CN114341150A - 用于增强逆转录酶活性和/或减少逆转录酶抑制的组合物和方法 - Google Patents

用于增强逆转录酶活性和/或减少逆转录酶抑制的组合物和方法 Download PDF

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CN114341150A CN202080046641.4A CN202080046641A CN114341150A CN 114341150 A CN114341150 A CN 114341150A CN 202080046641 A CN202080046641 A CN 202080046641A CN 114341150 A CN114341150 A CN 114341150A
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Abstract

本申请涉及用于增强逆转录酶(RT)活性和/或减少RT被抑制剂(例如福尔马林、单宁酸和/或肝素)抑制的组合物和方法。在一些实施方式中，通过向包含聚合酶的反应混合物中添加谷氨酸钾、组氨酸盐酸盐一水化物、泊洛沙姆188或其任意组合，以减少RT抑制。在其他实施方式中，通过向反应混合物中添加聚乙烯磺酸钠盐(PVSA)来增强RT。本申请还提供了用于目标序列的逆转录及其增强的寡核苷酸引物。这些引物具有高GC含量或低GC含量。还提供了在具有RNA模板和RT的组合物中使用RT抑制减少剂或RT增强剂改进RT产量、RT敏感性或RT对各种化学品的耐受性的方法。

Description

用于增强逆转录酶活性和/或减少逆转录酶抑制的组合物和 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月25日提交的美国临时申请62/866,182的权益，其通过引用全文纳入本文。
此申请的序列表被记为“Seq-List.txt”，其于2020年6月20日创建，大小为5KB。序列表的全部内容通过引用整体并入本文。
发明概述
本发明人惊喜地发现，在含有具有高和/或低GC含量的随机化引物的寡核苷酸引物存在的情况下，可以通过从具有高和低GC含量的RNA模板进行互补DNA(cDNA)的合成来增强逆转录酶(RT)活性。还令人惊喜地发现，可以通过在添加剂(例如谷氨酸钾、组氨酸盐酸盐一水化物和/或泊洛沙姆188)存在的情况下由RT进行cDNA的合成以减少肝素、福尔马林或单宁酸对逆转录酶的抑制。还令人惊讶地发现，可以通过在聚乙烯磺酸(PVSA)的盐(例如，PVSA的钠盐)存在的情况下从RNA模板进行互补DNA(cDNA)的合成来增强逆转录酶(RT)活性。还提供了包含本文公开的添加剂的多种反应混合物。
附图简要说明
图1.K-Glu(谷氨酸钾)对肝素耐受性的影响。谷氨酸钾改进了RT对肝素的耐受性。在RT反应中肝素(0.003U/μl)导致Cq延迟超过7，而当100mM K-Glu存在时，Cq延迟低于1。
图2.K-Glu(谷氨酸钾)改进了肝素耐受性，而不影响对其他抑制剂的耐受性。谷氨酸钾改进肝素耐受性而不影响对7.5％乙醇和50mM盐酸胍的耐受性。(NH4)2SO4也改进了肝素耐受性，虽然效果不如K-Glu，但它会损害乙醇和GC耐受性。
图3.泊洛沙姆对单宁酸耐受性的影响。泊洛沙姆改进单宁酸耐受性。RT反应中0.1μg/μl的单宁酸严重抑制了RT过程并导致Cq延迟超过13，而0.5％泊洛沙姆的存在有效改进了RT对单宁酸(小于2Cq延迟)的耐受性。
图4.组氨酸-HCl对福尔马林耐受性的影响。在RT反应期间组氨酸-HCl改进福尔马林耐受性。在没有组氨酸-HCl的情况下，RT产物具有约4Cq延迟，而在有15至20mM组氨酸-Cl存在的情况下，有少于1Cq延迟。
图5.PVSA对RT产量和敏感性的影响。当RT反应中RNA输入有限(减少)时，PVSA可以改进RT产量并使RNA检测更加灵敏。例如，本文显示在0.1ng RNA输入时，PVSA可以改进Cq(比不含PVSA早)约3个循环，并将敏感性增加约10倍。
发明内容
如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，就在具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“有”或其语法变体的程度而言，这些术语意在以类似术语“包含”的方式表示含(inclusive)。过渡术语/短语“包含”、“包括”、“含有”、“基本上由……组成”、“基本上由……构成”、“由……组成”和“由……构成”(及其任何语法变体)，可互换使用。
短语“基本上由……组成”或“基本上由……构成”表示权利要求涵盖包含特定材料或步骤，以及不实质性影响权利要求的基础和新颖特征的材料或步骤的实施方式。
术语“约”或“大约”表示在本领域普通技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，这将取决于该数值的测量或确定方式，即测量体系的极限。术语“约”和“大约”意为涵盖给定值的±20％、±10％或±5％的范围。因此，在使用术语“约”或“大约”的含有一定量成分的组合物的上下文中，这些组合物可包含规定量的成分，其变化(误差范围)在该值附近0-10％(X±10％)。
在本公开中，范围是简写形式，以避免不必要详细列出并描述范围内的每个值。适当时，可选择该范围内的任何合适值作为该范围的上限值，下限值或终点。例如，范围0.1-1.0表示终值0.1和1.0，以及中间值0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，并且所有中间范围都包含在0.1-1.0内，例如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。设想在一个范围内具有至少两个有效数字的值，例如，5-10的范围表示5.0和10.0之间以及5.00和10.00之间的所有值，包括端点值。
术语“同时”或“同时地”用于使用RT从RNA模板合成cDNA的方法，是指同时或在间隔不超过3分钟的两个不同的时间点，向组合物中添加一种或多种成分。适用于从模板RNA合成cDNA的方法的短语“之后或之前”是指在相隔多于3分钟的两个不同时间点添加多于一种的组合物，例如，约5分钟、30分钟、1小时、约2小时、约5小时，或甚至更长。
对核酸进行定量扩增的各种技术是已知的。这些技术包括5'至3'外切核酸酶试验的使用，例如，TaqmanTM探针(参见，例如，美国专利号5,210,015和5,487,972,Heid等,Genome Res.6:986-994,1996；Holland等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 88:7276-7280,1991；和Lee等,Nuc.Acids Res.21:3761-3766,1993)。其他方法采用一种或多种探针寡核苷酸，其构建为使得一个或多个寡核苷酸杂交至目标核酸时产生荧光变化。例如，一种此类方法涉及利用荧光共振能量转移(FRET)的双荧光团方法，例如，LightCyclerTM杂交探针，其中两个寡核苷酸探针退火到扩增子上(例如，美国专利号6,174,670)。构建为当结合至核酸或被纳入延伸产物时发出信号的标记的寡核苷酸的其他实例包括：ScorpionsTM探针(例如，Whitcombe等,Nature Biotechnology 17:804-807,1999，和美国专利号6,326,145)，Sunrise(或AmpliflourTM)引物(例如，Nazarenko等,Nuc.Acids Res.25:2516-2521,1997,和美国专利号6,117,635)，LUX.TM.引物和Molecular BeaconsTM探针(例如，Tyagi等,Nature Biotechnology 14:303-308,1996和美国专利号5,989,823)。
本发明提供了用于扩增核酸分子的方法。该方法涉及将RNA模板与包含逆转录酶、如本文所述的减少RT抑制和/或增加RT效率的添加剂和/或聚合酶的组合物混合。
在RT-PCR中，首先将反应混合物(在适当的缓冲剂中)在足以允许与至少部分RNA模板互补的DNA分子合成的温度下进行孵育。逆转录反应混合物的成分通常包含：RNA模板和DNA引物，从其中产生互补DNA(cDNA)；表现出逆转录酶活性的核酸聚合酶；以及核酸合成所需的合适的核苷酸构建模块(building blocks)(dNTP)。出于本发明的目的，cDNA被定义为其核酸序列互补于RNA分子的任何DNA分子。
RNA模板被定义为用于从可被合成的cDNA分子提供核酸序列的任何RNA分子。从RNA模板的cDNA合成通常是通过利用表现出逆转录酶活性的核酸聚合酶完成的。出于本发明的目的，逆转录酶活性指的是酶从RNA模板聚合cDNA分子的能力，以及术语“逆转录酶”(RT)广义地指任何拥有逆转录酶活性的酶。逆转录通常发生在从约20℃至约75℃的温度范围内，优选为约35℃至约70℃。
