CN113795593A - 快速逆转录定量聚合酶链式反应 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于快速检测样品中的RNA的方法。所述方法包括提供含有所述样品、扩增试剂和具有RNA依赖性聚合酶活性和DNA依赖性聚合酶活性两者的聚合酶的反应混合物；通过孵育不超过5分钟的逆转录时间将所述RNA逆转录成DNA；以及通过执行包括多个扩增循环的热循环方案来扩增所述DNA，其中每个扩增循环至少包括变性步骤和退火步骤。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年1月17日提交的序列号为62/793,657的美国临时专利申请的优先权，该美国临时专利申请据此通过引用整体并入本文。
技术领域
本文提供了用于快速扩增和检测样品中的RNA的方法。在特定实施方案中，所公开的方法可用于临床诊断，诸如用于检测受试者中的病毒感染。
背景技术
传染病常通过核酸测试诊断。然而，最广泛实践的核酸扩增方法聚合酶链式反应(PCR)或定量或实时PCR(qPCR或RT-PCR)既耗时又耗能。RNA的检测对于临床诊断，尤其是对于病毒感染也可为必不可少的，但是RNA不能通过PCR直接扩增。它需要第一逆转录步骤，在该第一逆转录步骤中称为逆转录酶的酶酶促地从RNA模板制造DNA拷贝(cDNA)。在RT-qPCR中，然后在PCR反应中扩增该cDNA。
RT-qPCR测定可以在一步或两步反应中执行。在一步法RT-qPCR中，cDNA合成和qPCR在单个反应容器中的通用反应缓冲液中执行。在两步法RT-qPCR中，cDNA在一个反应中合成，然后将等分的cDNA用于后续的qPCR实验。一步法反应允许最少的样品处理和闭管反应，从而减少移液错误和交叉污染的机会。然而，对于单管RT-qPCR测定，组合的RT和PCR试剂必须允许这些反应在一个管中一起进行。这会阻止对每个单独反应使用最优化的试剂和条件，从而可能使反应条件折衷并负面地影响效率和产量。
因此，需要允许高效率和高产量地用于快速检测样品中的靶RNA的改进方法。
发明内容
本文提供了用于检测样品中的靶RNA的方法。在一些实施方案中，本文提供了用于检测样品中靶RNA的方法，该方法包括：(a)提供含有样品、扩增试剂和具有RNA依赖性聚合酶活性和DNA依赖性聚合酶活性两者的聚合酶的反应混合物；(b)通过孵育不超过5分钟的逆转录时间将RNA逆转录成DNA；以及(c)通过执行包括多个扩增循环的热循环方案来扩增DNA，其中每个扩增循环至少包括变性步骤和退火步骤。
在一些实施方案中，扩增试剂包括三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液、辅因子和寡核苷酸引物，所述扩增试剂被配置用于扩增样品中的靶RNA。在一些实施方案中，寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物。在一些实施方案中，寡核苷酸引物以至少6μM(例如，6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM，或介于它们之间的范围)的浓度提供。
在一些实施方案中，寡核苷酸引物以12μM的浓度提供。在一些实施方案中，聚合酶以至少0.4U/μL(例如，0.4U/μL、0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL、1.0U/μL、1.1U/μL、1.2U/μL，或介于它们之间的范围)的浓度提供。在一些实施方案中，聚合酶以0.8U/μL的浓度提供。
在一些实施方案中，辅因子是镁盐或锰盐。在一些实施方案中，辅因子是锰盐。在一些实施方案中，锰盐是MnCl2。在一些实施方案中，辅因子以3mM至8mM(例如，3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM，或介于它们之间的范围)的浓度提供。在一些实施方案中，辅因子以4mM的浓度提供。
在一些实施方案中，逆转录时间不超过2分钟。在一些实施方案中，逆转录时间不超过30秒。在一些实施方案中，逆转录时间不超过12秒。在一些实施方案中，逆转录时间不超过5秒。在一些实施方案中，逆转录时间不超过1秒。
