CN102471804B - 细菌(柔膜细菌)污染的改良检测 - Google Patents

细菌(柔膜细菌)污染的改良检测 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过抑制非特异性扩增产物改良的基于PCR的靶序列扩增。改良涉及使用被最佳化以在第一种生物的基因组DNA的背景中扩增污染物的核酸的引物对。当对怀疑包含污染物的来自第二种生物的DNA实施相同的基于PCR的扩增反应时，当第一种生物的基因组DNA的量存在于扩增反应中时，污染物的检测灵敏度和特异性增强。

Description

细菌(柔膜细菌)污染的改良检测
本发明提供了通过抑制非特异性扩增产物改良的基于PCR的靶序列扩增。改良涉及使用被最佳化以在第一种生物的基因组DNA的背景中扩增污染物的核酸的引物对。当对怀疑包含污染物的来自第二种生物的DNA实施相同的基于PCR的扩增反应时，当第一种生物的基因组DNA的量存在于扩增反应中时，污染物的检测灵敏度和特异性增强。
发明背景
支原体属(Mycoplasma)是属于缺乏细胞壁的柔膜体纲的细菌属。没有细胞壁，支原体属细菌不受靶向原核细胞壁合成的许多常见抗生素影响，所述抗生素例如青霉素或其他β-内酰胺抗生素。存在超过100种公认的支原体属物种，柔膜体纲(Mollicutes)中的几个属之一。柔膜细菌是人、其他动物(包括昆虫)和植物的寄生虫或共生体；支原体属通过定义被限定于脊椎动物宿主。胆固醇是支原体属以及柔膜细菌(mollicutes)的某些其他属的物种生长所需的。它们的最佳生长温度通常是其宿主的温度，如果是温血的(warmbodied)(例如在人中37℃)，或环境温度，如果宿主不能调节其自身内部温度。16S核糖体RNA序列的分析以及基因含量强烈暗示柔膜细菌包括支原体与系统树的乳杆菌属(Lactobacillus)或梭菌属(Clostridium)分支(在严格意义上厚壁菌门(Firmicutes))紧密相关。
支原体属物种通常在研究实验室中作为细胞培养中的污染物发现。支原体细胞培养污染可以由于来自个体的污染或污染的细胞培养基成分而发生。支原体细胞物理上是很小的-小于1μm-并且它们因此难以用常规显微镜检测。支原体可以诱导细胞改变，包括染色体畸变、代谢和细胞生长中的改变。严重支原体感染具有破坏细胞系的潜力。
支原体还涉及作为许多疾病中的病原体。肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)是社区获得性肺炎的主要成因剂。
螺原体属(Spiroplasma)物种通过分子和血清学研究近期已与传播性海绵状脑病(TSEs)关联(Bastian，F.O.，J Neuropathol Exp Neurol 64(2005)833-838)。然而，螺原体属物种与TSEs的关系仍是有争议的，例如考虑到检测受绵羊疯痒病感染的仓鼠脑中螺原体的任何足迹的rRNA种类的参与者不知情研究的失败(Alexeeva，I.，等人，J ClinMicrobiol 44(2006)91-97)。然而，在考虑中的TSEs包括绵羊中的绵羊疯痒病、鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)和人中的克雅氏病。颅内接种到绵羊和山羊内的从受绵羊疯痒病侵袭的绵羊脑和受CWD侵袭的鹿脑中分离的螺旋体属物种诱导非常类似这些动物中的天然TSE的海绵状脑病。这些数据明确显示螺原体与TSE相关。
显示螺原体属细菌在含胚卵中生长且可以在此类培养系统中传代(Bastian，F.O.，等人，Journal of Medical Microbiology 56(2007)1235-1242)。
含胚卵在疫苗生产中起主要作用。例如，针对流行性感冒的人疫苗已可用几乎60年，并且直到最近，几乎完全由在9到11天龄的含胚鸡卵的尿囊腔中生长的病毒进行制备。因此，螺原体的致病性潜力使得柔膜体纲病原体的检测成为用于确保由含胚卵制备的任何产物的安全的首要重要的工具。
此外，在生物药物生产、细胞疗法和组织工程过程中支原体污染的可能性尤其是主要问题。由全世界的药典和药物管理机构要求的常规检测法使用在培养基上的生长，以鉴定污染生物。这些基于培养的技术要求长时间以达到结果。此外，某些支原体属物种的培养可能是不可能或不可靠的。因此，需要改良且特别是更快速和可靠的微生物测定。
Eldering，J.A.，等人，Biologicals 32(2004)183-193公开了用于中国仓鼠卵巢细胞培养的支原体测试的PCR法。测试的原理是首先分离来自细胞培养(细胞和上清液)的基因组DNA，并且其次使用对于支原体属物种的16S-rRNA基因中的区域特异的引物和分离的DNA作为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。在阳性结果的情况下，形成且检测到对应于靶向区域的扩增产物。当未形成扩增产物时，获得阴性结果。
在该方法中使用的引物是先前公开的通用支原体引物(Wong-Lee，J.G.和Lovett，M.，“Rapid and sensitive PCR method for identification ofMycoplasma species in tissue culture”in：Diagnostic molecularmicrobiology-principles and applications；Persing，DH，Smith，TF，Tenover，FC，White，TJ(编辑)，Washington，DC，American Societyfor Microbiology(1993)257-260)。Eldering，J.A.，等人(同上)的方法是测定最佳化的结果且组合了改善支原体检测的灵敏度和特异性的6个要素：(1)用于与支原体基因组的扩增物比较具有不同大小的PCR产物的阳性对照质粒，(2)从怀疑被支原体细菌污染的细胞培养中分离的DNA的纯化和浓缩，(3)热启动Taq DNA聚合酶的使用，(4)其中应用从70到60℃的退火温度梯度的所谓降落PCR技术的使用，(5)PCR试剂的净化，和(6)专用设备和材料的使用。
值得注意的是，关于所述最佳化PCR法的要素2，作者选择用于DNA纯化和浓缩的方法，其包括步骤(a)裂解细胞培养(细胞和培养基)，和(b)用乙醇沉淀来自裂解物的DNA且分离沉淀的DNA。
进一步公开的是此类沉淀法比使用旋转柱的用于DNA纯化的可替代方法具有优势。旋转柱一般含有具有二氧化硅表面的过滤材料。例如通过离心，通过使缓冲液经过旋转柱，使溶解于任选还含有醇的高盐和/或离液缓冲液中的DNA与过滤材料结合。在后续步骤中，DNA可以使用非离液低盐缓冲液或纯水从过滤材料中洗脱。在最佳化研究中，获得与可能存在于旋转柱中的痕量污染物一致的结果。当柱与CHO基因组DNA接触时，从旋转柱中去除痕量污染物。CHO基因组DNA的可能作用描述为用于污染物的载体的那种作用。