在对RNA模板逆转录以产生cDNA分子后，cDNA在足以复制cDNA分子的条件下(在合适的缓冲剂中)孵育。该反应混合物可以与之前的逆转录反应混合物相同，如在偶联(也称为连续或一步)RT-PCR中所使用的，或反应混合物可包含之前的逆转录反应混合物的等分式样且可进一步被修改以用于核酸复制，如在非偶联(或两步)RT-PCR中所使用的。复制反应混合物的成分通常包含：核酸模板(在此情况中为cDNA)；DNA引物；核酸聚合酶；以及核酸合成所需的合适的核苷酸构建模块。核酸复制指的是其序列由另一个核酸决定且互补于另一个核酸的核酸的聚合。DNA复制，如本文所用，与DNA扩增同义。优选地，DNA扩增重复发生，因此复制核酸序列的两条链，即DNA互补于RNA模板，且DNA的核酸序列基本与RNA模板相同。重复的或循环的DNA复制可以使用聚合酶链式反应(PCR)中的热稳定聚合酶有利地完成。
PCR是领域内公知的技术。PCR通过使反应混合物经历以下循环被用于扩增核酸：(i)核酸变性，(ii)寡核苷酸引物退火，和(iii)核酸聚合。优选的扩增反应条件包括热循环，即，交替调节反应混合物的温度以促进PCR循环的每个步骤。PCR通常通过变性、退火和复制的多个循环实现延伸，(可选地和优选地)以最初的延长变性步骤和最后的延长延伸(聚合)步骤来增强。热循环通常发生在从约23℃至约100℃的温度范围内，优选为约37℃至约95℃。核酸变性通常发生在约90℃至约100℃，优选约94℃。退火通常发生在约37℃至约75℃，优选约60℃。聚合通常发生在约55℃至约80℃，优选约72℃。热循环的数量变化很大，取决于从业者的偏好、所使用的DNA模板的数量和所需DNA产物的数量。优选地，PCR循环的数量从约5至约99个，更优选大于约20个循环，最优选约40个循环。
引物应根据标准PCR指南设计，长度为18至25个核苷酸，GC含量为40％至65％。引物设计应避免内部二级结构，以及每个引物和引物对内3’末端处的互补性。最佳结果可能需要在100和500nM之间滴定引物的浓度。每个引物300nM的终浓度对于大多数反应是有效的。一般来说，使用等浓度的每条引物可以优化反应效率和/或特异性。为了最佳结果，用于定量PCR的扩增子大小应限制在50-200bp。
建议的模板输入量为：0.1pg至100ng总RNA；10fg至100ng多聚A(+)RNA。第一链合成可以在40℃和52℃之间进行。通常在50℃孵育10分钟获得最佳结果。
A.RNA模板
模板RNA可以是从业者已知或未知的任何感兴趣的核糖核酸。模板RNA可以是人工合成的或从天然来源中分离的。在一些实施方式中，RNA模板可以是核糖核酸，例如RNA、mRNA、piRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、gRNA、shRNA、siRNA、snRNA、miRNA和snoRNA。优选RNA是mRNA。更优选RNA是具有生物学活性的，或编码具有生物学活性的多肽。RNA模板也可以以任何有用的量存在。在一些实施方式中，RNA模板浓度为50pg/μL或更少。本领域技术人员应理解，其他RNA模板浓度可用于本发明中。
B.逆转录酶
在本发明中有用的逆转录酶可以是任何表现出逆转录酶活性的聚合酶。优选的酶包括那些表现出降低的RNA酶H活性的酶。几种逆转录酶在本领域是已知的，并且可以商购(例如，来自勃林格殷格翰公司(Boehringer Mannheim Corp.)，印第安纳州印第安纳波利斯；生命科技公司(Life Technologies，Inc.)，马里兰州罗克维尔市；新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs，Inc.)，马萨诸塞州贝弗利；铂金埃尔默公司(Perkin ElmerCorp.)，康涅狄克州诺瓦克；法玛西亚LKB生物技术有限公司(Pharmacia LKBBiotechnology，Inc.)，新泽西州皮斯卡塔韦；凯杰公司(Qiagen，Inc.)，加利福尼亚州瓦伦西亚；司查塔基公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉由拉)。在一些实施方式中，逆转录酶可以是禽成髓细胞增多症病毒逆转录酶(AMV-RT)、莫罗尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)、人类免疫病毒逆转录酶(HIV-RT)、EIAV-RT、RAV2-RT、生氢氧化碳嗜热菌(C.hydrogenoformans)DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、SUPERSCRIPT I、SUPERSCRIPT II以及其突变体、变体和衍生物。应理解，各种逆转录酶可用于本发明，包括上文未具体公开的逆转录酶，而不偏离本文公开的范围或优选的实施方式。
C.DNA聚合酶
可用于本发明的DNA聚合酶可以是能够复制DNA分子的任何聚合酶。优选的DNA聚合酶是热稳定聚合酶，它在PCR中特别有用。热稳定聚合酶分离自多种嗜热细菌，例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)、布氏栖热菌(Thermus brockianus)(Tbr)、黄栖热菌(Thermus flavus)(Tfl)、红色栖热菌(Thermus ruber)(Tru)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)和嗜热球菌属(Thermococcus genus)的其他种，嗜酸热原体菌(Thermoplasma acidophilum)(Tac)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)(Tne)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)(Tma)和热袍菌属(Thermotoga genus)的其他种，激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)和火球菌属(Pyrococcus genus)的其他种，嗜热芽孢杆菌(Bacillus sterothemophilus)(Bst)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)(Sac)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Sso)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)(Poc)、阿比热网菌(Pyrodictium abyssi)(Pab)和嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)，及其突变体、变体或衍生物。
许多DNA聚合酶在本领域是已知的，并且可以商购(例如，来自勃林格殷格翰公司(Boehringer Mannheim Corp.)，印第安纳州印第安纳波利斯；生命科技公司(LifeTechnologies，Inc.)，马里兰州罗克维尔市；新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs，Inc.)，马萨诸塞州贝弗利；铂金埃尔默公司(Perkin Elmer Corp.)，康涅狄克州诺瓦克；法玛西亚LKB生物技术有限公司(Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.)，新泽西州皮斯卡塔韦；凯杰公司(Qiagen，Inc.)，加利福尼亚州瓦伦西亚；司查塔基公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉由拉)。在一些实施方式中，DNA聚合酶可以是Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENTTM、DEEPVENTTM及其活性突变体、变体或衍生物。应理解，各种DNA聚合酶可用于本发明，包括上文未具体公开的DNA聚合酶，而不偏离本发明的范围或其优选的实施方式。
逆转录酶可以与DNA聚合酶以任何适当的比率存在。在一些实施方式中，单位活性的逆转录酶比DNA聚合酶的比率大于或等于3。本领域技术人员应理解，其他逆转录酶比DNA聚合酶的比率可用于本发明中。
D.用于改进逆转录效率的添加剂
在某些方面，提供添加剂以改进逆转录效率、改进抑制剂耐受性和/或防止RNA降解。因此，添加剂可用于逆转录和PCR扩增反应，例如qPCR。包含添加剂的反应混合物可包含其他组分，例如聚合酶和/或逆转录酶。在反应混合物中包含添加剂足以产生效率接近100％的RT-qPCR结果，而且与缺乏添加剂的对照混合物相比，至少高10％、或40％或50％或100％。这些添加剂，例如泊洛沙姆188、组氨酸(例如组氨酸盐酸盐一水化物)、谷氨酸和/或其盐，减少了由肝素、福尔马林和/或单宁酸造成的扩增反应的抑制。在本发明的一些方面，添加剂，例如PVSA或其盐，可以在存在或不存在肝素、福尔马林和/或单宁酸的情况下改进扩增反应的效率。
在一些实施方式中，添加剂是组氨酸或组氨酸盐酸盐一水化物，且可以被包含在扩增反应中以改进RT效率，特别是在存在福尔马林和/或肝素的情况下。在本发明的方法中，已经发现毫摩尔浓度的组氨酸和/或组氨酸盐酸盐一水化物对改进扩增反应的反应效率有效。浓度为约0.01mM至约100mM的组氨酸或组氨酸盐酸盐一水化物被用于本发明的方法和试剂盒中。在更进一步的实施方式中，组氨酸或组氨酸盐酸盐一水化物的浓度约1mM至约50mM、约5mM至约40mM、约2.5mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM或约15mM至约20mM被用于本发明的方法和试剂盒。如图3所示，与缺乏组氨酸的对照相比，向含有福尔马林的反应混合物中添加组氨酸改进了扩增反应的效率。
