JP2021052598A - 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[項1] RT−RamDA反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、RT−RamDA反応液において鋳型RNA及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。
[項2] RT−RamDA反応に供する鋳型RNA含有生体試料を、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理することにより、カオトロピック剤を含む鋳型RNA含有生体試料液を調製し、該カオトロピック剤を含む鋳型RNA含有生体試料液とRT−RamDA反応液とを混合することにより、RT−RamDA反応液中で鋳型RNA及びカオトロピック剤を共存させる、項1に記載の方法。
[項3] 前記RT−RamDA反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が0mMより多く50mM以下である、項1又は2に記載の方法。
[項4] 前記RT−RamDA反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が0mMより多く20mM以下である、項1から3のいずれかに記載の方法。
[項5] 前記カオトロピック剤がグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種類のカオトロピック剤である項1から4のいずれかに記載の方法。
[項6] 前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩である項1から5のいずれかに記載の方法。
[項7] 前記カオトロピック剤がグアニジンチオシアン酸塩である項1から6のいずれかに記載の方法。
[項8] 前記RT−RamDA反応液が更に無機塩を含む、項1から7のいずれかに記載の方法。
[項9] 前記無機塩が、カリウム塩、マンガン塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも1種である、項8に記載の方法。
[項10] RT−RamDA反応の安定化方法であって、RT−RamDA反応液において鋳型RNA及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする、方法。
[項11] カオトロピック剤を含有するRT−RamDA反応液を含む、項1から10のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
[項12] カオトロピック剤を含有する細胞溶解液を含む、項1から10のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
RT−RamDA法とは、鋳型RNA、プライマー、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、RNase Hマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。従って、本発明におけるRT−RamDA反応液は少なくとも上記の各成分(即ち、鋳型RNA、プライマー、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、RNase Hマイナス型逆転写酵素、及び基質)を含むものである。RT−RamDA法では、RNase Hマイナス型逆転写酵素のRNA依存性DNAポリメラーゼ活性により鋳型RNAの相補鎖DNA(cDNA)を合成し、RNAとcDNAとのハイブリッド鎖のうちのcDNA鎖をDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、RNase Hマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により3’側のcDNA鎖がRNAから剥がされ、RNase Hマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなcDNA鎖が合成される。RT−RamDA法の詳細については、米国特許出願公開公報2017/0275685(参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)等に記載されている。
本明細書において、非特異的な核酸増幅が抑制されているかどうかの判断基準としては、例えば、カオトロピック剤を使用していない場合と比較して、RT−RamDA反応液中にカオトロピック剤を共存させた場合に、初期鋳型量とCt値との間での直線関係が改善すること、及び/又はPCR効率が改善すること(例えば、PCR効率がより100%に近付くこと)が挙げられる。
本発明においては、RT−RamDA反応液中にカオトロピック剤を共存させることを一つの特徴とする。カオトロピック剤は、水素結合、ファンデルワールス力および疎水性効果などの非共有結合力により仲介される分子間相互作用の安定化を阻害する成分をいう。そのためカオトロピック剤は、タンパク質、DNA、またはRNAなどの巨大分子の三次元構造を破壊し、それらを変性させることが可能である。従って、過剰量のカオトロピック剤の使用は、RT−RamDA反応に影響を与えることも懸念される。しかしながら、理論には束縛されないが、本発明者らの検討結果から、RT−RamDA反応液に所与の条件でカオトロピック剤を共存させることによって、RT−RamDA反応において、例えばプライマーのミスアニーリングを防ぐ作用及び/又は異常増幅産物の凝集体等を適切に解す作用等が発揮されて、意図しない非特異的な核酸増幅を抑制でき、RT−RamDA反応を安定化させることができると推察され得る。
RT−RamDA反応に用いる鋳型RNAとしては、組織や細胞から抽出されたRNA、組織や細胞からの抽出処理後に更に精製されたRNA(例えば、エタノール沈殿、カラム精製等の当該分野で公知の任意の精製手段により処理された精製RNA)等の任意のRNAであり得る。簡便には、鋳型RNAとして、RT−RamDA法による解析を望む生体試料(細胞や組織等)を細胞溶解剤で溶解した試料(本明細書では、これを「鋳型RNA含有生体試料」ともいう)を、更なる抽出・精製工程を経ずに、そのままRT−RamDA反応に用いることもできる。RT−RamDA反応液に含まれる鋳型RNAの量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくRT−RamDA反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは0.1pg/μl〜10ng/μl、より好ましくは0.1pg/μl〜1ng/μlとすることができる。本発明において、鋳型RNAとして「鋳型RNA含有生体試料」を用いる場合は、該生体試料中に含まれる鋳型RNAの量が上記濃度範囲内となるような量で使用すればよい。
細胞からRNAを抽出する方法は、通常、細胞溶解成分を含む細胞溶解剤を用いて、細胞を溶解する工程を含む。