基于Eldering，J.A.，等人(同上)的发现和其中公开的工作流程，Roche Applied Science(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)已进一步最佳化且开发了MYCOTOOL测试试剂盒。使用测试试剂盒进行的测定提供了用于细胞和无细胞系统的高度灵敏的支原体测定。MYCOTOOL特别涉及药物质量控制。
先前研究涉及来自16S rRNA基因特异性引物的PCR生成的人工产物(Osborne，C.A.，等人，FEMS Microbiology Letters 248(2005)183-187)。得出结论使用特定引物对生成的人工产物可以通过使用用于扩增反应的不同引物来避免。
本发明的发明人已发现其中MYCOTOOL测定的PCR产生可以是人工产物的片段的偶然情况(参见实施例)。注意到Eldering，J.A.，等人(同上)的最佳化测定以及特别是其中使用的引物基本上构成用于柔膜细菌的极佳检测系统的事实，本发明的目的是改善PCR方法，从而使得无关扩增物的出现降到最低。特别地达到这种预期效应而不改变引物的序列。
发明概述
根据本发明，一个或多个上述目的通过本发明的实施方案满足。
本发明的第一个方面是用于测定具有生物学材料的液体样品中细菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步骤：(a)处理样品且纯化来自经处理的样品的核酸，随后为(b)形成用于基于PCR的扩增反应的组合物(反应混合物)，该组合物包括-根据SEQ IDNO：1的第一种引物、-根据SEQ ID NO：2的第二种引物，和-步骤(a)的纯化核酸或其测量的部分作为模板；随后为(c)用步骤(b)的组合物进行聚合酶链式反应(PCR)；随后为(d)检测扩增的靶序列的存在或不存在，由此其中所述扩增的靶序列的存在指示样品中细菌污染物的存在，并且所述扩增的靶序列的不存在指示样品中细菌污染物的不存在；改良的特征在于相对于样品的体积，将来自CHO细胞的预定量的DNA加入(i)样品、或(ii)步骤(a)的经处理的样品、或(iii)在步骤(a)中获得的纯化核酸、或(iv)步骤(b)的组合物中，由此所加入的来自CHO细胞的DNA减少步骤(d)中的非特异性扩增。本发明的第二个方面是包含来自含胚卵的羊膜液和来自CHO细胞的DNA的组合物。本发明的第三个方面是组合物，其包含(i)来自样品的纯化核酸，所述样品选自羊膜液、真核细胞的悬液和来自真核细胞的悬液的上清液，和(ii)不含原核DNA的来自CHO细胞的DNA。本发明的第四个方面是根据本发明的组合物在用于扩增来自从样品中分离的DNA的原核污染物的DNA的方法中的用途，所述样品选自羊膜液、真核细胞的悬液和来自真核细胞的悬液的上清液。本发明的第五个方面是试剂盒，其在分开的容器中包含：(i)裂解试剂，(ii)以预定浓度的来自CHO细胞的纯化DNA，所述DNA不含原核DNA，和(iii)根据SEQ IDNO：1的第一种引物和根据SEQ ID NO：2的第二种引物。本发明的第六个方面是用于进行聚合酶链式反应(PCR)的改良方法，其中通过DNA聚合酶催化的一对寡核苷酸引物延伸形成具有范围为约100bp-约1500bp大小的特异性扩增产物，所述引物各自与一种或多种原核生物的16S-rRNA的基因组互补体中包含的靶序列杂交，其中所述寡核苷酸引物对能够在PCR中形成来自第一种模板的特异性扩增产物，所述PCR在预定条件(R)下在具有预定组合物的反应混合物(Q)进行，并且所述第一种模板包含第一种真核生物的基因组DNA和所述一种或多种原核生物的基因组DNA，并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物对在相同条件(R)下在反应混合物(Q)中不形成来自第二种模板的扩增产物，其中在所述第二种模板中，不存在所述一种或多种原核生物的基因组DNA，但包含第一种真核生物的基因组DNA，该改良方法包括以下步骤：(a)提供所述寡核苷酸引物对；(b)提供所述第一种真核生物的基因组DNA；(c)提供包含第二种真核生物的基因组DNA的第三种模板，所述第二种真核生物被怀疑含有所述一种或多种原核生物的基因组DNA；(d)在所述反应混合物(Q)中混合(a)的所述引物对、(c)的所述第三种模板、和(b)的所述第一种真核生物的所述基因组DNA的测量的量，和在条件(R)下进行PCR；其中非特异性PCR扩增产物的形成被抑制。
发明详述
在本发明的说明书中，某些术语以特定含义使用，或首次得到定义。为了本发明的目的，使用的术语通过其领域公认的定义进行定义，当存在此类情况时，除这些定义与下文所述的定义冲突或部分冲突外。在定义中冲突的情况下，术语的含义首先通过下文所述的任何定义进行定义。
术语“包含”在本发明的说明书和权利要求中用于意指“包括但不一定限于”。
冠词“a”和“an”在本文中用于指冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法目标。例如，“微生物”意指一种微生物或超过一种微生物。
当指定数值范围例如浓度范围时，范围可以通过单词“在......之间”指示，随后为第一个值n1、单词“和”和第二个值n2。此外，指定范围可以通过表达“在n1-n2的范围中”指示。如果没有另外说明，那么当指示指定范围时，指定范围的较低边界应理解为该值等于或高于第一个值。指定范围的较高边界应理解为该值等于或小于第二个值”。因此，在指定范围中的值x通过n1≤x≤n2给出。
此外，应当理解与数值n组合的术语“约”指示在通过该值的数值±5％给出的间隔中的值x，即n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。在与数值n组合的术语“约”描述本发明的一个优选实施方案的情况下，如果没有另外说明，那么n的值是最优选的。
如本文使用的，术语“样品”指复杂样品，更优选生物学样品，即具有生物学材料的样品。样品可以含有希望与生物学材料中包含的核酸分离的多种有机和无机化合物。术语“样品”还涵盖含有衍生自其他来源的核酸的水溶液，例如来自化学或酶促反应混合物，或来自生物学样品材料的先前纯化。从其中纯化核酸的术语生物学样品涵盖包含病毒或细菌细胞的样品，以及来自多细胞生物的分离细胞例如人和动物细胞，以及组织的原始培养物和细胞系的培养物，以及其上清液和冲洗。本发明还涵盖生物学样品例如来自人或动物体的流体。特别地，样品可以是全血、血液血清、血液血浆、大脑流体、唾液、粪便、活组织检查标本、骨髓、经口冲洗、组织、尿及其混合物。
