ES2533732T3 - Método para lisis celular en un tampón de reacción de RT-PCR - Google Patents
Método para lisis celular en un tampón de reacción de RT-PCR Download PDFInfo
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Abstract
Método para amplificación de un ácido nucleico diana de ARN, que comprende las etapas de a) transferir una muestra de líquido con un primer volumen inferior a 2 μl que comprende una o más células eucariotas vivas en un recipiente, b) añadir a dicho recipiente un tampón de reacción de RT-PCR en una etapa que comprende una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa, y dNTP, con un segundo volumen, mientras que dicho segundo volumen es al menos 2x tan grande como dicho primer volumen, b') incubar dicha muestra a una temperatura entre 37 ºC y 65 ºC de 30 segundos a 5 min. c) calentar dicho recipiente durante al menos 20 segundos a al menos 90 ºC, d) amplificar dicha diana en dicho recipiente por medio de una reacción en cadena de la polimerasa con una ADN polimerasa termoestable capaz de realizar una RT-PCR en una etapa sin realización de una etapa de purificación intermedia, en el que la relación del número de dichas células vivas de la etapa a) frente al volumen de líquido en el que la reacción en cadena de la polimerasa de la etapa d) no es superior a 2 células/μl, dichas relación es de al menos 1 célula/25 μl.
Description
E11763703
25-03-2015
En una realización alternativa, dichos recipientes de reacción dentro de dicho kit comprenden una composición seca de al menos una pareja de cebadores de amplificación por PCR y opcionalmente cualquiera de al menos una sonda de hibridación marcada o un compuesto fluorescente que se une a ADN bicatenario.
5 Ejemplos
Ejemplo 1
qPCR para amplificación del gen GAPDH y del gen RPLI13A a partir de células clasificadas de hibridoma de ratón
10 Un número definido de células de Hibridoma de Ratón se depositó en pocillos separados de una placa de microtitulación de 96 pocillos usando un Clasificador Celular (Beckton Dickinson, FACS Aria I) de una manera tal que el haz líquido siempre estaba orientado en el centro del pocillo. Debido la tecnología subyacente del Clasificador Celular, sin embargo, no se pudo excluir más un porcentaje menor de las partículas clasificadas que no eran células
15 enteras intactas sino residuos celulares. Por lo tanto, en lo sucesivo, el número de material clasificado se denomina equivalente celular.
Las células clasificadas tal como se desvela se distribuyeron en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nº de Cat.: 04 729 692 001 de Roche Applied Science) diseñada para el instrumento de PCR en tiempo real LC480 (Roche 20 Applied Science Nº de Cat.: 05 015 278 001) de acuerdo con el siguiente esquema de pipeteo:
1 equivalente celular/pocillo de la columna1-4 2 equivalentes celulares/pocillo en la columna 5-6 4 equivalentes celulares/pocillo en la columna 7-8
25 8 equivalentes celulares/pocillo en la columna 9 16 equivalentes celulares/pocillo en la columna 10 32 equivalentes celulares/pocillo en la columna 11 64 equivalentes celulares/pocillo en la columna 12
30 A cada pocillo, se añadió una mezcla maestra que contenía
Cebador directo agcttgtcatcaacgggaag 0,4 µM (SEC ID Nº: 1) Cebador inverso tttgatgttagtggggtctcg 0,4 µM (SEC ID Nº: 2)
35 Sonda de UPL 0,2 µM (Nº de Cat.: 04 685 075 001 de Roche Applied Science, Nº 9) Mezcla Maestra para Sonda LC480 1x (Nº de Cat.: 04 902 343 001 de Roche Applied Science)
El cebador directo e inverso se diseñaron para amplificar el gen GAPDH de ratón, que se sabe que está presente en el genoma de ratón con números de copias elevados.
