ES2866026T3

ES2866026T3 - Método para amplificar ácido nucleico

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Publication number: ES2866026T3
Application number: ES15846028T
Authority: ES
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: US20170275685A1; EP3202901A1; EP3202901B1; JP6583796B2; JPWO2016052619A1; WO2016052619A1; EP3202901A4; US10457982B2; US20200048693A1

Abstract

Un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende una etapa de incubar una mezcla que comprende ARN molde, un cebador, una enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN, una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H y un sustrato, completando de este modo un proceso desde la retrotranscripción hasta la amplificación en una sola etapa, en donde la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN tiene una actividad de escisión de una hebra de ADN en el híbrido de ARN-ADN y es una enzima degradante de ADN específica bicatenaria o una enzima degradante de ADN no específica, en donde (a) cuando la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN es una enzima degradante de ADN no específica, la mezcla comprende además una proteína de unión a ADN bicatenario, de modo que se suprime la actividad de degradación de la enzima degradante de ADN no específica sobre el ADN monocatenario, y (b) la etapa de incubar la mescla comprende sintetizar un ADN complementario (ADNc) del ARN molde mediante la actividad ADN polimerasa dependiente de ARN de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, después escindir aleatoriamente la hebra de ADNc en la hebra híbrida de ARN y ADNc mediante la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN, después desprender la hebra de ADNc en el lado 3' del ARN mediante la actividad de desplazamiento de hebra de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, mientras se usa el sitio de escisión como punto de partida, y después sintetizar un nuevo ADNc en una parte desprendida mediante la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para amplificar ácido nucleico

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para amplificar un ácido nucleico, en que se usa una enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN y una actividad de desplazamiento de hebra. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para amplificar un ácido nucleico, usando ARN como molde, y también usando una enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN y una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H. Además, la presente invención se refiere a un kit usado para realizar el método descrito anteriormente para amplificar un ácido nucleico.

Antecedentes de la técnica

Se ha informado hasta ahora de un gran número de métodos para amplificar un ácido nucleico. Ejemplos de dicho método para amplificar un ácido nucleico incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (publicación 1 no perteneciente a patente), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) (publicación 2 no perteneciente a patente), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) (publicación 3 no perteneciente a patente), amplificación por círculo rodante (RCA) (publicación 4 no perteneciente a patente), amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) (publicación 5 no perteneciente a patente), proceso de amplificación rápida (SmartAmp) (publicación 6 no perteneciente a patente), amplificación dependiente de helicasa (HDA) (publicación 7 no perteneciente a patente) y reacción en cadena de la ligasa (LCR) (publicación 8 no perteneciente a patente). Estos métodos son métodos de amplificación de uso de ADN como molde, y en todos los métodos distintos de PCR, HDA y LCR, se utiliza la actividad de desplazamiento de hebra de la ADN polimerasa. Un sistema de amplificación principal de utilización de una reacción de desplazamiento de hebra es SDA (publicación 2 no perteneciente a patente). En SDA, se genera un sitio de escisión (mella) en una hebra de ADN bicatenario usando una enzima de restricción o similar. Usando esta mella como punto de partida, la hebra de ADN en el lado 3' se desprende por la actividad de desplazamiento de hebra de la ADN polimerasa, y se sintetiza un nuevo ADN complementario. La SDA es una técnica de amplificación de ADN complementario generando continuamente esta reacción. Además, en MDA, que utiliza un cebador hexamérico aleatorio, puede tener lugar aleatoriamente una reacción de desplazamiento de hebra hibridando aleatoriamente los cebadores a múltiples sitios en el ADN molde y, por tanto, este es un método que tiene una tasa de amplificación extremadamente alta (publicación 3 no perteneciente a patente). Sin embargo, para amplificar una secuencia de ARN de acuerdo con estos métodos de amplificación usando ADN como molde, es necesario realizar una reacción de retrotranscripción de conversión de ARN en ADN. Además, en el caso de SDA, como tiene que insertarse una mella en el ADN molde usando enzimas de restricción, es necesario añadir una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, desoxiinosina y similares al molde. Además, en el caso de LAMP y SmartAmp, son necesarios cuatro o cinco cebadores específicos de secuencia para una sola diana. Por tanto, la síntesis de un cebador oligomérico especial, el diseño de un cebador específico de secuencia y similares se vuelven necesarios. Además, los métodos de amplificación que usan ADN como molde, tales como PCR como ejemplo representativo, son problemáticos en términos de resultados seudopositivos generados como resultado del arrastre de los productos de amplificación por PCR previos o productos de retrotranscripción en las muestras, y productos no específicos derivados de ADN contaminado con reactivos, ADN mezclado del entorno de trabajo, etc. (publicaciones 9 y 10 no pertenecientes a patente). En particular, en el caso de MDA, como los cebadores se hibridan aleatoriamente con el ADN, es probable que aumentaran dichos productos no específicos derivados de ADN contaminados. Como técnica de amplificación de uso de ARN como molde, se ha propuesto un método de utilización de un cebador en horquilla de ADN especial que tiene una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción. En este método, se genera un punto de escisión en un cebador en horquilla de ADN que se ha dejado que se una a ARN como molde y, después, se permite que tenga lugar una reacción de desplazamiento de hebra, para amplificar ADN de hebra complementaria. En este método, sin embargo, tiene que realizarse un pretratamiento para lugar el cebador en horquilla de ADN al extremo 3' del ARN molde y, por tanto, las moléculas que no pueden capturarse probablemente se generen dependiendo de las condiciones de ligamiento. Adicionalmente, como la amplificación se inicia desde el extremo 3' del ARN molde, se considera difícil que este método amplifique por igual el ADN de longitud completa.

El documento US 2005/084875 A1 divulga marcadores moleculares para determinar la susceptibilidad al desarrollo de enfermedad de Alzheimer en un paciente, así como métodos para determinar si un paciente es susceptible al desarrollo de enfermedad de Alzheimer. El documento EP 2666870 A1 se refiere a un método para el tratamiento diferencial de dos subpoblaciones de ácido nucleico dentro de una muestra, siendo una de estas subpoblaciones inferior en cantidad que las otras o inferior en cantidad que una subpoblación significativamente dominante de forma cuantitativa. El documento EP 1736775 A1 divulga un método de cribado de un agonista o antagonista para una proteína receptora acoplada a proteína G que comprende una secuencias de aminoácidos específica. Zaverucha-do-Valle, C. et al., Brain Research (2014) 1587, 54-68, divulga un estudio sobre una estrategia de tratamiento celular usando leucocitos monomorfonucleares de la médula ósea para aumentar la supervivencia celular del ganglio retiniano y la excrecencia axonal. Gliozzi, M. et al., Journal of Autoimmunity, Londres (2012) 40, 122-133 proporciona datos sobre los mecanismos detrás del síndrome de Sjogren. Holighaus, Y. et al., Peptides, Ámsterdam, 2011, 32, 8, 1647-1655, proporciona datos sobre la activación, mediada por polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria, de su receptor acoplado a proteína G PAC1, y las respuestas celulares resultantes a agentes agresores. El documento US 2011/020878 A1 divulga métodos de eliminación de la contaminación de ácidos nucleicos de las reacciones de retrotranscripción y PCR de inicio en caliente.

Publicaciones de la técnica anterior

Publicaciones no pertenecientes a patente

Publicación 1 no perteneciente a patente: Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Mullis K, et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986; 51 Pt 1: 263-73.

Publicación 2 no perteneciente a patente: Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Walker GT, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1 de enero de 1992; 89(1): 392-6.

Publicación 3 no perteneciente a patente: Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Dean FB, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 16 de abril de 2002; 99(8): 5261-6.

Publicación 4 no perteneciente a patente: Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rollingcircle amplification. Lizardi PM, et al., Nat Genet. julio de 1998; 19(3): 225-32.

Publicación 5 no perteneciente a patente: Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Notomi T, et al., Nucleic Acids Res. 15 de junio de 2000; 28(12): R63.

Publicación 6 no perteneciente a patente: Rapid SNP diagnostics using asymmetric isothermal amplification and a new mismatchsuppression technology. Mitani Y, et al., Nat Methods. marzo de 2007; 4(3): 257-62. Publicación electrónica 18 de febrero de 2007.

Publicación 7 no perteneciente a patente: Helicase-dependent isothermal DNA amplification. Myriam Vincent, et al., EMBO Rep. agosto de 2004; 5(8): 795-800.

Publicación 8 no perteneciente a patente: Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Barany F. Proc Natl Acad Sci USA. 1 de enero de 1991; 88(1): 189-93.

Publicación 9 no perteneciente a patente: An Efficient Multistrategy DNA Decontamination Procedure of PCR Reagents for Hypersensitive PCR Applications. Champlot S, et al., PLoS One. 28 sep 2010; 5(9).

Publicación 10 no perteneciente a patente: Novel Sensitive Real-Time PCR for Quantification of Bacterial 16S rRNA Genes in Plasma of HIV-Infected Patients as a Marker for Microbial Translocation. Kramski M, et al., J Clin Microbiol. octubre de 2011; 49(10).

Publicación 11 no perteneciente a patente: A Novel Method for SNP Detection Using a New Duplex-Specific Nuclease From Crab Hepatopancreas. Shagin DA, et al., Genome Res. diciembre de 2002; 12(12): 1935-42 Publicación 12 no perteneciente a patente: The Enzyme and the cDNA Sequence of a Thermolabile and Double-Strand Specific DNase from Northern Shrimps (Pandalus borealis). Nilsen IW, et al., PLoS One. 22 de abril de 2010; 5(4): e10295.

Publicación 13 no perteneciente a patente: Experimental Murine Endometriosis Induces DNA Methylation and Altered Gene Expression in Eutopic Endometriuml. Lee B, et al., Biol Reprod. enero de 2009; 80(1): 79-85.

Publicación 14 no perteneciente a patente: Versatile synthesis of oligodeoxyribonucleotide-oligospermine conjugates. Voirin E, Behr JP, et al., Nat Protoc. 2007; 2(6): 1360-7.

Publicación 15 no perteneciente a patente: Oligonucleotide-oligospermine conjugates (zip nucleic acids): a convenient means of finely tuning hybridization temperatures. Noir R, et al., J Am Chem Soc. 8 de octubre de 2008; 130(40): 13500-5.

Publicación 16 no perteneciente a patente: Zip Nucleic Acids: new high affinity oligonucleotides as potent primers for PCR and reverse transcription. Moreau V, et al., Nucleic Acids Res. octubre de 2009; 37(19) Publicación 17 no perteneciente a patente: DNA "melting" proteins. IV. Fluorescence measurements of binding parameters for bacteriophage T4 gene 32-protein to mono-, oligo-, and polynucleotides. Kelly RC, et al., J Biol Chem. 25 de noviembre de 1976; 251(22): 7240-50.

Publicación 18 no perteneciente a patente: Reverse Transcriptase (RT) Inhibition of PCR at Low Concentrations of Template and Its Implications for Quantitative RT-PCR. Chandler DP, et al., Appl Environ Microbiol. febrero de 1998; 64(2): 669-77.

Publicación 19 no perteneciente a patente: Increased Yield of PCR Products by Addition of T4 Gene 32 Protein to the SMART-PCR cDNA Synthesis System. Villalva C, et al., Biotechniques. julio de 2001; 31(1): 81-3, 86.

Publicación 20 no perteneciente a patente: An Optimized Protocol for First Strand cDNA Synthesis from Laser Capture Microdissected Tissue. Boylan S, et al., Lab Invest. agosto de 2001; 81(8): 1167-9.

Publicación 21 no perteneciente a patente: Extra-embryonic endoderm cells derived from ES cells induced by GATA factors acquire the character of x En cells. Shimosato D, et al., BMC Dev Biol. 3 de julio de 2007; 7: 80.

Publicación 22 no perteneciente a patente: Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300nm ultraviolet transilluminators. Tuma RS, et al., Anal Biochem. 15 de marzo de 1999; 268(2): 278 88.

Publicación 23 no perteneciente a patente: CRYSTALLINE DESOXYRIBONUCLEASE II. DIGESTION OF THYMUS NUCLEIC ACID (DESOXYRIBONUCLEIC ACID) THE KINETICS OF THE REACTION. Kunitz M, J Gen Physiol. marzo de 1950; 33(4): 363-77.

Publicación 24 no perteneciente a patente: The effect of divalent cations on the mode of action of DNase I. The initial reaction products produced from covalently closed circular DNA. Campbell VW, et al., J Biol Chem. 25 de abril de 1980; 255(8): 3726-35.