根据本发明，优选样品是“液体样品”，即样品处于流动状态，并且样品流体包含水和生物学材料。生物学材料优选包含细胞或细胞组分。非常优选的，根据本发明的液体样品选自细胞培养上清液、培养细胞的悬液和羊膜液。更加优选的，羊膜液来自含胚禽类卵。
为了本发明的目的，与“液体样品”组合的术语“处理”或“经处理的”含义是通过加入一种或多种化合物，并且使一种或多种化合物与液体样品混合来处理样品，从而得到“经处理的样品”。可以用于此类处理的优选化合物选自去垢剂、表面活性剂、有机溶剂、离液剂、蛋白酶和核酸酶抑制备物。根据本发明的“离液剂”是扰乱液态水的有序结构的任何化学物质。离液剂还促进蛋白质的解折叠、延伸和解离(Dandliker，W.，B.和de Saussure，V.，A.，In：The Chemistry of Biosurfaces，Hair，M.，L.，编辑，Marcel Dekker，Inc.New York(1971)第18页)。
根据本发明的优选经处理的样品是裂解物。“裂解物”或“裂解样品”可以得自包含细胞(a comprising cells)，优选微生物细胞，和非常优选的细菌细胞，其中存在的细胞的大量部分的结构完整性被破坏。为此，如果存在，那么细胞壁必须被破坏。为了释放被破坏的细菌细胞的内容物，用某些试剂处理材料，以崩解、使得多孔、溶解、降解或变性微生物细胞的细胞壁。此外，细胞膜必须被破坏。为了释放细胞、组织或更一般地来自生物学样品中包含的颗粒的内容物，材料可以用酶或用化学制品进行处理，溶解、降解或变性此类生物的细胞壁和细胞膜。在任何此类情况下，裂解(“裂解的”)过程还将破坏细菌污染物的结构完整性，从而释放污染物的核酸。
对于裂解过程，当核酸在该过程中释放时，通常使用离液剂例如胍盐和/或阴离子、阳离子、两性离子或非离子型去污剂。使用快速降解具有溶核活性的酶和其他不需要的蛋白质的蛋白酶也是有利的。在残留微粒即在裂解过程后样品材料的未溶解物质的情况下，粒性物质可以与裂解物分开，以导致澄清的裂解物。这可以例如通过过滤或离心完成。因此，术语“裂解物”涵盖澄清裂解液。
来自经处理的样品的“核酸的纯化”可以使用其为标准技术的广泛多样的方法完成。这些可以包括例如使用醇从水溶液中沉淀核酸(用乙醇或异丙醇的沉淀是本领域众所周知的)和沉淀物的分离。其他方法包括核酸吸附到固相(例如具有氧化表面例如二氧化硅)上，分离固相，随后为从固相中洗脱核酸。
“聚合酶链式反应”(“PCR”)是用于扩增特定靶DNA序列的单个或少数拷贝跨越几个数量级的技术，其中生成DNA序列的拷贝。PCR依赖于热循环，由反应混合物的反复加热和冷却循环组成，从而实现DNA解链和DNA的酶促复制。含有与靶DNA序列互补的序列的引物(DNA寡核苷酸)连同DNA聚合酶一起是致使选择性和反复扩增成为可能的关键组分。随着PCR进展，生成的DNA自身用作模板用于复制，启动其中DNA模板指数扩增的链反应。在这点上的“反应混合物”包含DNA聚合酶、dNTP、离子、缓冲液和实现与靶DNA序列杂交(退火)的引物延伸所需的所有其他化合物。
本发明人已得出结论在由Eldering，J.A.，等人(同上)公开的方法中，对于测定细菌污染物的存在或不存在关键的PCR条件是对于CHO(中国仓鼠卵巢)细胞培养和/或培养上清液专一地最佳化的。此外，本发明人已观察到根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物对偶然产生无关扩增或人工产物(即对于大小不同于所需靶DNA片段的片段的非特异性扩增)。这特别是当从来自衍生自其他动物物种或人的细胞培养的样品材料制备的DNA用作模板时的情况。在此类设置中，本发明基于其上的基础观察是当PCR在CHO细胞DNA的存在下进行时，PCR人工产物的形成可以被抑制。然而，这种所需技术效应要求CHO细胞DNA不含由细菌DNA的污染，所述细菌DNA可以通过所述引物对扩增。因此，以最广泛的含义，本发明的第一个方面是
用于进行聚合酶链式反应(PCR)的改良方法，
其中通过DNA聚合酶催化的一对寡核苷酸引物延伸(PCR)形成具有范围为约100bp-约1500bp大小的特异性扩增产物，所述引物各自与一种或多种原核生物的16S-rRNA的基因组互补体中包含的靶序列杂交，
其中所述寡核苷酸引物对能够在PCR中形成来自第一种模板的特异性扩增产物，所述PCR在预定条件(R)下在具有预定组合物的反应混合物(Q)进行，并且所述第一种模板包含第一种真核生物的基因组DNA和所述一种或多种原核生物的基因组DNA，
并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物对在相同条件(R)下在反应混合物(Q)中不形成来自第二种模板的扩增产物，其中在所述第二种模板中，不存在所述一种或多种原核生物的基因组DNA，但包含第一种真核生物的基因组DNA，
该改良方法包括以下步骤：
(a)提供所述寡核苷酸引物对；
(b)提供所述第一种真核生物的基因组DNA；
(c)提供包含第二种真核生物的基因组DNA的第三种模板，所述第二种真核生物被怀疑含有所述一种或多种原核生物的基因组DNA；
(d)在反应混合物(Q)中混合(a)的所述引物对、(c)的所述第三种模板、和(b)的所述第一种真核生物的所述基因组DNA的测量的量，和在条件(R)下进行PCR；
其中非特异性PCR扩增产物的形成被抑制。
在本发明的背景中，PCR的条件(R)反映参数包括温度方案、孵育时间、PCR循环数目和PCR领域技术人员已知的其他物理参数。反应混合物(Q)包含PCR过程与之一起进行的最终混合物的所有组分，包括引物延伸所需的所有化合物。反应混合物(Q)还包括各自以其分别的预定浓度的引物对。为了明确起见，以这种意义的反应混合物(Q)不包含分开添加的模板DNA。模板DNA这样加入，使得在最终混合物(即在模板DNA的添加后)中，所有其他组分的浓度是等同的，不管使用何种模板。
根据本发明，含有另一种生物而不是CHO细胞的基因组DNA的模板另外必须含有以测量的量即以预定浓度的CHO细胞DNA。
在本发明的一个优选实施方案中，寡核苷酸对与多个原核物种杂交，并且0-3个错配可能在引物与其16S-rRNA基因的靶区域的杂交中发生。在任何此类情况下，任何错配(如果存在的话)排除末端核苷酸，提供分别寡核苷酸的3’-OH基团。
在本发明的一个优选实施方案中，所述一种或多种原核生物是选自柔膜体纲物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、梭菌属物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、微球菌属(Micrococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种和链球菌属(Streptococcus)物种的物种。更加优选的，物种是柔膜体纲物种。更加优选的，物种是支原体属物种，更加优选的，物种选自猪鼻支原体(M.hyorhinis)、精氨酸支原体
