KR101414403B1

KR101414403B1 - 패니바실러스 폴리믹사 검출방법

Info

Publication number: KR101414403B1
Application number: KR1020120080484A
Authority: KR
Inventors: 마종범; 조민석; 지희연; 이정원; 전봉균; 손수인
Original assignee: 주식회사 스마테움
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2014-07-01
Also published as: KR20140014470A

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)의 검출방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계; (b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계. 본 발명의 프라이머쌍 및 이를 이용한 방법은 토양 내 패니바실러스 폴리믹사 균주만을 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통해 패니바실러스 폴리믹사의 동정 및 진단에 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 DNA 수준에서 패니바실러스 폴리믹사 균주의 분포 여부를 판별할 수 있어 토양 내 타겟균의 예찰에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

패니바실러스 폴리믹사 검출방법{Methods for Detecting Paenibacillus polymyxa}

본 발명은 패니바실러스 폴리믹사 검출용 프라이머 및 이를 이용한 패니바실러스 폴리믹사 검출방법에 관한 것이다.

전세계적으로 각종 항생제에 대한 다제내성균 증가로 인하여 세균감염증 치료가 어려움에 직면하고 있으며 기존 항생제에 대한 내성의 증가로 인해 새로운 항생제의 개발이 요구되고 있으며, 또한 새로운 항균물질 등을 발굴하고자 하는 다양한 노력이 이루어지고 있다.

항생제는 세균의 생장을 억제하거나 사멸시키는 항균물질 중의 하나로 병원성 세균에 대한 항균물질은 1928년 영국에서 페니실린(penicillin)을 발견하여, 2차 세계대전에서 창상감염증을 효과적으로 치료함으로써 인류 역사상 가장 우수한 치료제의 하나로 등장하였다. 그러나, 1950년대 초 페니실린에 의하여 사멸되지 않는 스타필로코커스(Staphylococcus) 균주가 나타나기 시작했으며, 페니실린에 내성 뿐 아니라, 테트라사이클린(tetracycline)과 에리스로마이신(erythromycin)에도 내성을 나타내는 스타필로코커스 균주가 보고되었다. 이처럼 현재 항생제 내성 및 다제내성 세균의 증가로 치료가 어려운 경우가 많아졌으며, 앞으로 세균감염 치료가 더욱 어려워질 것으로 세계적인 전문가들이 예측하고 있다. 이에 따라, 다제내성균에 대하여 항균효과를 가지는 새로운 항생물질의 개발이 절실히 요구되고 있으며, 학계와 산업계에서는 새로운 항생물질인 천연항생제 개발에 많은 노력을 기울이고 있다.

패니바실러스 속의 균들은 다양한 종류의 항균물질을 생산하고 있으며 이 속에서 새로운 항균물질들이 지속적으로 보고되고 있다. 패니바실러스 엘기(Paenibacillus elgii)에서 광범위한 항미생물 효과가 발견되었고(Kim, et al ., 2004), 패니바실러스 서큘란스(Paenibacillus circulans)와 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymixa)에서 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 억제하는 박테리오신(bacteriocin)이 보고되었으며, 패니바실러스 균주인 B2 스트레인에서 항균 펩타이드가 보고되었고, 패니바실러스 폴리믹사에서 신규한 란티바이오틱(lantibiotic)과 폴리믹신(polymixin)을 생산하는 균주가 보고되었다.