在一些实施方式中，添加剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188，其被包含于扩增反应混合物以改进效率，尤其是在存在单宁酸的情况下。在本发明的方法中，泊洛沙姆被以反应混合物的约0.01％至约5％(v/v)的量添加。在各种实施方式中，泊洛沙姆以约0.05％至约4％、约0.1％至约3％、约0.25％至约2％、约0.3％至约1％、约0.3％至约0.75％或约0.3％至约0.6％或约0.5％(v/v)的量添加。如图4所示，与缺乏泊洛沙姆的对照组相比，向含有单宁酸的反应混合物添加泊洛沙姆改进了扩增反应的效率。存在于反应混合物中的泊洛沙姆的浓度/量以泊洛沙姆含量v/v％提供。
在更进一步的实施方式中，谷氨酸或其盐类(例如铵盐、钙盐、镁盐、单钠盐和/或钾盐)可以被包含于扩增反应中以改进效率，尤其是在存在肝素的情况下。例如，谷氨酸钾在扩增反应混合物中以约5mM至约250mM、约10mM至约400mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约15mM至约400mM、约15mM至约300mM、约15mM至约250mM、约15mM至约200mM或约15mM至约150mM的浓度存在。
在其他实施方式中，PVSA被包含于扩增反应中以改进RT效率和/或敏感性。PVSA可以以约0.0001％至约0.002％、约0.0001％至约0.005％、约0.0001％至约0.004％、约0.0001％至约0.003％、约0.0001％至约0.002％或约0.0001％至约0.001％的浓度(v/v)提供。存在于反应混合物中的PVSA的浓度/量以PVSA含量v/v％提供。
为了增强RT，可以被提供给反应混合物的另一种添加剂是如本文所述的一种或多种寡核苷酸引物。公开的一种或多种寡核苷酸可用于与其他公开的添加剂组合或单独使用。这些寡核苷酸引物长度为五(5)至十二(12)个核苷酸，并且包含选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的随机核苷酸。因此，该寡核苷酸引物包含：X1-X2-X3-X4-X5、X1-X2-X3-X4-X5-X6、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)或X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)的序列。如果需要，引物可以在寡核苷酸内的任何位置含有一个或多个硫代磷酸酯键。例如，可以在寡核苷酸的5’或3’末端的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间引入一个或多个硫代磷酸酯键。或者，可以在寡核苷酸的5’和3’末端的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间引入一个或多个硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，寡核苷酸引物是随机的。其他实施方式提供的寡核苷酸引物具有高GC或高AT含量。出于本申请的目的，高GC含量引物中的至少60％的核苷酸是G和/或C。同样，高AT含量引物中至少60％的核苷酸是A和/或T。
某些实施方式提供了：
a)X1-X2-X3-X4-X5寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于五个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于五个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
b)X1-X2-X3-X4-X5-X6寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于六个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于六个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
c)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于七个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于七个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
d)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于八个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于八个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
e)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于九个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于九个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
f)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于十个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于十个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
g)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于十一个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于十一个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
h)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)寡核苷酸序列，其为：a)随机排列的A和T核苷酸；b)随机排列的G和C核苷酸；c)至少一个但少于十二个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或d)至少一个但少于十二个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸。
在某些实施方式中，寡核苷酸序列为dWn，其中W为A或T并且n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数。其他实施方式提供寡核苷酸序列dSn，其中S为G或C并且n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数。而其他实施方式提供寡核苷酸序列dAn、dGn、dCn或dTn，其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数。而其他实施方式提供随机寡核苷酸序列Xn(称为RXn)，其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数且X为公开于H小节的任何核苷酸，例如dNTP、dA、dC、dG或dT。任何公开的寡核苷酸的各种组合可以被添加到反应混合物中以增强RT。此外，添加到反应混合物中的引物的浓度可以介于约1μM至约1000μM、约2.5μM至约750μM、5μM至约500μM、5μM至约250μM、约5μM至约100μM、10μM至约500μM、10μM至约250μM、10μM至约100μM或10μM至约50μM。
关于一种或多种寡核苷酸用于增强逆转录酶活性的用途，该方法包括向包含本文公开的一种或多种寡核苷酸的反应混合物中添加RNA模板，并孵育该混合物以合成模板RNA的全部或部分互补DNA。任何寡核苷酸的组合可用于这种方法。例如，反应混合物可包含RXn和dWn；RXn和dSn、RXn和dWn、RXn、dSn和dWn、RXn和dTn、RXn、dSn和dTn或RXn、dTn、dWn和dSn，其中用于给定寡核苷酸的每个n独立地选自选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数。在某些实施方式中，n独立地选自5、6、7、8或9。在其他实施方式中，n独立地选自6或7。
除了包含上文所述各自浓度的添加剂的反应混合物之外，本发明还提供包含全部或一些以上添加剂的储备溶液，其中储备溶液中的所有成分为2X、3X、5X、10X、20X、25X、50X、100X或上述浓度的其他倍数，以便少量的储备溶液可作为最终反应混合物总体积的一部分加入。例如，在一些实施方式中，本文所述的添加剂的储备溶液可以包含聚合酶、核苷酸(例如dNTP)和/或缓冲液。
本发明的某些实施方式提供包含肝素、福尔马林、单宁酸或其任意组合的扩增反应混合物。替代性实施方式提供其中不存在肝素、福尔马林和单宁酸的扩增反应混合物。
