPCR
13:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜4:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入したベロ細胞懸濁液、CHO細胞DNA添加
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;ベロ細胞懸濁液、混入なし、CHO細胞DNAを添加
9、10:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、CHO細胞DNAを添加
11、12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;バッファー(「鋳型なし」対照)を用いたPCR
13:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜4:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイを「接種」した尿膜液、CHO細胞DNAなし
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;尿膜液、接種なし、CHO細胞DNA添加なし
9,10:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、CHO細胞DNAなし
11:サイズマーカー(50bpステップ)
矢印は、非特異的に増幅されたPCR産物が泳動するゲルの領域を示す。
1〜4:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイを「接種」した尿膜液、2.5μg/50μlのCHO細胞DNA
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;尿膜液、接種なし、2.5μg/50μlのCHO細胞DNA
9,10:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、CHO細胞DNAなし
11:サイズマーカー(50bpステップ)
矢印は、非特異的に増幅されたPCR産物が泳動するゲルの領域を示す。
1〜4:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイを「接種」した尿膜液、5μg/50μlのCHO細胞DNA
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;尿膜液、接種なし、5μg/50μlのCHO細胞DNA
9、10:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;バッファー(「鋳型なし」対照)を用いたPCR
11:サイズマーカー(50bpステップ)
矢印は、非特異的に増幅されたPCR産物が泳動するゲルの領域を示す。
1〜4:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイを「接種」した尿膜液、10μg/50μlのCHO細胞DNA
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;尿膜液、接種なし、10μg/50μlのCHO細胞DNA
9、10:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;バッファー(「鋳型なし」対照)を用いたPCR
11:サイズマーカー(50bpステップ)
矢印は、非特異的に増幅されたPCR産物が泳動するゲルの領域を示す。
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入したトリスバッファー
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA、仔ウシ胸腺DNAなし
5〜8:1cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA、仔ウシ胸腺DNAを添加
9〜12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;非混入トリスバッファー、仔ウシ胸腺DNA添加
13、14:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、PCR反応混合物毎に約10コピーの陽性対照プラスミド(MYCOTOOLキットの一部)、仔ウシ胸腺DNAなし
15:サイズマーカー(50bpステップ)
1〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;アコレプラズマ・レイドラウイを「接種」した尿膜液、仔ウシ胸腺DNAを添加
1〜4:3cfuアコレプラズマ・レイドラウイDNA
5〜8:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;尿膜液、接種なし、仔ウシ胸腺DNA添加
9〜12:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;トリスバッファー、接種なし、仔ウシ胸腺DNA添加
13、14:配列番号1及び配列番号2に示すプライマー;バッファー(「鋳型なし」対照)を用いたPCR
15:サイズマーカー(50bpステップ)
MYCOTOOLキット及びアッセイ
MYCOTOOL PCRマイコプラズマ検出キットは、モリクテス綱に属する細菌の検出のために最適化されたin vitro核酸増幅試験である。該細菌としては、マイコプラズマ・ハイオライニス、マイコプラズマ・アルギニーニ、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・ピラム、マイコプラズマ・サリバルム、マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・シノビエ、スピロプラズマ・ミリアム、スピロプラズマ・シトリ、及びアコレプラズマ・レイドラウイがある。
サンプルに混入するためのモリクテス種由来のDNA
本実施例で用いるサンプルはすべて、原核生物混入物を含まない培養物から得たものである。
MDCK細胞培養物(懸濁細胞)からのサンプルにおけるGAPDHゲノム標的配列の検出
原核生物を含まず、かつ細胞力価が0.79・106細胞/mlのMDCK細胞の培養物を用いた。アコレプラズマ・レイドラウイDNAをサンプル1ml当たり3コロニー形成単位(cfu)の濃度でサンプルに添加した。MYCOTOOLキットの説明書に明記されているように、混入したサンプル材料から核酸を単離した(実施例1も参照のこと)。2つの異なる核酸調製物を、第1は、CHO細胞DNAの添加なしで、また第2はサンプル材料にCHO細胞DNAを添加して(サンプル1ml当たり50 mg)調製した。
脂肪幹細胞(ASC)の培養上清由来の混入サンプルにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出
