CN107787370A - Rna的分子检测 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测RNA，如核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)等的方法。所述方法包括在溶液中加热包含RNA的细胞以从所述细胞中释放所述RNA；使用酶将所述RNA逆转录成DNA；使用所述相同的酶扩增所述DNA；以及检测所述扩增的DNA。在基本上相同的温度和基本上恒定的温度下进行所述方法中的至少一些中的所述加热、逆转录、以及扩增而在所述步骤期间或之间不添加另外的试剂。所述方法可以用于检测样品内区别于另一细胞类型的一种细胞类型的存在或确定基因表达的水平，每一种均不需要精心设计的提取方案。
Description
技术领域
本发明涉及扩增RNA以用于检测和鉴定单细胞物种和多细胞物种以及细胞的基因表达状态。本发明提供了等温扩增和检测核糖体RNA(rRNA)以用于特异性检测致病微生物和其它生命形式的方法以及扩增和检测信使RNA(mRNA)以用于检测基因表达的方法，所有这些方法均克服了对精心设计的提取方案的需要。
背景技术
对感染性疾病、癌症、或代谢紊乱的最有效的护理的施用往往取决于诊断的速度和可靠性。响应时间往往不仅受到样品制备的速率和诊断测试本身的孵育期的阻碍，而且还受到只有在装备完善的中心实验室中才能找到的先进设备和训练有素的工作人员的缺乏以及必须将样品运送到实验室和将结果传回给患者护理人员的阻碍。理论上，快速诊断将需要易于由受过最低限度训练的人员在不存在先进设备的情况下进行并且在单次患者就诊的范围内提供明确的结果的测试。这些要求驱动了对更快的、更灵敏的、更特异性的、更简易的诊断测试的需要。
在诊断领域内广泛认为基于检测感染因子的核酸的方法是可用于诊断感染性疾病的最快的、最可靠的测试之一。同样，用于基因表达的基于核酸的测试与替代方法相比在获得结果的速度、灵敏度、以及特异性方面提供优势并且特别适用于早期检测包括但不限于癌症和代谢紊乱的疾病状态。
最广泛使用的核酸检测方法是聚合酶链反应(PCR)的变体，它们提供了对少到单个核酸拷贝的非常特异性的检测。为了提供这种灵敏度，使用PCR产生靶序列的数十亿个拷贝，它们容易通过许多方法来检测，最常见的是由于荧光共振能量转移(FRET)探针的染料结合或激活而产生的荧光。最近，许多核酸扩增方法已经被引入，这些方法与PCR的共同之处在于靶核酸的高度灵敏和特异性的拷贝，但是不同之处在于它们使用基本上等温的条件，即在整个扩增期间使用单一温度。等温检测的主要方法是由东京的荣研化学株式会社(Eiken Chemical，Tokyo)开发的环介导等温扩增(LAMP)(Notomi等，2000年，美国专利6,410,278)。等温扩增具有几个优势，主要与检测速度、仪器的简单性以及测试的易执行性和易解读性有关。
用于检测细胞病原体和病毒病原体这两者的绝大多数的测试使用感染因子的DNA(或在某些病毒情况下的RNA)基因组内的确定序列作为靶标。这在本质上将在理想情况下检测的灵敏度限制在基于分别存在于例如原核细胞和二倍体真核细胞中的基因组DNA/RNA的一个或两个拷贝的单细胞水平。实际上，由于所有核酸扩增方法在不同程度上固有的不理想的扩增效率，因此检测限往往高出几个数量级。细胞还含有RNA，如果扩增化学方法被改进以支持它的检测，那么RNA可以用作替代的检测靶标。细胞中大部分的RNA呈信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、短核RNA(snRNA)的形式以及其它形式，它们仅可以间歇地表达并且在表达时，通常以每个细胞1个至100个的拷贝数存在。相反，核糖体RNA(rRNA)是组成型表达的，即存在于所有的活细胞中而基本上与代谢状态或发育阶段无关，并且常常以10,000个至100,000个的拷贝数存在于细菌细胞、真菌细胞以及其它细胞中。这样高的丰度可以被利用以大大增强灵敏的检测。
rRNA在微生物物种内是高度保守的，但是在比较不同的物种时是不同的。因此，编码这些rRNA的gDNA序列已经被广泛用于确定包括细菌、真菌、原生动物等的微生物的身份(Dark等，2009；Hofman等，2015；Lo等，2015；Frickmann等，2015；Steenkeste等，2009；Jenkins等，2012；Ravindran等，2015；Ptaszynska等，2014；Huy等，2012；Xu和Li等，2012)。这种广泛使用已经产生公共数据库，所述公共数据库提供有助于快速设计核酸测试的来自大量微生物生命的rRNA核酸序列(Cole等，2014；Wang等，2007；Wang等，2013；Fish等，2013；Cole等，2011；Cole等，2009；Cole等，2007；Cole等，2005；Cole等，2003；Maidak等，2001；Maidak等，2000；Maidak等，1999；Maidak等，1997；Maidak等，1996；Maidak等，1994；Larsen等，1993；Olsen等，1992)。与大多数RNA种类相比，rRNA在细胞中是相当稳定的，这提高了检测的可能性。
除了在原核生物基因组和真核生物基因组中编码的rRNA基因之外，rRNA基因还在真核生物的线粒体基因组中被编码。这些线粒体rRNA基因被表达，并且所表达的线粒体rRNA也可以通过本发明的方法来检测。
mRNA的检测被广泛用于辨别与导致癌症的致癌转化和其它代谢紊乱相关的代谢变化。mRNA检测通常使用使得能够进行逆转录PCR(RT PCR)的两种酶扩增混合物来进行。这些方法受到检测rRNA所固有的相同限制的阻碍，包括方案的复杂性和获得结果的时间较长。
检测包括rRNA和mRNA的任何RNA的一个重要的阻碍在于为了扩增靶标，扩增的化学方法必须提供一种手段来产生RNA的反向互补DNA拷贝，之后通过本领域被称作逆转录(RT)的方法扩增DNA拷贝。这在传统上依赖于多种酶，包括用于逆转录步骤的一种酶以及用于扩增步骤的至少一种酶。某些酶，例如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)聚合酶I可以通过调节扩增混合物的离子含量来诱导以提供逆转录和扩增这两者。然而，根据几种标准的性能不如双酶法并且这种方法在本领域中没有被广泛使用。更常见的是使用逆转录病毒逆转录酶(例如莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)或禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶)以及DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的方法。这些方法基本上是两步法。一些方案已经简化了这两个步骤以提供在功能上似乎是单步法的方法，但是这些方法必然是最适合于逆转录和扩增所需的酶的条件之间的折衷。由于促进逆转录和扩增的温度是不同的，因此在检测RNA靶标期间通常在不同的温度下进行单独的孵育。此外，rRNA与其它形式的RNA相比是高度结构化的，即它形成高度稳定的双链结构。该双链结构在加热到大于约60℃时松弛。如果冷却的话，RNA会快速重新退火，因此，合适的逆转录必须在更高的温度下进行。
除了两个例外，等温扩增方法没有被报道优先检测rRNA。转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)的相关方法已经被用于检测rRNA并且被并入到商业诊断产品(例如Hologic Aptima CT/NG测定)中。然而，这些产品的使用需要单独的步骤来进行靶标捕捉、扩增、以及通过杂交进行的检测，它们各自需要流体转移或添加以及在不同温度下进行的孵育。这种复杂性使得这样的测试不适用于在装备完善的实验室之外由训练有素的专业人员操作。
许多等温扩增测试已经被报道靶向原核生物和真核生物这两者的DNA中存在的rRNA基因的基因组拷贝。这些测试在它们的灵敏度方面受限于基因组或线粒体中rRNA基因的拷贝数并且与对任何其它DNA靶标相比，没有赋予显著的灵敏度优势。
在理想情况下，适用于快速检测包括rRNA或mRNA的RNA靶标的方法应当无缝地提供逆转录以及DNA扩增而不需要另外的处理或孵育步骤。适当的是，检测性能应当在灵敏度、特异性、以及获得结果的时间方面至少等同于双酶法。更适当的是，这种方法将与在不进行另外的处理的情况下直接检测细胞相容，从而使对精心设计的样品提取方案的需要减到最低限度。对灵敏度优势的验证将通过以低于单细胞灵敏度直接检测细胞的能力来提供。更适当的是，所述化学方法将简单到足以使得它在先进的设备和仪器以及训练有素的人员不可获得时便于使用。需要表现出这些特征中的至少一些的方法。
发明内容
提供了通过扩增和检测RNA，如rRNA和mRNA来检测细胞和确定细胞状态的改进的方法。所述rRNA和mRNA的扩增优选地使用等温扩增来进行。所述方法利用了某些热稳定性DNA聚合酶的独特特性，包括热稳定性、逆转录酶活性(RNA依赖性DNA聚合酶活性)、DNA依赖性DNA聚合酶活性、以及链置换活性。所述方法可以提供适合于缺乏广泛训练的专业人员以有限的设备使用的方法。