E.使用本发明的组合物的扩增反应
如本文所讨论的，本发明涉及扩增反应，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、DNA连接酶链反应(LCR)、QBeta RNA复制酶和基于RNA转录(例如TAS和3SR)的扩增反应以及如本领域技术人员已知的其他扩增反应。可以使用本文所述的组合物进行的聚合酶链反应包括但不限于反应混合物中的逆转录PCR(RT-PCR)和定量PCR(qPCR)。
当本发明的组合物是扩增反应的成分时，扩增反应(例如聚合酶链式反应(PCR)方法)显示出改进的效率和特异性。通常，本文所讨论的“效率”由在给定反应条件下产生的产物量表示。例如，在高效的实时PCR反应中，PCR产物应该在每个循环中翻倍。如本领域已知的，不同种扩增反应的效率可以使用不同的方法计算。例如，PCR的指数扩增通常使用方程Xn＝Xo*(1+Ex)n(I)确定，其中Xn是第n个循环时的目标分子数，Xo是目标分子的初始数，Ex是目标扩增的效率，n为循环数。由于本发明的某些方面，效率和特异性的改进可以使用本领域已知的试验来鉴定和量化。
F.反应混合物
本发明还提供了反应混合物，其包含一种或多种本发明的添加剂和以下至少之一：逆转录酶；聚合酶；一种或多种dNTP；包含目标核酸的生物学样品。还如本文所讨论的，反应混合物可包含肝素、福尔马林、单宁酸或其各种组合。替代性实施方式提供其中不存在肝素、福尔马林和单宁酸的反应混合物。
G.试剂盒
一方面，本发明提供用于进行核酸扩增反应的试剂盒。在一些实施方式中，这种试剂盒包括聚合酶和任选的dNTP，以及至少一种含有如本文所公开的添加剂的缓冲液。试剂盒还可包含一个或多个引物以及使用试剂盒成分进行核酸扩增反应的说明书。
在一些方面，本发明的试剂盒包含的说明书将包括典型扩增方案，其包括以下步骤：95-98℃约30秒至约2分钟40个循环(95-98℃约1至约5秒，60℃约1至约5秒，检测步骤)和约60℃至约95℃的解链循环。应理解，可以使用本领域公知的参数改变上述示例性方案，以优化核酸扩增反应，以优化不同目标核酸的效率和特异性的条件。例如，更长的目标核酸的扩增可能需要更长的孵育时间和/或更高的温度以进行高效和特异性的扩增。
H.核苷酸碱基
可用于本发明的核苷酸碱基可以是可用于核酸聚合的任何核苷酸。核苷酸可以是天然的、稀有的、修饰的、衍生的、或者人工的。核苷酸可以未标记的，或者可以通过本领域技术人员已知的方法可检测地标记(例如采用放射性同位素、维生素、荧光部分或化学发光部分，地高辛(dioxigenin))。优选地，核苷酸是脱氧核苷三磷酸、dNTP(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-硫代-dNIT、生物素-dUTP、荧光素-dUTP、地高辛-dUTP、7-脱氮-dGTP)。dNTP也是本领域公知的，并且可以商购自供应商(例如，从勃林格殷格翰公司，印第安纳州印第安纳波利斯；新英格兰生物实验室公司，马萨诸塞州贝弗利；法玛西亚LKB生物技术有限公司，新泽西州皮斯卡塔韦)。
本发明的核苷酸可以以任何浓度存在。在一些实施方式中，核苷酸可以以约1μM至约1000μM的量存在。在其他实施方式中，核苷酸可以以约10μM至约750μM的量存在。在另外的其他实施方式中，核苷酸可以以约100μM至约500μM的量存在。本领域技术人员将理解，其他浓度的核苷酸可用于本发明。
I.缓冲剂和盐
可用于本发明的缓冲剂和盐提供合适于核酸合成(例如适于逆转录酶和DNA聚合酶活性)的稳定pH和离子条件。可用于本发明的多种缓冲液和盐溶液和改进型缓冲液是本领域已知的，包括本领域未具体公开的试剂。优选的缓冲剂包括但不限于：TRIS、TRICINE、BIS-TRICINE、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES、CAPS。优选的盐溶液包括但不限于以下的溶液：乙酸钾、硫酸钾、氯化钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂和乙酸锂。
本发明的缓冲剂可以以任何浓度存在。在一些实施方式中，缓冲液以约0.1mM至约1000mM的量存在。在其他实施方式中，缓冲液以约1mM至约500mM的量存在。在另外的其他实施方式中，缓冲液以约5mM至约250mM的量存在。本领域技术人员将理解，其他浓度的缓冲液可用于本发明。
各种非限制性实施方式包括：
1.一种反应混合物，其包含逆转录酶和一种或多种的添加剂，选自谷氨酸或其盐、泊洛沙姆188、组氨酸或其盐和聚乙烯磺酸(PVSA)，以及一种或多种选自以下的寡核苷酸：X1-X2-X3-X4-X5、X1-X2-X3-X4-X5-X6、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)或X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)；
2.如实施方式1所述的反应混合物，其中所述添加剂是：a)谷氨酸或其盐；b)组氨酸或其盐；c)泊洛沙姆188；d)PVSA；e)谷氨酸或其盐和组氨酸或其盐；f)谷氨酸或其盐和泊洛沙姆188；g)谷氨酸或其盐和PVSA；h)组氨酸或其盐和泊洛沙姆188；i)组氨酸或其盐和PVSA；j)泊洛沙姆188和PVSA；k)谷氨酸或其盐、组氨酸或其盐和泊洛沙姆188；l)谷氨酸或其盐、组氨酸或其盐和PVSA；m)组氨酸或其盐、泊洛沙姆188和PVSA；n)谷氨酸或其盐、组氨酸或其盐、泊洛沙姆188和PVSA；或o)谷氨酸或其盐、泊洛沙姆188和PVSA；
3.如实施方式1或2所述的反应混合物，其中所述谷氨酸盐为谷氨酸钾且组氨酸盐为组氨酸HCl一水化物。
4.如实施方式1-3中任一项所述的反应混合物，其中：
a)泊洛沙姆以约0.01％至约5％的量(v/v％)存在；
b)组氨酸或其盐以约1mM至约50mM、约5mM至约40mM、约2.5mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM或约15mM至约20mM的浓度存在；
c)谷氨酸或其盐以约5mM至约250mM、约10mM至约400mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约15mM至约400mM、约15mM至约300mM、约15mM至约250mM、约15mM至约200mM或约15mM至约150mM的浓度存在；和/或
d)PVSA以约0.0001％至约0.002％、约0.0001％至约0.005％、约0.0001％至约0.004％、约0.0001％至约0.003％、约0.0001％至约0.002％或约0.0001％至约0.001％的量(v/v％)存在。
5.如实施方式1所述的反应混合物，其中所述添加剂是一种或多种寡核苷酸。
6.如实施方式5所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述一种或多种寡核苷酸内的任何位置处含有一个或多个硫代磷酸酯键。
7.如实施方式6所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’末端、3’末端或5’和3’末端两者的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间含有一个或多个硫代磷酸酯键。
8.如实施方式1、5、6或7所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是选自A、G、T和C的核苷酸的随机序列。
9.如实施方式1、5、6、7或8所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是：
a)X1-X2-X3-X4-X5寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于五个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于五个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
b)X1-X2-X3-X4-X5-X6寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于六个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于六个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
c)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于七个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于七个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
d)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于八个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于八个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