(M.arginini)、肺炎支原体、发酵支原体(M.fermentans)、口腔支原体(M.orale)和梨形支原体(M.pirum)，或物种是无胆甾原体属(Acholeplasma)物种，更加优选莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii)，或物种是螺原体属物种，更加优选非凡螺原体(Spiroplasmamirium)。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述第一种真核生物是CHO细胞或包含多个CHO细胞的培养物。更加优选的，所述引物对包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之一，或两者。
在本发明的一个更加优选的实施方案中，条件(R)和反应混合物(Q)是在MYCOTOOL测试试剂盒的手册中描述的通过RocheDiagnostics GmbH，Mannheim(德国)MYCOTOOL测定。
本发明的进一步优选实施方案在下述项目列表中给出：
1.用于测定液体样品中细菌污染物的存在或不存在的改良方法，所述方法包括以下步骤：
(a)处理样品且纯化来自经处理的样品的核酸，随后为
(b)形成用于基于PCR的扩增反应的组合物，该组合物包括
-根据SEQ ID NO：1的第一种引物、
-根据SEQ ID NO：2的第二种引物，和
-步骤(a)的纯化核酸或其测量的部分作为模板；随后为
(c)用步骤(b)的组合物进行聚合酶链式反应(PCR)，由此扩增原核16S-rRNA基因中包含的靶序列，如果存在于模板中的话；随后为
(d)检测扩增的靶序列的存在或不存在，由此所述扩增的靶序列的存在指示样品中细菌污染物的存在，并且所述扩增的靶序列的不存在指示样品中细菌污染物的不存在；
改良的特征在于相对于样品的体积，将来自CHO细胞的预定量的DNA加入(i)样品、或(ii)步骤(a)的经处理的样品、或(iii)在步骤(a)中获得的纯化核酸、或(iv)步骤(b)的组合物中，由此所加入的来自CHO细胞的DNA减少步骤(d)中的非特异性扩增。
2.项目1的方法，其特征在于每ml液体样品的预定量DNA是来自约5x106个CHO细胞的DNA含量。
3.根据项目1和2中任一项的方法，其特征在于所述液体样品选自具有培养的细胞的细胞培养基、无细胞的培养上清液和羊膜液。
4.根据项目3的方法，其特征在于所述液体样品是羊膜液。
5.根据项目4的方法，其特征在于所述羊膜液来自含胚卵。
6.根据项目1-5中任一项的方法，其特征在于所述细菌污染物是选自无胆甾原体属、芽孢杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、微球菌属、支原体属、螺原体属、葡萄球菌属和链球菌属的属。
7.根据项目6的方法，其特征在于所述细菌污染物是选自猪鼻支原体、精氨酸支原体、肺炎支原体、发酵支原体、口腔支原体和梨形支原体的支原体属物种，或所述细菌污染物是莱氏无胆甾原体，或所述细菌污染物是非凡螺原体。
8.组合物，其包含来自含胚卵的羊膜液和来自CHO细胞的DNA。
9.根据任何项目8的组合物，其进一步包含选自离液剂和蛋白酶的裂解试剂。
10.组合物，其包含(i)来自样品的纯化核酸，所述样品选自羊膜液、真核细胞的悬液和来自真核细胞的悬液的上清液，和(ii)不含原核DNA的来自CHO细胞的DNA。
11.根据项目10的组合物，其进一步包含根据SEQ ID NO：1的第一种引物、根据SEQ ID NO：2的第二种引物、核苷酸三磷酸和耐热的DNA聚合酶。
12.根据项目11的组合物，其进一步包含嵌入染料。
13.试剂盒，其在分开的容器中包含(i)裂解试剂，(ii)以预定浓度的来自CHO细胞的纯化DNA，所述DNA不含原核DNA，和(iii)根据SEQ ID NO：1的第一种引物和根据SEQ ID NO：2的第二种引物。
14.根据项目10-12中任一项的组合物用于扩增原核污染物的DNA的用途，所述原核污染物的DNA来自从样品中分离的DNA，所述样品选自羊膜液、真核细胞的悬液和来自真核细胞的悬液的上清液。
15.用于进行改良聚合酶链式反应(PCR)的改良方法，
其中通过DNA聚合酶催化的一对寡核苷酸引物延伸形成具有范围为约100bp-约1500bp大小的特异性扩增产物，所述引物各自与一种或多种原核生物的16S-rRNA的基因组互补体中包含的靶序列杂交，
其中所述寡核苷酸引物对能够在PCR(P)中形成来自第一种模板的特异性扩增产物，所述PCR(P)在预定条件(R)下在具有预定组合物的反应混合物(Q)进行，并且所述第一种模板包含第一种真核生物的基因组DNA和所述一种或多种原核生物的基因组DNA，
并且其中在P中，所述寡核苷酸引物对在相同条件(R)下在反应混合物(Q)中不形成来自第二种模板的扩增产物，其中在所述第二种模板中，不存在所述一种或多种原核生物的基因组DNA，但包含第一种真核生物的基因组DNA，
所述改良方法包括以下步骤：
(a)提供所述寡核苷酸引物对和所述第一种真核生物的基因组DNA；
(b)提供包含第二种真核生物的基因组DNA的第三种模板，所述第二种真核生物被怀疑含有所述一种或多种原核生物的基因组DNA；
(c)在所述反应混合物(Q)中混合(a)的所述引物对、(d)的所述第三种模板、和所述第一种真核生物的所述基因组DNA的测量的量，和在条件(R)下进行PCR；
其中非特异性PCR扩增产物的形成被抑制。
序列表描述
SEQ ID NO：1用于检测支原体属和相关物种的通用引物(正向)；先前公开于Wong-Lee，J.G.和Lovett，M.，“Rapid and sensitive PCRmethod for identification of Mycoplasma species in tissue culture”中：Diagnostic molecular microbiology-principles and applications；Persing，DH，Smith，TF，Tenover，FC，White，TJ(编辑)Washington，DC，American Society for Microbiology(1993)257-260，和Eldering，J.A.，等人，Biologicals 32(2004)183-193。
SEQ ID NO：2用于检测支原体属和相关物种的通用引物(反向)；先前公开于Wong-Lee，J.G.，等人(同上)和Eldering，J.A.，等人(同上)中。
SEQ ID NO：3对于甘油醛3-磷酸脱氢酶基因中的靶序列(对照序列)特异的正向引物。