本发明的一种型式是一种检测RNA的方法。所述方法包括在溶液中加热包含RNA的细胞以从所述细胞中释放所述RNA；使用酶在逆转录温度下将所述RNA逆转录成DNA；使用所述酶在扩增温度下扩增所述DNA；以及检测所述扩增的DNA。所述酶在所述逆转录温度下具有热稳定性，在所述扩增温度下具有热稳定性，具有逆转录酶活性，具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，并且具有链置换活性。所述逆转录温度和所述扩增温度是基本上相同的。
在一些型式中，所述逆转录温度和所述扩增温度各自在彼此相差15℃以内。
在一些型式中，所述逆转录温度和所述扩增温度各自在65℃至90℃的范围内。
在一些型式中，所述方法包括在所述逆转录期间、从所述逆转录到所述扩增、以及在所述扩增期间维持基本上恒定的温度。所述基本上恒定的温度可以在跨越15℃的范围内。
在一些型式中，所述加热包括将所述细胞加热到与所述逆转录温度和所述扩增温度基本上相同的温度。
在一些型式中，所述方法包括在所述加热期间、从所述加热到所述逆转录、在所述逆转录期间、从所述逆转录到所述扩增、以及在所述扩增期间维持基本上恒定的温度。所述基本上恒定的温度可以在跨越15℃的范围内。
在一些型式中，进行所述加热、所述逆转录、以及所述扩增而在这些步骤期间或之间不添加另外的试剂。
在一些型式中，进行所述加热、所述逆转录、所述扩增、以及所述检测而在这些步骤期间或之间不添加另外的试剂。
在一些型式中，在单个容器中在基本上恒定的温度下进行所述加热、所述逆转录、所述扩增、以及所述检测而在所述步骤期间或之间不添加另外的试剂。所述基本上恒定的温度可以在跨越15℃的范围内。
在一些型式中，RNA是核糖体RNA(rRNA)。
在一些型式中，所述RNA是信使RNA(mRNA)。
在一些型式中，所述溶液包含与核糖体RNA序列互补的引物，所述核糖体RNA序列在第一细胞类型的细胞当中是保守的并且不存在于第二细胞类型的细胞的核糖体RNA中。
在一些型式中，所述扩增包括等温扩增，如环介导等温扩增。
在一些型式中，所述溶液包含体液。
在一些型式中，所述方法还包括将液体与干燥的溶液组分混合以产生所述溶液，其中所述干燥的溶液组分包括所述酶。在一些型式中，所述方法还包括将包含所述细胞的液体与干燥的溶液组分混合以产生所述溶液，其中所述干燥的溶液组分包括所述酶。所述液体可以包含体液。
在一些型式中，所述加热不包括酶消化或物理搅拌所述细胞，并且所述加热在不对所述细胞进行酶消化或物理搅拌的情况下从所述细胞中释放所述RNA。
从以下结合附图对本发明的优选的实施方案作出的详细说明，本发明的目的和优势将更充分地显现出来。
附图说明
图1：通过使用RT LAMP检测rRNA来检测荚壳伯克霍尔德氏菌(B.glumae)的灵敏度。使用RT LAMP测试荚壳伯克霍尔德氏菌细胞的所示稀释液。轴上所示的CFU是通过平板计数来确定的。阳性对照(pos)是提取的荚壳伯克霍尔德氏菌gDNA。NTC指示没有添加核酸或细胞的非模板对照反应。数据点是一式三份反应的平均值。
图2：16S RT LAMP荚壳伯克霍尔德氏菌测试的特异性。使用荚壳伯克霍尔德氏菌反应来测试大肠杆菌(E.coli)细胞、金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞、荚壳伯克霍尔德氏菌细胞以及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)细胞的培养物。通过琼脂糖凝胶电泳检测阳性反应。包括没有添加核酸或细胞的阴性反应。
图3：rRNA复合物内皮炎芽生菌(B.dermatitidis)测试的靶序列的示意图。
图4：PCR、RT PCR、以及RT LAMP在检测RNA和DNA中的灵敏度之间的比较。通过如所示的标准PCR或RT PCR对来自芽生菌(Blastomyces)的提取的RNA样品和DNA样品的稀释液以及非模板对照(NTC)进行定量(图A)。通过RT LAMP测试相同的样品稀释液(图B)。在每一个稀释度下的条柱组中从左到右的条件如图例中从上到下所列。
图5：在不提取的情况下使用rRNA靶向LAMP直接检测细胞。在存在和不存在唾液的情况下测试约106cfu的培养的皮炎芽生菌细胞的样品。包括非模板对照(NTC)。
图6：细胞裂解。将约2,000cfu的培养的芽生菌细胞添加到每一个反应中，除了非模板对照(NTC)和阳性对照之外，后者含有提取的PCR产物。将通过珠粒搅打方案(图A)或在如所示的不同的温度和孵育时间下进行酶促裂解(图B、图C、以及图D)对细胞进行的预处理与无处理相比较。
图7：HPV mRNA的检测。从没有经过处理(图A)或经过RNA酶处理(图B)的HeLa细胞培养物中提取总核酸。将提取物以log10系列稀释。通过针对E6/E7mRNA的LAMP测试如所示的稀释液。还运行无模板对照(NTC)。
具体实施方式
提供了以亚单细胞灵敏度检测细胞的方法。这些方法依赖于对来自细胞的核酸的检测并且可以对直接从增殖细胞中分离的RNA，如核糖体RNA(rRNA)进行而无需另外的处理或处置。所述方法是通过某些酶的热稳定性、逆转录活性、DNA依赖性DNA聚合酶活性、以及链置换活性的组合来促成的。
还提供了通过基于mRNA水平的变化来检测基因表达的增加或减少以检测细胞的代谢状态的变化的方法。该信息可以用于推断诸如癌症的疾病的进展或推断细胞的代谢状态的病理改变，从而向临床医生提供指导治疗的可行信息。
热稳定性、逆转录活性、DNA依赖性DNA聚合酶活性、以及链置换活性是本领域公知的酶的特性或活性。热稳定性是在高温下维持一种或多种酶活性的能力。逆转录活性也被称为RNA依赖性DNA聚合酶活性，是从RNA模板合成DNA分子的活性。DNA依赖性DNA聚合酶活性是从DNA模板合成DNA分子的活性。链置换活性是置换退火到RNA模板或DNA模板的下游DNA的活性。
用于本发明中的酶优选地在以下温度下对于逆转录活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性具有热稳定性：至少约40℃、至少约45℃、至少约50℃、至少约55℃、至少约60℃、至少约61℃、至少约62℃、至少约63℃、至少约64℃、至少约65℃、至少约66℃、至少约67℃、至少约68℃、至少约69℃、至少约70℃、至少约71℃、至少约72℃、或更高。这样的热稳定性优选地在以下时间段内表现出：至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟或更长时间。可以用于本发明中的酶的热稳定性没有温度上限，但是很少有酶在比110℃高得多的温度下具有热稳定性。
与链置换活性相一致，适用于本发明中的酶优选地缺乏5′→3′核酸外切酶活性。这容许用于从核酸模板置换先前合成的链的等温扩增技术中，如环介导等温扩增(LAMP)等。
适用于本发明的各种型式中的示例性酶包括来自Lucigen公司(威斯康辛州的麦迪逊(Madison WI))的PYROPHAGE 3173核酸外切酶减去型(Exo-)DNA聚合酶、来自Lucigen公司的OMNIAMP聚合酶、来自新英格兰生物实验室公司(New England BioLabs Inc.)(马萨诸塞州的伊普斯维奇(Ipswich，MA))的Bst 2.0 DNA聚合酶、以及来自OptiGene公司(英国的西萨塞克斯(West Sussex，UK))的GspSSD LF DNA聚合酶等。在US 2012/0083018(美国申请13/313,783)中描述的聚合酶和其序列变体也是合适的，该美国申请以引用的方式并入本文。
使用具有上文所述的特性的酶，本发明的方法包括将从细胞中释放的RNA逆转录成DNA以及在基本上相同的温度下扩增所述DNA。如本文所用的“温度”指的是单个温度值或温度值的范围。如本文所用，关于温度所使用的“基本上相同的”指的是彼此相同的或相差约30℃、约25℃、约20℃、约19℃、约18℃、约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、或约1℃以内的温度值。
所述逆转录和所述扩增各自优选地在以下温度下进行：约40℃至约90℃、约50℃至约90℃、约55℃至约90℃、约60℃至约90℃、约61℃至约90℃、约62℃至约90℃、约63℃至约90℃、约64℃至约90℃、约65℃至约90℃、约66℃至约90℃、约67℃至约90℃、约68℃至约90℃、约69℃至约90℃、约70℃至约90℃、约40℃至约80℃、约50℃至约80℃、约55℃至约80℃、约60℃至约80℃、约61℃至约80℃、约62℃至约80℃、约63℃至约80℃、约64℃至约80℃、约65℃至约80℃、约66℃至约80℃、约67℃至约80℃、约68℃至约80℃、约69℃至约80℃、或约70℃至约80℃。在本发明的一些型式中，所述逆转录和所述扩增各自优选地在以下温度下进行：最多约75℃、最多约76℃、最多约77℃、最多约78℃、最多约79℃、最多约80℃、最多约81℃、最多约82℃、最多约83℃、最多约84℃、最多约85℃、最多约86℃、最多约87℃、最多约88℃、最多约89℃、或最多约90℃。