e)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于九个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于九个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
f)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
g)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十一个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十一个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；或
h)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十二个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十二个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸。
10.如实施方式1、5、6、7、8或9所述的反应混合物，其中所述寡核苷酸具有高GC含量且至少60％的核苷酸是G和/或C，或寡核苷酸具有高AT含量且至少60％的所述核苷酸是A和/或T。
11.如实施方式2、3或4所述的反应混合物，其中所述反应混合物进一步包含一种或多种寡核苷酸作为添加剂。
12.如实施方式11所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸内的任何位置处含有一个或多个硫代磷酸酯键。
13.如实施方式12所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’末端、3’末端或5’和3’末端两者的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间含有一个或多个硫代磷酸酯键。
14.如实施方式11、12或13所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是选自A、G、T和C的核苷酸的随机序列。
15.如实施方式11、12或13所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是：
a)X1-X2-X3-X4-X5寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于五个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于五个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
b)X1-X2-X3-X4-X5-X6寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于六个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于六个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
c)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于七个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于七个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
d)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于八个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于八个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
e)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于九个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于九个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
f)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
g)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十一个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十一个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；或
h)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十二个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十二个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸。
16.如实施方式11-15所述的反应混合物，其中所述一种或多种所述寡核苷酸具有高GC含量且至少60％的核苷酸是G和/或C，或所述一种或多种寡核苷酸具有高AT含量且至少60％的所述核苷酸是A和/或T。
17.如实施方式1或5-16中任一项所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸选自：dWn(其中W是A或T且n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数)、dSn(其中S是G或C且n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数)、dAn(其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数)、dGn(其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数)、dCn(其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数)、dTn(其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数)或dWn、dSn、dAn、dGn、dCn和dTn的任意组合。
18.如实施方式17所述的反应混合物，其中所述任何一种或多种寡核苷酸的浓度为0.1μM至约1000μM、约2.5μM至约750μM、约5μM至约500μM、约5μM至约250μM、约5μM至约100μM、约10μM至约500μM、约10μM至约250μM、约10μM至约100μM或约10μM至约50μM。
19.如前述实施方式任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物包含一种或多种以下的RT抑制剂：肝素、福尔马林和/或单宁酸。
20.如实施方式1-18中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物不包含肝素、福尔马林和/或单宁酸。
21.一种减少福尔马林对逆转录酶抑制的方法，其中所述方法包括：向实施方式1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，并合成部分或全部所述模板RNA的互补DNA，所述反应混合物包含福尔马林和至少组氨酸和/或其盐作为添加剂。
22.一种减少肝素对逆转录酶抑制的方法，其中所述方法包括：向实施方式1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，并合成部分或全部所述模板RNA的互补DNA，所述反应混合物包含肝素和至少组氨酸和/或其盐和/或谷氨酸和/或其盐作为添加剂。
23.一种减少单宁酸对逆转录酶抑制的方法，其中所述方法包括：向实施方式1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，并合成部分或全部所述模板RNA的互补DNA，所述反应混合物包含单宁酸和至少泊洛沙姆188作为添加剂。
24.一种改进逆转录酶效率和敏感性的方法，其中所述方法包括：向实施方式1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，以合成所述模板RNA的全部或部分的互补DNA，所述反应混合物包含PVSA作为添加剂。
25.一种增强逆转录酶活性的方法，其中所述方法包括：向反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，以合成所述模板RNA的全部或部分的互补DNA，所述反应混合物包含如实施方式5-10任一项所定义的一种或多种寡核苷酸作为添加剂。