SEQ ID NO：4对于甘油醛3-磷酸脱氢酶基因中的靶序列(对照序列)特异的反向引物。
附图描述
图1泳道注释/稀释度
1-5GAPDH对照PCR；从MDCK细胞中分离的DNA，无CHO细胞DNA，用莱氏无胆甾原体DNA掺加
1未稀释的
2 10-1
3 10-2
4 10-3
5 10-4
6大小标记(50bp间隔(steps))
7-11GAPDH对照PCR；从MDCK细胞中分离的DNA，无CHO细胞DNA，未掺加
7 10-1
8 10-2
9 10-3
10 10-4
11大小标记(50bp间隔)
图2泳道注释/稀释度
1-5GAPDH对照PCR；从MDCK细胞中分离的DNA，加入CHO细胞DNA，用莱氏无胆甾原体DNA掺加
1未稀释的
2 10-1
3 10-2
4 10-3
5 10-4
6大小标记(50bp间隔)
7-11 GAPDH对照PCR；从MDCK细胞中分离的DNA，加入CHO细胞DNA，未掺加
7 10-1
8 10-2
9 10-3
10 10-4
11大小标记(50bp间隔)
图3泳道注释/稀释度
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；从ASC分离的DNA，用口腔支原体DNA掺加，无CHO细胞DNA
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用8个独立抽取的等分试样的PCR
6条带的大小与对于特定靶DNA扩增产物观察到的大小范围一致
图4泳道注释/稀释度
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；从ASC中分离的DNA，用口腔支原体DNA掺加，含加入的CHO细胞DNA
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用8个独立抽取的等分试样的PCR
9-12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用缓冲液的PCR(“无模板”对照)
13大小标记(50bp间隔)
图5泳道注释/稀释度
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体DNA掺加的Tris缓冲液，无CHO细胞DNA
1-40cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-81cfu莱氏无胆甾原体DNA
9-12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，未掺加，无CHO细胞DNA
13，14如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，无CHO细胞DNA
15大小标记(50bp间隔)
图6泳道注释/稀释度
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体DNA掺加的Tris缓冲液，含加入的CHO细胞DNA
1-410cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-81cfu莱氏无胆甾原体DNA
9-12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，未掺加，含加入的CHO细胞DNA
13，14如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，含加入的CHO细胞DNA
15大小标记(50bp间隔)
图7泳道注释/稀释度
1-4如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体DNA掺加的Vero细胞悬液，无CHO细胞DNA
1-410cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Vero细胞悬液，未掺加，无CHO细胞DNA
9，10如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，无CHO细胞DNA
11，12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用缓冲液的PCR(“无模板”对照)
13大小标记(50bp间隔)
图8泳道注释/稀释度
1-4如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体DNA掺加的Vero细胞悬液，含加入的CHO细胞DNA
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Vero细胞悬液，未掺加，含加入的CHO细胞DNA
9，10如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，含加入的CHO细胞DNA
11，12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用缓冲液的PCR(“无模板”对照)
13大小标记(50bp间隔)
图9泳道注释/稀释度
1-4如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体“接种”的尿囊液，无CHO细胞DNA
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；尿囊液，未接种的，无CHO细胞DNA
9，10如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，无CHO细胞DNA
11大小标记(50bp间隔)
箭头指出其中非特异性扩增的PCR产物移动的凝胶区域
图10泳道注释/稀释度
1-4如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体“接种”的尿囊液，2.5μg/50μl CHO细胞DNA
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；尿囊液，未接种的，2.5μg/50μl CHO细胞DNA
9，10如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，无CHO细胞DNA
11大小标记(50bp间隔)
箭头指出其中非特异性扩增的PCR产物移动的凝胶区域
图11泳道注释/稀释度
1-4如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体“接种”的尿囊液，5μg/50μl CHO细胞DNA