所述逆转录和所述扩增各自进行一段时间。所述时间段优选地是约2分钟至约120分钟的时间段，如约2分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约105分钟、约120分钟、或其间的任何范围。高于和低于指定值的时间段也是可接受的。
所述逆转录和所述扩增可以各自包括在所述时间段内维持基本上恒定的温度。“基本上恒定的温度”指的是被维持在跨越约30℃、约25℃、约20℃、约19℃、约18℃、约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、或约1℃的范围内的温度。
用于逆转录的RNA模板可以是任何类型的RNA，包括信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、短核RNA(snRNA)以及核糖体RNA(rRNA)等。在本发明的一个优选的型式中，使用rRNA作为模板。在另一个优选的型式中，mRNA是模板。
用于所述逆转录的RNA的来源优选地是释放所述RNA的细胞。所述细胞优选地是于没有可检测量的游离RNA(没有被包封在细胞内的RNA)的溶液中的完整或未裂解的细胞、或完整或未裂解的细胞的群体。优选地通过在如本文所述的溶液中加热细胞来从所述细胞中释放RNA。所述细胞被加热到的温度优选地与进行逆转录和/或扩增时的温度基本上相同。因此，通过将细胞加热到以下温度来从所述细胞中释放RNA：约40℃至约90℃、约50℃至约90℃、约55℃至约90℃、约60℃至约90℃、约61℃至约90℃、约62℃至约90℃、约63℃至约90℃、约64℃至约90℃、约65℃至约90℃、约66℃至约90℃、约67℃至约90℃、约68℃至约90℃、约69℃至约90℃、约70℃至约90℃、约40℃至约80℃、约50℃至约80℃、约55℃至约80℃、约60℃至约80℃、约61℃至约80℃、约62℃至约80℃、约63℃至约80℃、约64℃至约80℃、约65℃至约80℃、约66℃至约80℃、约67℃至约80℃、约68℃至约80℃、约69℃至约80℃、或约70℃至约80℃。
所述加热优选地进行一段时间。所述时间段优选地是约2分钟至约120分钟的时间段，如约2分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约105分钟、约120分钟、或其间的任何范围。高于和低于指定值的时间段也是可接受的。所述加热可以包括在所述时间段内维持基本上恒定的温度。
在一些型式中，从所述细胞释放所述RNA而不对所述细胞进行酶消化或物理搅拌。酶消化的实例包括使用Yatalase(丝状真菌细胞壁的消化酶)(加利福尼亚州山景城的Clontech公司(Clontech，Mountain View，CA))、Zymolase(酵母裂解酶)(加利福尼亚州欧文的Zymo Research公司(Zymo Research，Irvine，CA))以及CellLytic Y(酵母细胞裂解酶)(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))中的一种或多种进行消化。物理搅拌的实例包括使用二氧化硅珠粒搅拌(珠粒搅打)、超声处理、以及剪切。
从所述细胞中释放RNA、逆转录、以及扩增可以在相同的溶液中进行。这些步骤可以在将所述细胞添加到所述溶液中之后进行，而不添加、转移、去除、纯化、或提取组分。
所述溶液可以包括缓冲剂。适用于在约中性的pH值下对水溶液进行缓冲的任何缓冲剂是可接受的。合适的缓冲剂是本领域公知的。所述溶液优选地在约6至约9的pH值下被缓冲。
所述溶液可以包括洗涤剂。优选地包括约0.01％w/v至约2％w/v的量的洗涤剂，如约0.01％w/v、约0.025％w/v、约0.05％w/v、约0.075％w/v、约0.1％w/v、约0.25％w/v、约0.5％w/v、约0.75％w/v、约1％w/v、约1.25％w/v、约1.5％w/v、约1.75％w/v、约2％w/v、或其间的任何范围。高于和低于这些值的量也是可接受的。所述洗涤剂可以是非离子的、离子的、或两性离子的。示例性洗涤剂包括Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween 20、Tween 80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、以及3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)。
所述溶液还可以包括还原剂。优选地包括约0.1μM至约300μM的量的还原剂，如约0.1μM、约0.3μM、约1μM、约3μM、约10μM、约30μM、约100μM、约300、或其间的任何范围。高于和低于这些值的量也是可接受的。示例性还原剂包括三(2-羧乙基)膦(TCEP)和二硫苏糖醇(DTT)。
所述溶液还可以包括镁盐。优选地包括约10mM至约100mM的量的镁盐，如约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、或其间的任何范围。高于和低于这些值的量是可接受的。示例性镁盐包括硫酸镁和氯化镁。
所述溶液还可以包括铵盐或钾盐。已知这些盐通过促进核酸链分离来增强DNA扩增反应。可以包括约10mM至约100mM的量的铵盐或钾盐，如约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、或其间的任何范围。高于和低于这些值的量是可接受的。示例性铵盐或钾盐包括硫酸铵和氯化钾。
所述溶液还可以包括如上文所述的用于进行逆转录和DNA依赖性DNA聚合的酶。所述酶优选地以足以产生RNA模板的DNA拷贝并且将所述DNA拷贝扩增到可检测量的量存在。
所述溶液还可以包括脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，如脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧肌苷三磷酸(dITP)、以及脱氧黄嘌呤核苷三磷酸(dXTP)。所述脱氧核苷酸三磷酸优选地以足以产生RNA模板的DNA拷贝并且将所述DNA拷贝扩增到可检测量的组合和量存在。
所述溶液还可以包括用于逆转录和DNA依赖性DNA聚合酶反应的引物。用于逆转录和扩增(包括等温扩增)的引物的设计是本领域公知的。所述引物优选地以足以产生RNA模板的DNA拷贝并且将所述DNA拷贝扩增到可检测量的组合和量存在。
所述溶液还可以包含DNA检测试剂。示例性DNA检测试剂包括双链DNA检测试剂和序列特异性探针(杂交探针)。双链DNA检测试剂是本领域公知的。示例性双链DNA结合试剂包括PICOGREEN(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies，Carlsbad，CA))、SYBR Green(生命技术公司)、溴化乙锭、以及FIONAGREEN(俄勒冈州尤金的标记基因技术公司(Marker Gene Technologies，Inc.，Eugene，OR))等。示例性序列特异性探针包括荧光团标记的探针和放射性标记的探针。示例性序列特异性探针包括SCORPIONS探针(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))、分子信标探针、TAQMAN探针(瑞士巴塞尔的罗氏分子诊断产品公司(Roche MolecularDiagnostics，Basel，Switzerland))、分子信标探针、以及LNA(锁核酸)探针等。将序列特异性探针与本发明一起使用可能需要DNA解链步骤和退火步骤。或者，可以使用被设计成提供特异性扩增产物的存在的可见指示的侧流检测装置来检测扩增产物。
在一些型式中，所述溶液不含具有逆转录酶活性，但不具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的DNA聚合酶、具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，但不具有逆转录酶活性的DNA聚合酶、和/或具有逆转录酶活性和DNA依赖性DNA聚合酶活性这两者，但是仅在不同的溶液条件下具有这两种活性的DNA聚合酶、以及切口酶(链限制的限制性核酸内切酶)中的一种或多种。在一些型式中，所述溶液不合锰，以使得至少逆转录和扩增在不存在锰的情况下进行。
本发明的溶液可以包括上述组分中的任何一种或多种。对于从细胞中释放RNA，优选的是，所述溶液包含洗涤剂、还原剂、镁盐、铵盐、以及钾盐中的一种或多种。在指定温度下在这些组分中的一种或多种存在下加热细胞从所述细胞中释放出足以产生可检测的扩增的DNA的量的RNA，如经由部分或完全细胞裂解。对于逆转录和扩增，优选的是，所述溶液至少包含酶、脱氧核苷酸三磷酸、以及引物。上述的其它组分也有助于促进逆转录步骤和扩增步骤。
