CN100999763A - 一种应用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种应用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6的方法，在应用DNA提取、RNA提取、蛋白提取、免疫组化、逆转录(RT)、PCR、Northern杂交、原位杂交、毛细管电泳方法中，所述改良引物是在第一反应中将下游引物5′端的碱基序列和引物3′端的碱基形成发夹结构，在常温时，引物的3′端处于封闭状态，当反应加热到退火延伸温度时，发夹结构打开，引物延伸开始；本发明提高了检测灵敏度和特异性，确保临床判断肿瘤细胞的进程与预后的可靠性，同时也在预防传染方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6的方法
背景技术
基因诊断和基因治疗随着分子生物学技术的发展越来越广泛的应用于临床，比如聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的发展和应用。但是由于PCR技术本身的特点，在临床应用中发现容易出现假阳性和假阴性，为避免这些错误，在实际应用PCR过程中要根据不同的核酸片段特点做许多具体改变、设计、分析以及实验验证。本专利从引物设计方面做了改进，检测肿瘤细胞分裂周期蛋白基因6。为提高其特异性防止污染做了具体的设计和实验验证。
细胞分裂周期蛋白基因6(cdc6)是DNA复制起始和延伸的首要因子，是确保细胞在一个细胞周期中只复制一次的重要因子。肿瘤细胞是典型的恶性增殖细胞，在无序增殖的同时伴随着DNA复制，因而在肿瘤细胞中存在高表达的cdc6蛋白。聚合酶链反应(PCR)以敏感、特异为特点，在临床早期诊断中发挥着巨大优势。量化监测cdc6基因对临床判断肿瘤细胞疾病进程和预后具有重要意义。然而正是由于PCR反应有赖于高度的特异性和灵敏度，在cdc6的测定中常常出现意想不到的失误，导致不可信的测定结果。
引物，实际上就是两段与特扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，是决定扩增片段的长度、位置和结果的关键，所以，引物设计尤为重要。
发明内容
本发明目的在于提供一种应用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6的方法，以确保临床判断肿瘤细胞的进程与预后的可靠性。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案，在应用DNA提取、RNA提取、蛋白提取、免疫组化、逆转录(RT)、PCR、Northern杂交、原位杂交、毛细管电泳等方法中，采用引物改良检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6；所述引物改良是在第一反应中将下游引物5′端的碱基序列进行改良，使其和引物3′端的碱基形成发夹结构，此时引物的3′端处于封闭状态，形成引物二聚体的可能性大为降低，当反应加热到退火延伸温度时，发夹结构打开，引物延伸才开始，发夹结构引物可起到自动热启动的作用；同时，发夹结构的存在也极大地提高了该引物的结合特异性，减少非特异性的发生，进而有助于排除非特异性扩增产物的干扰，这与分子信标可提高检测特异性的原理相似。
本发明提高了检测灵敏度和特异性，确保临床判断肿瘤细胞的进程与预后的可靠性，同时也在预防传染方面具有重要意义。
附图说明
图1 cdc6最小检测限实验照片。
图2 cdc6测序结果。
具体实施方式
1、随机选择病例
确诊膀胱癌30例，其中6例初发、24例复发；36岁～84岁男性26例；60岁～73岁女性4例。
确诊其它泌尿系疾病25例，其中男性28～77岁18例；女性27～69岁7例；病因：膀胱结石4例；肾结石4例；泌尿系感染10例；肾癌2例；附睾炎1例；前列腺增生症2例；尿道狭窄2例。29～31岁男性健康志愿者5例。
2、尿脱落细胞的制备
取清晨第一次尿后的随机尿150-200ml，分装在几个经过处理的玻璃离心管中，4℃、380g离心10分钟，弃上清，收集沉淀于一个离心管中，用生理盐水洗涤沉淀两遍，将沉淀物分成三份，一份用于总数计数和活性计数，一份用于HE染色，另一份用于总RNA提取。
尿脱落细胞总数计数和活性计数：取一滴尿脱落细胞悬液，用细胞计数池计数4角大方格细胞数。取一滴尿脱落细胞悬液，与0.4％台盼蓝染料混合，数100个细胞，计数细胞活性百分比。
尿脱落细胞HE染色
3、膀胱癌组织总RNA提取
3.1、提取总RNA质量的检验
3.2、RNA电泳：采用琼脂糖凝胶水平平板电泳，凝胶浓度为1.5％，EB终浓度为0.5ug/ml，电压5V/cm，电泳35分钟后在254nm波长的紫外灯下观察，应用UVI凝胶成像系统摄取凝胶图像.