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；尿囊液，未接种的，5μμg/50μlCHO细胞DNA
9，10如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用缓冲液的PCR(“无模板”对照)
11大小标记(50bp间隔)
箭头指出其中非特异性扩增的PCR产物移动的凝胶区域
图12泳道注释/稀释度
1-4如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体“接种”的尿囊液，10μg/50μl CHO细胞DNA
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；尿囊液，未接种的，10μg/50μl CHO细胞DNA
9，10如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用缓冲液的PCR(“无模板”对照)
11大小标记(50bp间隔)
箭头指出其中非特异性扩增的PCR产物移动的凝胶区域5
图13泳道注释/稀释度
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体DNA掺加的Tris缓冲液
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA，无小牛胸腺DNA
5-81cfu莱氏无胆甾原体DNA，含加入的小牛胸腺DNA
9-12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；未掺加的Tris缓冲液，含加入的小牛胸腺DNA
13，14如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，阳性对照质粒的约10个拷贝(MYCOTOOL试剂盒的部分)/PCR反应混合物，无小牛胸腺DNA
15大小标记(50bp间隔)
图14泳道注释/稀释度
1-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用莱氏无胆甾原体“接种”的尿囊液，含加入的小牛胸腺DNA
1-43cfu莱氏无胆甾原体DNA
5-8如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；尿囊液，未接种的，含加入的小牛胸腺DNA
9-12如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；Tris缓冲液，无接种物，含加入的小牛胸腺DNA
13，14如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中的引物；用缓冲液的PCR(“无模板”对照)
15大小标记(50bp间隔)
实施例1
MYCOTOOL试剂盒和测定
MYCOTOOL PCR支原体检测试剂盒是对于属于柔膜体纲的细菌检测最佳化的体外核酸扩增测试。这些包括猪鼻支原体、精氨酸支原体、肺炎支原体、发酵支原体、口腔支原体、梨形支原体、唾液支原体(M.salivarum)、人型支原体(M. hominis)、滑液囊支原体(M.synoviae)、非凡螺原体、柠檬螺原体(S.citri)和莱氏无胆甾原体。
MycoTool试剂盒包含2个亚试剂盒(subkits)：亚试剂盒1(“Detection Prep Kit”；Roche Applied Science目录号05184592001)和亚试剂盒2(“Detection Amplification Kit”；Roche Applied Science目录号05184240001)。
试剂盒确切地根据制造商的说明书使用。
如果没有另外说明，那么通过下述裂解选自(i)细胞培养上清液、(ii)培养细胞的悬液和(iii)羊膜液的液体样品：加入含有胍盐和蛋白酶K的水性缓冲液，将缓冲液与样品混合，且孵育混合物以实现裂解。
在裂解后，一般将10-250μg/1ml样品CHO细胞DNA加入裂解物中且混合。CHO细胞DNA不含如分开测试的任何污染原核DNA。随后，通过加入醇从混合物中沉淀核酸。通过离心回收沉淀物，用70％乙醇洗涤且干燥。将干燥的团块溶解于预先制备的缓冲液中且实施PCR分析。
作为内部对照，MYCOTOOL试剂盒还包括用于GAPDH持家基因的引物对。
在PCR扩增前，通过应用尿嘧啶-N-糖基化酶(试剂盒的组分)减少扩增子污染的危险。
在下文每个实施例中，根据通过制造商的说明书确切地进行PCR。PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶上在标准条件下进行电泳。条带用RESOLIGHT化合物和UV照明进行显现，条带检测在520nm。
用于检测柔膜体纲的MYCOTOOL试剂盒的引物是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的那些引物。还提供了对于GAPDH特异的对照引物(SEQID NO：3和SEQ ID NO：4)。
每个MYCOTOOL试剂盒进一步包含含有支原体属DNA的对照质粒，然而，产生具有与由分离的细菌DNA(阳性对照)扩增的PCR片段相比较可区分的不同大小的PCR片段。为此，参考Eldering，J.A.，等人，Biologicals 32(2004)183-193，其公开了质粒。
实施例2
用于样品掺加的来自柔膜体纲物种的DNA
在本实施例中使用的所有样品来自不含原核污染物的培养物。
代替由柔膜体纲物种感染的样品材料，由莱氏无胆甾原体或口腔支原体制备的DNA在裂解前被掺加到样品材料，或被掺加到由样品材料制备的分离的DNA中(如果没有另外说明)。为了掺加的目的，由莱氏无胆甾原体(ATCC27556)和口腔支原体(ATCC23714)的参考培养物(标准条件)制备DNA。对于每种培养物，测定表示为菌落形成单位(cfu)的细胞滴度。应用的掺加的DNA的数量反映对于由其制备DNA的各自培养物测定的cfu数目。
如上所述的柔膜细菌DNA用于下文描述的掺加实验中。由柔膜体纲DNA扩增的一般特定PCR片段(特异性扩增产物)的大小在约430-470bp的范围中。
实施例3
在来自MDCK细胞培养(悬浮细胞)的样品中GAPDH基因组靶序列的检测
使用不含任何原核生物且具有0,79·106细胞/ml的细胞滴度的MDCK细胞的培养物。将莱氏无胆甾原体DNA以3个菌落形成单位(cfu)/1ml样品的浓度加入样品中。如MYCOTOOL试剂盒(还参见实施例1)的指导手册中说明的，从掺加的样品材料中分离核酸。制备2种不同核酸制备物，第一种不含CHO细胞DNA的添加，第二种含加入样品材料中的CHO细胞DNA(50mg/1ml样品)。