40 En una placa separada, se añadió la misma mezcla maestra, pero cebadores y sonda se diseñaron para amplificar el gen RPLI13A, que está presente solamente en 12 copias del genoma del ratón. Cebadores y sonda eran como sigue a continuación:
45 Cebador directo catgaggtcgggtggaagta 0,4 µM (SEC ID Nº: 3) Cebador inverso gcctgtttccgtaacctcaa 0,4 µM (SEC ID Nº: 4) Sonda de UPL 0,2 µM (de Roche Applied Science Nº de Cat.: 04 686 993 001, Nº 25)
La Mezcla Maestra para Sonda de LightCycler comprender la ADN polimerasa FastStart termoestable, que es una 50 enzima de inicio en caliente que está modificada químicamente. La activación se induce por medio de retirada de dicha modificación a través de incubación a temperatura elevada.
Se realizó qPCR en un instrumento LC480 para PCR en tiempo real de acuerdo con el siguiente protocolo de termociclado: 55
Incubación previa 1x 95 ºC 10’
Desnaturalización 45x 95 ºC 10"
Hibridación 45x 60 ºC 30"
Elongación 45x 72 ºC 1"
Tasas de aumento de enfriamiento 2,2 ºC/s
Tasas de aumento de calentamiento 4,4 ºC/s
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En una segunda placa, se realizó RT-PCR en 1 etapa en un instrumento de PCR en tiempo real LC480 de acuerdo con un protocolo de termociclado que incluye una etapa de incubación previa adicional a 61 ºC.
Incubación previa 1x 61 ºC 3’ Incubación previa 1x 95 ºC 30" Desnaturalización 45x 95 ºC 10" Hibridación 45x 60 ºC 30" Elongación 45x 72 ºC 1" Tasas de aumento de enfriamiento 2,2 ºC/s Tasas de aumento de calentamiento 4,4 ºC/s
5 La detección de las señales de amplificación y cálculo de los valores de cp (valores de cp bajos que indican un nivel elevado de amplificación) se realizó de acuerdo con las instrucciones de los manuales del Fabricante.
Con el fin de demostrar que los valores de cp medidos reflejan realmente la detección de la expresión del ARNm en lugar de la del ADN, el tamaño correcto de los amplicones se confirmó posteriormente mediante electroforesis en 10 gel. La siguiente tabla desvela los valores medios de cp obtenidos para los diferentes números de células analizados.
- Sin incubación previa a 61 ºC
- Con incubación previa a 61 ºC
- Diana/ Número de células
- Cp Medio Cp STD Cp Medio Cp STD
- Actb/1
- 32,06 0,60 30,55 0,35
- Actb/2
- 31,60 1,12 29,12 0,50
- Actb/4
- 31,15 0,71 28,71 0,47
- Actb/8
- 29,92 0,11 27,78 0,07
- Actb/16
- 29,13 0,30 27,05 0,39
- Actb/32
- 28,24 0,22 25,98 0,23
- Actb/64
- 26,47 0,13 24,11 0,01
- B2M/1
- 36,04 0,38 31,64 0,00
- B2M/2
- 36,13 0,43 30,99 0,06
- B2M/4
- 35,54 0,24 30,88 0,22
- B2M/8
- 34,64 0,48 30,69 0,25
- B2M/16
- 34,52 0,01 30,21 0,13
- B2M/32
- 34,19 0,13 30,15 0,08
- B2M/64
- 34,59 0,07 30,13 0,10
- 18s/1
- 27,90 0,55 24,43 1,36
- 18s/2
- 27,27 0,32 23,59 0,74
- 18s/4
- 26,81 0,44 22,43 0,57
- 18s/8
- 25,74 0,19 22,49 0,21
- 18s/16
- 25,21 0,49 21,62 0,16
- 18s/32
- 24,66 0,18 20,78 0,25
- 18s/64
- 23,44 0,06 19,38 0,03
Tal como se puede observar a partir de la tabla, la expresión de los genes sometidos a ensayos se puede detectar
15 en materia que se origina a partir de solamente una célula como un material de partida. Se puede observar que los valores de cp se correlacionan de forma inversa con el número de células/por pocillo. La etapa de transcripción inversa se produce durante las etapas iniciales de aumento, hibridación y elongación del protocolo de termociclado.