패니바실러스 폴리믹사는 식물의 뿌리 부근에 서식하면서 식물의 생장을 촉진하고 토양의 다른 미생물과 상호작용해 식물병 발생을 억제하며, 다양한 항생물질과 가수분해 효소를 생산하는 유용 미생물이다. 또한, 질소고정을 하는 그람양성 세균으로 최근 그 중요성이 크게 부각되고 있다. 특히, 패니바실러스 폴리믹사는 폴리믹신 B와 같은 작은 펩타이드 항생물질을 생산한다고 알려져 있으며, 이 균주는 가타발린(gatavaline), 졸리펩틴(jolipeptin), 가바세린(gavaserin), 살타발린(saltavalin), 물질 BN 109(substance BN 109), LI-F 등과 같은 다양한 항균물질을 생산한다는 사실이 보고되었다. 이처럼 패니바실러스 폴리믹사는 다제내성을 가지는 다양한 장내세균에 대하여 항균력을 나타내어 장내세균 치료제로서의 잠재력을 가지고 있다. 또한, 미생물 농약(기존 화학농약으로 방제가 어려운 토양병해 방제), 환경친화형 비료(벼보리밀 등 작물생장 촉진제), 항생제(항진균제), 효소(키티나아제셀룰라아제), 부탄올 생산 등 광범위한 분야에서 다양하게 활용될 수 있을 것이며, 향후 국제적으로 화학합성 농약 사용규제가 강화될 것으로 보여 무독성 농약 개발부문에서 효과적으로 적용될 수 있다.

그러나, 정확한 패니바실러스 폴리믹사의 올바른 동정을 위해서 토양내 미생물을 배양하여 형태학적, 생화학적 테스트를 수행하는 것을 원칙으로 하는데, 이는 최소 3일에서 수 주일이 소요된다. 이와 같은, 배지법이나 생화학적 테스트는 공인검사법으로 널리 사용되고 있기는 하지만 정확히 검출하지 못하는 한계가 있다.

상술한 바와 같이, PCR법과 같은 다양한 기술을 이용하여 신속하고 정확하며, 토양 미생물의 배양과정이 생략되어 토양 내 패니바실러스 폴리믹사 균체를 검출할 수 있는 검출 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 토양 내 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) 균주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 토양 내 패니바실러스 폴리믹사를 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하고 이를 이용한 증폭을 통해 패니바실러스 폴리믹사를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 패니바실러스 폴리믹사 검출용 프라이머 쌍을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 패니바실러스 폴리믹사 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)의 검출방법을 제공한다: (a) 시료를 준비하는 단계; (b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머로 이루어진 패니바실러스 폴리믹사 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.

본 발명자들은 토양 내 패니바실러스 폴리믹사 균주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 토양 내 패니바실러스 폴리믹사를 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하고 이를 이용한 증폭을 통해 패니바실러스 폴리믹사를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.

패니바실러스 폴리믹사는 그람-양성(Gram-positive) 균주로, (a) 질소 고정능을 가지고; (b) 비병원성이며; 및 (c) 내생포자 형성 바실러스로 낮은 GC+ 함량(G+C content)으로 구성되어 있다. 또한, 패니바실러스 폴리믹사는 근권미생물(생육촉진근권세균; Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR)로, 식물의 뿌리 부근에 서식하면서 식물의 생장을 촉진하고 토양의 다른 미생물과 상호작용해 식물병 발생을 억제하며, 다양한 항생물질과 가수분해 효소를 생산하는 유용 미생물이다.

이에, 본 발명자들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 blastn 프로그램을 이용하여 패니바실러스 폴리믹사를 특이적으로 검출할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 정보를 탐색한 결과, 패니바실러스 폴리믹사를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 디자인하였으며, 이는 서열목록 제3서열을 기반으로 제1서열 및 서열목록 제2서열로 예시되어 있다(참고: 표 2).

본 발명에 따르면, 본 발명은 시료에서 매우 효과적이고 간편하게 패니바실러스 폴리믹사를 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 "어닐링(annealing)" 또는 "프라이밍(priming)"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 타겟 핵산에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서의 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 본 명세서의 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 타겟 유전자를 적합한 방법으로 분석하여 패니바실러스 폴리믹사를 검출하는 것이다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 패니바실러스 폴리믹사를 검출할 수 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상의 시료(예컨대, 토양)에서 패니바실러스 폴리믹사를 검출하는 것이다. 즉, 본 발명의 방법은 시료 내 패니바실러스 폴리믹사의 게놈 DNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용한 유전자 증폭 반응을 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 토양으로부터 DNA를 추출한 후, 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭하고 이의 결과물을 확인한다. 그 결과, 예상 크기의 PCR 증폭산물이 검출되면 상기 토양에 패니바실러스 폴리믹사가 포함된 것으로 판단(/진단)할 수 있다.