Publicación 25 no perteneciente a patente: Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA. Shamoo Y, et al., Nature. 27 de julio de 1995; 376(6538): 362-6.

Sumario de la invención

Objetivo a lograr mediante la invención

Para realizar un análisis de expresión génica, es necesario convertir ARN en ADN complementario (ADNc). Ha habido una técnica de amplificación de uso de ADN como molde, pero no ha habido técnicas de amplificación de uso directamente, como molde, de ARN sin tratar que no se haya sometido a un pretratamiento tal como adición de una secuencia especial. Un objetivo de la presente invención es proporcionar, no el método de amplificación existente de uso de ADN como molde, sino un método para amplificar un ácido nucleico, usando ARN como molde. Es decir, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para amplificar un ácido nucleico, usando ARN como molde, que pueda lograr no solamente la simplificación de las operaciones, sino también la eliminación del riesgo de amplificación no específica provocada por a Dn contaminado con reactivos y/o el entorno de trabajo, un aumento en la sensibilidad de detección de ARN vestigial y una reducción en el sesgo de amplificación.

Medio para lograr el objetivo

Como resultado de intensos estudios dirigidos a conseguir el objetivo mencionado anteriormente, los autores de la presente invención han descubierto un método de retrotranscripción con amplificación por desplazamiento aleatorio (a partir de ahora en el presente documento denominado también "método de RT-RamDÁ' o simplemente "método de RamDA"), en que se amplifica ADNc usando ARN como molde. Se ha revelado que, de acuerdo con el método de RT-RamDA, el rendimiento de ADNc puede aumentarse hasta 10 a 100 veces en comparación con un kit disponible en el mercado, y que haga posible capturar genes de baja expresión o aumentar el número de genes detectados en un análisis de expresión génica a partir de un cantidad vestigial de ARN. Además, el ADNc amplificado por el método de RamDA puede aplicar a diversos análisis génicos tales como un método de secuenciación de ARN y, por tanto, se espera que el método de RamDA se use como técnica básica de biología molecular en una amplia gama de campos. Además, difiriendo de la tecnología de amplificación existente de uso de ADN como molde, el uso de ARN como molde puede lograr no solamente la simplificación de las operaciones, sino también la eliminación del riesgo de amplificación no específica provocada por ADN contaminado con reactivos y/o el entorno de trabajo, y una reducción en el sesgo de amplificación. La presente invención se ha completado basándose en estos hallazgos.

La presente invención se define por el método de la reivindicación independiente 1, así como el kit de la reivindicación 14.

Efectos ventajosos de la invención

Como un ácido nucleico puede amplificarse usando ARN como molde de acuerdo con el método para amplificar un ácido nucleico de la presente invención, el presente método puede lograr no solamente la simplificación de las operaciones, sino también la eliminación del riesgo de amplificación no específica provocada por ADN contaminado con reactivos y/o el entorno de trabajo, y una reducción en el sesgo de amplificación. Además, de acuerdo con el método para amplificar un ácido nucleico de la presente invención, puede obtenerse el rendimiento que es 10 veces o más del rendimiento en comparación con el kit de síntesis de ADNc por retrotranscripción existente, y también es posible realizar amplificación a un aumento de 100 veces o más, dependiendo de las condiciones.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 es una vista esquemática de un método de RT-RamDA (RamDA).

[Figura 2] La figura 2 muestra que una enzima degradante de ADN específica bicatenaria (DNasabc) y una enzima degradante de ADN no específica (DNasa I) escinde no solamente ADN bicatenario, sino también ADN en un híbrido de ARN-ADN. De acuerdo con el análisis de FRET usando un oligonucléotido fluorescente, se examinaron DNasabc y DNasa I en términos de propiedades nucleasa en condiciones de tampón de retrotranscripción. La actividad nucleasa se midió a lo largo del tiempo en cuatro condiciones, concretamente, DNasabc, DNasa I, DNasabc-TL que tiene inestabilidad térmica y un control de tampón (tampón) que no contenía DNasa. Las figuras 2A y 2C muestran la actividad en ADN de ADN bicatenario, la figura 2B muestra la actividad en ADN de un híbrido de ARN-ADN y la figura 2D muestra la actividad en ARN del híbrido. Las figuras 2E y 2F muestran los resultados de la actividad en ADN monocatenario y en ARN monocatenario, respectivamente. La medición se llevó a cabo realizando detección 50 veces, a 37 °C cada 70 segundos. La barra de error indica una desviación típica (n = 3).

[Figura 3] La figura 3 muestra que la fragmentación y amplificación de ADNc tienen lugar mediante la actividad de DNasabc. En la figura 3A, usando 5 ng de ARN sintetizado artificialmente, ARN Thr (2.052 b), como molde, el patrón de ADNc de un método de retrotranscripción convencional (RamDA (-)) y el patrón de ADNc de RamDA (+) que implica la adición de DNasabc, un cebador hexamérico aleatorio con ANZ y una proteína del gen 32 de T4 para el método de retrotranscripción convencional se examinaron por electroforesis en gel de agarosa. La escala de ADNmc es una escala de ADNbc termodesnaturalizado. Las flechas indican, cada una, 2 kb. En la figura, el símbolo "-" indica RamDA (-), y el símbolo "+" indica RamDA (+). En la figura 3B, la cantidad de ADNc en 100 fg de ARN sintetizados artificialmente, ARN Dap (96.725 copias) y ARN Thr (89.991 copias), que se añadieron a 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón que era la cantidad de ARN total correspondiente a una sola célula, se detectó por qPCR. Para la qPCR, se usó un producto de retrotranscripción en una cantidad de 1/50. El eje horizontal indica la distancia desde el extremo 3'. Con respecto a los cebadores de qPCR para detección, los cebadores para Dap y Thr se diseñaron, cada uno, en 12 regiones desde 5' hasta 3'. dT: un cebador de oligo dT, N6: un cebador hexamérico aleatorio, y N6Z: un cebador hexamérico aleatorio con ANZ. La barra de error indica una desviación típica (n = 3).

[Figura 4] La figura 4 muestra que un método de RT-RamDA actúa con DNasabc termoinestable y retrotranscriptasa sin actividad RNasa H. En la figura 4A, la cantidad detectada de ADNc en el caso de usar, como molde, 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón se muestra como un calor de cuantitativo relativa usando qPCR. El valor indica un valor relativo a la cantidad de ADNc (número de copias) detectada en cada gen en condiciones de RamDA (-). La barra de error indica una desviación típica (n = 4). La figura 4B muestra los patrones de electroforesis en gel de agarosa de ADNc sintetizados usando, como moldes, 20 ng de marcadores de ARN Millennium (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 y 9 kb) y empleando diversos tipos de kits de retrotranscriptasa. Las letras de la a hasta la j corresponden a la a hasta la j en el gráfico mostrado en la figura 4C. Una banda que forma una hebra híbrida de ARN-ADN se tiñe de forma brillante con respecto al ADNc monocatenario (publicación 21 no perteneciente a patente). La reacción de elongación se llevó a cabo a 42 °C durante 2,5 minutos. En la figura 4C, la cantidad detectada de ADNc en el caso de usar, como molde, 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón se muestra como un calor de cuantitativo relativa usando qPCR. En la figura, el símbolo "-" indica RamDA (-), y el símbolo "+" indica RamDA (+). El valor de RamDA (-) para cada enzima se definió como 1. En RamDA (+) para cada uno de la a hasta la c, h e i, se observó amplificación a un aumento de 2 veces o más. La barra de error indica una desviación típica (n = 4).

[Figura 5] La figura 5 muestra que RamDA-B y RamDA-C presentan tasas de amplificación extremadamente altas en genes específicos. La figura 5A muestra la cantidad de ADNc detectada por qPCR usando, como molde, 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón (letra mayúscula) y el valor relativo obtenido con RamDA (-) se establece a 1 (letra minúscula). La barra de error indica una desviación típica (n = 4). La figura 5B muestra los efectos del termociclado. La figura muestra la cantidad de ADNc detectada por qPCR usando, como molde, 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón (letra mayúscula) y el valor relativo obtenido con RamDA (-) en condiciones isotérmicas se establece a 1 (letra minúscula). La barra de error indica una desviación típica (n = 3). En la figura, "RamDA (-) iso" y "RamDA (+) iso" indican condiciones isotérmicas (las mismas condiciones que las de RamDA-A), y "RamDA (-) ciclo" y "RamDA (+) ciclo" indican condiciones de termociclado.

[Figura 6] La figura 6 muestra una disminución en la actividad nucleasa de DNasa I de una manera dependiente de la concentración de Tris-HCl y KCI. De acuerdo con el análisis de FRET usando un oligonucléotido fluorescente, se midió la actividad nucleasa de DNasa I. Con respecto al oligonucleótido fluorescente, la cantidad fluorescente se midió usando un color de sonda marcadora fA m a 37 °C cada 1 minuto. La actividad nucleasa se calculó basándose en la tasa de aumento de fluorescencia en la fase inicial de reacción (5-10 minutos). La actividad se indicó como un valor relativo, cuando la actividad para el ADN bicatenario en un tampón de DNasa I (Tris-HCl 50 mM, KCI 75 mM y MgCI22 mM) se estableció a 1. El valor se calculó basándose en el valor medio de n = 3. El símbolo # indica la concentración de un tampón de DNasa I. El símbolo ## indica la concentración de Tris-HCl y KCI que es igual que la de un tampón de retrotranscripción común. ADNbc: ADN bicatenario; ADN en híbrido de ARN:ADN: ADN en una hebra híbrida de ARN y ADN; ADNmc: ADN monocatenario; y ARNmc: ARN monocatenario.

[Figura 7] La figura 7 muestra que un método de RT-RamDA de uso de DNasa I (RamDA-D) no se limita a una composición de tampón de reacción específico. El rendimiento de ADNc en un método de RT-RamDA de uso de DNasa I y también usando, como molde, 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón, se cuantificó por qPCR. El símbolo # indica la misma composición de tampón de reacción que la de un tampón de DNasa I. El símbolo ## indica la concentración de Tris-HCl y KCI que es igual que la de un tampón de reacción de retrotranscripción común. El símbolo ### indica la misma composición que la de un tampón de reacción de retrotranscripción común, tal como tampón FirstStrand. FS: tampón First-Strand. PS: tampón PrimeScript (para Real Time). Estableciendo RamDA (-) de uso de tampón PrimeScript (para Real Time) como control (*), el rendimiento de ADNc se indica como un valor relativo, cuando la cantidad de ADNc detectada en cada gen en el control se establece en 1. La barra de error indica una desviación típica (n = 4). La amplificación tiene lugar incluso en la misma composición (#) que la de un tampón de DNasa I que tiene alta actividad de DNasa I para ADN monocatenario. Más bien, la tasa de amplificación es mayor que en condiciones en que la actividad para ADN monocatenario es baja (##).

[Figura 8] La figura 8 muestra que una proteína del gen 32 de T4 suprime la fragmentación de ADNc por DNasa I. En la figura 8A, usando 5 ng de ARN Thr (2.052 b) como molde, los patrones de distribución de ADNc se compararon en condiciones de una muestra de retrotranscripción convencional no añadida, adición individual de una proteína del gen 32 de T4, adición individual de DNasa I o DNasabc, y adición simultánea de una proteína del gen 32 de T4 con DNasa I o DNasabc. La reacción de retrotranscripción se realizó en un volumen de reacción de 6 |jl que es dos veces la cantidad normal, usando solamente un cebador de oligo dT. El patrón de distribución de ADNc se examinó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2 %. La figura 8B muestra los resultados obtenidos analizando el ADNc de la figura 8A que estaba en una cantidad de 1/20 de la figura 8A, usando el kit BioAnalyzer RNA 6000 Pico (Agilent Biotechnology). Los valores numéricos en la figura muestran, cada uno, un valor relativo de la concentración de ADNc. T4GP32: proteína del gen 32 de T4.