26.如实施方式25所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸为选自以下的寡核苷酸的组合：
a)RXn和dWn；
b)RXn和dSn；
c)RXn、dWn和dSn；
d)RXn和dTn；
e)RXn、dTn和dSn；或
f)RXn、dTn、dWn和dSn，
其中给定寡核苷酸的每个n独立地选自选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数。
27.如实施方式26所述的方法，其中对于每个寡核苷酸，每个n独立地选自5、6、7、8或9。在其他实施方式中，n独立地选自6或7。
28.如实施方式27所述的方法，其中对于每个寡核苷酸，每个n独立地选自6或7。
29.如实施方式25-28中任一项所述的方法，所述反应进一步包含如实施方式1-4中任一项所述的添加剂。
30.如实施方式25-28中任一项所述的方法，所述一种或多种寡核苷酸在所述一种或多种寡核苷酸内的任何位置处含有一个或多个硫代磷酸酯键。
31.如实施方式30所述的方法，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’末端、3’末端或5’和3’末端两者的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间含有一个或多个硫代磷酸酯键。
本文所引用或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物(包括所有附图和表格)均通过引用全文并入本文，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾即可。
以下是说明实施本发明的流程的实施例。这些实施例不应被理解为限制。除非另有说明，所有的百分比都是按重量计的，所有的溶剂混合物比例都是按体积计的。
应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
实施例1.示例性RT-qPCR混合物
配制RT反应缓冲液，以便在与热稳定RT(例如，MMLV或工程化改造的MMLV)和RNA模板(例如Hela RNA)混合在一起后可以进行RT反应。在20μl RT反应混合物中，有1u RT酶、10u Rnasin(RNA酶抑制剂)、核苷酸每种1.5mM(例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、随机六聚体、寡聚dT或适当浓度(0.5至1uM)的基因特异性寡核苷酸、4％甘油、0.01％去污剂(例如，Tween 20)、有或没有RT抑制剂(例如肝素、乙醇、盐酸胍、福尔马林、单宁酸等)或改进RT反应效率或敏感性的添加剂(例如PVSA)。RT反应在T100 Thermo Cycler(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories Inc.)加利福尼亚州赫拉克勒斯)中完成。RT反应方案如下：50℃20分钟、95℃1分钟，4℃孵育。
RT反应之后，RT产物被用于qPCR反应，使用SsoAdvanced通用SYBR GreenSupermix(伯乐实验室公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯)。在qPCR反应中RT产物的输入量为qPCR反应的10％至0.1％，取决于目标基因的表达丰度。使用250nM的目标基因引物(表3)。在CFC348 Thermo Cycler(伯乐实验室公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯)上使用qPCR的下述方案：95℃变性2分钟，40个循环的95℃变性5S、60℃退火/延伸/读取30S。qPCR反应后，比较具有和不具有抑制剂的RT产物的Cq值，当存在抑制剂时，通常Cq值会被延迟(数值较大)。相对于无抑制剂的RT产物，Cq值越大，观察到的对RT反应的抑制就越大。
实施例2.K-Glu对肝素耐受性的影响
与不含肝素的RT产物相比，当在RT反应中加入0.003u/μl抑制剂肝素(西格玛公司(Sigma),H3149)时，该RT产物的qPCR被大大延迟了。GAPDH和18S都显示出相似的结果。与不含肝素的RT产物相比，当在含有肝素的RT反应中加入100mM谷氨酸钾(西格玛公司,C1149)时，该RT产物的qPCR结果没有显示太多延迟。这表明RT反应中谷氨酸钾改进了其对肝素的耐受性。其他盐(例如，(NH4)2SO4)也可以改进肝素耐受性，但它们可能会损害其他抑制剂耐受性(例如，乙醇、盐酸胍，Calbiochem，369075)。
实施例3.泊洛沙姆对单宁酸耐受性的影响
与不含单宁酸的RT产物相比，当在RT反应中加入0.1μg/μl抑制剂单宁酸(西格玛公司,403040)时，该RT产物的qPCR结果被大大延迟了。在qPCR反应中检测到人GAPDH目标基因。与不含单宁酸的RT产物相比，当0.5％泊洛沙姆(西格玛公司,P5556)被加入含有相同浓度单宁酸的RT反应中时，该RT产物的qPCR结果没有显示太多延迟。这表明泊洛沙姆有效地改进了对单宁酸的RT耐受性。
实施例4.His-HCl对福尔马林耐受性的影响
与不含福尔马林的RT产物相比，当在RT反应中加入0.125％福尔马林(EMD,R04586-76)时，该RT产物的qPCR结果被显著延迟了。在qPCR反应中检测到人GAPDH目标基因。与不含福尔马林的RT产物相比，当15至20mM His-HCl(西格玛公司,H8125)被加入含有相同浓度福尔马林的RT反应中时，该RT产物的qPCR结果没有显示出很大的延迟。这表明His-HCl有效地改进了对福尔马林的RT耐受性。
实施例5.PVSA(聚乙烯磺酸)对RT产量和敏感性的影响
与含有0.0003％PVSA(西格玛公司,278424)的RT产物相比，当RT反应中的RNA输入有限(RNA模板低输入)且不含PVSA时，该RT产物的qPCR结果显著延迟。在qPCR反应中检测到人GAPDH目标基因。
实施例6.高和低GC目标的逆转录的增强
与不添加用于低或高GC目标(表3中的目标基因)的低/高GC的RT产物相比，在添加低/高GC随机引物的RT反应中，该RT产物的qPCR结果显著改进(更早的Cq，更小的Cq值)。
表1.高和低GC目标的逆转录的增强。仅使用随机六聚体或添加不同的低/高GC随机引物进行逆转录。cDNA通过qPCR定量。dCq是在逆转录中仅使用随机引物和逆转录中添加低/高GC随机引物的条件之间计算的；dCq(-Cq(RH)-Cq(测试条件)。负dCq值表示测试条件的Cq更早和逆转录增强。RH:DNA随机六聚体；dW7；寡聚dW七聚体(septamer)；dS6；寡聚dS六聚体。dT6：寡聚dT六聚体。所用的寡核苷酸浓度已标明。*：-0.5≥dCq≥-0.9；**：dCq≤-0.91。
Figure BDA0003432633320000251
表2.不同目标RNA的GC含量
GC含量(％)
NGFRAP198 40
SNRPE109 35.8
TXN192 29
RHPN2 27
SBNO2 GC3 74.8
CBP hgc1 78.5
CBP hgc2 81.7
CBP hgc3 78.3
表3.本申请的研究中使用的引物序列
Figure BDA0003432633320000261
Figure BDA0003432633320000271
序列表
<110> 生物辐射实验室股份有限公司(Bio-Rad Laboratories, Inc.)
<120> 用于增强逆转录酶活性和/或减少逆转录酶抑制的组合物和方法
<130> BRL.133XPCT
<150> US 62/866,182
<151> 2019-06-25
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
gaaggtgaag gtcggagtc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
aggaattccc agtaagtgcg 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
gcctcactaa accatccaa 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
agctctctaa tcaccatgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
aatagaagct ggcaacacaa 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
tgatgcagaa gagattcatt ctaa 24
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
tcatttctag ttggagacac t 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
attcagacat gagacggttt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
aaagcttgaa gccaccatta 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