細胞溶解剤は、例えば、細胞溶解成分として界面活性剤を含むもの等であり得る。界面活性剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム)、カチオン性界面活性剤(例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム)、ノニオン性界面活性剤(例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)、及び両イオン性界面活性剤(例えば、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホン酸)等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、細胞溶解剤は、細胞溶解成分としてプロテアーゼ(例えば、プロテアーゼK)、RNase阻害剤、これら2種以上の組合せ等を任意に含むものであってもよい。更に特定の実施形態では、本発明で用いる細胞溶解剤は、カオトロピック剤(例えば、尿素、過塩素酸リチウム塩、グアニジン塩酸塩等のグアニジニウム塩等)を含んでいてもよいし、他の特定の実施形態では、細胞溶解剤はカオトロピック剤を含まないものであってもよい。細胞溶解剤は、通常、前記のような細胞溶解成分を、水(好ましくはヌクレアーゼフリー水)等の水性溶媒に溶解した水溶液の形態で使用される。
DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素は、RNAとDNAとのハイブリッド鎖中のDNA鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的DNA分解酵素、非特異的DNA分解酵素を使用することができる。RT−RamDA反応液に含まれるDNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実に精度よくRT−RamDA反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、0.01U/μl〜0.1U/μlとすることができる。
・ Solenocera melantho(ナミクダヒゲエビ)DNase
・ Penaeus japonicus(クルマエビ)DNase
・ Paralithodes camtschaticus(タラバガニ)DSN
・ Pandalus borealis(ホッコクアカエビ)dsDNase
・ Chionoecetes opilio(ズワイガニ)DSN
・ その他のDSNホモログ
二本鎖特異的DNA分解酵素は、好ましくは、60℃未満でもDNA分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的DNA分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的DNA分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、dsDNase(ArcticZymes社)、Hl−dsDNase(ArcticZymes社)、dsDNase(Thermo scientific社)、Shrimp DNase、Recombinant(affymetrix社)、Atlantis dsDNase(Zymo Research社)、Thermolabile Nuclease(Roche社)などを挙げることができる。
非特異的DNA分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的DNA分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的DNA分解酵素又はその改変体を使用することができる。
RT−RamDA反応液は更に、一本鎖DNA結合タンパク質を含んでいてもよい。一本鎖DNA結合タンパク質は、通常、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素とともに使用される。なかでも、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素として、非特異的DNA分解酵素を用いる場合に、一本鎖DNA結合タンパク質を含むことが好ましい。一本鎖DNA結合タンパク質としては、例えば、T4ジーン32プロテイン、RecA、SSB(Single−Stranded DNA Binding Protein)、これら2種以上の組合せが挙げられる。RT−RamDA反応液が一本鎖DNA結合タンパク質を含む場合、その一本鎖DNA結合タンパク質の添加量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にRT−RamDA反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、10ng/μl〜100ng/μlとすることができる。
RT−RamDA反応に用いるプライマーとしては、鋳型RNAに対する特異的なプライマー、オリゴdTプライマー、ランダムプライマー、これら2種以上の組合せが挙げられる。オリゴdTプライマーとランダムプライマーとを組み合わせて用いる場合、それらのモル比は、例えば、オリゴdTプライマー:ランダムプライマーの比率が1:5〜1:15とすることができ、好ましくは1:8〜1:12である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、NSR(Not So Random)プライマーが挙げられる。
NSRプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからrRNA配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからrRNA配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをNSRプライマーとすることもできる。
このようなNSRプライマーを使うことにより、mRNA等をより高感度に解析することができる。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば5塩基以上、好ましくは6塩基以上であり、合成の観点から、例えば30塩基以下、好ましくは25塩基以下、より好ましくは20塩基以下である。
RT−RamDA反応液中における、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば1〜10μM、好ましくは2〜6μM、より好ましくは3〜5μMである。
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート(dCTP)、デオキシグアノシントリホスフェート(dGTP)、デオキシアデノシントリホスフェート(dATP)、デオキシチミジントリホスフェート(dTTP)、デオキシウリジントリホスフェート(dUTP)、これらの誘導体、これら2種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、dCTP、dGTP、dATP、及びdTTPの混合物、dCTP、dGTP、dATP、及びdUTPの混合物、dCTP、dGTP、dATP、dTTP、及びdUTPの混合物等が好ましい。RT−RamDA反応液に含まれるデオキシリボヌクレオチド(基質)の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にRT−RamDA反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、0.1〜5mMとすることができる。