[Figura 9] La figura 9 muestra que una proteína del gen 32 de T4 contribuye a la amplificación del ADNc y la estabilidad del mismo. La figura muestra la cantidad de ADNc en 100 fg de ARN sintetizados artificialmente, ARN Dap (96.725 copias) y ARN Thr (89.991 copias), que se añadieron a 10 pg de ARN de referencia humano universal (Universal Human Reference (UHRR)). La reacción de retrotranscripción se realizó usando solamente un cebador de oligo dT, y el rendimiento de ADNc se cuantificó usando qPCR. Se usaron DNasa I y DNasabc en cantidades de 0,2 U y 0,4 U, respectivamente, y la proteína del gen 32 de T4 se usó en una cantidad de 100 ng para una sola reacción. La qPCR se realizó usando el producto de retrotranscripción en una cantidad de 1/50. Con respecto a los cebadores de qPCR para detección, los cebadores para Dap y Thr se diseñaron, cada uno, en 12 regiones desde 5' hasta 3'. La figura 9A muestra la cantidad de ADNc (número de copias) detectada en cada región. El eje horizontal indica la distancia desde el extremo 3'. (-): control (una muestra de retrotranscripción convencional no añadida), y la barra de error indica una desviación típica (n = 3). La figura 9B muestra un valor relativo, cuando la cantidad detectada en cada región de la muestra de control no añadida (*) se establece en 1. La figura 9C muestra una fluctuación en los valores relativos (tasas de amplificación) de las cantidades de detección en el mismo ARN. T4GP32: proteína del gen 32 de T4.

[Figura 10] La figura 10 muestra el efecto de una proteína del gen 32 de T4 sobre la actividad nucleasa en un tampón de reacción de retrotranscripción, que se examinó por análisis FRET usando oligonucleótidos fluorescentes. Como dichos oligonucleótidos fluorescentes, dos colores, concretamente, sonda marcadora FAM o HEX, se usaron y se midió la intensidad de fluorescencia a 37 °C cada 1,5 minutos. La actividad nucleasa se calculó basándose en la tasa de aumento de fluorescencia en la fase inicial de reacción (1,5-9 minutos) (un valor medio de n = 3). Como tampón de retrotranscripción, se usó tampón PrimeScript. La figura 10A indica un valor relativo de actividad nucleasa, cuando la actividad de DNasa I sobre ADN bicatenario en un tampón de DNasa I se establece en 1. La figura 10B muestra la relación de actividad degradante de ADN monocatenario a la actividad degradante de ADN en un híbrido de ARN-ADN, o a la actividad degradante de ADN bicatenario, en condiciones de reacción individuales. ADNbc: ADN bicatenario; ADN en híbrido: ADN en el híbrido de ARN-ADN; ADNmc: ADN monocatenario; y ARNmc: ARN monocatenario.

[Figura 11] La figura 11 muestra un aumento en el rendimiento de ADNc de una manera dependiente del tiempo de reacción, en RamDA-D de uso de un lisado de 1 célula de células ES de ratón. Entre las condiciones de temperatura de reacción para RamDA-D, se aplicó 37 °C, el tiempo de reacción a 37 °C se prolongó hasta 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos, y entonces se examinó la influencia del tiempo de reacción sobre la tasa de amplificación. Usando el tiempo de reacción de 30 minutos en RamDA-D (-) como control (*), se muestra un valor relativo, cuando la cantidad de ADNc detectada en cada gen por qPCR se establece en 1. La barra de error indica una desviación típica (n = 4).

[Figura 12] La figura 12 muestra que, en RamDA-D, puede realizarse amplificación, incluso si no se limita el tipo de retrotranscriptasa y se usa ARN molde en una cantidad correspondiente a 100 células. Estableciendo la condición de RamDA (-) de PrimeScript como control (*), se muestra un valor relativo, cuando la cantidad de ADNc detectada en cada gen por qPCR se establece en 1. Como ARN molde, se usó ARN total derivado de células ES de ratón (10 pg, 200 pg o 1 ng). PS: enzima RT PrimeScript; SSII: enzima RT SuperScript II; SSIII: enzima RT SuperScript Ill; y SSIV: enzima RT SuperScript IV. La barra de error indica una desviación típica (n = 4).

Realizaciones para llevar a cabo la invención

A partir de ahora en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente.

El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se realiza incubando una mezcla que comprende ARN molde, un cebador, una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN, una retrotranscriptasa sin actividad RNasa y un sustrato, y este método también se denomina método de retrotranscripción con amplificación por desplazamiento aleatorio (RT-RamDA). El método para amplificar un ácido nucleico de la presente invención es un método de retrotranscripción con amplificación por desplazamiento aleatorio, en que se utiliza una reacción de desplazamiento de hebra y se usa ARN directamente como molde, y este método puede realizarse in vitro. El método de la presente invención es una técnica de amplificación de ADNc en una reacción de retrotranscripción, por la que la hebra de ADNc en el híbrido de ARN-ADNc se escinde utilizando la actividad nucleasa de una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN como endonucleasa, tal como una enzima degradante de ADN específica bicatenaria (DNasa con especificidad bicatenaria: DNasabc) o una enzima degradante de ADN no específica (DNasa I), de modo que se permite que tenga lugar una reacción de desplazamiento de hebra aleatoriamente.

En la presente descripción, el término "amplificación" se usa para indicar el aumento del número de copias (replicaciones) de la secuencia de un ácido nucleico. Además, ejemplos de la forma de amplificación incluyen amplificación lineal, amplificación instantánea, amplificación cuantitativa, amplificación semicuantitativa y amplificación competitiva, pero no se limitan particularmente a las mismas.

La mezcla usada en la presente invención es una mezcla que comprende ARN molde, un cebador, una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN, una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H y un sustrato. La presente mezcla es preferiblemente un tampón acuoso, y más preferiblemente un tampón acuoso que comprende sales.

A continuación se describirá un resumen de un aspecto del método de RT-RamDA de la presente invención (figura 1).

1. El ADN complementario (ADNc) del ARN molde se sintetiza por la actividad ADN polimerasa dependiente de ARN de una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H.

2. Se genera aleatoriamente un punto de escisión (mella) en la hebra de ADNc en el híbrido de ARN-ADNc por la actividad nucleasa de una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN, tal como una enzima degradante de ADN específica bicatenaria (DNasabc) o una enzima degradante de ADN no específica (DNasa I).

3. El sitio de mella se convierte en un punto de partida, y la hebra de ADNc en el lado 3' se desprende mediante la actividad de desplazamiento de hebra de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H. El ADNc se sintetiza recientemente en la parte desprendida por la retrotranscriptasa. El ADNc desprendido se protege de la actividad nucleasa por una proteína del gen 32 de T4 (T4GP32) como proteína de unión a ADN monocatenario. Cuando este fenómeno tiene lugar continuamente, el rendimiento de ADNc puede aumentarse hasta 10 veces o más.

Como la hebra híbrida de ARN-ADN la aborda la enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN en el método para amplificar un ácido nucleico de la presente invención, o como el molde es ARN en la reacción de amplificación por desplazamiento de hebra, la retrotranscriptasa disponible se limita a las que no tienen actividad RNasa H. La actividad RNasa H es actividad ribonucleasa de escisión aleatoria solamente de la hebra de ARN en un híbrido de ARN-ADN. La RNasa H es endonucleasa no específica, que cataliza la escisión de ARN por hidrólisis.

Además, la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H usada en la presente invención tiene una actividad de desplazamiento de hebra. La hebra de ADNc en el lado 3' se desprende del ARN por la actividad de desplazamiento de hebra de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, y se sintetiza una nueva hebra de ADNc en la parte desprendida.

La retrotranscripción es un proceso en que la retrotranscriptasa (ADN polimerasa dependiente de ARN) cataliza la formación de ADN complementario (ADNc) a partir del ARN molde. Como dicha retrotranscriptasa, se ha identificado un gran número de enzimas, y ejemplos de la retrotranscriptasa incluyen retrotranscriptasa del VIH, retrotranscriptasa del VMA, retrotranscriptasa del VLM-M, polimerasa de C. therm. y polimerasa Tth. En la presente invención, se usa retrotranscriptasa sin actividad RNasa H.

En la presente invención, se usa una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN. La expresión "enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN" se usa en la presente descripción para indicar una enzima que tiene una actividad de escisión de una hebra de ADN en una hebra híbrida de ARN y ADN (híbrido de ARN-ADN). Como dicha una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN, puede usarse una enzima degradante de ADN específica bicatenaria o una enzima degradante de ADN no específica. Como enzima degradante de ADN específica bicatenaria, se ha conocido una enzima degradante de ADN específica bicatenaria (nucleasa específica bicatenaria; NEB) derivada de cangrejo. Esta enzima escinde aleatoriamente no solamente ADN bicatenario, sino también solamente la hebra de ADN en un híbrido de ARN-ADN. En la presente invención, se ha propuesto un método de utilización de la actividad mencionada anteriormente para escindir el ADNc en un híbrido de ARN-ADNc formado durante retrotranscripción, para provocar amplificación por desplazamiento de hebra mientras se usa ARN como molde. Sin embargo, como la temperatura para la activación de la NEB derivada de cangrejo es una temperatura extremadamente alta que es de 60 °C o mayor, es inadecuada para una reacción de retrotranscripción general (publicación 11 no perteneciente a patente). Por tanto, usando DNasabc termolábil derivada de gamba que es activa incluso a una baja temperatura, podría conseguirse tanto una reacción de retrotranscripción como escisión con DNasa (publicación 12 no perteneciente a patente). Por otro lado, usando se usa una enzima degradante de ADN no específica tal como DNasa I, el ADN monocatenario, concretamente, el ADN amplificado que se desprende por una reacción de desplazamiento de hebra o un cebador de retrotranscripción probablemente se descomponga. Sin embargo, incluso si la enzima tiene una actividad de degradación de ADN monocatenario, existe en caso donde no provocaría problemas, dependiendo de las condiciones de reacción, tales como la composición del tampón usado. Que sean adecuadas o no las enzimas usadas o las condiciones de reacción puede confirmarse realizando una reacción de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la divulgación de la presente descripción. Además, mediante la adición de una proteína de unión a ADN monocatenario, se suprime la actividad de degradación de ADN monocatenario, y puede promoverse la síntesis y amplificación de ADNc mediante una reacción de desplazamiento de hebra usando retrotranscriptasa. Como dicha proteína de unión a ADN monocatenario, cualquier proteína dada, que se una a ADN monocatenario para aumentar la eficacia de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con el método de la presente invención, puede usarse y, por ejemplo, cualquier proteína del gen 32 de T4 derivada de un origen dado, RecA, SSB (proteína de unión a ADN monocatenario, siglas del inglés Single-Stranded DNA Binding Protein) o una variante de las mismas puede usarse. De este modo, puede aumentarse la tasa de amplificación, en lugar de mediante un método de uso de DNasabc. El uso de DNasabc o DNasa I es ventajoso porque las contaminaciones de ADN en la solución de reacción, por ejemplo, ADN genómico en una muestra de lisado celular, también pueden eliminarse. Además en el pasado, ha habido métodos presentados de eliminación de ADN contaminado usando DNasa I o DNasabc en RT-qPCR. Sin embargo, en una mayoría de dichos métodos, la inactivación de la nucleasa ha sido esencial y, por tanto, dichos métodos no podían realizarse solamente mediante una etapa que consistiera en una reacción de retrotranscripción, como el método de RT-RamDA (publicación 13 no perteneciente a patente).

Ha habido muchos informes con respecto a métodos de amplificación de ADN usando reacción de desplazamiento de hebra, como con el método de RT-RamDA (por ejemplo, publicaciones 2 a 6 no pertenecientes a patente). Sin embargo, una mayoría de estos métodos de amplificación, incluyendo SDA como un ejemplo típico, tienen que usar enzimas de restricción para insertar una mella en el ADN molde, o tienen que usar una pluralidad de cebadores específicos de secuencia en combinación. Por consiguiente, es esencial añadir una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción o desoxiinosina al ADN molde, o diseñar y/o sintetizar un cebador específico de secuencia. Además, los genes diana también están limitados. Además, como casi todos los métodos existentes usan ADN como molde, es necesario realizar una reacción de retrotranscripción de conversión de ARN en ADN para amplificar una secuencia de ARN. Adicionalmente, los resultados seudopositivos generados como resultado del arrastre de los productos de amplificación por PCR previos o productos de retrotranscripción en las muestras, y productos no específicos derivados de a Dn contaminado con reactivos, ADN mezclado del entorno de trabajo, etc., han sido problemáticos (publicaciones 9 y 10 no pertenecientes a patente). En particular, en MDA, como un cebador se hibrida aleatoriamente con el ADN, es muy probable que aumentaran los productos no específicos derivados de ADN contaminados. Por otro lado, el método de RT-RamDA de la presente invención usa una reacción de desplazamiento de hebra no dependiente de la secuencia y, por tanto, llega a ser necesario diseñar y/o sintetizar un cebador específico de secuencia o un cebador especial y, también, puede abordar genes completos. Además, usando directamente ARN como molde, puede completarse el proceso desde la retrotranscripción hasta la amplificación mediante solamente una etapa, y como el ADN apenas se convierte en molde, también puede reducirse la amplificación de productos no específicos derivados del ADN contaminado.