在一些实施方案中，逆转录步骤在64-72℃(例如，64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃，或介于它们之间的范围)的温度下进行。在一些实施方案中，逆转录步骤在68℃的温度下进行。在一些实施方案中，每个变性步骤在91-99℃(例如，91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃，或介于它们之间的范围)下执行1秒。在一些实施方案中，每个退火步骤在64-72℃(例如，64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃，或介于它们之间的范围)下执行4秒。在一些实施方案中，每个变性步骤在95℃下执行1秒并且每个退火步骤在68℃下执行4秒。在一些实施方案中，热循环方案包括至少30个(例如，30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个，或介于它们之间的范围)扩增循环。在一些实施方案中，热循环方案包括40个扩增循环。
附图说明
图1.利用不同的以秒为单位的RT时间的MS2 RT-qPCR的Cq的箱线图。重复的数量在图式上指示。
图2.用Mg2+或Mn2+辅因子扩增的MS2 RNA的扩增曲线。
图3.含有封闭HCV cDNA的质粒和利用Mg2+或Mn2+辅因子自质粒体外转录的RNA的扩增曲线。
定义
尽管在本文所述的实施方案的实践或测试中可使用与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了一些优选的方法、组合物、设备和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应了解的是本发明不限于本文描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可以根据常规实验和优化而变化。还应了解，在本说明书中使用的术语是出于仅描述特定版本或实施方案的目的，并且不意图限制本文所述的实施方案的范围。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意义相同的意义。然而，在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。因此，在本文所述的实施方案的上下文中，以下定义适用。
除非上下文另外明确地指示，否则如本文和随附权利要求中使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指代物。因此，例如，对“肽两亲分子”的引用是对本领域技术人员已知的一种或多种肽两亲分子及其等同物的引用，等等。
如本文所用，术语“包含/包括(comprise)”及其语言变型指示一种或多种所列举特征、要素、方法步骤等的存在，而不排除额外一种或多种特征、要素、方法步骤等的存在。相反，术语“由……组成”及其语言变型指示一种或多种所列举特征、要素、方法步骤等的存在，并且排除任何未列举的一种或多种特征、要素、方法步骤等，通常相关联的杂质除外。短语“基本上由……组成”表示所列举的特征、要素、方法步骤等以及任何附加特征、要素、方法步骤等不会实质性地影响组合物、系统或方法的基本性质。使用开放的“包含”语言描述了本文的许多实施方案。此类实施方案包含多个封闭的“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”，所述实施方案可以替代地使用此类语言来要求保护或描述。
如本文所用，术语“分析”及其语言等同形式是指为表征样品或其一个或多个组分而采取的任何步骤。示例性分析步骤包括例如样品组分(例如，靶核酸)的定量、样品组分测序等。
如本文所用，术语“制备”及其语言等同形式是指为改变样品或其一个或多个组分而采取的任何步骤，例如用于后续分析或检测步骤。示例性样品制备步骤包括例如样品的稀释或浓缩、样品组分的分离或纯化、加热或冷却样品、样品组分(例如，核酸)的扩增、标记样品组分等。
如本文所用，术语“样品”和“标本”可互换使用，并具有最广泛的意义。在某种意义上，样品意味着包括从任何来源获得的标本或培养物，以及生物和环境样品。生物样品可以从动物(包括人类)获得并且涵盖流体、固体、组织和气体。生物样品包括血液产品，诸如血浆、血清，粪便、尿液等。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、泥浆、污泥、生物膜、水和工业样品。然而，此类示例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。
如本文所用的术语“系统”是指出于特定目的而以任何合适的方式(例如，物理相关联的；流体、电子或数据连通；包装在一起；等)分组在一起的组合物、设备、制品、材料等的集合。
具体实施方式
本文提供了用于检测样品中的靶RNA的方法。本文所述的方法使得能够使用单一酶，而不是一种用于逆转录的酶的和一种用于聚合酶链式反应的酶，来进行快速转录和聚合酶链式反应。所述方法包括提供含有样品、扩增试剂和具有RNA依赖性聚合酶活性和DNA依赖性聚合酶活性两者的聚合酶的反应混合物；通过孵育达逆转录时间(例如，不超过5分钟)将RNA逆转录成DNA；以及通过执行包括多个扩增循环的热循环方案来扩增DNA，其中每个扩增循环至少包括变性步骤和退火步骤。