gccatatttc atatcttcaa cact 24
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
agaaacctct aggaattagt ga 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
gaagttgatg tcgcagccct 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
acttctcttt cccggcgc 18
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gttgctgtgg ctgagatttg g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
cattttcacc tgctcgcgaa 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gttgctgtgg ctgagatttg g 21
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
aacagccccg ggcac 15
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
gttgctgtgg ctgagatttg g 21
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
agggagagga gcgagc 16
<210> 21
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(10)
<223> n为a、c、g或t
<400> 21
nnnnnnnnnn 10
<210> 22
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(11)
<223> n为a、c、g或t
<400> 22
nnnnnnnnnn n 11
<210> 23
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> misc_特征
<222> (1)..(12)
<223> n为a、c、g或t
<400> 23
nnnnnnnnnn nn 12

Claims (31)

1.一种反应混合物，其包含逆转录酶和一种或多种添加剂，所述添加剂选自：谷氨酸或其盐、泊洛沙姆188、组氨酸或其盐和聚乙烯磺酸(PVSA)，以及一种或多种选自以下的寡核苷酸：X1-X2-X3-X4-X5、X1-X2-X3-X4-X5-X6、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)或X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)。
2.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述添加剂是：
a)谷氨酸或其盐；
b)组氨酸或其盐；
c)泊洛沙姆188；
d)PVSA；
e)谷氨酸或其盐和组氨酸或其盐；
f)谷氨酸或其盐和泊洛沙姆188；
g)谷氨酸或其盐和PVSA；
h)组氨酸或其盐和泊洛沙姆188；
i)组氨酸或其盐和PVSA；
j)泊洛沙姆188和PVSA；
k)谷氨酸或其盐，组氨酸或其盐和泊洛沙姆188；
l)谷氨酸或其盐，组氨酸或其盐和PVSA；
m)组氨酸或其盐，泊洛沙姆188和PVSA；或
n)谷氨酸或其盐，组氨酸或其盐，泊洛沙姆188和PVSA；或
o)谷氨酸或其盐，泊洛沙姆188和PVSA。
3.如权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述谷氨酸盐为谷氨酸钾，所述组氨酸盐为组氨酸HCl一水化物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的反应混合物，其中：
a)泊洛沙姆以约0.01％至约5％的量(v/v％)存在；
b)组氨酸或其盐以约1mM至约50mM、约5mM至约40mM、约2.5mM至约30mM、约5mM至约30mM、约10mM至约30mM、约10mM至约25mM或约15mM至约20mM的浓度存在；
c)谷氨酸或其盐以约5mM至约250mM、约10mM至约400mM、约10mM至约300mM、约10mM至约250mM、约10mM至约200mM、约10mM至约150mM、约15mM至约400mM、约15mM至约300mM、约15mM至约250mM、约15mM至约200mM或约15mM至约150mM的浓度存在；和/或
d)PVSA以约0.0001％至约0.002％、约0.0001％至约0.005％、约0.0001％至约0.004％、约0.0001％至约0.003％、约0.0001％至约0.002％或约0.0001％至约0.001％的量(v/v％)存在。
5.如权利要求1所述的反应混合物，其中所述添加剂是一种或多种寡核苷酸。
6.如权利要求5所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述一种或多种寡核苷酸内的任何位置处含有一个或多个硫代磷酸酯键。
7.如权利要求6所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’末端、3’末端或5’和3’末端两者的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间含有一个或多个硫代磷酸酯键。
8.如权利要求1、5、6或7所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是选自A、G、T和C的核苷酸的随机序列。
9.如权利要求1、5、6、7或8所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是：
a)X1-X2-X3-X4-X5寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于五个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于五个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
b)X1-X2-X3-X4-X5-X6寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于六个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于六个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
c)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于七个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于七个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
d)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于八个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于八个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
e)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于九个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于九个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
f)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
g)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十一个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十一个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；或
h)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十二个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十二个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸。
10.如权利要求1、5、6、7、8或9所述的反应混合物，其中所述寡核苷酸具有高GC含量且至少60％的核苷酸是G和/或C，或寡核苷酸具有高AT含量且至少60％的所述核苷酸是A和/或T。