然而，进行不掺加莱氏无胆甾原体DNA的样品的重复制备。再次，制备含或不含CHO细胞DNA的核酸。
在TE缓冲液中制备DNA制备物的几个稀释度。根据MYCOTOOL指导手册，对每个稀释度的等分试样实施GAPDH特异性PCR。
图1和2显示具有指出获得的PCR产物的条带的凝胶。图1描述了不含加入的CHO细胞DNA而获得的结果，图2显示了含加入的CHO细胞DNA的PCR产物。
可以明确观察到含加入的CHO DNA，即使当用10-4稀释度进行PCR时，GAPDH对照条带也是可检测的。
实施例4
在来自脂肪干细胞(ASC)的细胞上清液的掺加的样品中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测
通过离心沉积不含任何原核生物的ASC。如MYCOTOOL试剂盒的指导手册中说明的(还参见实施例1)，澄清上清液(细胞培养基)用于DNA分离。在裂解步骤之前，将口腔支原体DNA以3个菌落形成单位(cfu)/1ml样品的浓度加入样品中。随后将样品分成2个相等体积。向一个等分试样中加入以100mg/1ml上清液浓度的CHO细胞DNA。从2个等分试样中分开地分离总DNA。用每种DNA制备物的等分试样进行几次PCR反应。图3和4显示通过PCR获得的扩增产物和在电泳泳动后的DNA片段的凝胶。
明确地，CHO细胞DNA的添加使得MYCOTOOL测试更有效(robust)，因为支原体属DNA在测试的所有掺加的样品中检测到。另一方面，不含CHO细胞DNA，8次PCR反应中仅1次成功扩增对于支原体属靶DNA特异的片段。
在其中不存在CHO细胞DNA的情况下，可以看出(图3)非特异性PCR片段基本上不存在(图3中的泳道1是可能的例外)。这强调本发明人的PCR人工产物通常不通过MYCOTOOL测定产生的观察。有趣的是，CHO细胞DNA的添加还不导致如在图4中可以看出的非特异性扩增产物。
实施例5
在掺加的水性缓冲液中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测
不含任何污染物的10mM TrisHCl缓冲液pH7.5用莱氏无胆甾原体DNA以1或10cfu/1ml缓冲液的浓度进行掺加。掺加和未掺加的缓冲液与CHO细胞DNA混合，以获得80μg/1ml缓冲液的浓度。此外，制备不含CHO细胞DNA的掺加和未掺加的缓冲液。根据MYCOTOOL方案，从每种掺加和未掺加的制备物来制备DNA。用每种DNA制备物的等分试样进行几次PCR反应。此外，用含有其为MYCOTOOL试剂盒的一部分(阳性对照)的对照质粒的约10个拷贝的Tris缓冲液的等分试样进行PCR。图5和6显示具有通过PCR获得的扩增产物和在电泳泳动后的DNA片段的凝胶。
虽然PCR检测对应于10cfu的莱氏无胆甾原体DNA没有问题，但1cfu的检测在CHO细胞DNA的存在下得到显著改善。
具有阳性对照质粒的泳道举例说明与莱氏无胆甾原体靶序列的特异性扩增产物比较的可区分的大小差异。
实施例6
在来自培养的Vero细胞培养(悬浮细胞)的掺加样品中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测
向具有来自不含任何原核生物的培养物在105-106细胞/ml范围中的细胞滴度的Vero细胞悬液中以3或10cfu/1ml细胞悬液的浓度掺加莱氏无胆甾原体或口腔支原体DNA。向用3cfu/mlCHO细胞DNA掺加的培养物中，加入以10、30、50、70、85、100和150μg/1ml细胞悬液浓度的DNA。
根据MYCOTOOL方案，由每种掺加的悬液以及仅Vero细胞的未掺加的悬液制备DNA。用每种DNA制备物的等分试样进行几次PCR反应。此外，用含有其为MYCOTOOL试剂盒的一部分(阳性对照)的对照质粒的约10个拷贝的Tris缓冲液(10mM TrisHCl缓冲液pH7.5)的等分试样进行PCR。图7和8显示具有通过PCR获得的扩增产物和在电泳泳动后的DNA片段的凝胶。图8中所示的样品含有以150μg/1ml细胞悬液的浓度的CHO细胞DNA。当使用10、30、50、70、85和100μgCHO细胞DNA/1ml细胞悬液的浓度时，获得可比较的结果。
值得注意的是，在不存在CHO细胞DNA的情况下获得某些非特异性(人工产物)PCR产物(参见图7)。注意到在某些情况下这些人工产物条带的大小与特异性扩增产物的大小的相似性(图7中的泳道1-4)。令人惊讶的是，在CHO细胞DNA的存在下没有产生非特异性PCR扩增产物(图8，泳道1-4)。
实施例7
在来自含胚鸡卵的尿囊液的“接种”样品中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测
不含支原体污染的尿囊液从用病毒疫苗株接种的含胚鸡卵(9-11天)中收获。
用TE缓冲液1∶1,000稀释具有2.45x103cfu滴度的莱氏无胆甾原体的液体培养物。用尿囊液1∶10稀释这个稀释度的等分试样。加入这种1∶10,000接种物的12.2μl体积/1ml尿囊液，以获得3cfu/1ml接种的尿囊液的等价滴度。对接种的尿囊液实施DNA分离而无进一步孵育，即细菌不允许在尿囊液中生长。
提供了4种不同样品：(i)不含CHO细胞DNA的接种的尿囊液，(ii)不含CHO细胞DNA的非接种的尿囊液，(iii)含加入的CHO细胞DNA的接种的尿囊液，和(iv)含加入的CHO细胞DNA的非接种的尿囊液。在(iii)和(iv)的样品中，CHO细胞DNA的浓度是208mg/1ml尿囊液。
根据MYCOTOOL方案，由每种接种和非接种的样品(i-iv)制备DNA。用每种DNA制备物的等分试样进行几次PCR反应。此外，用含有其为MYCOTOOL试剂盒的一部分(阳性对照)的对照质粒的约10个拷贝的Tris缓冲液(10mM TrisHCl缓冲液pH7.5)的等分试样进行PCR。
再次，可以验证下述效应：CHO细胞DNA的存在(a)抑制非特异性PCR扩增产物和(b)增加PCR检测的灵敏度。
实施例8
在来自含胚鸡卵的尿囊液的“接种”样品中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测，其中将不同浓度的CHO细胞DNA加入PCR反应混合物中
如实施例7中所述的进行实验，除在DNA纯化前不加入CHO细胞DNA。相反，在起始PCR之前，将CHO细胞DNA加入反应混合物中。在反应混合物中CHO细胞DNA的浓度是0、2.5、5和10μg/50μl(PCR反应混合物的体积)。这对应于最终反应混合物中的0μg/μl、0.05μg/μl、0.1μg/μl和0.2μg/μl，即仅在起始PCR反应前的反应混合物。图9-12显示结果。
实施例9