본 명세서의 용어 "토양"은 패니바실러스 폴리믹사의 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 DNA를 추출하는 데 이용하는 미지의 물질을 의미하며, 예를 들어 패니바실러스 폴리믹사를 포함한 토양 및 생물학적 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 토양으로부터 DNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 쌍(Pp268F 및 Pp268R)을 이용한 증폭산물은 패니바실러스 폴리믹사를 포함하는 시료에서 268 bp의 DNA 증폭산물을 생산한다(참고: 도 1).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 제1서열 및 서열목록 제2서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 패니바실러스 폴리믹사 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 프라이머 쌍을 이용하기 때문에, 그 발명들 사이의 공통 사항은 본 명세서의 복잡성을 야기하는 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 프라이머 쌍은 패니바실러스 폴리믹사를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 이를 이용하면 진단하고자 하는 시료(예컨대, 토양) 내 패니바실러스 폴리믹사를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 즉, 본 발명의 프라이머 쌍에 의해 증폭된 산물은 패니바실러스 폴리믹사의 존재에 대한 지표가 될 수 있으며, 패니바실러스 폴리믹사의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 증폭반응(예컨대, PCR)에 의한 패니바실러스 폴리믹사의 검출을 위해 필요한 최소 DNA 양은 1-500 ng이고, 보다 바람직하게는 1-250 ng이며, 보다 더 바람직하게는 1-150 ng이고, 가장 바람직하게는 1-50 ng이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 따라 검출될 수 있는 패니바실러스 폴리믹사의 시료 내 양은 10¹-10⁷ 세포/g이고, 보다 바람직하게는 10¹-10⁵ 세포/g이며 가장 바람직하게는 10²-10⁴ 세포/g이다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 패니바실러스 폴리믹사 검출용 프라이머 쌍, 이를 이용한 패니바실러스 폴리믹사 검출방법, 그리고 패니바실러스 폴리믹사 진단 키트에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 방법은 토양 내 패니바실러스 폴리믹사 만을 신속하고 정확하게 검출할 수 있으며, 이를 통해 패니바실러스 폴리믹사 진단에 이용될 수 있다.

(c) 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 DNA 수준에서 패니바실러스 폴리믹사의 분포 여부를 판별할 수 있어 토양 내 타겟균의 예찰에 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과를 보여주는 사진이다. 약어: M, DNA 사이즈 마커; 레인 1 내지 47, 균주(표 1); 및 레인 48, 음성 대조군.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 실험균주

본 발명에서 사용된 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)을 포함한 기타 미생물은 표 1에 정리하였다.

본 발명에서 이용된 균주들.