a.反应混合物
在反应混合物中可以使用任何合适的PCR试剂。合适的PCR试剂包括水、缓冲液、dNTP、引物、对照、催化剂、起始物、启动子、辅因子、盐、螯合剂、探针、荧光染料，以及它们的组合。例如，反应混合物可以含有扩增试剂。扩增试剂可包括dNTP、缓冲液、辅因子和寡核苷酸引物，所述扩增试剂被配置用于扩增样品中的靶RNA。
术语“引物”和“寡核苷酸引物”在本文中可互换使用。通常，引物是与较长模板互补的较短核酸。在复制期间，引物可以基于模板序列而延伸，以产生更长的核酸，该更长的核酸是模板的互补拷贝。延伸可通过连续添加单独核苷酸(例如，通过聚合酶的作用)而进行。引物可以是DNA、RNA、它们的类似物(例如，人工核酸)或它们的任何组合。引物可以具有任何合适的长度。例如，引物可以是至少10个核苷酸。例如，引物可以是至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸。示例性引物是化学合成的。
寡核苷酸引物可以作为用于扩增至少一个核酸靶标的至少一对引物供应。例如，一对引物可以是正向引物(即有义引物)和反向引物(即反义引物)，该一对引物共同限定了所得扩增子的相对末端(并因此限定了长度)。可以使用任何合适浓度的引物。在一些实施方案中，寡核苷酸引物以至少6μM的浓度提供。例如，寡核苷酸引物可以以至少6μM、至少7μM、至少8μM、至少9μM、至少10μM、至少11μM或至少12μM的浓度提供。在一些实施方案中，寡核苷酸引物以12μM的浓度提供。
聚合酶可以是具有RNA依赖性聚合酶活性和DNA依赖性聚合酶活性两者的任何合适的酶。具有DNA依赖性聚合酶活性和RNA依赖性聚合酶活性两者的聚合酶可以是市售聚合酶(例如，来自Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，Ind.；Life Technologies，Inc.，Rockville，Md.；New England Biolabs，Inc.，Beverley，Mass.；Perkin ElmerCorp.，Norwalk，Conn.；Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Piscataway，N.J.；Qiagen，Inc.，Valencia，Calif.；Stratagene，La Jolla，Calif.)。例如，聚合酶可以是HawkZ05Fast Polymerase。可以使用任何合适浓度的聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶可以至少0.4U/μL的浓度提供。例如，聚合酶可以至少0.4U/μL、至少0.5U/μL、至少0.6U/μL、至少0.7U/μL、或至少0.8U/μL的浓度提供。在一些实施方案中，聚合酶以0.8U/μL的浓度提供。
在一些实施方案中，聚合酶具有DNA依赖性聚合酶活性和RNA依赖性聚合酶活性两者。在一些实施方案中，聚合酶与热启动PCR相容。在一些实施方案中，聚合酶是适体/酶系统的允许进行热启动PCR的部分(例如，聚合酶在低于阈值温度时失活)。在一些实施方案中，提供了来自栖热菌属(Thermus species)Z05的聚合酶。
辅因子可以是所用聚合酶的任何合适的辅因子。例如，辅因子可以是镁盐。例如，镁盐可以是MgCl2或MgSO4。作为另一个示例，辅因子可以是锰盐。例如，锰盐可以是MnCl2或MnSO4。可以使用任何合适浓度的辅因子。在一些实施方案中，辅因子以3mM至8mM的浓度提供。例如，辅因子可以3mM、4mM、5mM、6mM、7mM或8mM的浓度提供。在一些实施方案中，辅因子以4mM的浓度提供。
根据本文提供的实施方案，PCR试剂还可以包括一种或多种探针，或连接至至少一种标记(诸如至少一种染料)的任何核酸。探针可以是核酸靶标和/或扩增子的序列特异性结合配偶体。探针可以被设计成使得能够基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)检测靶扩增，包括连接至一对染料的一个或多个核酸，该对染料当彼此接近时共同表现出荧光共振能量转移(FRET)。这对染料可以提供第一发射体和第二发射体，或发射体和猝灭剂，等等。当例如通过在引物延伸期间切割探针(例如，5'核酸酶测定，诸如使用使用TAQMAN探针)或当探针与扩增子(例如，分子信标探针)杂交时染料彼此分离时，来自这对染料的荧光发射会发生变化。探针的核酸部分可以具有任何合适的结构或来源，例如，该部分可以是锁核酸、通用探针文库的成员等。在其他情况下，探针与引物对中的一个引物可以组合在同一分子中。例如，引物-探针分子可以在其3'端包括引物序列并且在其5'端包括分子信标型探针。使用这种安排，用不同染料标记的相关引物-探针分子可以在使用相同的反向引物的多重测定中使用，以对差异单个核苷酸的靶序列进行定量(单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP))。