所述溶液优选地包括包含水的溶剂。所述溶剂也可以包括有机溶剂，如二甲亚砜。
在一些型式中，所述溶液包括体液。所述体液可以来自动物或植物的身体。合适的体液的示例性类型包括细胞内液和细胞外液，如血管内液(血液、血浆、血清)、间质液、淋巴液(有时被包括在间质液中)、跨细胞液、以及植物渗出物。示例性的合适的体液包括羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血液、乳汁、脑脊髓液、耳垢、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、血浆、渗出物、粪便(如腹泻)、女性射精、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻涕和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、稀粘液、唾液、皮脂(皮肤油)、浆液、血清、精液、包皮垢、痰液、滑液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、以及呕吐物等。所述溶液可以包含0.1％v/v至约99％v/v的体液，如约0.1％v/v、约0.5％v/v、约1％v/v、约5％v/v、约10％v/v、约15％v/v、约20％v/v、约25％v/v、约30％v/v、约35％v/v、约40％v/v、约45％v/v、约50％v/v、约55％v/v、约60％v/v、约65％v/v、约70％v/v、约75％v/v、约80％v/v、约85％v/v、约90％v/v、约95％v/v、或其间的任何范围。
在本发明的一些型式中，溶液组分中的一些或全部最初是共同作为混合物以干燥形式提供的并且在使用之前用液体复原。可以用包含释放RNA的细胞的液体复原干燥的溶液组分。可以经由冻干或本领域已知的其它方法将试剂干燥。呈干燥形式的组分呈固体形式，如粉末，而非处于溶液中。
可以用包含水的液体复原干燥的液体组分。所述液体还可以包含有机溶剂，如二甲亚砜。所述液体还可以或者可以替代地包含上列量中的任一个的体液，如上列的体液中的任一种。
可以通过任何DNA扩增技术来扩增由逆转录产生的DNA。等温扩增是优选的。“等温扩增”和其语法上的变体指的是在基本上相同的温度下进行的DNA扩增。在扩增程序的过程中，温度可以变化，只要所述温度保持基本上相同即可。在本发明的优选的型式中，等温扩增在不存在热循环的情况下发生。热循环指的是在几次循环，如5次、6次、7次、或更多次循环的过程中在两个或更多个限定的温度之间循环限定的时间段，如PCR中所发生的那样。
多种等温扩增方法是本领域已知的。这些包括转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、链置换扩增(SDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)、环介导的DNA等温扩增(LAMP)、等温多重置换扩增(MDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、单引物等温扩增(SPIA)、以及交叉引物扩增(CPA)。这些等温扩增方法中的任一种都可能适用于本发明中。用于设计适用于这些等温扩增方法中的引物的软件和其它方法是本领域公知的。参见例如来自荣研化学株式会社的PrimerExplorer LAMP引物设计软件(Kimura等，2011)等。
优选的等温扩增方法是使用如下引物的那些，所述引物具有在3′末端结合时不结合模板DNA的5′末端、具有与下游合成的DNA互补的部分、具有与下游模板DNA相同的部分、和/或通过退火到下游合成的DNA形成环。这样的引物是诸如LAMP和CPA等方法的特征。参见例如Notomi等，2000；Xu和Hu等，2012；美国专利6,410,278；美国专利6,743,605；美国专利6,764,821；美国专利7,494,790；美国专利7,468,245；美国专利7,485,417；美国专利7,713,691；美国专利8,133,989；美国专利8,206,902；美国专利8,288,092；美国专利8,445,664；美国专利8,486,633；以及美国专利8,906,621。
扩增的DNA可以通过用双链DNA检测试剂检测双链DNA或用序列特异性探针特异性检测扩增的DNA序列来检测。检测扩增的DNA的任何方法适用于本发明中。
本发明的方法可以用于特异性检测与至少一种其它类型的细胞不同的一种类型的细胞。这可以通过靶向RNA的区分序列来进行。所述区分序列优选地在所关注的细胞类型的细胞当中是保守的(即相同或基本上相同)并且在不是所关注的细胞类型的至少一种细胞类型的细胞的RNA中不存在于相应位置处或根本不存在。所述靶向可以通过在扩增步骤中使用与所述区分序列互补的一种或多种引物和/或在检测步骤中使用与所述区分序列互补的探针来进行。所述不同类型的细胞可以来自不同领域、不同界、不同门、不同纲、不同目、不同科、不同属、不同种、不同亚种、不同变体等。
因此，在本发明的一些型式中，所述溶液包含与RNA序列互补的一种或多种引物，所述RNA序列在第一细胞类型的细胞当中是保守的并且不存在于一种第二细胞类型或一组第二细胞类型的细胞的核酸，如RNA中。该组第二细胞类型可以包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种、至少500种、至少1,000种、至少2,000种、至少5,000种、或至少10,000种细胞类型。
rRNA中有许多用于鉴定所关注的大量细胞的区分序列的选项。众多生物体的rRNA序列是已知的和充分表征的。所述序列被保存在公共数据库中，并且用于访问这些数据库和设计可以用作区分序列的序列的软件是公知的。参见例如Cole等，2014；Wang等，2007；Wang等，2013；Fish等，2013；Cole等，2011；Cole等，2009；Cole等，2007；Cole等，2005；Cole等，2003；Maidak等，2001；Maidak等，2000；Maidak等，1999；Maidak等，1997；Maidak等，1996；Maidak等，1994；Larsen等，1993；Olsen等，1992，这些文献描述了与密歇根州立大学(Michigan State University)的核糖体数据库项目(Ribosomal Database Project)相关的数据库和软件。
可以检测的细胞类型包括真核细胞和原核细胞这两者。可以检测的示例性真核细胞包括真菌细胞、哺乳动物细胞、原生动物细胞等。可以检测的示例性原核细胞包括细菌细胞和古菌细胞。所述方法可以用于检测与非真核细胞不同的真核细胞、与非原核细胞不同的原核细胞、与非真菌细胞不同的真菌细胞、与非哺乳动物细胞不同的哺乳动物细胞、与非细菌细胞不同的细菌细胞、与非古菌细胞不同的古菌细胞、与另一类型的真核细胞不同的一种类型的真核细胞、与另一类型的原核细胞不同的一种类型的原核细胞、与另一类型的真菌细胞不同的一种类型的真菌细胞、与另一类型的哺乳动物细胞不同的一种类型的哺乳动物细胞、与另一类型的细菌细胞不同的一种类型的细菌细胞、与另一类型的古菌细胞不同的一种类型的古菌细胞等。
本文所述的RNA释放步骤、逆转录步骤、扩增步骤、以及检测步骤优选地单独或共同在基本上恒定的温度下进行。在一些型式中，RNA释放步骤和逆转录步骤在基本上恒定的温度下进行。在一些型式中，逆转录步骤和扩增步骤在基本上恒定的温度下进行。在一些型式中，扩增步骤和检测步骤在基本上恒定的温度下进行。在一些型式中，RNA释放步骤、逆转录步骤、扩增步骤、以及检测步骤均在基本上恒定的温度下进行。在一些型式中，在RNA释放步骤期间、从RNA释放步骤到逆转录步骤、以及在逆转录步骤期间维持基本上恒定的温度。在一些型式中，在逆转录步骤期间、从逆转录步骤到扩增步骤、以及在扩增步骤期间维持基本上恒定的温度。在一些型式中，在扩增步骤期间、从扩增步骤到检测步骤、以及在检测步骤期间维持基本上恒定的温度。在一些型式中，在RNA释放步骤期间、从RNA释放步骤到逆转录步骤、在逆转录步骤期间、从逆转录步骤到扩增步骤、在扩增步骤期间、从扩增步骤到检测步骤、以及在检测步骤期间维持基本上恒定的温度。
RNA释放步骤、逆转录步骤、扩增步骤、以及检测步骤可以共同进行一段时间。所述时间段优选地是约2分钟至约120分钟的时间段，如约2分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约75分钟、约90分钟、约105分钟、约120分钟、或其间的任何范围。高于和低于指定值的时间段也是可接受的。在一些型式中，扩增的DNA可以在检测步骤中在以下时间段内被检测到：从加热步骤开始少于约120分钟、少于约105分钟、少于约90分钟、少于约75分钟、少于约60分钟、少于约45分钟、少于约30分钟、少于约25分钟。