3.3、RNA OD值的测定：将总RNA用DEPC处理水稀释100倍，分别测定其在230nm，260nm和280nm波长下的OD值，计算OD260/OD230和OD260/OD的比值。
4、cdc6基因检测
4.1、多聚酶链式反应：
采用耐热DNA多聚酶(Taq DNA polymerase)，热启动PCR，最佳延伸温度在72℃；
引物改良：在第一个反应中将下游引物5′端的碱基序列进行改良，使其和引物3′端的碱基形成发夹结构；
尿嘧啶糖苷酶(UNG)法
在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dN的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
dU引物：合成第一对反应引物时以dU代dT，在进行第二次扩增以前用UNG处理可消除PCR产物的残留污染，UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，因此可除去产物中的dU，从而使其失去在原有引物结合部位被再扩增的能力，因为引物失去了结合位点而不能进行非特异扩增，保证了扩增的特异性。
第二次扩增过程中，用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。本实验采用dUTP替代dTTP，并在反应体系中加入014U的UNG，因此可有效地控制扩增产物污染造成的假阳性。其原理在于：当以dUTP替代dTTP时所有扩增产物胸苷的部位均为尿苷所替代。UNG能有效地识别DNA上的尿苷键使其水解下来，从而防止产物的再被扩增，所有扩增只能以不含dUTP的原有模板作为扩增目标。
本尿嘧啶糖苷酶(UNG)法可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
4.2、DNA电泳
4.2.1、取PCR产物5ul与1ul的上样缓冲液混合，用1×TAE缓冲液配制2％琼脂糖进行水平平板电泳，电压5V/cm，电泳40分钟，然后在254nm波长的紫外灯下观察，应用UVI凝胶成像系统摄取凝胶图像。
4.2.2、DNA片段的回收与纯化
将待测DNA片段经上述电泳条件分离后，从琼脂糖凝胶上切下所需的DNA片段，放入1.5mlEP管中。
加入3倍体积溶胶液，室温放置5分钟，其间轻摇EP管几次使胶完全溶化。
加入10ul玻璃奶，颠倒混匀，冰浴下放置10分钟。每隔2-3分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清。
加入250ul漂洗液，用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30秒，吸弃上清，重复1次。
吸取完漂洗液后再离心10秒钟，用Tip头吸尽漂洗液，放置于37℃烘箱干燥直至沉淀呈白色，约15-20分钟。
加20ul洗脱缓冲液，混匀，60℃水浴5分钟，12000rpm离心1分钟，回收上清备用。
4.2.3、核酸序列分析
将上述回收的DNA，用美国ABI公司自动测序仪分析其序列。
4.3、逆转录-PCR(Peverse Transcription-PCR，RT-PCR)TranscriptionSystem的操作说明进行。如下：
样品总RNA 1ug
随机引物 0.5ug/ul 0.5ul
加DEPC水至9.75ul，70℃水浴10分钟，立即放入冰水浴中，随后加入下列物质：
10×PT——PCR BUFFER 2ul
AMV 20U/ul 0.75ul
dNTPs 2ul
RNasin 40U/ul 0.5ul
DEPC水补至20ul，42℃反应60分钟，99℃灭活逆转录酶5分钟
同上PCR
4.4、巢式-PCR(Nest-PCR)
PCR-1
cDNA 100ng
Taq酶(3U/ul) 0.5ul
引物Fn，Rn(12.5pmol/ul) 各2ul
MgCl2(25mM) 1.5ul
10×BUFFER 2.5ul
dNTPS(10mM) 0.5ul
DEPC水补足体积25ul。
总体积25ul，，94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸31分钟，循环25次。
PCR-2
PCR产物 1ul
Taq酶(3U/ul) 0.5ul
引物Fm，Rm(12.5pmol/ul) 各2ul
MgCl2(25mM) 1.5ul
10×BUFFER 2.5ul
dNTPS(10mM) 0.5ul
DEPC水补足体积25ul。
总体积25ul，94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸31分钟，循环25次。
4.5、逆转录-巢式-PCR(PT-Nest-PCR)
重复3.3与3.4步骤。
5、结果
5.1、尿脱落细胞检测
尿脱落细胞中cdc6基因表达
表1RT-PCR结果显示cdc6、MCM5基因的表达在膀胱癌患者尿脱落细胞中的阳性率均为93.3％，在非膀胱癌患者尿脱落细胞中的阳性率分别为16.7％和13.3％，尿脱落细胞HE染色两组阳性率分别为70％和0.
表1 60例受试者尿液脱落细胞中cdc6基因表达结果
| cdc6 | mcm5 | beta-actm | |||||
| 阳性(n) | 阴性(n) | 阳性率(％) | 阳性(n) | 阴性(n) | 阳性率(％) | 阳性(n) | |
| 膀胱癌非膀胱癌对照组非膀胱癌泌尿系统疾病* | 285 | 220 | 93.316.7 | 284 | 221 | 93.313.3 | 2925 |
| 健康人 | 0 | 5 | 0 | 5 | 5 |
*膀胱结石4例；膀胱炎5例；肾结石4例；泌尿系感染5例；肾癌2例；附睾炎1例；前列腺增生症2例；尿道狭窄2例。
表2.显示cdc6在膀胱癌患者尿脱落细胞中的表达显著高于非膀胱癌患者，两者差异有非常显著意义(P＜0.01).