b.逆转录
逆转录是指从样品中存在的RNA模板生成互补DNA链(cDNA)的过程。本文所述的方法需要短孵育时间来从RNA模板生成cDNA产物。特别地，所公开的方法包括通过孵育达逆转录时间(例如，不超过5分钟)将RNA逆转录成DNA。例如，逆转录时间可以不超过5分钟，不超过4分钟，不超过3分钟，不超过2分钟，不超过90秒，不超过60秒，不超过30秒、不超过15秒、不超过12秒、不超过10秒、不超过8秒、不超过5秒、或不超过1秒。在一些实施方案中，逆转录时间为0秒。
逆转录步骤可以在任何合适的温度下进行，具体取决于所使用的聚合酶。在一些实施方案中，与通常用于逆转录方法的温度相比，逆转录步骤在升高的温度下执行。例如，HawkZ05 Fast Polymerase与适体一起出售，该适体可防止低于55℃时的酶促活性。因此，对于使用HawkZ05 Fast polymerase的方法，逆转录步骤是在高于55℃的温度下执行的。在一些实施方案中，逆转录步骤可以在60-70℃的温度下执行。例如，逆转录步骤可以在高于55℃、高于60℃或高于65℃的温度下进行。在一些实施方案中，逆转录步骤在68℃的温度下进行。其他聚合酶在逆转录步骤中可能需要交替温度。
在将RNA添加到RT-PCR反应之前，某些RNA靶标需要先对RNA进行变性。例如，在丙型肝炎病毒中看到的轮状病毒或RNA二级结构的变性需要显著高于常用逆转录酶的最佳温度范围的解链温度。这导致逆转录聚合酶变性。例如，诸如马洛尼鼠白血病病毒(Maloneymurine leukemia virus，MMLV)逆转录酶或禽成髓细胞瘤病毒(avian myeloblastomavirus，AMV)逆转录酶的常用逆转录酶的最佳温度范围为37-42℃。因此，诸如轮状病毒或丙型肝炎的靶标需要初步的RNA变性步骤，这一过程与一步法封闭盒式设计不兼容。相比之下，本文所述的方法使得逆转录步骤能够在升高的温度范围内，例如在60-70℃的范围内执行。这允许进行逆转录和后续RNA靶标检测，而无需先使RNA变性。
c.DNA扩增
PCR反应通常还涉及扩增过程，或随着时间的推移重复发生复制以形成模板分子的至少一个区段的多个拷贝的反应。通常，扩增依赖于加热和冷却的交替循环(即，热循环)来实现连续几轮复制。
本文公开的方法包括通过执行包括多个扩增循环的热循环方案来扩增DNA。可以使用如上所述的任何合适的试剂执行扩增。每个扩增循环至少包括变性步骤和退火步骤。例如，每个扩增循环可以在两个或更多个温度设定点，诸如较高的解链(变性)温度和较低的退火/延伸温度之间交替。在其他实施方案中，每个扩增循环可以在三个或更多个温度设定点，例如较高的解链温度、较低的退火温度和中间延伸温度之间交替。
可以针对扩增循环中的每个步骤使用任何合适的温度和持续时间。通常，每个变性步骤都在91-98℃的温度下执行。例如，每个变性步骤可以在91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃下执行。在一些实施方案中，每个变性步骤在95℃下执行。在一些实施方案中，每个变性步骤可以执行少于20秒。例如，每个变性步骤可以执行少于20秒、少于10秒、少于5秒、少于4秒、少于3秒、少于2秒或1秒。在一些实施方案中，每个变性步骤在95℃下执行1秒。
适当的退火温度取决于引物对，并且通常可以在45-70℃下执行。例如，每个退火步骤可以在45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃或68℃的温度下执行。每个退火步骤可以执行少于20秒。例如，每个退火步骤可以执行少于20秒、少于10秒或少于5秒。在一些实施方案中，每个退火步骤在68℃下执行4秒。
在一些实施方案中，热循环方案可以包括在执行多个扩增循环之前初始保持在高温(例如95℃)下。例如，热循环方案可包括初始保持在95℃下达2分钟或更短时间。在一些实施方案中，热循环方案可包括初始保持在95℃下达2分钟、90秒、1分钟、30秒或15秒。
随着扩增的进行，扩增可产生拷贝数的指数或线性增加。典型的扩增会使拷贝数和/或信号增加大于1，000倍。可以执行任何合适数量的扩增循环以产生所需信号。例如，热循环方案可包括至少30个扩增循环。在一些实施方案中，热循环方案包括40个扩增循环。