本发明的方法容许在单个容器中在基本上恒定的温度下使用上述步骤检测细胞而在所述步骤期间或之间不添加另外的试剂。由于所述步骤在空间上没有分开或在时间上没有明显分开，因此所述方法的步骤中的至少一些可能同时发生。举例来说，一些RNA分子可能正在被逆转录的过程中，而其它RNA分子仍在从细胞中释放。逆转录的RNA的一些DNA拷贝可能正在被扩增的过程中，而一些RNA分子正在被逆转录和/或其它RNA分子仍在从细胞中释放。一些扩增的DNA拷贝可能开始被检测，而逆转录的RNA的一些DNA拷贝正在被扩增的过程中，一些RNA分子正在被逆转录，和/或其它RNA分子仍在从细胞中释放。因此，在一些型式中，RNA释放步骤和逆转录步骤在时间上至少部分重叠。在一些型式中，逆转录步骤和扩增步骤在时间上至少部分重叠。在一些型式中，扩增步骤和检测步骤在时间上至少部分重叠。
本文所述的方法能够检测以少于约10-1cfu(菌落形成单位)，如约少于约10-2cfu或少于约10-3cfu的量存在于溶液中的细胞。预测检测以低到10-3.5、10-4、10-5或更低的量存在于溶液中的细胞的灵敏度。
本文所述的方法能够检测以如下拷贝数存在于溶液中的RNA：少于约1,000个拷贝、少于约500个拷贝、少于约250个拷贝、少于约200个拷贝、少于约150个拷贝、少于约100个拷贝、少于约75个拷贝、或少于约50个拷贝。预测检测以低到40个拷贝、35个拷贝、30个拷贝、25个拷贝、20个拷贝、15个拷贝、10个拷贝、5个拷贝、或更低的量存在于溶液中的RNA的灵敏度。
本文所述的要素和方法步骤可以任何组合使用，无论是否被明确描述。
除非其中产生所提到的组合的上下文另外说明或明确暗示相反情况，否则如本文所用的方法步骤的所有组合均可以按照任何顺序进行。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数指代对象。
如本文所用的数值范围意图包括该范围内所含的每一个数字和数字的子集，无论是否被具体公开。此外，这些数值范围应当被视为对涉及该范围内的任何数字或数字的子集的权利要求提供支持。举例来说，1至10的公开内容应当被视为支持了2至8、3至7、5至6、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等范围。
本文引用的所有专利、专利公开、以及同行评审的出版物(即“参考文献”)明确地以引用的方式并入本文，该引用的程度就如同每一篇单独的参考文献均具体地和单独地被指示为以引用的方式并入本文一般。在本公开与所并入的参考文献之间存在矛盾的情况下，以本公开为准。
应当了解的是，本发明并不局限于本文所说明和描述的部分的具体构造和布置，而是涵盖其落入权利要求书的范围内的修改形式。
实施例1：检测细菌核糖体RNA
总结
在一个实施方案中，本发明包括一种通过使用RT LAMP将热松弛的rRNA逆转录成用作用于通过相同的酶进行DNA扩增的模板的DNA反向互补序列而以高灵敏度检测细菌物种的方法。该过程包括在单一温度下进行的单一操作和孵育以特异性检测所关注的细菌物种。在所提供的实施例中，测试靶标是16S rRNA的V1可变区和V2可变区。细菌rRNA包括通常被称为5S、16S、以及23S的几种形式。这些形式以基本上等摩尔量存在并且这些rRNA形式中的任一种的任何可变区将足以提供用于灵敏的特异性检测的靶标。细菌的所有已知的物种均产生rRNA。任何细菌物种均可以在适度改变引物序列和反应条件的情况下被检测而无需过多的实验。
在本实施例中，从大肠杆菌(Escherichia coli)、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderia glumae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及脑膜炎败血伊丽莎白金菌(Elizabethkingia meningoseptica)的液体细菌培养物中直接检测16S rRNA。引物被设计成靶向与其它菌株存在差异的区域。将区域1-300用于大肠杆菌、荚壳伯克霍尔德氏菌以及金黄色葡萄球菌。将区域300-600用于脑膜炎败血伊丽莎白金菌。这些区域覆盖了16S rRNA基因的可变区V1和V2。使用反应缓冲液在单个步骤中重悬、裂解、以及提取rRNA。在不进一步添加流体或进行其它操作的情况下立即将反应物转移到Bio-Rad cfx96实时PCR热循环仪中，所述热循环仪被设定成在70℃进行等温孵育并且用于进行LAMP扩增。尽管在该实施例中使用基于实验室的仪器，但是应当了解的是，潜在的扩增化学方法适用于通过本领域公认的许多手段中的任一种来检测扩增，这些手段还满足了对易用性和便携性的需要。这些手段包括便携形式的荧光检测、核酸侧流、比色检测、比浊检测等。
设计用于伯克霍尔德氏菌的LAMP引物
使用荚壳伯克霍尔德氏菌的16S rRNA基因的序列(SEQ ID NO：1)来设计用于LAMP的引物。使用计算机程序(威斯康辛州麦迪逊的DNAStar公司(DNAStar，Madison WI))比较荚壳伯克霍尔德氏菌和相关物种的16S rRNA基因以鉴定在目标物种当中保守的并且相对于在相同的样品中可能共同存在的物种不同的区域。在使用PrimerExplorer(荣研化学株式会社)设计引物期间靶向相对包容性和排他性的这些区域。所得引物(SEQ ID NO：2-6)是由IDT公司(爱荷华州的科拉尔维尔(Coralville，IA))合成的。
测试伯克霍尔德氏菌LAMP的灵敏度
将荚壳伯克霍尔德氏菌细胞在30℃在卢里亚肉汤(Luria Broth)中培养到后期对数期并且在10-0至10-9范围内在卢里亚肉汤中连续稀释以确定细胞密度并且在TT缓冲液(10mM 1.25mM TCEP(三(2-羧乙基)膦)、25mM Tris-HCl，pH 8.0)中连续稀释以进行LAMP检测。将10-4至10-9的连续稀释液平板接种到酵母胰蛋白胨琼脂上以确定细胞密度，所述细胞密度被测量为菌落形成单位(cfu)，如本领域通常实行的那样。在TT中制备整个稀释系列(10-0至10-9)以用于LAMP反应。对于扩增，使用包含以下各项的混合物：0.2μM引物B16F3(SEQ ID NO：2)、0.2μM引物B16B3(SEQ ID NO：3)、1.6μM引物B16FIP(SEQ ID NO：4)、1.6μM引物B16BIP(SEQ ID NO：5)、0.4μM引物B16_7(SEQ ID NO：6)、20mM K-MOPS(pH 7.9)、10mMNH4SO4、0.8mM dATP、0.8mM dCTP、0.8mM dGTP、0.8mM dTTP、10mM MgSO4、0.3％CHAPS、2mMFiona绿色染料、0.72U/μl PYROPHAGE 3173 exo-DNA聚合酶(威斯康辛州麦迪逊的Lucigen公司)。将1.5μl的每一个细胞稀释液添加到23.5μl的扩增混合物中并且将反应物立即转移到在72℃等温运行扩增的持续时间的Bio-Rad实时PCR热循环仪中。以30秒时间间隔使用仪器上的FAM/SYBR设置监测荧光。基于相对荧光越过被设定在最大值的10％的理论阈值所需要的时间来确定获得结果的时间(TTR)。结果示于图1中。在绘制TTR相对于来自原始对数期培养物的细胞计数的图表时，确定至少10-3cfu的检测灵敏度。
检测细菌核糖体RNA的特异性
使用针对非目标细菌菌株的LAMP反应来评估特异性。使用与上文所述相同的反应混合物和孵育条件来测试大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、荚壳伯克霍尔德氏菌以及脑膜炎败血伊丽莎白金菌的细胞培养物(每个反应约106个细胞)。如通过琼脂糖凝胶所检测的LAMP扩增的结果示于图2中。使用对靶标具有类似特异性的针对目标物种和非目标物种的其它引物组进行测试(未示)。所述引物对目标物种具有特异性。
实施例2：检测真核生物核糖体RNA
总结
在另一个实施方案中，本发明包括一种通过直接逆转录和扩增来靶向真核生物rRNA以检测真核生物物种的手段。在所示的实施例中，靶向28S rRNA的D1区和D2区以进行检测。所有真核生物均产生通常被称为5S、5.8S、18S以及28S的不同形式的rRNA，并且所有形式均以基本上等摩尔量存在并且含有不同独特性的区域。核酸扩增测试可以成功地靶向这些形式中的任一种，在灵敏度上具有类似的优势。可以通过靶向这些rRNA序列中的一个来检测任何真核病原体，包括真菌，例如假丝酵母属菌种(Candida spp.)；原生动物，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)；寄生虫，例如蛔虫(Ascaris lumbricoides)；或任何其它真核感染因子。可以开发这些测试而无需过多实验。除了在核基因组中编码的rRNA基因之外，真核生物还在亚细胞器，例如线粒体、叶绿体、顶复体的基因组中编码原核生物样rRNA基因，它们也将用作用于病原体特异性检测的潜在靶标。这种推理延及非病原性细菌和真核微生物或细胞。gDNA拷贝已经被用作靶标(Oriero等，2015；Haanshuus等，2013)，但是rRNA本身没有被用作靶标。