在掺加的水性缓冲液中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测
如实施例5中所述的进行实验，除莱氏无胆甾原体DNA的浓度是3cfu/1ml缓冲液外，并且代替CHO细胞DNA，在DNA纯化前加入以200μg/1ml缓冲液的浓度的小牛胸腺。图13显示结果。
值得注意的是，在小牛胸腺DNA的存在下生成的PCR片段显示大小中的某些变动，不像在CHO细胞DNA的存在下产生的片段，例如图6中所示的那些(具体地)。
因此，小牛胸腺DNA不适合于抑制PCR人工产物的形成。考虑到这些结果，得出结论CHO细胞DNA而不是小牛胸腺DNA(和其他真核基因组DNA)的能力可以提供所需效应，原因在于最初基于SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的引物的MYCOTOOL PCR适合于CHO细胞培养和培养上清液的事实。在做出最佳化时，CHO细胞的基因组DNA提供对于引物看起来是有利的“本底”并不显而易见，因为“本底”看起来抑制人工产物的形成。来自其他物种的基因组DNA在组成中是不同的，并且看起来不能抑制非特异性人工产物的形成(或在实现这点时较不有效)。
实施例10
在来自含胚鸡卵的尿囊液的“接种”样品中原核DNA的16S-rRNA互补体中靶序列的检测，其中添加小牛胸腺DNA
如实施例7中所述的进行实验，除代替CHO细胞DNA，在DNA纯化前加入小牛胸腺外。
提供了4种不同样品：(i)不含小牛胸腺DNA的接种的尿囊液，(ii)不含小牛胸腺DNA的非接种的尿囊液，(iii)含加入的小牛胸腺DNA的接种的尿囊液，和(iv)含加入的小牛胸腺DNA的非接种的尿囊液。在(iii)和(iv)的样品中，小牛胸腺DNA的浓度是200mg/1ml尿囊液。
图14显示结果。基本上，结论与实施例9相似。再次，与在CHO细胞DNA的存在下的PCR形成对比，产生非特异性扩增产物。

Claims (13)

1.不含原核DNA的来自CHO细胞的基因组DNA在制备用于测定具有生物学材料的样品中细菌污染物的存在或不存在的改良方法的试剂盒中的用途，所述细菌污染物选自猪鼻支原体、精氨酸支原体、肺炎支原体、发酵支原体、口腔支原体、梨形支原体、莱氏无胆甾原体和非凡螺原体，以及所述方法包括步骤：
（a）处理所述样品且纯化来自所述经处理的样品的核酸，随后为
（b）形成用于基于PCR的扩增反应的组合物，简称反应混合物，所述组合物包括
     - 根据SEQ ID NO:1的第一种引物、
     - 根据SEQ ID NO:2的第二种引物，和
     - 步骤（a）的所述纯化核酸或其用于测量的部分作为模板；随后为
（c）用步骤（b）的所述组合物进行聚合酶链式反应（PCR）；随后为
（d）检测扩增的靶序列的存在或不存在，其中所述扩增的靶序列的存在指示所述样品中所述细菌污染物的存在，并且所述扩增的靶序列的不存在指示所述样品中所述细菌污染物的不存在；
所述改良的特征在于相对于所述样品的体积，将不含原核DNA的来自CHO细胞的预定量的基因组DNA加入（i）所述样品、或（ii）步骤（a）的所述经处理的样品、或（iii）在步骤（a）中获得的所述纯化核酸、或（iv）步骤（b）的所述组合物中，由此所加入的不含原核DNA的来自CHO细胞的基因组DNA减少步骤（d）中的非特异性扩增。
2.权利要求1的用途，其特征在于每ml样品的不含原核DNA的来自CHO细胞的基因组DNA的预定浓度在10 μg/1 ml样品 - 250 μg/1 ml样品的范围中。
3.根据权利要求1和2中任一项的用途，其特征在于所述样品选自具有培养的细胞的细胞培养基、无细胞的培养上清液和羊膜液。
4.根据权利要求3的用途，其特征在于所述样品是羊膜液。
5.根据权利要求4的用途，其特征在于所述羊膜液来自含胚卵。
6.一种组合物，其包含来自含胚卵的羊膜液和来自CHO细胞的基因组DNA。
7.根据权利要求6的组合物，其进一步包含选自离液剂和蛋白酶的裂解试剂。
8.一种组合物，其包含（i）来自样品的纯化核酸，所述样品选自羊膜液、真核细胞的悬液和来自真核细胞的悬液的上清液，和（ii）不含原核DNA的来自CHO细胞的基因组DNA。
9.根据权利要求8的组合物，其进一步包含根据SEQ ID NO:1的第一种引物、根据SEQ ID NO:2的第二种引物、核苷酸三磷酸和耐热的DNA聚合酶。
10.根据权利要求9的组合物，其进一步包含嵌入染料。
11.一种试剂盒，其在分开的容器中包含（i）裂解试剂，（ii）以预定浓度的来自CHO细胞的纯化基因组DNA，所述DNA不含原核DNA，和（iii）根据SEQ ID NO:1的第一种引物和根据SEQ ID NO:2的第二种引物。
12.根据权利要求8 - 10中任一项的组合物在制备用于扩增原核污染物的DNA的试剂盒中的用途，所述原核污染物的DNA来自从样品中分离的DNA，所述样品选自羊膜液、真核细胞的悬液和来自真核细胞的悬液的上清液。
13.不含原核DNA的来自CHO细胞的基因组DNA在制备用于进行聚合酶链式反应（PCR）的改良方法的试剂盒中的用途，
其中通过DNA聚合酶催化的寡核苷酸引物对延伸形成具有范围为100 bp - 1500 bp大小的特异性扩增产物，所述寡核苷酸引物对由根据SEQ ID NO:1的第一种引物和根据SEQ ID NO:2的第二种引物组成，所述引物各自与选自猪鼻支原体、精氨酸支原体、肺炎支原体、发酵支原体、口腔支原体、梨形支原体、莱氏无胆甾原体和非凡螺原体的一种或多种原核生物的16S-rRNA的基因组互补体中包含的靶序列杂交，
其中所述寡核苷酸引物对能够在PCR中形成来自第一种模板的特异性扩增产物，所述PCR在预定条件下在权利要求1定义的反应混合物中进行，并且所述第一种模板包含第一种真核生物的基因组DNA和所述一种或多种原核生物的基因组DNA，
并且其中在所述PCR中，所述寡核苷酸引物对在相同条件下在权利要求1定义的反应混合物中不形成来自第二种模板的扩增产物，其中在所述第二种模板中，不存在所述一种或多种原核生物的基因组DNA，但包含第一种真核生物的基因组DNA，
所述改良方法包括以下步骤：
（a）提供所述寡核苷酸引物对；
（b）提供所述第一种真核生物的基因组DNA；
（c）提供包含第二种真核生物的基因组DNA的第三种模板，所述第二种真核生物被怀疑含有所述一种或多种原核生物的基因组DNA；
（d）在权利要求1定义的所述反应混合物中混合（a）的所述引物对、（c）的所述第三种模板、和测量的量的（b）的所述第一种真核生物的所述基因组DNA，和在所述条件下进行PCR；
其中非特异性PCR扩增产物的形成被抑制，并且其中所述第一种真核生物的基因组DNA是不含原核DNA的来自CHO细胞的基因组DNA。
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