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Tal como se puede deducir adicionalmente a partir de la tabla, de forma sorprendente la detección de la expresión es incluso más sensible, en el caso de una etapa de incubación previa durante 3 minutos a 61 ºC antes de la lisis real a 95 ºC. Probablemente tal efecto positivo se debe al pequeño volumen de muestra inferior a 2 µl, que da como resultado un secado inmediato y destrucción de las pocas células clasificadas, de modo que el ARN celular queda
5 disponible para la reacción de transcripción inversa.
Ejemplo 6
Comparación entre PCR y RT-PCR en 1 etapa de ADN en la diana 18s
10 Las células se clasificaron y se colocaron en una placa de microtitulación tal como se esperan en ejemplo 1 de acuerdo con el siguiente esquema de pipeteo:
Para 3 lacas idénticas Nº 1-3, se añadieron sondas de Hidrólisis Maestra de ARN LC480 1x (Nº de
15 Cat. 04 991 885 001 de Roche Applied Science, que contenían T.th polimerasa y un aptámero de inicio en caliente) con el fin de amplificar un ARN con una reacción de RT PCR en una etapa. Se diseñaron cebadores de una manera tal que durante esta reacción, tanto el ARN como su fragmento de ADN genómico correspondiente se podían amplificar. Para una cuarta placa Nº 4, se usó una mezcla maestra para sondas de ADN lista en Tiempo Real (d Nº de Cat.: 05 502 381 001e Roche Applied Science) que comprendía una ADN Polimerasa dependientes de ADN
20 termoestable sin ninguna actividad de transcriptasa inversa.
Además las 4 preparaciones contenían los siguientes cebadores y son más adecuados para amplificación de ARN y ADN de 18s
25 Cebador directo GCCGCTAGAGGTGAAATTCTT 0,4 µM (SEC ID Nº: 11) Cebador inverso CGTCTTCGAACCTCCGACT 0,4 µM (SEC ID Nº: 12) Sonda de UPL 0,2 µM (Nº de Cat.: 93 de Roche Applied Science)
Para la Placa 1, se realizó RT-PCR en 1 etapa con una etapa de incubación previa a 61 ºC en un instrumento de 30 PCR en tiempo real LC480 de acuerdo con el siguiente protocolo de termociclado:
Incubación previa 1x 95 ºC 1’
Incubación previa: 1x 61 ºC 3’
Incubación previa 1x 95 ºC 30"
Desnaturalización 45x 95 ºC 10"
Hibridación 45x 60 ºC 30"
Elongación 45x 72 ºC 1"
Tasas de aumento de enfriamiento 2,2 ºC/s
Tasas de aumento de calentamiento 4,4 ºC/s
Para la placa 2 y 3, se realizó RT-PCR sin ninguna ovación previa a 61 ºC:
Incubación previa 1x 95 ºC 30" (placa 2) o 2’ (placa 3)
Desnaturalización 45x 95 ºC 10"
Hibridación 45x 60 ºC 30"
Elongación 45x 72 ºC 1"
Tasas de aumento de enfriamiento 2,2 ºC/s
Tasas de aumento de calentamiento 4,4 ºC/s
35 Para la placa 4 se usó en el mismo protocolo que para la placa 3 con el fin de realizar una PCR sin ninguna actividad de transcripción inversa.
La detección de las señales de amplificación y cálculo de los valores de cp (valores de cp bajos que indican un nivel 40 elevado de amplificación) se realizó de acuerdo con las instrucciones de los manuales del Fabricante.
Con el fin de demostrar que los valores de cp medidos reflejan realmente la detección de la expresión del ARNm en lugar de la del ADN, el tamaño correcto de los amplicones se confirmó posteriormente mediante electroforesis en
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