d.设备
可以使用任何合适的设备来执行所公开的方法。例如，用于执行所公开的RT-qPCR方法的合适设备可以包括样品容器、第一温度区、第二温度区和穿梭机构。穿梭机构在第一温度区与第二温度区之间以物理方式移动样品容器。样品容器可以是能够容纳液体样品的孔。或者，样品容器可以是能够吸附液体样品的多孔材料。每个温度区可包含温度调节器，该温度调节器保持温度区内的固定温度。在一些实施方案中，合适的设备还包括检测区，诸如包括荧光计的检测区。在一些实施方案中，温度区中的一个或两个温度区可以是检测区。示例性设备描述于国际申请第PCT/US2018/034443号中，该国际申请的全部内容通过引用并入本文。
e.试剂盒
可以将本文所述的PCR试剂并入用于快速检测样品中的靶RNA的试剂盒中。例如，可以将所公开的组分并入用于快速临床诊断(例如用于检测样品中的病毒RNA)的试剂盒中。合适的试剂盒可以包含用于检测样品中任何所需RNA的任何合适的引物和/或探针。例如，该试剂盒可包含用于检测需要高温(例如60-70℃)以使RNA变性的病毒RNA的适当组分。此类试剂盒将使得能够快速逆转录和扩增RNA靶标，诸如轮状病毒或丙型肝炎病毒，而无需先进行RNA变性步骤。在一些实施方案中，该试剂盒可以在单个封闭盒中包含合适的PCR试剂以用于检测样品中的靶RNA。
实施例
实施例1
快速RT-qPCR测定
方法
HawkZ05 Fast Polymerase作为快速RT-qPCR测定销售。制造商建议执行RT步骤2至5分钟(4)。对涉及较高水平引物和酶的反应条件如何影响RT-qPCR测定进行了测试。令人惊讶的是，当RT时间为5分钟、2分钟、30秒、12秒和5秒时，测得非常相似的Cq。将改编自Beck等人(5)的MS2 RT-qPCR引物和探针用于扩增从MS2细菌噬菌体中提取的RNA。使用LinRegPCR分析PCR数据(6，7)。使用原型仪器以使用15μl样品执行RT-qPCR。RT步骤在68℃下执行0秒至5分钟，在95℃下保持15秒，然后进行40个在95℃下保持1秒和在68℃下保持4秒的循环。
反应组合物
RT-qPCR反应组合物包含以下物质：
10％的甘油(ACROS)
0.2％的吐温20(Pierce)
150mM的海藻糖(Life Sciences Advanced Technologies)
6mg/ml的超纯BSA(Ambion)
65mM Tris pH 8.0(Thermo Scientific)
62.4mM Bicine/KOH pH 8.0(USB)
65mM的谷氨酸钾(Sigma)
0.4mM dNTP(Thermo Scientific)
4.0mM MnCl2(Sigma)
12μM的MS2正向和反向引物混合物(IDT；参见下面的序列)
500nM的MS2 FAM标记的水解探针(IDT；参见下面的序列)
0.8U/μL的HawkZ05 Fast Polymerase(Roche Custom Biotech)
约5000个拷贝的通过Dynal MyOne Silane病毒分离试剂盒(Thermo Scientific)从MS2细菌噬菌体(Zeptometrix 0810066)中分离的MS2 RNA
正向引物：5’-agg tcg gta cta aca tca agt-3’
反向引物：5’-gat atg ttg cac gtt gtc tgg a-3’
水解探针：5’-/56-FAM/cgt ctg tcg/zen/tat cca gct gca aac t/3IABkFQ-3’
结果
RT长度从5秒至5分钟(300秒)的RT-qPCR测定测量的Cq没有差异(图1)。即使在68℃下保持0秒，也可以观察到显著的RT活性。然而，平均12秒RT与0秒RT之间的差异为1.4Cq，这相当于cDNA产量低约2.5-3倍。
令人惊讶的是，0秒RT与快速PCR循环条件配对产生了产物。Z05选择的辅因子是用于PCR的Mg2+和用于RT-PCR的Mn2+。因此，为了测试污染性噬菌体DNA是否是用0秒RT观察到的Cq的原因，将MS2 RNA使用Mg2+辅因子进行扩增并将结果与Mn2+辅因子进行比较。Mn2+辅因子反应的PCR曲线在Mg2+辅因子反应之前约6个循环时从背景上升，图2)。这种扩增差异对应于在RT步骤期间产生的cDNA量的约2个数量级差异。无模板对照反应(No TemplateControl reaction，NTC)中没有扩增表明试剂没有被MS2 DNA污染。