번호	균주 명( Species Name )	기탁번호( Collection No .)
1	Paenibacillus polymyxa	KACC 10098
2	Paenibacillus polymyxa	KACC 10790
3	Paenibacillus polymyxa	LMG 6320
4	Paenibacillus polymyxa	LMG 11617
5	Paenibacillus polymyxa	LMG 13295
6	Paenibacillus aestuarii ^T	KACC 13125
7	Paenibacillus anaericanus ^T	KACC 11533
8	Paenibacillus assamensis ^T	KACC 12301
9	Paenibacillus barcinonensis ^T	KACC 11450
10	Paenibacillus brasilensis ^T	KACC 13842
11	Paenibacillus castaneae ^T	KACC 14162
12	Paenibacillus chibensis ^T	KACC 11526
13	Paenibacillus chinjuensis ^T	KACC 12279
14	Paenibacillus favisporus ^T	KACC 15577
15	Paenibacillus forsythiae ^T	KACC 14518
16	Paenibacillus gansuensis ^T	KACC 12291
17	Paenibacillus ginsengarvi ^T	KACC 13906
18	Paenibacillus lactis ^T	KACC 11525
19	Paenibacillus larvae	KACC 14031
20	Paenibacillus massiliensis ^T	KACC 11490
21	Paenibacillus motobuensis ^T	KACC 11488
22	Paenibacillus naphthalenovorans ^T	KACC 11505
23	Paenibacillus odorifer ^T	KACC 11494
24	Paenibacillus panacisoli ^T	KACC 13041
25	Paenibacillus pasadenensis ^T	KACC 14475
26	Paenibacillus phyllosphaerae ^T	KACC 15578
27	Paenibacillus pini ^T	KACC 14198
28	Paenibacillus pinihumi ^T	KACC 14199
29	Paenibacillus rhizosphaerae ^T	KACC 15579
30	Paenibacillus soli ^T	KACC 15341
31	Paenibacillus sp.	KACC 13757
32	Paenibacillus tarimensis ^T	KACC 14087
33	Paenibacillus thiaminolyticus ^T	KACC 14476
34	Paenibacillus timonensis ^T	KACC 11491
35	Paenibacillus tundrae ^T	KACC 14353
36	Paenibacillus wynnii ^T	KACC 12302
37	Paenibacillus xinjiangensis ^T	KACC 12292
38	Paenibacillus xylanexedens ^T	KACC 14352
39	Paenibacillus xylanilyticus ^T	KACC 15580
40	Rhizobium cellulosilyticum ^T	KACC 15581
41	Rhizobium daejeonense ^T	KACC 13094
42	Rhizobium rhizogenes ^T	KACC 10734
43	Rhizobium rubi ^T	KACC 10739
44	Rhizobium vitis ^T	KACC 10735
45	Pseudomonas aeruginosa ^T	LMG 1242
46	Pseudomonas fluorescens ^T	LMG 1794
47	Escherichia coli ^T	LMG 2092
48	Negative control (D.W)

KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea; The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms(BCCM^TM), Belgium.

^T; 표준 균주형.

사용된 균주들은 영양배지[Nutrient agar; 염화 나트륨 5 g, 펩톤(Difco) 5 g, 이스트 익스트렉트(Difco) 2 g, 미트 익스트렉트(Difco) 1 g, 아가 15 g: 1L]에 글루코즈 10 g을 첨가하여 배양하였다.

실시예 2: 프라이머 쌍 제작

실시예 2-1: DNA 추출

실시예 1에서 배양된 균주들의 게놈(genomic) DNA는 Qiagen(Hilden, Germany)사의 게놈 DNA 추출 키트(Genomic-tips)를 이용하여 추출하였다.

실시예 2-2: 특이 염기서열 정보 탐색

패니바실러스 폴리믹사를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제작을 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 패니바실러스 폴리믹사의 유전체 정보를 blastn 프로그램을 이용한 분석을 통해 제작하였으며, 그 결과 상기 염기서열이 패니바실러스 폴리믹사-특이적이라는 것을 확인하였다.

실시예 2-3: 프라이머 쌍 제작

패니바실러스 폴리믹사의 268 bp 크기의 단편을 증폭하는 Pp268F 프라이머와 Pp268R 프라이머 쌍을 제작하였다. 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.

본 발명에서 이용된 프라이머 서열.

서열번호	명칭	염기서열(5-> 3)
1 2	Pp268F Pp268R	GCCCGTTGCCCCGTAGA TGGCGCGACTGCTGAGGAAC

상기 프라이머는 GenBank 등록된 각각의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인한 후 제작하였다.

실시예 3: 프라이머 쌍의 특이성 확인

실시예 3-1: 일반 PCR 증폭 반응

Pp268F 및 Pp268R로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 표 1에 기재된 균주들을 대상으로 PCR 증폭 반응을 실시하였다.

PCR 증폭 반응은 PTC-200TM thermocycler(MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴, dNTP(각각 0.2 mM), 10 pM의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머, 1 유니트의 Taq 중합효소(Taq polymerase; Promega, Madison, Wis.)를 함유하는 PCR 혼합액으로 총 50 ㎕의 양으로 실시하였다. PCR 혼합액에 첨가한 균주들의 게놈 DNA 양은 약 50 ng이었다.