La enzima degradante de ADN específica bicatenaria usada en la presente invención puede ser preferiblemente una enzima, que tiene actividad de escisión de la hebra de ADN de un híbrido de ARN-a Dn , y sustancialmente no tiene una actividad de escisión de la hebra de ARN de un híbrido de ARN-ADN, ADN monocatenario y ARN monocatenario. La enzima degradante de ADN específica bicatenaria es preferiblemente una enzima que tiene una actividad degradante de ADN incluso a una temperatura menor de 60 °C.

Como dicha enzima degradante de ADN específica bicatenaria, pueden usarse enzimas derivadas de procariotas o eucariotas. Preferiblemente, puede usarse una enzima degradante de ADN específica bicatenaria derivada de crustáceos o una variante de la misma.

Como dicha enzima degradante de ADN específica bicatenaria (que también se denomina "nucleasa específica bicatenaria (NEB)"), se han conocido hasta ahora las siguientes enzimas (publicación de patente JP (Kokai) 2014 103867 A).

(1) DNasa de Solenocera melantho (gamba cabezona)

(2) DNasa de Penaeus japonicus (camarón tigre japonés)

(3) NEB de Paralithodes camtschaticus (cangrejo rojo gigante)

(4) DNasabc de Pandalus borealis (camarón nórdico)

(5) NEB de Chionoecetes opilio (cangrejo de las nieves)

(6) Otros homólogos de NEB

Entre las enzimas descritas anteriormente, la NEB del cangrejo rojo gigante y la NEB del cangrejo de las nieves tienen resistencia al calor a una temperatura activa óptima de aproximadamente 60 °C, mientras que la DNasabc del camarón nórdico es una enzima termolábil que tiene una temperatura óptima de 37 °C.

En la presente invención, una enzima degradante de ADN específica bicatenaria derivada de gambas o una variante de la misma es más preferible.

En la presente descripción, el término "variante" se usa para indicar una enzima obtenida modificando la secuencias de aminoácidos de una enzima degradante de a Dn específica bicatenaria derivada de producto natural. Específicamente, dicha variante significa una enzima que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de un 80 % o más (preferiblemente un 90 % o más, y más preferiblemente un 95 % o más) con la secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de ADN específica bicatenaria derivada de producto natural, y que tiene una actividad degradante de ADN específica bicatenaria y, también, una enzima que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una eliminación, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5, y más preferiblemente de 1 a 3 aminoácidos) con respecto a la secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de ADN específica bicatenaria derivada de producto natural, y que tiene una actividad degradante de ADN específica bicatenaria.

Como enzima degradante de ADN específica bicatenaria, puede usarse un producto disponible en el mercado. Ejemplos de dicho producto disponible en el mercado incluyen DNasabc (ArcticZymes), DNasabc-TL (ArcticZymes), DNasabc (Thermo scientific), DNasa de gamba, recombinante (Affymetrix), DNasabc Atlantis (Zymo Research) y nucleasa termolábil (Roche).

Un ejemplo de la enzima degradante de ADN no específica usada en la presente invención es una enzima, que tiene actividad de escisión de la hebra de ADN de un híbrido de ARN-ADN y sustancialmente no tiene actividad de escisión de la hebra de ARN de un híbrido de ARN-ADN y ARN monocatenario, en la que la actividad de escisión del ADN monocatenario es preferiblemente menor que la actividad de escisión de la hebra de ADN del híbrido de ARN-ADN. La enzima degradante de ADN no específica se preferiblemente una enzima que tiene una actividad degradante de ADN incluso a una temperatura menor de 60 °C.

Como dicha enzima degradante de ADN no específica, puede usarse una enzima derivada de procariotas o eucariotas. Preferiblemente, puede usarse una enzima degradante de ADN no específica derivada de mamífero o una variante de la misma.

En la presente invención, una enzima degradante de ADN no específica derivada de bovino o una variante de la misma es más preferible.

En la presente descripción, el término "variante" se usa para indicar una enzima obtenida modificando la secuencias de aminoácidos de una enzima degradante de ADN no específica derivada de producto natural. Específicamente, la variante significa una enzima que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de un 80 % o más (preferiblemente un 90 % o más, y más preferiblemente un 95 % o más) con la secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de ADN no específica derivada de producto natural, y que tiene una actividad degradante de ADN no específica y, también, una enzima que consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende una eliminación, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos (por ejemplo, de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5, y más preferiblemente de 1 a 3 aminoácidos) con respecto a la secuencia de aminoácidos de una enzima degradante de ADN no específica derivada de producto natural, y que tiene una actividad degradante de ADN no específica.

El cebador usado en la presente invención está compuesto por un desoxinucleótido y/o un ribonucleótido, y el presente cebador tiene una longitud de cadena que puede experimentar emparejamiento de bases con un ácido nucleico diana en condiciones dadas. La longitud de cadena de dicho cebador no está particularmente limitada, y es preferiblemente de 5 a 50 nucleótidos, y más preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos. Como dichos cebadores, uno o más tipos de cebadores aleatorios, cebadores de oligo dT o cebadores específicos de secuencia pueden usarse preferiblemente. En el caso de usar un cebador aleatorio, la longitud del cebador es preferiblemente de aproximadamente 5 a 10 nucleótidos, y más preferiblemente de aproximadamente 6 a 8 nucleótidos. En el caso de usar un cebador de oligo dT, la longitud del cebador es preferiblemente de 10 a 50 nucleótidos, y más preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos. En el caso de usar un cebador específico de secuencia, la longitud del cebador es preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos, y más preferiblemente de 7 a 20 nucleótidos.

El cebador puede sintetizarse mediante cualquier método dado que pueda usarse en la síntesis de un oligonucleótido, tal como un método de triéster de fosfito, el método de H-fosfonato o el método de tiofosfonato. El cebador de acuerdo con la presente invención puede sintetizarse, por ejemplo, mediante un método de fosforamidita, usando el sintetizador de ADN de tipo 394 fabricado por ABI (Applied Biosystem Inc.).

Preferiblemente, puede usarse un cebador cuyo valor de Tm se ha aumentado por modificación con una unidad catiónica. Por ejemplo, puede usarse un cebador de ácido nucleico en cremallera (Zip) (ANZ). El ANZ tiene una acción para aumentar el valor de Tm de un oligonucleótido, usando una unidad catiónica (publicaciones 14 a 16 no pertenecientes a patente). Usando un cebador, cuyo valor de Tm se ha aumentado por modificación con una unidad catiónica, tal como un cebador de ANZ, puede potenciarse la eficacia de amplificación. En particular, usando un cebador hexamérico aleatorio modificado con a Nz , el cebador puede hibridarse con el ARN molde incluso a una temperatura de reacción durante la retrotranscripción y, de este modo, puede realizarse amplificación por desplazamiento de hebra más eficaz.

El término "sustrato" se usa en la presente descripción para indicar un sustrato de retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, y como dicho sustrato, puede usarse una mezcla de cuatro tipos de desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Sin embargo, el sustrato no se limita a la mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y puede añadirse trifosfato de didesoxinucleótido a la mezcla, o también puede usarse un desoxirribonucleótido modificado.

En la presente invención, la mezcla a usar en la reacción puede comprender una proteína de unión a ADN monocatenario tal como una proteína del gen 32 de T4. La proteína del gen 32 de T4 puede usarse como factor auxiliar para aumentar la uniformidad de amplificación. La proteína del gen 32 de T4 como proteína de unión a ADN bicatenario se ha sabido que actúa, no solamente sobre ADN monocatenario, sino también sobre ARN (publicaciones 17 a 20 no pertenecientes a patente). Usando la proteína del gen 32 de T4, puede aflojarse la estructura superior del ARN molde, y puede realizarse una reacción de desplazamiento de hebra más uniforme sobre el molde de longitud completa. Además, en el caso de una reacción usando una enzima degradante de ADN no específica, puede evitarse la descomposición del ADNc amplificado.

La reacción de amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede realizarse en condiciones isotérmicas, o en condiciones de termociclado.

Cuando la reacción de amplificación de ácido nucleico se realiza en condiciones isotérmicas, la reacción puede realizarse, por ejemplo, a una temperatura predeterminada entre 25 °C y 50 °C, preferiblemente a una temperatura predeterminada entre 30 °C y 45 °C, y más preferiblemente a una temperatura predeterminada entre 35 °C y 40 °C y, por tanto, la reacción puede realizarse, por ejemplo, a 37 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, en 5 minutos a 3 horas, y preferiblemente de 10 minutos a 150 minutos). Cuando la reacción se realiza, por ejemplo, a 37 °C, después de haber incubado la solución de reacción, por ejemplo, a 25 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos) y, después, se ha incubado a 30 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos), la reacción se realiza a 37 °C. Como alternativa, después de haber incubado la solución de reacción a 37 °C, puede incubarse a 50 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos) y, después, a 85 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos).

Cuando la reacción de amplificación de ácido nucleico se realiza en condiciones de termociclado, por ejemplo, se combina una temperatura predeterminada T1 de 20 °C o mayor y menor de 30 °C (por ejemplo, 25 °C) con una temperatura predeterminada T2 de 30 °C o mayor y 45 °C o menos (por ejemplo, 37 °C). Después, se establece T1 durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 1 minuto a 3 minutos y, como ejemplo, 2 minutos) y T2 durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 1 minuto a 3 minutos y, como ejemplo, 2 minutos) en un ciclo, y este ciclo se repite preferiblemente durante 10 ciclos a 40 ciclos, y más preferiblemente durante 15 ciclos a 35 ciclos, de modo que pueda realizarse la reacción. Además, antes del termociclado descrito anteriormente, puede incubarse la solución de reacción, por ejemplo, a 25 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos), después a 30 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos), y después a 37 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 1 minuto a 5 minutos). Además, después de completarse el termociclado descrito anteriormente, la solución de reacción puede incubarse a 50 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos) y, después, a 85 °C durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, de 5 minutos a 15 minutos).

El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede usarse como parte de un método de RT-qPCR de uso de una cantidad vestigial de ARN (por ejemplo, ARN vestigial correspondiente a un volumen que varía de una sola célula a varios cientos de células).

El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede utilizarse en un método de secuenciación de ARN de uso de una cantidad vestigial de a Rn (por ejemplo, a Rn vestigial correspondiente a un volumen que varía de una sola célula a varios cientos de células).

Utilizando el método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, es posible detectar una sola célula en una gran cantidad de células. Específicamente, amplificando específicamente genes que se expresan solamente en células diana contenidas en una gran cantidad de células, llega a ser posible detectar solamente unos pocos genes celulares diana contenidos en una gran cantidad de ARN, de modo que puede juzgarse la presencia o ausencia de células diana.

La presente invención se refiere además a un kit para realizar el método descrito anteriormente para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. El kit de la presente invención comprende, al menos, una enzima degradante de hebra híbrida de ARN-ADN específica de hebra de ADN tal como una enzima degradante de ADN específica bicatenaria o una enzima degradante de ADN no específica, y una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H. Preferiblemente, el kit de la presente invención comprende además una proteína de unión a ADN bicatenario (por ejemplo, una proteína del gen 32 de T4). El kit de la presente invención puede comprender además, según se desee, otros reactivos necesarios para realizar la reacción de amplificación de ácido nucleico, un tampón y similares. Ejemplos de dichos otros reactivos incluyen un cebador, y trifosfato de desoxirribonucleótido.

La presente invención se describirá en mayor detalle en los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se pretende que estos ejemplos limiten el alcance de la presente invención.

Ejemplos

El método de RT-RamDA es un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende una etapa de incubar una mezcla que comprende ARN molde, un cebador, una enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN tal como una enzima degradante de ADN específica bicatenaria o una enzima degradante de ADN no específica, una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H y un sustrato. En el método de RT-RamDA, el ADN de hebra complementaria (ADNc) del ARN molde se sintetiza por la actividad ADN polimerasa dependiente de ARN de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, la hebra de ADNc en el híbrido de ARN-ADNc se escinde aleatoriamente con la enzima degradante específica para ADN en híbrido de ARN-ADN. El sitio de escisión descrito anteriormente se convierte en un punto de partida, la hebra de ADNc en el lado 3' se desprende del ARN por la actividad de desplazamiento de hebra de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, y se sintetiza una nueva hebra de ADNc en la parte desprendida por la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H.

La RamDA-A es un aspecto de realización del método de RT-RamDA, usando una enzima degradante de ADN específica bicatenaria y una proteína del gen 32 de T4.

La RamDA-B es un aspecto de realización del método de RT-RamDA, usando una enzima degradante de ADN específica bicatenaria, sin usar una proteína del gen 32 de T4.