使用已用DNA酶I作为转录方案的一部分(MEGAshortscript试剂盒，AppliedBiosystems)处理的体外转录的丙型肝炎RNA执行了类似的研究。DNA Mn2+是阳性对照，用以证明Mn2+辅因子在PCR测定中是可接受的。另外两条曲线显示用Mn2+作为辅因子扩增的RNA比用Mg2+作为辅因子的反应具有早得多可见的扩增，并且估计的Cq将分隔开8-10，这是使用Mn2+作为辅因子的RNA产量百分比的一小部分。
应当了解，前面的详细描述和所附的实施例仅仅是说明性的，不应当被认为是对本公开的范围的限制，本公开的范围仅由所附的权利要求及其等同形式来限定。
对所公开的实施方案的各种改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以进行此类改变和修改，包括但不限于与本公开的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和修改。本文所引用的所有专利和出版物通过引用整体并入本文。
参考文献
以下参考文献通过引用整体并入本文，所述参考文献中的一些参考文献在上文被引用。
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Claims (21)
1.一种检测样品中靶RNA的方法，所述方法包括：
a.提供含有所述样品、扩增试剂和具有RNA依赖性聚合酶活性和DNA依赖性聚合酶活性两者的聚合酶的反应混合物；
b.通过孵育不超过5分钟的逆转录时间将所述RNA逆转录成DNA；
c.通过执行包括多个扩增循环的热循环方案来扩增所述DNA，其中每个扩增循环至少包括变性步骤和退火步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增试剂包括三磷酸脱氧核苷酸、缓冲液、辅因子和寡核苷酸引物，所述扩增试剂被配置用于扩增所述样品中的所述靶RNA。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸引物以至少6μM的浓度提供。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸引物以12μM的浓度提供。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述聚合酶以至少0.4U/μL的浓度提供。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述聚合酶以0.8U/μL的浓度提供。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述辅因子是镁盐或锰盐。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述辅因子是锰盐。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述锰盐是MnCl2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述辅因子以3mM至8mM的浓度提供。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述辅因子以4mM的浓度提供。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述逆转录时间不超过2分钟。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述逆转录时间不超过30秒。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述逆转录时间不超过12秒。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述逆转录时间不超过5秒。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述逆转录时间不超过1秒。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述逆转录步骤在68℃的温度下进行。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中每个变性步骤在95℃下执行1秒，并且每个退火步骤在68℃下执行4秒。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述热循环方案包括至少30个扩增循环。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述热循环方案包括40个扩增循环。
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