原核生物を含まないASCを、遠心分離により沈降させた。MYCOTOOLキットの説明書に明記されているように、清澄化上清(細胞培地)をDNA単離に用いた(実施例1も参照のこと)。溶解ステップの前に、マイコプラズマ・オラーレDNAをサンプル1ml当たり3コロニー形成単位(cfu)の濃度でサンプルに添加した。次に、該サンプルを2つの等しい量に分割した。1つのアリコートに対して、上清1ml当たり100mgの濃度でCHO細胞DNAを添加した。全DNAを両方のアリコートから個別に単離した。各DNA調製物のアリコートを用いて複数回のPCR反応を実施した。図3及び図4は、PCRによって得られた増幅産物のDNA断片の電気泳動後のゲルを示す。
混入水性バッファーにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出
混入物を含まない10mM Tris HClバッファーに、バッファー1ml当たり1又は10cfuの濃度のアコレプラズマ・レイドラウイDNAを混入した。混入バッファー及び非混入バッファーをCHO細胞DNAと混合することによって、バッファー1ml当たり80μgの濃度を達成した。さらに、CHO細胞DNAを含まない混入バッファー及び非混入バッファーを調製した。各混入調製物及び非混入調製物から、MYCOTOOLプロトコルに従いDNAを調製した。複数回のPCR反応を、各DNA調製物のアリコートを用いて実施した。さらに、MYCOTOOLキットの一部である約10コピーの対照プラスミド(陽性対照)を含むTrisバッファーのアリコートを用いて、PCRを実施した。図5及び図6は、PCRによって得られた増幅産物のDNA断片の電気泳動後のゲルを示す図である。
ベロ細胞培養物(懸濁細胞)由来の混入サンプルにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出
原核生物を含まない培養物由来の、1ml当たり105〜106個の細胞の範囲の細胞力価を有するベロ細胞の懸濁液に、細胞懸濁液1ml当たり3若しくは10cfuの濃度のアコレプラズマ・レイドラウイDNA又はマイコプラズマ・オラーレDNAを混入した。3cfu/mlで混入した培養物に、細胞懸濁液1ml当たり10、30、50、70、85、100及び150μgの濃度でCHO細胞DNAを添加した。
孵化鶏卵由来の尿膜液の「接種」サンプルにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出
マイコプラズマ混入のない尿膜液を、ウイルスワクチン株を接種した孵化鶏卵(9〜11日齢)から回収した。
孵化鶏卵由来の尿膜液の「接種」サンプルにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出、PCR反応混合物への様々な濃度のCHO細胞DNAの添加
DNA精製前にCHO細胞DNAを添加しない以外は実施例7に記載したのと同様に実験を実施した。その代わり、CHO細胞DNAをPCR開始前に反応混合物に添加した。反応混合物中のCHO細胞DNAの濃度は、50μl(PCR反応混合物の量)当たり0、2.5、5、及び10μgとした。これは、最終反応混合物すなわち、PCR反応開始直前の反応混合物中の0μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl、及び0.2μg/μlに対応する。図9〜図12に結果を示す。
混入水性バッファーにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出
アコレプラズマ・レイドラウイDNAの濃度がバッファー1ml当たり3cfuであり、DNA精製前に、CHO細胞DNAの代わりに、仔ウシ胸腺をバッファー1ml当たり200μgの濃度で添加する以外は、実施例5に記載したのと同様に実験を実施した。図13は結果を示す。
孵化鶏卵由来の尿膜液の「接種」サンプルにおける原核生物DNAの16S-rRNA相補配列中の標的配列の検出、仔ウシ胸腺DNAの添加
DNA精製前に、CHO細胞DNAではなく、仔ウシ胸腺を添加した以外は実施例7に記載したのと同様に実験を実施した。
Claims (11)
- 生体材料を含むサンプル中の細菌混入物の存在又は非存在を決定するための改善された方法であって、ここでサンプルは羊水、真核細胞の懸濁液、及び真核細胞の懸濁液の上清からなる群より選択され、以下のステップ:
(a)上記サンプルを処理して、処理済サンプルから核酸を精製するステップ;次に、
(b)PCR増幅反応のための組成物(反応混合物)を形成するステップであって、該組成物が、
−配列番号1の第1プライマー、
−配列番号2の第2プライマー、及び
−鋳型としての、ステップ(a)の精製された核酸又はその測定画分
を含む、上記ステップ;次に
(c)ステップ(b)の組成物を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施するステップ;続いて
(d)増幅された標的配列の存在又は非存在を検出するステップであって、ここで、該増幅された標的配列の存在は、上記サンプル中の細菌混入物の存在を示し、また、該増幅された標的配列の非存在は、上記サンプル中の細菌混入物の非存在を示すものであり、該細菌混入物は、アコレプラズマ(Acholeplasma)、マイコプラズマ(Mycoplasma)、及びスピロプラズマ(Spiroplasma)からなる群より選択される属である、上記ステップ
を含み、
上記の改善が、上記サンプルの量に対して、CHO細胞由来の所定量のDNAを、(i)サンプル、又は(ii)ステップ(a)の処理済サンプル、又は(iii)ステップ(a)で得られた精製された核酸、又は(iv)ステップ(b)の組成物、に添加し、これにより、添加されたCHO細胞由来のDNAによって、ステップ(d)における非特異的増幅を低減させることを特徴とする、上記方法。 - 前記液体サンプル1ml当たりの所定濃度のDNAが、サンプル1ml当たり10μgからサンプル1ml当たり250μgの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 前記液体サンプルが羊水である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記羊水が孵化卵に由来する、請求項3に記載の方法。
- 孵化卵由来の羊水、CHO細胞由来のDNA、及び配列番号1の第1プライマーと配列番号2の第2プライマーを含む組成物。
- カオトロピック試薬及びプロテアーゼから選択される溶解試薬をさらに含む、請求項5に記載の組成物。
- (i)羊水、真核細胞の懸濁液、及び真核細胞の懸濁液の上清からなる群より選択されるサンプル由来の精製された核酸と、(ii)原核生物DNAを含まないCHO細胞由来のDNAと、(iii)配列番号1の第1プライマー及び配列番号2の第2プライマーとを含む組成物。
- ヌクレオチド三リン酸と、耐熱性DNAポリメラーゼとをさらに含む、請求項7に記載の組成物。
- インターカレーション色素をさらに含む、請求項8に記載の組成物。
- (i)溶解試薬と、(ii)原核生物DNAを含まない、所定濃度のCHO細胞由来の精製されたDNAと、(iii)配列番号1の第1プライマー及び配列番号2の第2プライマーと、を別個の容器に含むキット。
- 羊水、真核細胞の懸濁液、及び真核細胞の懸濁液の上清からなる群より選択されるサンプルから単離されたDNAから原核生物混入物のDNAを増幅するための、請求項7〜9のいずれかに記載の組成物の使用。
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