在本实施例中，使用RT LAMP通过靶向rRNA来检测一组双相型真菌。该组真菌的特征在于两种生命形式，即多细胞霉菌状态和单细胞酵母状态，在这两种生命形式之间的转变由温度决定。霉菌状态在环境中占优势并且酵母状态在感染包括人类在内的放热宿主之后占优势。出于历史原因，单一物种的霉菌状态和酵母状态分别被称作皮炎阿耶罗菌(Ajellomyces dermatitidis)和皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)。第二不同物种的对应霉菌状态和酵母状态被称为荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatum)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。在这两种情况下，在实施例中使用后一术语，尽管这两种形式均可以被等同地检测。第三种双相型真菌物种在霉菌形式和酵母形式这两者下均被称作粗球孢子菌(Coccidioides immitis)。使用rRNA测试直接检测这三种物种的rRNA序列。
在所述实施例中使用RT LAMP。应当了解的是，可以使用其它等温和热循环扩增方法，包括SDA、HDA、NEAR、PCR等以直接检测rRNA并且在灵敏度、特异性以及易用性方面赋予类似的优势。尽管在所述实施例中使用RT LAMP，但是对所述方法的修改允许使用其它扩增方法实施本发明。
设计用于皮炎芽生菌的LAMP引物
使用皮炎芽生菌中的rRNA复合物的靶序列(SEQ ID NO：7)来设计用于LAMP的引物。使用计算机程序(威斯康辛州麦迪逊的DNAStar公司)比较皮炎芽生菌菌株和相关物种的rRNA复合物以鉴定在目标物种当中保守的并且相对于在相同的样品中可能共同存在的物种不同的区域。在使用PrimerExplorer(荣研化学株式会社)设计引物期间靶向相对包容性和排他性的这些区域。所得引物(SEQ ID NO：8-13)是由IDT公司(爱荷华州的科拉尔维尔)合成的。
通过LAMP直接检测真菌核糖体RNA
针对SEQ ID NO：7的靶序列开发靶向真菌病原体皮炎芽生菌的28S rRNA的LAMP反应。引物位点的位置示意性地示于图3中。对于扩增，使用包含以下各项的混合物：0.2μM引物BL29F3(SEQ ID NO：8)、0.2μM引物BL29B3(SEQ ID NO：9)、1.6μM引物BL29FIP(SEQ IDNO：10)、1.6μM引物BL29BIP(SEQ ID NO：11)、0.4μM引物BL29LF1(SEQ ID NO：12)、0.4μM引物BL29LB1(SEQ ID NO：13)、20mM K-MOPS(pH 7.9)、10mM NH4S04、0.8mM dATP、0.8mM dCTP、0.8mM dGTP、0.8mM dTTP、10mM MgSO4、0.3％CHAPS、2mM Fiona绿色染料、0.72U/μlPYROPHAGE 3173 exo-DNA聚合酶(威斯康辛州麦迪逊的Lucigen公司)。将2.0μl的每一个细胞稀释液添加到23.0μl的扩增混合物中并且将反应物立即转移到在68℃等温运行测试的持续时间的Bio-Rad cfx96实时PCR热循环仪中。以30秒时间间隔使用仪器上的FAM/SYBR设置监测荧光。基于相对荧光越过被设定在最大值的10％的理论阈值的时间来确定获得结果的时间(TTR)。
RT LAMP与RT PCR的一致性
测试通过本发明的RT LAMP方法相对于标准和逆转录PCR检测提取的RNA和DNA的相对效率以确定所述反应检测rRNA，而非编码它的gDNA基因。使用标准PCR(EconoTaq，Lucigen公司)和RT PCR(Path-ID多重单步RT-PCR试剂盒，生命技术公司)，根据对应的制造商的建议检测皮炎芽生菌的提取的RNA样品和DNA样品的稀释系列。结果示于图4的图A中。通过本发明的RT LAMP方法，使用上文所述的条件针对检测灵敏度测试RNA和DNA的相同稀释系列。这些结果示于图4的图B中。RT LAMP结果与RT PCR检测比标准PCR检测要一致得多，这提供强有力的证据表明所述反应直接检测rRNA。引物组BL29和BL55(图3)具有类似的灵敏度(未示)。使用BL29引物组进行所述的剩余工作。
在不存在和存在样品基质的情况下通过rRNA LAMP直接检测真菌细胞
将芽生菌细胞在培养物中培养到每毫升约106个细胞。添加2微升的培养物以达到25微升的最终体积并且使用实施例3中所述的材料和方法直接测试而不进行另外的处理。通过用唾液替代样品中的水并且测试相对于水重悬的灵敏度来测试唾液的干扰(图5)。唾液不抑制反应并且可能稍微缩短检测时间。
实施例3：扩增混合物的干制剂
总结
可以在室温下储存一段较长的时间的干的稳定的等温扩增混合物对于在护理点环境和现场检测生物体将是有用的。本实施例证实干扩增混合物的功效。
方法和结果
获得皮炎芽生菌DNA。产生覆盖rRNA复合物的1.2kb PCR扩增子。1.2kb产物尺寸与单拷贝扩增一致。配制扩增混合物并且冻干以使得使用悬浮在含有2mM Fiona绿色染料的水中的皮炎芽生菌扩增子样品复原到25μl将产生以下浓度：0.2μM引物BL29F3(SEQ ID NO：8)、0.2μM引物BL29B3(SEQ ID NO：9)、1.6μM引物BL29FIP(SEQ ID NO：10)、1.6μM引物BL29BIP(SEQ ID NO：11)、0.4μM引物BL29LF1(SEQ ID NO：12)、0.4μM引物BL29LB1(SEQ IDNO：13)、20mM K-MOPS(pH 7.9)、10mM NH4SO4、0.8mM dATP、0.8mM dCTP、0.8mM dGTP、0.8mMdTTP、10mM MgSO4、0.3％CHAPS、0.8％海藻糖、4.5U/μl PYROPHAGE 3173 exo-DNA聚合酶(威斯康辛州麦迪逊的Lucigen公司)。确定使用LAMP的检测限(LOD)。对单拷贝靶标的分析灵敏度在22分钟内是40个拷贝而没有显著的背景检测。在该实施例中使用的干燥的扩增混合物在室温下在超过六个月内具有稳定性。因此，本实施例证实含有聚合酶的干燥的扩增混合物可以用于本文所述的方法中。
实施例4：在进行和不进行酶裂解或细胞搅拌的情况下直接检测细胞rRNA
总结
用于护理点使用的最简单的可能的样品制备是在不进行预处理的情况下直接检测培养的细胞。本实施例解决了对在不进行预处理的情况下从细胞提取可扩增的核酸以用于护理点使用的快速的和容易的方法的需要。
方法和结果
获得皮炎芽生菌的培养物(ATCC 26199)，并且如实施例3中那样配制冻干的扩增混合物。使用Tris缓冲液(pH 7.5)复原细胞。将复原的细胞与冻干的扩增混合物混合，并且如实施例2中所概述的那样进行RT LAMP。在没有进行预处理的情况下直接检测的结果(图6的图A、图B、图C以及图D中所示的“未处理”)在灵敏度和获得结果的时间方面适用于预期用途。测试另外的裂解处理以确定这些处理是否改进测定。在即将检测之前使用如所示的以二氧化硅珠粒搅拌1分钟和2分钟(图6的图A)。还根据对应的制造商的建议在如所示的不同的温度下用以下通常用于裂解真菌细胞的三种酶进行预处理：Yatalase(加利福尼亚州山景城的Clontech公司)、Zymolase(加利福尼亚州欧文的Zymo Research公司)以及CellLytic Y(西格玛-奥德里奇公司)(图8的图B、图C、以及图D)。酶和珠粒搅打都没有将测定的性能提高到足以证实预处理所需的时间是合理的。假设含有洗涤剂和/或还原剂的扩增混合物，如本文所述的扩增混合物在热和渗透性冲击之后使细胞壁不稳定并且释放rRNA以进行扩增。
实施例5：直接检测HPV E6/E7 mRNA
总结
为了区分由整合的HPV的E6/E7基因表达的mRNA与它的同源gDNA序列，设计LAMP引物组以跨越在基因表达期间被切除的内含子的剪接位点。常见的HeLa细胞系含有整合的HPV18病毒并且组成型表达E6/E7mRNA。所述引物跨越内含子边界，即剪接位点，从而使得剪接的mRNA容易与相应的gDNA区分。
方法和结果
HPV18的gDNA序列和剪接的mRNA序列分别由SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15表示。从HeLa细胞中提取mRNA并且用作LAMP检测的靶标。使用0.2μM引物HPV70F3(SEQ ID NO：16)、0.2μM引物HPV70B3(SEQ ID NO：17)、1.6μM引物HPV70FIP(SEQ ID NO：18)、1.6μM引物HPV70BIP(SEQ ID NO：19)、0.4μM引物HPV70LF2(SEQ ID NO：20)、0.4μM引物HPV70LB2(SEQID NO：21)、20mM K-MOPS(pH7.9)、10mM NH4SO4、0.8mM dATP、0.8mM dCTP、0.8mM dGTP、0.8mM dTTP、10mM MgSO4、0.3％CHAPS、2mM Fiona绿色染料、0.72U/μl PYROPHAGE 3173exo-DNA聚合酶。将2.0μl的每一个样品稀释液添加到23.0μl的扩增混合物中并且将反应物立即转移到在68℃等温运行测试的持续时间的Bio-Rad cfx96实时PCR热循环仪中。以30秒时间间隔使用仪器上的FAM/SYBR设置监测荧光。基于相对荧光越过被设定在最大值的10％的理论阈值的时间来确定获得结果的时间(TTR)。