11.如权利要求2、3或4所述的反应混合物，其中所述反应混合物进一步包含一种或多种寡核苷酸作为添加剂。
12.如权利要求11所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸内的任何位置处含有一个或多个硫代磷酸酯键。
13.如权利要求12所述的反应混合物，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’末端、3’末端或5’和3’末端两者的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间含有一个或多个硫代磷酸酯键。
14.如权利要求11、12或13所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是选自A、G、T和C的核苷酸的随机序列。
15.如权利要求11、12或13所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸是：
a)X1-X2-X3-X4-X5寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于五个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于五个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
b)X1-X2-X3-X4-X5-X6寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于六个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于六个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
c)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于七个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于七个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
d)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于八个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于八个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
e)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于九个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于九个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
f)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO:21)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；
g)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:22)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十一个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十一个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸；或
h)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12(SEQ ID NO:23)寡核苷酸序列，其为：i)随机排列的A和T核苷酸；ii)随机排列的G和C核苷酸；iii)至少一个但少于十二个核苷酸随机地选自：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的G和C核苷酸；或iv)至少一个但少于十二个核苷酸是随机地选自下组：A、G、T和C，而剩余的核苷酸是随机选择的A和T核苷酸。
16.如权利要求11-15任一项所述的反应混合物，其中所述一种或多种所述寡核苷酸具有高GC含量且至少60％的核苷酸是G和/或C，或所述一种或多种寡核苷酸具有高AT含量且至少60％的所述核苷酸是A和/或T。
17.如权利要求1或5-16中任一项所述的反应混合物，其中所述一种或多种寡核苷酸选自：dWn，其中W是A或T且n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数；dSn，其中S是G或C且n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数；dAn，其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数；dGn，其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数；dCn，其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数；dTn，其中n为选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数；或dWn、dSn、dAn、dGn、dCn和dTn的任意组合。
18.如权利要求17所述的反应混合物，其中所述任何一种或多种寡核苷酸的浓度为0.1μM至约1000μM、约2.5μM至约750μM、约5μM至约500μM、约5μM至约250μM、约5μM至约100μM、约10μM至约500μM、约10μM至约250μM、约10μM至约100μM或约10μM至约50μM。
19.如前述权利要求任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物包含一种或多种以下的RT抑制剂：肝素、福尔马林和/或单宁酸。
20.如权利要求1-18中任一项所述的反应混合物，其中所述反应混合物不包含肝素、福尔马林和/或单宁酸。
21.一种减少福尔马林对逆转录酶抑制的方法，其中所述方法包括向权利要求1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，并合成部分或全部所述模板RNA的互补DNA，所述反应混合物包含福尔马林和至少组氨酸和/或其盐作为添加剂。
22.一种减少肝素对逆转录酶抑制的方法，其中所述方法包括向权利要求1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，并合成部分或全部所述模板RNA的互补DNA，所述反应混合物包含肝素和至少组氨酸和/或其盐和/或谷氨酸和/或其盐作为添加剂。
23.一种减少单宁酸对逆转录酶抑制的方法，其中所述方法包括向权利要求1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，并合成部分或全部所述模板RNA的互补DNA，所述反应混合物包含单宁酸和至少泊洛沙姆188作为添加剂。
24.一种改进逆转录酶效率和敏感性的方法，其中所述方法包括向权利要求1-19中任一项所述的反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，以合成所述模板RNA的全部或部分的互补DNA，所述反应混合物包含PVSA作为添加剂。
25.一种增强逆转录酶活性的方法，其中所述方法包括向反应混合物中加入RNA模板，孵育所述混合物，以合成所述模板RNA的全部或部分的互补DNA，所述反应混合物包含如权利要求5-10任一项所定义的一种或多种寡核苷酸作为添加剂。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸为选自以下的寡核苷酸的组合：
a)RXn和dWn；
b)RXn和dSn；
c)RXn、dWn和dSn；
d)RXn和dTn；
e)RXn、dTn和dSn；或
f)RXn、dTn、dWn和dSn
其中给定寡核苷酸的每个n独立地选自选自5、6、7、8、9、10、11或12的整数。
27.如权利要求26所述的方法，其中对于每个寡核苷酸，每个n独立地选自5、6、7、8或9，在其他实施方式中，n独立地选自6或7。
28.如权利要求27所述的方法，其中对于每个寡核苷酸，每个n独立地选自6或7。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，所述反应进一步包含如权利要求1-4中任一项所述的添加剂。
30.如权利要求25-28中任一项所述的方法，所述一种或多种寡核苷酸在所述一种或多种寡核苷酸内的任何位置处含有一个或多个硫代磷酸酯键。
31.如权利要求30所述的方法，所述一种或多种寡核苷酸在所述寡核苷酸的5’末端、3’末端或5’和3’末端两者的最末、倒数第二和/或倒数第三个核苷酸之间含有一个或多个硫代磷酸酯键。
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