表2 cdc6在膀胱癌与非膀胱癌患者尿脱落细胞中的表达
| 疾病 | 阳性(n) | 阴性(n) | 阳性率(％) |
| 膀胱癌非膀胱癌 | 285 | 225 | 93.316.7 |
注：X＝35.62 P＜0.01，
表3显示：cdc6RT-PCR的总阳性率、敏感性均与尿脱落细胞间的差异有显著性意义(P＜0.05)，但特异性差异无显著性意义(P＞0.05).
表3 Cdc6 RT-PCR与尿脱落细胞检测结果比较
| 检测方法 | n | 阳性预示率(％) | 阴性预示率(％) | 敏感性(％) | 特异性(％) |
| 脱落细胞检查Cdc6RT-PCRX2P | 6060 | 10084.81.9350.16 | 76.992.61.8050.18 | 7093.35.4550.02 | 10083.33.4910.06 |
5.2、膀胱组织检测
cdc6 PT-PCR结果与病理分级间的关系(见表4)
cdc6基因表达在不同病理等级间有显著性差异(P＜0.05)，以1级表达最低，3级最高，其中2级、3级与1级差异非常显著(P＜0.01)，2级与3级的差异显著(P＜0.05)；除1级与2级之间mcm5基因表达量差异无显著性外，其他各等级间mcm5基因表达量差异有非常显著性意义(P＜0.01)，以1级表达最低，3级表达最高(见图1)。
表4.cdc6与病理分级间的差异比较
| 病理分级 | n | cdc6/beta-actin |
| 123 | 786 | 0.363±0.188**△0.697±0.183*0.965±0.159 |
| FP | 18.6＜0.01 |
cdc6与3级比较**P＜0.01，*P＜0.05，与2级比较△P＜0.01；
5.3、PCNA免疫组化结果
表5.PCNA免疫组化与病理分级
| 病理分级 | PCNA | 合计(n) | ||
| +(n) | ++(n) | +++(n) | ||
| 123 | 310 | 150 | 326 | 786 |
| 合计(n) | 4 | 6 | 11 | 21 |
+：阳性细胞数＜10％，++：阳性细胞数10％-30％，+++：阳性细胞数＞30％
5.4、cdc6与PCNA间的关系
表6.cdc6、mcm5表达量与PCNA间的差异比较
| PCNA | 例数 | cdc6/beta-actin |
| ++++++ | 4611 | 0.330058±0.199330.653176±0.2565560.787621±0.264508* |
| FP | 4.82＜0.05 |
注：*P＜0.05，**P＜0.01
表6显示：PCNA(+++)的膀胱癌组织中cdc6表达量与PCNA(+)的差异有显著性意义(P＜0.05)；mcm5表达量与PCNA(+)的差异有非常显著性意义(P＜0.01).见图5。
图5 cdc6与PCNA表达间的关系
5.5、循环参数的选择
将循环次数分别设定为31次、33次、35次、37次、39次、41次、43次、45次、47次、49次，Mg离子取2.3.1中最合适的Mg离子浓度，其他条件同2.3.1。
5.6、批内、批间实验
将同一份cDNA分成两份，用2.3.1及2.3.2(？)选择的最佳条件一份进行同时扩增16次，另一份分别扩增16次，PCR产物经普通琼脂糖水平平板电泳，用UVI凝胶成像系统分析电泳结果，计算批内、批间变异系数。
5.7、最小检测限检测
将50ng/ul的cDNA按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105的比例进行比例稀释，按照2.3.1及2.3.2选择的最佳条件进行扩增，PCR产物用UVI凝胶成像系统分析。
最小检测限实验见图1
5.8、DNA片段回收及序列分析
采用玻璃奶技术回收DNA片段，可得到背景清晰的单一DNA条带。在使用玻璃奶回收DNA片段时，使用TAE配制的凝胶效果更好，因为溶胶液中的NaI不能完全溶解TBE配制的凝胶，影响回收率。将纯化好的CDC6片段利用ABI自动测序仪对其进行序列分析，结果与美国GeneBank中cdc6相应序列的顺序完全一致(测序结果见图2)。
Claims (2)
1、一种应用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6的方法，在应用DNA提取、RNA提取、蛋白提取、免疫组化、逆转录(RT)、PCR、Northern杂交、原位杂交、毛细管电泳方法中，其特征在于，采用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6；所述改良引物是在第一反应中将下游引物5′端的碱基序列和引物3′端的碱基形成发夹结构。
2、根据权利要求1所述的一种应用改良引物检测肿瘤中细胞分裂周期蛋白基因6的方法，其特征在于，在常温时，引物的3′端处于封闭状态，当反应加热到退火延伸温度时，发夹结构打开，引物延伸开始。
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| CN113862339A (zh) * | 2021-12-01 | 2021-12-31 | 广州滴纳生物科技有限公司 | 核酸组合产品、检测试剂盒和扩增靶核酸的方法 |
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2006
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