La RamDA-C es un método de termociclado de RT-RamDA, que es un aspecto de realización de una reacción modificando las condiciones de temperatura de reacción, mientras se mantiene la misma composición de la solución de reacción que en RamDA-B, y repitiendo con intervalos cortos una etapa de hibridación y una etapa de reacción de elongación.

La RamDA-D es un aspecto de realización del método de RT-RamDA, usando una enzima degradante de ADN no específica y una proteína del gen 32 de T4.

(Materiales y métodos)

Cultivo celular

Para la extracción de ARN total, se usaron células ES de ratón 5G6GR. Esta línea celular se produjo incorporando aleatoriamente un vector Gata6-GR-IRES-Puro linealizado en células ES EB5 (publicación 20 no perteneciente a patente). Las células se cultivaron en una plaza recubierta de gelatina sin alimentación, en un medio esencial mínimo Glasgow que contiene suero bovino fetal al 10 % (GMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) que comprende 1000 U/ml de factor inhibidor de leucemia (ESGRO; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. ^{u U . ) ,} 100pmol/l de 2-mercaptoetanol (Nacalai Tesque Inc., Kioto, Japón), aminoácidos no esenciales 1 x (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.), 1 mmol/l de piruvato de sodio (Life Technologies), 2 mmol/l de L-glutamina (Nacalai Tesque), penicilina/estreptomicina 0,5 x (Life Technologies) y 10 pg/ml de blasticidina (Life Technologies).

Extracción de ARN

El ARN total se purificó usando el kit RNeasy Mini (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE. UU.). La cuantificación del ARN y la comprobación de calidad del mismo se realizaron usando un fluorímetro Quantus (Promega Corp., Madison, Wl, EE. UU.) y el kit RNA 6000 Nano (Agilent Biotechnology, Santa Clara, CA, EE. UU.). El ARN sintetizado artificialmente se sintetizó a partir de plásmido pGIBS-DAP, pGIBS-THR (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE. UU.), usando el kit MEGAscript T3 (Life Technologies).

Preparación de lisado de 1 célula de células ES de ratón

Las células cultivadas se hicieron reaccionar a 37 °C durante 3 minutos, usando TrypLE Express (Life Technologies), para disociar las células en 1 célula. Después de completarse la disociación, el reactivo se remplazó inmediatamente con PBS (-) para terminar la reacción. Para fraccionar de forma precisa únicamente la célula usando un clasificador de células, el núcleo celular vivo de la célula disociada se marcó tiñéndola usando Vybrant Dye Cycle (Life Technologies). El método incluido en el reactivo se aplicó como condiciones de tinción. Usando un clasificador de células SH 800 (Sony Corp., Tokio, Japón), las células, que se mostraron positivas a Vybrant Dye Cycle (filtro de detección: BP450/50) y se mostraron negativas al tinte marcador de fluorescencia de células muertas, PI (filtro de detección: BP585/40), se definieron como una fracción de células vivas. A partir de esta fracción, se fraccionaron 50 células en 1 pl de tampón de lisis (1 U de RNasin plus (Promega), NP40 al 0,3% (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, m A EE. UU.) y agua sin RNasa (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Japón)). Después de completarse el fraccionamiento, las células se sometieron inmediatamente a centrifugación y agitación batiendo, y las células resultantes entonces se conservaron a -80 °C. Cuando las células se usaron en una reacción de retrotranscripción, las células se descongelaron, y después se añadieron 49 pl de tampón de lisis a las células resultantes, de modo que se usó 1 pl de lisado celular diluido en factor 50 como lisado de 1 célula.

Ensayo FRET

Se realizó análisis FRET modificando el método de Inge W. Nilsen et al (publicación 12 no perteneciente a patente). Se prepararon 0,6 pl de mezcla de sondas oligonucleotídicas (6 pmol de ADN o ARN oligomérico (Sigma-Aldrich), tampón First-Strand 1 x (Life Technologies) y agua sin RNasa (TaKaRa)), y después se desnaturalizó a 70 °C durante 5 minutos. Después de ello, la temperatura se devolvió lentamente hasta temperatura ambiente. Las combinaciones de oligonucleótidos usadas en el análisis son como sigue (SEQ ID NO: 1 a 10).

Sonda doble para ADN bicatenario:

FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1

HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1

Sonda doble para híbrido de ARN-ADN:

FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1

HEX-rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1

Sonda simple para ADN monocatenario:

HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1

Sonda simple para ARN monocatenario:

HEX-rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1

Sonda FAM simple para corrección:

FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1 GAACCTCCGATGGCG

Sonda HEX simple para corrección:

CGCCATCGGAGGTTC HEX-GAACCTCCGATGGCG-BHQ1

Posteriormente, Se prepararon 5,4 |jl de solución enzimática (tampón First-Strand 1 x, 0,12 U de cada nucleasa y agua sin RNasa). Como nucleasas, se usaron DNasa I de calidad de amplificación (Life Technologies), DNasabc (ArcticZymes AS, Tromso, Noruega) y DNasabc-TL (ArcticZymes). Como control, se añadió agua sin RNasa en lugar de la enzima. se mezclaron 0,6 j l de la mezcla de sondas oligonucleotídicas, que se había devuelto hasta temperatura ambiente, con 5,4 j l de la solución enzimática en PloxiPlate-384F Plus (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU.), y la mezcla obtenida se midió entonces usando EnVision (PerkinElmer). Para la medición, se midieron las intensidades de fluorescencia de FAM y HEX a 37 °C a una tasa de una medición para 70 segundos, y esta medición se realizó 50 veces. Las fugas de la fluorescencia de FAM y HEX se corrigieron usando la cantidad de fluorescencia de cada sonda individual para la corrección.

En un experimento de verificación con respecto a la acción de una proteína del gen 32 de T4 sobre la actividad nucleasa (figura 10), se prepararon 0,6 j l de mezcla de sondas oligonucleotídicas (6 pmol de ADN o ARN oligomérico (Sigma-Aldrich), tampón PrimeScript 1 x (para Real Time) (TaKaRa) y agua sin RNasa) y 5,4 j l de solución enzimática (tampón PrimeScript 1 x (para Real Time) o tampón de reacción de DNasa I 1 x (Life Technologies), 0,12 U de cada nucleasa y agua sin RNasa). Como nucleasas, se usaron DNasa I de calidad de amplificación y DNasabc. Como muestra con proteína del gen 32 de T4 añadida, se añadieron 180 ng de proteína del gen 32 de T4 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE. UU.) a la solución enzimática. Como control, se añadió agua sin RNasa en lugar de la enzima. La medición se realizó a una tasa de una medición para 90 segundos, 50 veces. La actividad enzimática se calculó usando la tasa de amplificación de fluorescencia en la fase inicial de reacción (de 1,5 minutos a 9 minutos).

En un experimento de medición con respecto a la actividad nucleasa, dependiente de la concentración de KCI y Tris-HCl, de DNasa I (figura 6), se prepararon 0,6 j l de mezcla de sondas oligonucleotídicas (6 pmol de ADN o ARN oligomérico (Sigma-Aldrich), tampón de reacción de DNasa I 1 x (Life Technologies) y agua sin RNasa) y 5,4 j l de solución enzimática (tampón de reacción propio, 0,12 U de DNasa I de calidad de amplificación y agua sin RNasa). El tampón de reacción propio se ajustó para que tuviera una concentración final mostrada en la figura 6, dependiendo de las condiciones. La medición se realizó a una tasa de una medición para 60 segundos, 50 veces.

La actividad enzimática se calculó usando la tasa de amplificación de fluorescencia en la fase inicial de reacción (de 5 minutos a 10 minutos). Las combinaciones de oligonucleótidos usadas en el análisis son como sigue (SEQ ID NO: 11 a 16).

Sonda simple para ADN bicatenario:

FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1

GAACCTCCGATGGCG-BHQ1

Sonda simple para híbrido de ARN-ADN:

FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1

rGrArArCrCrUrCrCrGrArUrGrGrCrG-BHQ1

Sonda simple para ADN monocatenario:

FAM-CGCCATCGGAGGTTC-BHQ1

Sonda simple para ARN monocatenario:

FAM-rCrGrCrCrArTrCrGrGrArGrGrTrTrC-BHQ1

Reacción de retrotranscripción

Método de RT-RamDA (RamDA-A):

El ARN molde se diluyó con 1 j l de tampón de lisis (1 U de RNasin plus (Promega), tampón de lisis Roche al 10%(Roche), NP40 al 0,3% (Thermo Fisher) y agua sin RNasa) y después se sometió a un tratamiento de desnaturalización a 65 °C durante 2 minutos. El ARN resultante se conservó en hielo antes de su uso. Se modificó el kit de qPCR RT ReverTra Ace (TOYOBO Co. Ltd., Osaka, Japón) y se usó como solución de reacción de retrotranscriptasa. A 1 j l del ARN molde diluido desnaturalizado, se le añadió 2 j l de mezcla de RT (tampón de RT ReverTra Ace 1,5 x (TOYOBO), 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18 (Thermo Fisher), 7,8 pmol de cenador hexamérico aleatorio (TaKaRa), mezcla de enzimas ReverTra Ace 1,5 x (TOYOBO) y agua sin RNasa), o 2 |jl de mezcla de RamDA-A (tampón de RT ReverTra Ace 1,5 x, 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18, 7,8 pmol de cebador hexamérico aleatorio con An Z ([Z][Z]NNNNNN; Sigma-Aldrich), 0,4 U de DNasabc (ArcticZymes), 100 ng de proteína del gen 32 de T4, mezcla de enzimas ReverTra Ace 1,5 x y agua sin RNasa). Las mezclas así obtenidas se agitaron, cada una, a 2.000 rpm durante 30 segundos usando MixMate (Eppendorf, Westbury, NY, EE. UU.), y después se hicieron reaccionar usando un termociclador C1000 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.)), a 25 °C durante 10 minutos, a 30 °C durante 10 minutos, a 37 °C durante 30 minutos, a 50 °C durante 5 minutos y a 85 °C durante 5 minutos.

Método de RT-RamDA sin usar proteína del gen 32 de T4 (RamDA-B):

El ARN molde se diluyó con 1 j l de tampón de lisis (1 U de RNasin plus, NP40 al 0,3 % y agua sin RNasa), y después se sometió a un tratamiento de desnaturalización a 70 °C durante 90 segundos. El ARN resultante se enfrió en hielo y, después de ello, se le añadió 2 j l de mezcla de RT (tampón de RT ReverTra Ace 1,5 x, 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18, 7,8 pmol de cenador hexamérico aleatorio, mezcla de enzimas ReverTra Ace 1,5 x y agua sin RNasa), o 2 j l de mezcla de RamDA-B (tampón de RT ReverTra Ace 1,5 x, 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18, 7,8 pmol de cebador hexamérico aleatorio con ANZ ([Z][Z]NNNNNN; Sigma-Aldrich) y 0,1 U de DNasabc). Después de ello, las mezclas así obtenidas se sometieron, cada una, a las mismas operaciones que las realizadas en RamDA-A.

Método de termociclado de RT-RamDA (RamDA-C):

Se realizó una reacción de retrotranscripción con la misma composición de solución de reacción que la de RamDA-B, con la excepción de que se cambiaron las condiciones de temperatura. Las condiciones de reacción son como sigue. Después de haber realizaron una reacción a 25 °C durante 10 minutos, a 30 °C durante 10 minutos y a 37 °C durante 2 minutos, se realizó una reacción a 25 °C durante 2 minutos, y después a 37 °C durante 2 minutos durante 29 ciclos. Después de ello, el producto de reacción se trató a 50 °C durante 5 minutos, y después a 85 °C durante 5 minutos.

Método de RT-RamDA con enzima degradante de ADN no específica (DNasa I) (RamDA-D):

El ARN molde se diluyó con 1 j l de tampón de lisis (1 U de RNasin plus, tampón de lisis Roche al 10 %, NP40 al 0,3 % y agua sin RNasa) y después se sometió a un tratamiento de desnaturalización a 70 °C durante 90 segundos. El ARN resultante se conservó en hielo antes de su uso. Se modificó el kit de reactivo de RT PrimeScript (Perfect Real Time) (TaKaRa) y se usó como solución de reacción de retrotranscriptasa. A 1 j l del ARN molde desnaturalizado, se le añadió 2 j l de mezcla de RT (tampón PrimeScript 1,5 x (para Real Time), 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18, 8 pmol de cebador hexamérico aleatorio, mezcla de enzimas RT I PrimeScript 1,5 x y agua sin RNasa), o 2 j l de mezcla de RamDA-D (tampón PrimeScript 1,5 x (para Real Time), 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18, 8 pmol de cebador hexamérico aleatorio, 0,2 U de DNasa I, calidad de amplificación, 100 ng de proteína del gen 32 de T4, mezcla de enzimas RT I PrimeScript 1,5 x y agua sin RNasa). Las mezclas así obtenidas se hicieron reaccionar, cada una, a 25 °C durante 10 minutos, a 30 °C durante 10 minutos, a 37 °C durante 60 minutos, a 50 °C durante 5 minutos y a 85 °C durante 5 minutos.