结果示于图7中。为了进一步确定RNA靶标的身份而不是gDNA，将提取的样品分成两个等分部分。将一个等分部分在37℃用10μg的RNA酶处理30分钟而另一个等分部分不用酶处理。比较经过RNA酶处理的样品和未处理的样品的检测时间，示于图7中。经过RNA酶处理的样品相较于未处理的样品之间显著的延迟支持了对RNA的检测，而不是DNA是检测靶标的替代解释。我们预测mRNA和其它类型的RNA能够如上文在实施例1和实施例4中对于rRNA所述的那样从全细胞样品中被检测到。我们还预测mRNA和其它类型的RNA能够如上文在实施例3中对于rRNA所述的那样由干燥的试剂用纯化的mRNA或全细胞样品被检测到。
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<400> 1
acacatgcaa gtcgaacggc agcacgggtg cttgcacctg gtggcgagtg gcgaacgggt 60
gagtaataca tcggaacatg tcctgtagtg ggggatagcc cggcgaaagc cggattaata 120
ccgcatacga tctacggatg aaagcggggg atctttggac ctcgcgctat agggttggcc 180
gatggctgat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc agtagctggt 240
ctgagaggac gaccagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
cagtggggaa ttttggacaa tgggcgaaag cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga 360
aggccttcgg gttgtaaagc acttttgtcc ggaaagaaat cctgagggct aatatccttc 420
ggggatgacg gtaccggaag aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat 480
acgtagggtg cgagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgcag gcggtttgtt 540
aagaccgatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc attggtgact ggcaagctag 600
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tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga 900
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gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttgctacgc 1080
aagagcactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt 1140
cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggaac agagggtcgc 1200
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<220>
<223> 引物
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<220>
<223> 引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<400> 5
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<211> 23
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
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<210> 7
<211> 1199
<212> DNA
<213> 皮炎阿耶罗菌
<400> 7
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acctggccac ccttgtctat ttttacctgt tgcttcggcg ggcctgcagc gatgctgccg 120
ggggagtttt cactccccgg gcttgtgccc gccgaggaca ccgctagaac ttctggtgaa 180
cgattgacat ctgagaaaat aactataatc agttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 240
ttccgacatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattccg 300
tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccctctggt attccggggg gcatgcctgt 360
ccgagcgtca ttgcaaccct caagcgcggc ttgtgtgttg ggccttcgtc cccccgtgga 420
cgtgcccgaa atgcagcggc ggcgtcgtgt tccggtgccc gagcgtatgg ggctttgtca 480
cccgctctag aggcccggcc ggctccggcc ccatctcaaa cccttcgagg gagggcggtc 540
ttcgggccgg tctccccacc aggttgacct cggatcaggt aggaataccc gctgaactta 600
agcatatcaa taagcggagg aaaagaaacc aacagggatt gcctcagtaa cggcgagtga 660
agcggcaaaa gctcaaattt gaaatctggc tcctttgggg cccgagttgt aatttgcaga 720
ggatgcttcg ggcgtggccg cggtctaagt cccctggaac ggggcgtcgc agagggtgag 780
aatcccgtct tcggccggcc ggcttcgccc atgtgaagct ccttcgacga gtcgagttgt 840
ttgggaatgc agctctaaat gggtggtaaa tttcatctaa agctaaatat tggtcggaga 900
ccgatagcgc acaagtagag tgatcgaaag atgaaaagca ctttgaaaag agagttaaac 960
agcatgtgaa attgttgaaa gggaagcgct tgcgaccaga gtcggccgtg ggggttcagc 1020
gggcattcgt tgcccgtgca ctcccccacg ggcgggccag cgtcggtttc gacggccggt 1080
caaaggcccc cggaatgtgt cgcctctcgg ggcgtcttat agccgggggt gcaatgcggc 1140
cagtcgggac cgaggaacgc gcttcggcac ggacgctggc ttaatggtcg taagcgacc 1199
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tccccaccag gttgacc 17
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
tccaggggac ttagaccg 18
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
gaggcaatcc ctgttggttt cttcggatca ggtaggaata cccg 44
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
cggcgagtga agcggcaaaa gccgaagcat cctctgcaaa t 41