패니바실러스 폴리믹사의 PCR 반응 조건은 다음과 같다: (a) 전-변성 단계, 94℃에서 5분; (b) PCR 증폭단계(35 사이클), 1 사이클 당 95℃에서 60초, 63℃에서 30초 및 72℃에서 60초; 및 (c) 최종 연장단계, 72℃에서 10분. 증폭반응 후 10 ㎕의 PCR 증폭산물을 1.5% 농도의 아가로오스 젤에 전기영동한 후 EtBr(Ethidium bromide)로 염색하여 자외선 조사기(UV transilluminator)로 밴드 패턴을 확인하였다(도 1).

도 1을 통해 알 수 있듯이, PCR 증폭 산물은 패니바실러스 폴리믹사 균주인 1 내지 5번에서만 확인되었는 바, 본 발명의 프라이머 쌍이 패니바실러스 폴리믹사 균주를 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Smarteome. Co., Ltd. <120> Methods for Detecting Paenibacillus polymyxa <130> PN120378 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp268F primer <400> 1 gcccgttgcc ccgtaga 17 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pp268R primer <400> 2 tggcgcgact gctgaggaac 20 <210> 3 <211> 1338 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 3 tcatttcgtc acaacctcta ccgtcattcc aggcaataat tcagatgttc gctggagatc 60 cacccgtact tggaaggagc ttatatccga cagacctttg tcacgactca ttctcatgtt 120 ggtatactga ggggcagaag taatgtacct caccttgcct tggacatctt tatctaaagc 180 tacaacgtgc gaagtcacat ttcccccagc tttaaactgt gatatggaat cctcgcccac 240 ataaatatcg tagtatagct gattggtttc aataacggcg cccgttgccc ccgtagaaac 300 gatctctccc attttaggta caatacgtgc caccttacca tctgtagatg ccttcagcac 360 catacgtccg cgctgcaatt ccaaagtttt gagttgaaca cttaatgcct gcttttgttg 420 agccagaaga tccacattgt attcgctatt cttaacatct tttcgtgttt gcgaggtttg 480 agtcaaggct tccttggctt tttctgtttt gatacgagcc tgctggcgtt cctcagcagt 540 cgcgccagcc tccattttat ccaaagcggt ttgctgctga gcgatcccat ttttagcaat 600 gtccgattgt ttgctagccg cagtaatctg gttattggaa atttcaacct gatccttagc 660 tgtatctaac gcgatttggg cattatccag ttggtttttg gcgttatcca tttctgcttt 720 ggttccagct ccggcatcat ataacgcttg gatacggttg taattcactt tagccaagtc 780 cagagcctgt tgtctggatg caactgtttt ttgcgcgatt tccgcatttc ttttggctgt 840 ctctactcct gtcagagctg cgtccaacga ttgctgtgct gcttcaatag ccagtttttg 900 tcttacaata tcctccgcac gtgtgccttg gtttaataag gactctccag cttgcgcggc 960 ttgaatgtcc aattgcccct gtttttctga attcgaaatt ttctccgact gattttgtag 1020 cccgtcttta gcctgtttta ttttcacatc agcctgtgcg atatccgttt ttaatttctc 1080 aatttgcaaa tcaaggtcta caggatcgag ggtcatgagc acatcccctt ttttcacctg 1140 ttgttcttcc ttcacctcaa tcgtgtttac tcttccccct acaccctgaa aagcaacatt 1200 cacggtatct gccgtaagca gtgtattttt ttgttgggct gccatactca cagcatcctt 1260 gccgctcatt gccatcagcg tacctccagt acctaatgcg acaacaagta acacatacac 1320 aatgatcttt ttattcat 1338

Claims

다음의 단계를 포함하는 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)의 검출방법:
(a) 시료를 준비하는 단계;
(b) 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머를 이용하여 상기 시료 내의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과물을 확인하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 토양 또는 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 검출은 유전자 증폭을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 패니바실러스 폴리믹사 진단용 키트.
제 4 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 키트.
삭제
서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머로 이루어진 패니바실러스 폴리믹사 검출용 프라이머 쌍.