Experimento para estudiar la composición de la solución de reacción de retrotranscripción, usando RamDA-D:

Cuando un tampón de reacción de retrotranscripción propio, en que las concentraciones de Tris-HCl, KCI, NaCl y MgCl²se cambiaban, o se usaba tampón First-Strand, estos se remplazaban con tampón PrimeScript (para Real Time) en mezcla de RamDA-D, y se añadía adicionalmente mezcla de dNTP (Life Technologies) a la solución hasta una concentración final de 0,5 mM, seguido de realización de la reacción. La composición de cada tampón se muestra en la tabla 1 a continuación.

[Tabla 1]

Tabla 1 Composiciones de tampones de reacción propios y tampones de reacción con enzima añadida disponibles en el mercado

continuación

Sistema de ARN sintetizado artificialmente (Dap y Thr) de uso de RamDA-D:

Se usaron solamente 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18 como cebador de retrotranscripción en mezcla de RamDA-D, y la composición de la mezcla de RamDA-D se cambió dependiendo de las condiciones. Además, las condiciones de temperatura para la reacción de retrotranscripción se determinaron para que fueran las mismas condiciones que las de RamDA-A.

Estudios con respecto a la retrotranscriptasa en RamDA-D:

Con respecto a las condiciones de SuperScript II, SuperScript Ill y SuperScript IV, se usaron 30 U de SuperScript II (Life Technologies), 30 U de SuperScript Ill (Life Technologies) y 30 U de SuperScript IV (Life Technologies) como retrotranscriptasa en mezcla de RamDA-D, en lugar de la mezcla de enzimas RT I PrimeScript y, además, también se añadieron 6 U de RNasin plus. Como tampón de reacción de retrotranscripción, se usó tampón PrimeScript (para Real Time) para todas las condiciones.

Comparación de DNasabc:

La nucleasa se remplazó con 0,2 U de DNasabc de 43 KDa (ArcticZymes), 0,2 U de DNasabc de 47 KDa (Affymetrix Inc., Santa Clara, ^{C a ,} EE. UU.) y 0,2 U de nucleasa específica bicatenaria (NEB; Evrogen JSC, Moscú, Rusia), respectivamente, en las condiciones de solución de reacción de RamDA-A, y después se hizo una comparación. Las condiciones de temperatura de reacción se determinaron de acuerdo con RamDA-A, y la tasa de amplificación de ADNc se cuantificó después por qPCR.

Comparación de retrotranscriptasa:

Se hizo una comparación usando 10 tipos de kits de qPCR RT, kit de síntesis de ADNc de primera hebra sin actividad H Maxima (Thermo Fisher), kit de qPCR RT ReverTra Ace (TOYOBO), kit de reactivo de RT PrimeScript (TaKaRa), kit de síntesis de ADNc por qPCR AffinityScript (Agilent Biotechnology), kit de retrotranscripción QuantiTect (Qiagen), sistema de retrotranscripción GoScript (Promega), kit de síntesis de ADNc iScript Select (Bio-Rad), kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript II (New England Biolabs, MA, R. U.), SuperScript Ill (Life Technologies) y kit de síntesis de ADNc de primera hebra Transcriptor (Roche).

Para un ensayo de actividad de elongación, se realizó una reacción de retrotranscripción usando marcadores de ARN Millennium (Life Technologies) que comprendía ARN con poli-A añadida con diversas longitudes (0,5-9 k bases). Se preparó una mezcla de retrotranscripción usando reactivos suministrados en cada kit, aplicando las condiciones para la formulación de los reactivos recomendados por el kit, en 10 pl de un sistema de reacción. Sin embargo, como cebador de retrotranscripción, se usó un cebador de oligo (dT) 18 en todos los kits. Se desnaturalizaron 1,5 pl de mezcla de ARN-cebador (20 ng de marcadores de ARN Millennium, 25 pmol de cebador de oligo (dT) 18 y tampón de lisis (condiciones de RamDA-A)) a 65 °C durante 2 minutos, después se mezclaron con 8,5 pl de mezcla de retrotranscripción, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a 42 °C durante 2,5 minutos, y después a 85 °C durante 5 minutos. Después de completarse la reacción, la mezcla de reacción se analizó por electroforesis en gel de agarosa.

Para un ensayo de adaptación del método de RamDA, usando 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón, se realizó una reacción de retrotranscripción. Para la preparación de una mezcla de retrotranscripción, se usaron los reactivos suministrados a cada kit, y para la formulación de los reactivos, se usaron 3 j l de un sistema de reacción, que se había reducido de escala en condiciones recomendadas por el kit. Sin embargo, con respecto a los cebadores de retrotranscripción, se usaron 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18 y 7,8 pmol de cebador haxamérico aleatorio en condiciones de RamDA (-), mientras se usaron 0,6 pmol de cebador de oligo (dT) 18 y 7,8 pmol de cebador haxamérico aleatorio con ANZ en condiciones de RamDA (+). Además, en el caso de RamDA (+), se añadieron además 0,2 U de DNasabc (ArcticZymes) y 100 ng de proteína del gen 32 de T4. La reacción se realizó en condiciones de temperatura de reacción de 25 °C, 10 minutos, 30 °C, 10 minutos, 42 °C, 30 minutos, 50 °C, 5 minutos y 85 °C, 5 minutos, y después se cuantificó la tasa de amplificación de ADNc por qPCR.

La preparación de reactivos y las reacciones se realizaron todas en 0,2 ml de Hi-Tube Flat Cap Recovery (TaKaRa), tira con 8 tapas semiabombada EU (BlOplastics BV, Landgraaf, Países Bajos) o placa de 96 pocillos RP, LF, SEMI Sk, cortable (BlOplastics BV).

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

En el caso de un sistema de ARN sintetizado artificialmente (Dap y Thr), se diluyó un producto de reacción de retrotranscripción con agua sin nucleasa (Qiagen), y el producto diluido en una cantidad de 1/50 se usó como solución de reacción de qPCR. En el caso de un sistema de 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón, se diluyó un producto de reacción de retrotranscripción con agua sin nucleasa, y el producto diluido en una cantidad de 1/6, 1/8 o 1/10, se usó como solución de reacción de qPCR. La qPCR se realizó usando LightCyclar 480 (Roche) o ABI 7900HT (Life Technologies) en las siguientes condiciones. 10 j l de solución de reacción de qPCR (mezcla general de SybrGreen Quantitect 1 x (Qiagen), 5 pmol de cebador directo, 5 pmol de cebador inverso, 3 j l de ADNc diluido y agua sin nucleasa) se hicieron reaccionar a 95 °C durante 15 minutos para activar la enzima y, después de ello, se realizó desnaturalización a 95 °C durante 15 segundos y una reacción de elongación a 60 °C durante 1 minuto durante 40 ciclos. La curva de fusión se analizó a 95 °C durante 15 segundos, a 60 °C durante 15 segundos y a 95 °C durante 15 segundos. Para la producción de curvas patrón usadas para cuantificación absoluta, como ADN patrón, se usaron series de dilución de factor 5 de una solución mixta de ADNbc de Dap y Thr (31250, 6250, 1250, 250, 50, 10 y 0 copias) para ARN sintetizado artificialmente, y series de dilución de factor 5 de ADN genómico de ratón (Clonetech) (31250, 6250, 1250, 250, 50, 10 y 0 copias) para ARN total. Como el ADNc era ADNmc, el valor cuantitativo se calculó por la fórmula: un valor detectado (copia de ADNbc) x 2. Las secuencias de cebadores individuales se muestran en la tabla 2. El análisis de datos se realizó usando el programa informático LightCycler 480, versión 1.5 (Roche) o el programa informático SDS 2.1 (Life Technologies).

[Tabla 2]

Tabla 2: Secuencia del cebador SEQ ID NO: 17 a 80

(continuación)

(continuación)

Electroforesis en gel

Cada producto de reacción de retrotranscripción se diluyó con un tampón TE sin RNasa (Life Technologies) para producir un volumen de 20 pl, y el producto así diluido se sometió a un tratamiento de desnaturalización a 70 °C durante 10 minutos, e inmediatamente después del tratamiento, la solución de reacción se enfrió en hielo. Con respecto a los marcadores de escala de ADN, se usó 1 j l de escala de ADN EGel 1 Kb Plus (Life Technologies), que se diluyó con tampón TE sin RNasa hasta un volumen de 20 j l y después se termodesnaturalizó, como escala de ADNmc, y se usó 1 j l de escala de ADN E-Gel 1 Kb Plus (Life Technologies) que se diluyó, pero no se termodesnaturalizó, como escala de ADNbc. Sin embargo, en un sistema de uso de marcadores de ARN Millennium, se omitió un tratamiento de termodesnaturalización después de completarse la dilución. El producto de reacción de retrotranscripción y el marcador de escala se llenaron en geles de agarosa E-Gel EX al 2 % (Life Technologies) y, después de ello, se realizó electroforesis usando el sistema E-Gel iBase Power (Life Technologies) durante 10 minutos. Las imágenes electroforéticas se fotografiaron usando FAS-Digi (NIPPON Genetics Co.Ltd, Tokio, Japón).

(Resultados)

Escisión selectiva de ADN en híbrido de ARN-ADN por DNasabc y DNasa I

En primer lugar, se examinó si la DNasabc o DNasa I tiene actividad de escisión selectiva de ADN en un híbrido de ARN-ADN en condiciones de tampón de retrotranscripción convencionales.

Se ha sabido que la nucleasa específica bicatenaria derivada de cangrejo tiene actividad de escisión de ADN en un híbrido de ARN-ADN (publicación 11 no perteneciente a patente). Sin embargo, esta enzima casi no tiene actividad a una temperatura aplicada durante la retrotranscripción (publicación 11 no perteneciente a patente). Por tanto, se ha focalizado la DNasabc derivada de gambas conocida como enzima térmicamente inestable (publicación 12 no perteneciente a patente). Esta enzima tiene actividad alrededor de los 37 °C y escinde específicamente ADN bicatenario. Por tanto, esta enzima tiene acción para eliminar ADN contaminado, ADN genómico y similares sin digerir los cebadores o ADNc (publicaciones 12 y 13 no pertenecientes a patente). Sin embargo, aún no se ha informado de que esta enzima tenga actividad de escisión de ADN en un híbrido de ARN-ADN, que es esencial para realizar una reacción de desplazamiento de hebra. Por tanto, usando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), se realizó un análisis. Como resultado, se descubrió que la DNasabc tiene actividad de escisión selectiva del ADN en un híbrido de ARN-ADN, aunque la actividad es aproximadamente la mitad de la actividad sobre ADN bicatenario (figuras 2A a 2C). Además, también se confirmó que esta enzima casi no tiene actividad sobre una hebra de ARN en un híbrido de ARN-ADN, ADN monocatenario y ARN monocatenario (figuras 2D a 2F). Se obtuvieron resultados similares de la DNasa específica bicatenaria termolábil (DNasabc-TL) que tiene mayos inestabilidad térmica que la DNasabc, pero se descubrió que la actividad nucleasa de la DNasabc-TL es menor que la de DNasabc (figuras 2A a 2C). Por otro lado, cuando se usaba DNasa I como DNasa no específica, mostraba actividad de escisión selectiva de ADN en un híbrido de ARN-ADN, como con DNasabc. Sin embargo, esta enzima también presentó actividad sobre ADN monocatenario, aunque la actividad fue baja (figuras 2B y 2E). En vista de lo anterior, en primer lugar, se examinó un método de RT-RamDA de uso de DNasabc que no presenta actividad de degradación sobre ADN monocatenario.