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
cctccgctta ttgatatgct taagt 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
aaatttgaaa tctggctcct ttggg 25
<210> 14
<211> 558
<212> DNA
<213> 人类乳头瘤病毒18型
<400> 14
tatataaaaa agggagtaac cgaaaacggt cgggaccgaa aacggtgtat ataaaagatg 60
tgagaaacac accacaatac catggcgcgc tttgaggatc caacacggcg accctacaag 120
ctacctgatc tgtgcacgga actgaacact tcactgcaag acatagaaat aacctgtgta 180
tattgcaaga cagtattgga acttacagag gtatttgaat ttgcatttaa agatttattt 240
gtggtgtata gagacagtat accgcatgct gcatgccata aatgtataga tttttattct 300
agaattagag aattaagaca ttattcagac tctgtgtatg gagacacatt ggaaaaacta 360
actaacactg ggttatacaa tttattaata aggtgcctgc ggtgccagaa accgttgaat 420
ccagcagaaa aacttagaca ccttaatgaa aaacgacgat tccacaacat agctgggcac 480
tatagaggcc agtgccattc gtgctgcaac cgagcacgac aggaaagact ccaacgacgc 540
agagaaacac aagtataa 558
<210> 15
<211> 376
<212> RNA
<213> 人类乳头瘤病毒18型
<400> 15
uauauaaaaa agggaguaac cgaaaacggu cgggaccgaa aacgguguau auaaaagaug 60
ugagaaacac accacaauac cauggcgcgc uuugaggauc caacacggcg acccuacaag 120
cuaccugauc ugugcacgga acugaacacu ucacugcaag acauagaaau aaccugugua 180
uauugcaaga caguauugga acuuacagag gugccugcgg ugccagaaac cguugaaucc 240
agcagaaaaa cuuagacacc uuaaugaaaa acgacgauuc cacaacauag cugggcacua 300
uagaggccag ugccauucgu gcugcaaccg agcacgacag gaaagacucc aacgacgcag 360
agaaacacaa guauaa 376
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
tgagaaacac accaca 16
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
cccagctatg ttgtgg 16
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
tgttcagttc cgtgcacaga tcgcgctttg aggatccaa 39
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tggaacttac agaggtgcct gcgtgtctaa gtttttctgc t 41
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gtagcttgta gggtcgccg 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
gtgccagaaa ccgttgaatc c 21
Claims (21)
1.一种检测RNA的方法，所述方法包括：
在溶液中加热包含RNA的细胞以从所述细胞中释放所述RNA；
使用酶在逆转录温度下将所述RNA逆转录成DNA；
使用所述酶在扩增温度下扩增所述DNA；以及
检测所述扩增的DNA，其中：
所述酶在所述逆转录温度下具有热稳定性，在所述扩增温度下具有热稳定性，具有逆转录酶活性，具有DNA依赖性DNA聚合酶活性，并且具有链置换活性；并且
所述逆转录温度和所述扩增温度是基本上相同的。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述逆转录温度和所述扩增温度各自在彼此相差15℃以内。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述逆转录温度和所述扩增温度各自在65℃至90℃的范围内。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，所述方法包括在所述逆转录期间、从所述逆转录到所述扩增、以及在所述扩增期间维持基本上恒定的温度。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述基本上恒定的温度在跨越15℃的范围内。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述加热包括将所述细胞加热到与所述逆转录温度和所述扩增温度基本上相同的温度。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，所述方法包括在所述加热期间、从所述加热到所述逆转录、在所述逆转录期间、从所述逆转录到所述扩增、以及在所述扩增期间维持基本上恒定的温度。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述基本上恒定的温度在跨越15℃的范围内。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中进行所述加热、所述逆转录、以及所述扩增而在这些步骤期间或之间不添加另外的试剂。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中进行所述加热、所述逆转录、所述扩增、以及所述检测而在这些步骤期间或之间不添加另外的试剂。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在单个容器中在基本上恒定的温度下进行所述加热、所述逆转录、所述扩增、以及所述检测而在这些步骤期间或之间不添加另外的试剂。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述基本上恒定的温度在跨越15℃的范围内。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述RNA是核糖体RNA(rRNA)。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述RNA是信使RNA(mRNA)。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述溶液包含与核糖体RNA序列互补的引物，所述核糖体RNA序列在第一细胞类型的细胞当中是保守的并且不存在于第二细胞类型的细胞的核糖体RNA中。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述扩增包括环介导的等温扩增。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述溶液包含体液。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，所述方法还包括将液体与干燥的溶液组分混合以产生所述溶液，其中所述干燥的溶液组分包括所述酶。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述液体包含体液。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，所述方法还包括将包含所述细胞的液体与干燥的溶液组分混合以产生所述溶液，其中所述干燥的溶液组分包括所述酶。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述加热不包括酶消化或物理搅拌所述细胞并且其中所述加热在不对所述细胞进行酶消化或物理搅拌的情况下从所述细胞中释放所述RNA。
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