RT−RamDA反応に用いるRNase Hマイナス型逆転写酵素は、逆転写活性(RNA依存性DNAポリメラーゼ活性)を有する任意のタンパク質(酵素)であって、RNaseH活性を有さないものをいう。RNase Hマイナス型逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス(Avian Myeloblastosis Virus)逆転写酵素(AMV−RT)、モロニーネズミ白血病ウイルス(Moloney Murine Leukemia Virus)逆転写酵素(MMLV−RT)、ヒト免疫ウイルス(Human Immunovirus)逆転写酵素(HIV−RT)、EIRV−RT、RAV2−RT、C.ヒドロゲノホルマンス(C.hydrogenogormans)DNAポリメラーゼ、rTthDNAポリメラーゼ、スーパースクリプト(SuperScript)I、スーパースクリプト(SuperScript)II、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、MMLV−RTが好ましい。RT−RamDA反応液に含まれるRNase Hマイナス型逆転写酵素の量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、より確実にRT−RamDA反応を行うことができ、安定して再現性の高い結果が得られ易いという観点から、好ましくは、0.2〜2U/μlとすることができる。
本発明のRT−RamDA反応液は、更に無機塩を含むことが好ましい。RT−RamDA反応液中で更に無機塩を共存させることにより、RT−RamDA反応をより一層効率的に行うことが可能となる。本発明に用いられ得る無機塩の種類は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、カリウム塩、マンガン塩、及び/又はマグネシウム塩を挙げることができ、好ましくはカリウム塩を挙げることができる。RT−RamDA反応液に無機塩を共存させる場合、その反応液中終濃度は特に限定されないが、一例として、20〜100mMとすることができる。
本発明のRT−RamDA反応液は、DNAポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい。本発明のRT−RamDA反応液がDNAポリメラーゼを含む場合、任意のDNAポリメラーゼを使用することができ、例えば、下記のようなDNAポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない:
Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENT(商標)、DEEPVENT(商標)、これらの変異体
本発明のRT−RamDA反応液は、RNase阻害剤を含んでいてもよい。RNase阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質が挙げられる。
本発明のRT−RamDA反応液は、他の添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、これら2種以上の組合せが挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、トリス(Tris)、トリシン(Tricine)、ビス−トリシン(Bis−Tricine)、ヘペス(Hepes)、モプス(Mops)、テス(Tes)、タプス(Taps)、ピペス(Pipes)、ギャプス(Caps)、これら2種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水(好ましくはヌクレアーゼフリー水)に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物(例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン)、酢酸塩(例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン)、硫酸塩(例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン)、これら2種以上の組合せが挙げられる。
RT−RamDA反応は、解析対象とする鋳型RNAと共に、プライマー、DNA鎖特異的RNA:DNAハイブリッド鎖分解酵素、RNase Hマイナス型逆転写酵素、及び基質、並びに、必要に応じて一本鎖DNA結合タンパク質、他の任意の成分を含むRT−RamDA反応液を、所定条件下でインキュベーションすることにより核酸増幅反応させる。RT−RamDA反応におけるインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、90〜100℃で所定時間(例えば1〜10分)インキュベーションする方法であってもよい。
インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば25℃以上50℃未満の間の所定の温度、好ましくは30〜45℃の間の所定の温度、より好ましくは35〜40℃の間の所定の温度、例えば37℃で所定の時間(例えば5〜180分、好ましくは10〜150分)行うことができる。
25℃以上50℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、2以上の段階に分けて行ってもよい。例えば25℃以上30℃未満の間の所定の温度で5〜15分、次いで30℃以上35℃未満の間の所定の温度で5〜15分、次いで35℃以上50℃未満の間の所定の温度で所定の時間(例えば5〜60分)インキュベーションしてもよい。
25℃以上50℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば50℃以上100℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。50℃以上100℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは2以上の段階に分けて行ってもよい。例えば50℃以上80℃未満の間の所定の温度で5〜15分、次いで80〜90℃の間の所定の温度で5〜15分インキュベーションしてもよい。
インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば20℃以上30℃未満の間の所定の温度T1(例えば25℃)と30〜45℃の間の所定の温度T2(例えば37℃)とを組み合わせて、T1で所定の時間(例えば1〜3分、一例として2分)とT2で所定の時間(例えば1〜3分、一例として2分)とを1サイクルとして、これを好ましくは10〜40サイクル、より好ましくは15〜35サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば25℃以上30℃未満の間の所定の温度で所定の時間(例えば5〜15分)、次いで30℃以上35℃未満の間の所定の温度で所定の時間(例えば5〜15分)、次いで35℃以上50℃未満の間の所定の温度で所定の時間(例えば1〜5分)インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば50℃以上80℃未満の間の所定の温度で所定の時間(例えば5〜15分)、次いで80〜90℃の間の所定の温度で所定の時間(例えば5〜15分)インキュベーションしてもよい。
量RNA)を用いたRT−PCR法またはRT−qPCR法の一部として使用することができる。
本発明による核酸の増幅方法は、微量のRNA(例えば、1細胞から数百細胞相当の微
量RNA)を用いたRNAシーケンス法に利用することができる。
PCR反応液又はqPCR反応液等のDNA増幅のために用いられるプライマーとしては、DNA(RNAから逆転写されたDNAを含む)に対して特異的なプライマー(フォワードプライマー、リバースプライマー)が好ましい。
更に、PCR反応液又はqPCR反応液等のDNA増幅用組成物は、抗DNAポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン(マグネシウムイオンなど)、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら2種以上の組合せを含んでいてもよい。
本実施例では、RT−RamDA法におけるカオトロピック剤による非特異的核酸増幅への影響を確認する目的で、以下の試験を行った。
サンプル溶液(RT−RamDA反応液)に、グアニジンチオシアネートを添加し、RT−RamDA反応により1本鎖cDNAの合成を行った。その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)にて、グアニジンチオシアネートの有無による増幅曲線の比較を行った。具体的には、以下の手法により行った。
本実施例で用いる核酸断片サンプルは、NIH3T3細胞をRNeasy Mini Kit(Qiagen社)を用いて精製したRNA5pg〜10ngを用いた。
このRNA5pg〜10ngをRT−RamDA法で逆転写反応するために、本実施例で使用したサンプル溶液(RT−RamDA反応液)に含まれる成分とそのサンプル溶液中の終濃度を以下の表1に示す。
その後、以下の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)にてDNA量の比較を行った。
具体的には、前述のサンプル溶液(RT−RamDA反応液)中でRT−RamDA反応を行った後、nuclease free water(Qiagen社)で5倍希釈し、希釈したサンプル溶液 2μlをqPCR反応に用いた。このRT−RamDA反応後のqPCRは、StepOne Plus(Life Technologies社)を用いて、以下の条件で行った。
qPCR反応用溶液[20μl(THUNDERBIRD(商標) SYBR qPCR Mix (TOYOBO社)、6pmol フォワードプライマー、6pmol リバースプライマー、2μl RT−RamDA反応液、nuclease free water]を95℃1分処理して酵素を活性化したのち、95℃15秒の変性及び60℃1分の伸長反応を40サイクル行った。
標的遺伝子としてメッセンジャーRNA(mRNA)であるβactinを使用した。
βactin(mRNA)
フォワードプライマー:CAGCTGAGAGGGAAATCGTG(配列番号1)
リバースプライマー:CGTTGCCAATAGTGATGACC(配列番号2)
Claims (12)
- RT−RamDA反応における非特異的な核酸増幅を抑制する方法であって、RT−RamDA反応液において鋳型RNA及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする方法。
- RT−RamDA反応に供する鋳型RNA含有生体試料を、カオトロピック剤を含む細胞溶解剤で処理することにより、カオトロピック剤を含む鋳型RNA含有生体試料液を調製し、該カオトロピック剤を含む鋳型RNA含有生体試料液とRT−RamDA反応液とを混合することにより、RT−RamDA反応液中で鋳型RNA及びカオトロピック剤を共存させる、請求項1に記載の方法。
- 前記RT−RamDA反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が0mMより多く50mM以下である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記RT−RamDA反応液中におけるカオトロピック剤の終濃度が0mMより多く20mM以下である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記カオトロピック剤がグアニジニウムイオン、尿素イオン、ヨウ化物イオン、リチウムイオン及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも1種類のカオトロピック剤である請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記カオトロピック剤がグアニジニウム塩である請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記カオトロピック剤がグアニジンチオシアン酸塩である請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記RT−RamDA反応液が更に無機塩を含む、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 前記無機塩が、カリウム塩、マンガン塩、及びマグネシウム塩からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項8に記載の方法。
- RT−RamDA反応の安定化方法であって、RT−RamDA反応液において鋳型RNA及びカオトロピック剤を共存させることを特徴とする、方法。
- カオトロピック剤を含有するRT−RamDA反応液を含む、請求項1から10のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
- カオトロピック剤を含有する細胞溶解液を含む、請求項1から10のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
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WO2016052619A1 (ja) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 核酸の増幅方法 |
JP2017209036A (ja) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | 東洋紡株式会社 | 改良されたウイルス検出方法 |
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