Amplificación por fragmentación de ADNc y reacción de desplazamiento de hebra

Para confirmar si la DNasabc realmente actúa sobre ADNc sintetizado por una reacción de retrotranscripción para fragmentarlo y, también, si de este modo tiene lugar una reacción de desplazamiento de hebra y se amplifica el ADNc, se realizó una retrotranscripción usando aproximadamente 2 kb de ARN sintetizado artificialmente con poli-A añadida como molde y, después de ello, se examinó la presencia o ausencia de fragmentación de ADNc por electroforesis en gel, y se midió el rendimiento de ADNc por RT-qPCR. Por consiguiente, se descubrió que, en un método de retrotranscripción convencional (RamDA (-)), casi nada de fragmentación tenía lugar en ambos casos de un cebador de oligo dT y un cebador hexamérico aleatorio. Por otro lado, en RamDA (+), se fragmento el ADNc y se obtuvo una imagen electroforética extendida (figura 3A). Se sugirió que estos resultados deben obtenerse por la acción de DNasabc para escindir el ADNc en un híbrido de ARN-ADNc. Posteriormente, para detectar cuantitativamente la amplificación provocada por una reacción de desplazamiento de hebra, se realizó cuantificación absoluta de ADNc por qPCR. Como ARN molde, se mezclaron ARN sintetizados artificialmente, cada uno, Dap (1.910 b) y Thr (2.052 b), en una cantidad de 100 fg cada uno (Dap: 96.725 copias, Thr. 89.991 copias) con 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón (correspondiente a una sola célula), y la mezcla se usó después para realizar una retrotranscripción. Se realizó cuantificación de acuerdo con qPCR, diseñando cebadores de qPCR en 12 regiones desde el extremo 3' hasta el extremo 5' en cada ARN sintetizado artificialmente, y midiendo la cantidad detectada en cada región. Como resultado, en ambos casos de Dap y Thr, se mostró una cantidad detectada casi constante en todas las regiones en las condiciones de cebador de oligo dT o en las condiciones de cebador hexamérico aleatorio, en condiciones de control de RamDA (-) (figura 3B). Por otro lado, en el caso de RamDA (+), no solamente en condiciones de uso del cebador hexamérico aleatorio, sino también en condiciones de uso del cebador de oligo dT, en regiones de 500 nt o más desde el lado 3', la cantidad detectada de ADNc se aumentaba de forma estable hasta casi 10 veces la del control de RamDA (-) (figura 3B). Además, se descubrió que la cantidad aumentada era relativamente baja alrededor del extremo 3' (figura 3B). A partir de estos resultados, se sugirió que un aumento en la cantidad de ADNc detectada en RamDA (+) debe ser amplificación por una reacción de desplazamiento de hebra, y que la mella en el lado de ADNc formada por la DNasabc se convertiría en un punto de partida de la reacción de desplazamiento de hebra.

Enzima DNasabc y retrotranscriptasa que puede usarse en el método de RT-RamDA

Para examinar una enzima DNasabc y retrotranscriptasa que pueda usarse en un método de RT-RamDA, se examinó si los efectos de amplificación pueden obtenerse incluso en condiciones de uso de otras enzimas DNasabc o diversos tipos de retrotranscriptasas. En primer lugar, con respecto a las enzimas DNasabc, se hizo una comparación entre tres enzimas, concretamente, DNasabc (43 KDa) disponible en el mercado de ArcticZymes, DNasabc (47 KDa) de Affymetrix y nucleasa específica bicatenaria (NEB) de Evrogen. Usando 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón que era la cantidad de ARN total correspondiente a una sola célula, se realizó retrotranscripción. Como resultado, se observó un aumento significativo en la cantidad detectada de ADNc en las dos muestras con DNasabc añadida (figura 4A). La tasa de amplificación de NEB fue muy baja debido a una diferencia en la temperatura activa, pero se descubrió que, si la enzima es una DNasa específica bicatenaria, el tipo de la DNasa específica bicatenaria no se limita particularmente a una enzima específica.

A continuación, se examinó la presencia o ausencia de efectos de amplificación obtenidos por el método de RT-RamDA usando retrotranscriptasa disponible en el mercado. En primer lugar, para examinar la actividad de elongación de una enzima, se usaron marcadores de ARN Millennium con poli-A añadida (Life Technologies) para realizar retrotranscripción usando un cebador de oligo dT, de modo que se realizó un ensayo de funcionamiento. Como resultado, se descubrió que, independientemente del tiempo de elongación corto de 2 minutos 30 segundos, casi todas las enzimas tenían una actividad de elongación de 2 kb o más (figura 4B). Además, las retrotranscriptasas, que no tenían actividad RNasa H, mostraron un claro patrón de escala (figura 4B, a-c, h e i), mientras que las retrotranscriptasas que tenían actividad RNasa H mostraban un patrón extendido oscuro (figura 4B, e-g y j). Cuando el SYBR Gold (Life Technologies) usado como tinte de tinción de ADN se hace reaccionar con ADN monocatenario, proporciona intensidad de fluorescencia que es aproximadamente la mitad en el caso de reaccionar con ADN bicatenario (publicación 22 no perteneciente a patente). De este modo, se asume que una diferencia en los patrones electroforéticos indica la presencia o ausencia de una hebra híbrida de ARN-ADN.

A continuación, se usaron retrotranscriptasas individuales para realizar retrotranscripción usando 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón, en condiciones de adición (+) de componentes de RT-RamDA (DNasabc, una proteína del gen 32 de T4 un cebador hexamérico aleatorio con ANZ), o sin adición (-) de dichos componentes, y entonces se hizo una comparación por qPCR, en términos de rendimiento de ADNc. Como resultado, en todas las retrotranscriptasas que no tienen actividad RNasa H, en el caso de RamDA (+), se observaba un aumento en la cantidad detectada (figura 4C, a-c, h e i). Por otro lado, en las retrotranscriptasas que tienen actividad RNasa H, dicho aumento en la cantidad detectada no se observaba, o la cantidad detectada estaba disminuida (figura 4C, e-g y j). Además, aunque la actividad RNasa H no se remitiera nominalmente, AffinityScript también mostraba ligera amplificación en RamDA (+) (figura 4B, d). Sin embargo, como AffinityScript mostraba un patrón extendido en su imagen electroforética, se asumió que tenía actividad RNasa aunque la actividad era débil (figura 4B, d). A partir de estos resultados, se descubrió que la acción de amplificación del método de RT-RamDA no se limita a DNasabc específica o retrotranscriptasa específica, sino que es una técnica ampliamente usada siempre que las enzimas sean DNasabc que tienen actividad alrededor de 37 °C y retrotranscriptasas que no tienen actividad RNasa H. Además, si una enzima tenía actividad RNasa H, no mostraba efectos de amplificación. Por consiguiente, se demostró que tiene lugar amplificación por desplazamiento de hebra, usando directamente ARN como molde.

Método concerniente de potenciación de la eficacia de reacción del método de RT-RamDA

Los autores de la presente invención se han centrado en la mejora de la tasa de amplificación, y han desarrollado métodos de desviación, concretamente, un método de RT-RamDA (RamDA-B) sin usar una proteína del gen 32 de T4 y un método de termociclado de RT-RamDA (RamDA-C). En una reacción de desplazamiento de hebra, la formación de la estructura secundaria de un molde impide la amplificación. Los autores de la presente invención han introducido una proteína del gen 32 de T4 en el método de RT-RamDA (RamDA-A) como función para aliviar dicha estructura secundaria. Sin embargo, al mismo tiempo, se asumió que la proteína del gen 32 de T4 provocaría inestabilización de un híbrido de ADN-ARN, y suprimiría la actividad de DNasabc. Por tanto, se intentó RamDA-B sin usar dicha proteína del gen 32 de T4. Usando 10 pg de ARN total derivado de células ES de ratón como molde, se realizó la síntesis de ADNc. Como resultado, se descubrió que, en las condiciones de RamDA-B, las cantidades detectadas de Gnb2l1 y Oct3/4 se aumentaban hasta 40 veces o más, en comparación con un método de retrotranscripción convencional (RamDA (-)) (figura 5A). Por otro lado, con respecto a Nanog, Sox2, Eeflb2 y similares, no se encontró una gran diferencia entre RamDA-B y RamDA-A (figura 5A).

A continuación, se intentó RamDA-C, en que se modificaron solamente las condiciones de temperatura de reacción en RamDA-B y se repitió una etapa de hibridación y elongación con intervalos cortos. Como resultado, se descubrió que las cantidades detectadas de Gnb2l1 y Oct3/4 en RamDA-C estaban aumentadas hasta 100 veces o más que en un método de retrotranscripción convencional (figura 5B, RamDA (+) ciclo). Por otro lado, en el método de retrotranscripción convencional, no se observaron los efectos de termociclado (figura 5B, RamDA (-) ciclo). Además, en RamDA-A también, no se observaron los efectos de termociclado (no se muestran los datos). A partir de estos resultados, se sugirió que, en el método de RamDA-B, la rehibridación de un cebador debe ser extremadamente eficaz para la amplificación de ADNc. En particular, el cebador hexamérico aleatorio con ANZ implica la adición de dos unidades catiónicas, y el valor de Tm del cebador hexamérico aleatorio con ANZ se ha diseñado para que sea aproximadamente 26 °C mayor que el de un cebador hexamérico aleatorio general (publicación 14 no perteneciente a patente). Por tanto, el cebador hexamérico aleatorio con ANZ posibilita la hibridación eficaz incluso durante una reacción a 37 °C y, además, se considera que la hibridación se ha promovido adicionalmente por termociclado.

Método de RT-RamDA concerniente de uso de DNasa I

La mayor razón para el uso de DNasabc en el método de RT-RamDA es que la DNasabc no tiene actividad nucleasa sobre el ADNc amplificado, que es ADN monocatenario, y un cebador de retrotranscripción. Sin embargo, se ha sabido que la DNasa I, que es una enzima degradante de a Dn no específica originalmente tiene una actividad nucleasa menor sobre ADN monocatenario, que sobre ADN bicatenario (publicación 12 no perteneciente a patente), y que esta actividad nucleasa se reduce de un modo dependiente de catión monovalente (por ejemplo, K+, Na+, etc.) (publicaciones 23 y 24 no pertenecientes a patente). Por otro lado, la composición general de un tampón de reacción usado en retrotranscripción (tampón First-Strand (Life Technologies), tampón PrimeScript (para síntesis de ADNc) (TaKaRa), tampón de RT de síntesis de ADNc de primera hebra sin actividad H Maxima (Thermo Fisher), tampón de reacción de retrotranscriptasa de VLMu-M (New England Biolabs), tampón de RT AffinityScript (Agilent Biotechnology), etc.) comprende Tris-HCl 50 mM, KCI 75 mM y MgCh 3 mM. Por tanto, las concentraciones de Tris-HCl y KCI son altas en dicho tampón de reacción usado en retrotranscripción. Es decir, se prevé que la actividad nucleasa de la DNasa I sobre ADN monocatenario, sería baja en las condiciones de tampón de reacción de retrotranscripción, y el método de RT-RamDA funcionaría. En realidad, de acuerdo con el análisis FRET, la actividad nucleasa se midió sobre la base de Tris-HCl 20 mM, KCI 50 mM y MgCI 2 mM comprendidos en tampón de reacción de DNasa I (Life Technologies), aumentando las concentraciones de Tris-HCl y KCI. Como resultado, se descubrió que la actividad nucleasa de DNasa I, no solamente sobre ADN bicatenario, sino también sobre ADN monocatenario y ADN en un híbrido de ARN-ADN, se inhibe significativamente en condiciones de altas concentraciones de Tris-HCl y KCI (figura 6). En las concentraciones de Tris-HCl y KCI que eran equivalentes a las de un tampón de reacción de retrotranscripción, la actividad se suprimía hasta un 43 %, 16 % y 14 %, en comparación con las condiciones de un tampón de reacción de DNasa I (figura 6, ##).

A continuación, se examinó la eficacia del método de RT-RamDA de uso de una enzima degradante de ADN no específica y, en particular, la relación entre la concentración salina en la solución de reacción y la tasa de amplificación. La concentración salina se cambió de la composición de un tampón de reacción de DNasa I a la composición de un tampón de reacción de retrotranscripción, y se examinó sin el método de RT-RamDA funciona usando qPCR. Como resultado, inesperadamente, se descubrió que el método de RT-RamDA proporciona suficiente amplificación incluso en condiciones de un tampón de reacción de DNasa I que tiene una alta actividad nucleasa sobre ADN monocatenario (figura 7). Además, incluso si se cambiaban las concentraciones de KCI y Tris-HCl, tenía solamente una pequeña influencia sobre la tasa de amplificación (figura 7, a-i). Por otro lado, se descubrió que la concentración de NaCl en la composición de un tampón de reacción de retrotranscripción tiene una gran influencia sobre la tasa de amplificación (figura 7, j-1). A partir de estos resultados, se asume que la composición de un tampón de reacción que no contiene NaCl es deseable. Además, incluso en el caso de usar un tampón de reacción propio, el tampón de reacción propio mostraba una tasa de amplificación que no era inferior al tampón First-Strand disponible en el mercado (Life Technologies) o el tampón PrimeScript (para Real Time) (TaKaRa) (figura 7, j, FS y PS). A partir de estos resultados, se descubrió que el tampón de reacción usado en el método de RT-RamDA no se limita a un determinado tampón de reacción, y además que el método de RT-RamDA funciona de manera no dependiente de la actividad nucleasa dependiente de la concentración salina. A partir de estos hallazgos, se sugirió que factores distintos de la concentración salina en el tampón de reacción deben suprimir la descomposición de ADNc.

Contribución de la proteína del gen 32 de T4 a la protección del ADNc y estabilización de la amplificación

Se ha informado de que la proteína del gen 32 de T4 tiene acción de unirse a ADN monocatenario, para proteger el ADN monocatenario de las nucleasas (publicación 25 no perteneciente a patente). Por tanto, el estado de fragmentación del ADNc de acuerdo con el método de RT-RamDA de uso, como molde, de ARN sintetizado artificialmente con poli-A añadida, y también usando solamente un cebador de oligo dT, se examinó basándose en la presencia o ausencia de una proteína del gen 32 de T4 (figura 8). Como resultado, se descubrió a partir de los patrones electroforéticos que, en ambos casos de DNasa I y DNasabc, la fragmentación del ADNc se suprime combinando la enzima con una proteína del gen 32 de T4, en lugar de en el caso de usar DNasa en solitario (figura 8, A). En el análisis usando BioAnalyzer, no solamente pudieron obtenerse resultados similares, sino que también se descubrió que el rendimiento de ADNc se aumentaba hasta casi 10 veces permitiendo que la DNasa actúe sobre el mismo (figura 8, B). Se considera que estos resultados sugieren la amplificación global de ADNc por una reacción de desplazamiento de hebra. Posteriormente, usando qPCR, se examinó la tasa de amplificación desde el extremo 3' hasta el extremo 5' en el ARN molde (figura 9). Como resultado, en el caso de usar DNasa I en solitario, casi no se observó amplificación. En cambio, cuando se combinaba la DNasa I con una proteína del gen 32 de T4, se observaba amplificación a un aumento de casi 10 veces (figuras 9A y 9B). Además, se descubrió que la tasa de amplificación sobre el lado 3' se mejoraba en comparación con DNasabc (figura 9,A). Por otro lado, en el caso de DNasabc, como la DNasabc no tiene originalmente una actividad de degradación sobre ADN monocatenario, mostraba una alta tasa de amplificación, incluso cuando se dejaba actuar en solitario. Sin embargo, la DNasabc produjo una gran fluctuación en las tasas de amplificación sobre ARN monocatenario (figuras 9A y 9C). Como estas condiciones eran casi equivalentes a las condiciones de RamDA-B, se sugirió que una fluctuación en la amplificación, no solamente entre los genes, sino también dentro de un solo gen, debe aumentarse, salvo que haya una proteína del gen 32 de T4. A partir de estos resultados, se sugirió que, en RamDA-D de uso de DNasa I, la proteína del gen 32 de T4 debe tener dos funciones para contribuir a la supresión de la descomposición del ADNc y la estabilización de la tasa de amplificación entre los genes o dentro de un solo gen.

Proteína del gen 32 de T4 que tiene acción para mejorar la relación entre la actividad nucleasa sobre ADN en hebra híbrida de ARN-ADN y la actividad sobre ADN monocatenario

Para la función del método de RT-RamDA de uso de DNasa I, se considera importante que la cantidad descompuesta de ADN amplificado sea más pequeña que la cantidad de amplificación por desplazamiento de hebra provocada por la formación de una mella en una hebra de ARN-ADNc, concretamente, que la actividad nucleasa sobre ADN monocatenario sea suficientemente más pequeña que la actividad sobre ADN en una hebra híbrida de ARN-ADN. A partir de un experimento con respecto a la fragmentación de ADNc y la tasa de amplificación (figuras 8 y 9), se asumió que la proteína del gen 32 de ^{t 4} contribuía a ello. Por tanto, de acuerdo con el análisis FRET, se examinó la acción de la proteína del gen 32 de T4 sobre la actividad nucleasa en un tampón de reacción de retrotranscripción (figura 10). Como resultado, se descubrió que la actividad sobre el ADN monocatenario se reducía hasta un 25 % añadiendo la proteína del gen 32 de T4 en el tampón de reacción de retrotranscripción. En cambio, casi no hubo fluctuación en la actividad sobre ADN bicatenario, y la actividad sobre ADN en la hebra híbrida de ARN-ADN fue de aproximadamente un 60 % (figura 10, A). Posteriormente, se examinó la relación de la actividad sobre ADN monocatenario a la actividad nucleasa sobre ADN en una hebra híbrida de ARN-ADN. Como resultado, se descubrió que la relación de actividad se mejoraba desde un 40 % hasta un 14 % mediante la adición de la proteína del gen 32 de T4 (figura 10, B). Se asumen que esta mejora de la relación es un factor clave para la eficacia del método de RT-RamDA. Por otro lado, en el caso de DNasabc, la relación de actividad simplemente era de aproximadamente un 7 % incluso en ausencia de la proteína del gen 32 de T4 y, por tanto, se considera que RamDA-B y RamDA-C son usar proteínas del gen 32 de T4 funcionan suficientemente (figura 10, B).

RamDA-D que muestra tasa de amplificación dependiente del tiempo de reacción

Se examinó si la tasa de amplificación se mejoraría de una manera dependiente del tiempo de reacción usando un lisado de 1 célula de células ^{E s} de ratón como molde (figura 11). Se midió un valor relativo del rendimiento de ADNc por qPCR. Como resultado, se descubrió que según se aumentaba el tiempo de reacción a 37 °C hasta 30, 60 y 120 minutos, también se aumentaba el rendimiento hasta aproximadamente 10, 20 y 30 veces, respectivamente (figura 11). Dicho fenómeno no se observó en RamDA-A de uso de DNasabc (no se muestran los datos). La actividad nucleasa de DNasabc se inhibió significativamente en un tampón de reacción de retrotranscripción, en particular, en presencia de una proteína del gen 32 de T4, y la actividad nucleasa de DNasabc sobre ADN en un híbrido de ARN-ADN fue solamente de aproximadamente un 6 %, en comparación con la actividad nucleasa de DNasa I (figura 10, A). Esto puede provocar una diferencia en la tasa de amplificación entre el uso de DNasa I y el uso de DNasabc. Por otro lado, se confirmó que RamDA-D funciona sin problemas incluso en una muestra en bruto que contiene impurezas, tal como un lisado celular. Además, con respecto a la actividad nucleasa sobre ADN bicatenario en una reacción de retrotranscripción, la actividad de la DNasa I fue mayor que la actividad de la DNasabc y, por tanto, se sugirió que RamDA-D debe ser eficaz no solamente con respecto a la tasa de amplificación, sino también a la capacidad de eliminar la contaminación (figura 10, A).

RamDA-D que no está limitada a retrotranscriptasa sin actividad RNasa H específica y, además, funciona también sobre ARN correspondiente a 100 células.

Para confirmar si RamDA-D está limitada a una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H específica, se realizó un examen usando retrotranscriptasa de la serie Superscript (Life Technologies), así como mezcla de enzimas RT I PrimeScript (figura 12). Como resultado, pudo confirmarse amplificación de ADNc en Superscript II y Ill. Entre otros, Superscript II mostró una tasa de amplificación que era equivalente a la de la mezcla de enzimas ^{R t} I PrimeScript (figura 12, SSII). Además, se confirmó que RamDA-D funciona incluso en el caso de usar el kit de síntesis de ADNc de primera hebra sin actividad H Maxima (Thermo Fisher) o el kit de qPCR RT ReverTra Ace (TOYOBO) (no se muestran los datos). A partir de estos resultados, se descubrió que RamDA-D no se limita a una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H específica. Adicionalmente, se descubrió también que RamDA-D funciona sin problemas incluso en ARN en una cantidad mayor de 10 pg de ARN total correspondiente a una sola célula, por ejemplo, en 200 pg de ARN o 1 ng de ARN (figura 12, 200 pg, 1 ng). A partir de estos resultados, se sugirió que debe garantizarse suficiente actividad de amplificación incluso usando ARN molde en una cantidad de al menos 100 células.

Como se indica anteriormente, el método de RT-RamDA puede ser un medio extremadamente útil como técnica de amplificación de ARN vestigial y, en particular, la tasa de amplificación proporcionada por RamDA-C debe ser una ventaja extremadamente grande en el análisis de detección de un gen diana específico. Por otro lado, como RamDA-C provoca una gran fluctuación en las tasas de amplificación entre genes, RamDA-A que implica el uso de una proteína del gen 32 de T4 es eficaz para un análisis que requiera amplificación uniforme. Además, RamDA-D que implica el uso de dicha proteína del gen 32 de T4 y DNasa I como enzima degradante de ADN no específica tiene una alta tasa de amplificación y también tiene una pequeña fluctuación de amplificación entre genes o dentro de un solo gen. Además, como la actividad nucleasa de la DNasa I sobre ADN bicatenario durante una reacción de retrotranscripción también se mantiene a un nivel mayor que el de una enzima degradante de ADN específica bicatenaria, se espera

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende una etapa de incubar una mezcla que comprende ARN molde, un cebador, una enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN, una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H y un sustrato, completando de este modo un proceso desde la retrotranscripción hasta la amplificación en una sola etapa, en donde la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN tiene una actividad de escisión de una hebra de ADN en el híbrido de ARN-ADN y es una enzima degradante de ADN específica bicatenaria o una enzima degradante de ADN no específica, en donde

(a) cuando la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN es una enzima degradante de ADN no específica, la mezcla comprende además una proteína de unión a ADN bicatenario, de modo que se suprime la actividad de degradación de la enzima degradante de ADN no específica sobre el ADN monocatenario, y

(b) la etapa de incubar la mescla comprende sintetizar un ADN complementario (ADNc) del ARN molde mediante la actividad ADN polimerasa dependiente de ARN de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, después escindir aleatoriamente la hebra de ADNc en la hebra híbrida de ARN y ADNc mediante la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN, después desprender la hebra de ADNc en el lado 3' del ARN mediante la actividad de desplazamiento de hebra de la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, mientras se usa el sitio de escisión como punto de partida, y después sintetizar un nuevo ADNc en una parte desprendida mediante la retrotranscriptasa sin actividad RNasa H.

2. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende una enzima degradante de ADN específica bicatenaria como la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN, y la enzima degradante de ADN específica bicatenaria tiene una actividad de escisión de la hebra de ADN en el híbrido de ARN-ADN, y sustancialmente no tiene una actividad de escisión de la hebra de ARN en el híbrido de ARN-ADN, ADN monocatenario y ARN monocatenario.

3. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende una enzima degradante de ADN no específica como la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN, y la enzima degradante de ADN no específica tiene una actividad de escisión de la hebra de ADN en el híbrido de ARN-ADN, y sustancialmente no tiene una actividad de escisión de la hebra de ARN en el híbrido de ARN-ADN y ARN monocatenario.

4. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN tiene una actividad degradante de ADN incluso a una temperatura menor de 60 °C.

5. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la enzima degradante de ADN específica bicatenaria es una enzima degradante de ADN específica bicatenaria derivada de crustáceos, o una variante de la misma.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la enzima degradante de ADN específica bicatenaria es una enzima degradante de ADN específica bicatenaria derivada de gambas, o una variante de la misma.

7. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la enzima degradante de ADN no específica es una enzima degradante de ADN no específica derivada de un mamífero, preferiblemente un bovino, o una variante de la misma.

8. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador es uno o más de un cebador aleatorio, un cebador de oligo dT y un cebador específico de secuencia.

9. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador es un cebador cuyo valor de Tm está aumentado por modificación con una unidad catiónica.

10. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cebador es un cebador de ácido nucleico en cremallera (Zip) (a Nz ).

11. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mezcla comprende además una proteína de unión a ADN monocatenario.

12. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ARN molde es ARN vestigial correspondiente a un volumen que varía de una sola célula a varios cientos de células.

13. El método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que se realiza para amplificar ADNc que tiene que someterse a la producción de una colección de secuencias de ADN.

14. Un kit usado para realizar el método para amplificar un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el kit comprende, al menos, una enzima degradante específica para ADN en un híbrido de ARN-ADN y una retrotranscriptasa sin actividad RNasa H, que comprende además una proteína de unión a ADN bicatenario.