JP2023038069A - 長時間の核酸増幅反応の改善 - Google Patents

Abstract

【課題】 所定の温度で長時間インキュベートする工程を含む核酸増幅において親水性ポリマーにより引き起こされる増幅効率の低下を抑制し、効率よく核酸増幅反応を行う方法を提供すること。【解決手段】 本発明は、３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、親水性ポリマーを含む核酸増幅反応液中に特定の濃度の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有させることで、親水性ポリマーにより引き起こされる増幅阻害を抑制する方法を提供する。【選択図】 なし

Description

本発明は、所定温度で長時間の核酸増幅反応を行う方法に関する。

近年、等温で核酸増幅反応を行う方法が種々開発されている。このような等温での核酸増幅が可能な方法としては、例えば、ＲＮＡからの増幅に用いられるＲＴ－ＲａｍＤＡ法（特許文献１、非特許文献１）、ＤＮＡの増幅に用いられるＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＤＡ）法（非特許文献２）、Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ）法（非特許文献３）、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｙｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法（非特許文献４）、Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法（非特許文献５）などが知られており、実用化されている。

この中でも、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は、試料中のＲＮＡからｃＤＮＡを従来の逆転写反応よりも１０～１００倍に増やすことができ、微量ＲＮＡからの遺伝子発現解析において低発現遺伝子の捕捉や検出遺伝子数の拡充を可能にする有望な方法である（特許文献１、非特許文献１）。このＲＴ－ＲａｍＤＡ法は、例えば等温での反応時間を３０分から１２０分にすることで、より多量のｃＤＮＡを得ることができる（特許文献１、非特許文献１）。より多くのｃＤＮＡを得ることで、微量ＲＮＡから様々な解析を行うことができる。

国際公開第２０１６／０５２６１９号

Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ＲＮＡｓ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１８ Ｄｅａｎ Ｆ．Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００２ Ｗａｌｋｅｒ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ａ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ／ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９２ Ｌｉｚａｒｄｉ Ｐ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒｏｌｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９８ Ｎｏｔｏｍｉ Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０００

本発明者らは、親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を用いて、所定温度で長時間にわたり核酸増幅反応を行った場合に増幅効率が低下し得るという、これまでに知られていない知見を得た。よって、本発明では、このような場合であっても高い増幅効率で長時間にわたり核酸増幅反応を行う方法を提供することを主な課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、前記核酸増幅反応液中に一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を特定の濃度で添加することにより、親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制し、高い増幅効率で核酸を増幅することができることを見出した。当該知見を基にさらに検討を重ねることにより本発明を完成するに至った。

即ち、代表的な本発明は以下の態様を包含する。
［項１］ 親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、前記核酸増幅反応液中に４０ｎｇ／μＬ以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有させることにより、前記親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制する方法。
［項２］ ＲＴ－ＲａｍＤＡ法により核酸を増幅する、項１に記載の方法。
［項３］ 前記核酸増幅反応液が、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、４０ｎｇ／μＬ以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、逆転写酵素、プライマー、鋳型ＲＮＡ、及び親水性ポリマーを含有する、項１又は２に記載の方法。
［項４］ 前記ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が非特異的ＤＮＡ分解酵素である、項３に記載の方法。
［項５］ 前記鋳型ＲＮＡが、１細胞～１０００細胞から抽出されたＲＮＡである、項３又は項４に記載の方法。
［項６］ 前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質がＴ４ジーン３２プロテインである、項１～５のいずれかに記載の方法。
［項７］ 前記インキュベートの時間が６０分以上である、項１～６のいずれかに記載の方法。
［項８］ 前記インキュベートの時間が１２０分以上である、項１～７のいずれかに記載の方法。
［項９］ 前記親水性ポリマーが、核酸ポリマー及びポリエチレングリコールからなる群から選択される少なくとも一種である、項１～８のいずれかに記載の方法。
［項１０］ 前記核酸増幅反応液中の前記親水性ポリマーの濃度が０．０１ｎｇ／μＬ以上である、項１～９のいずれかに記載の方法。
［項１１］ 前記親水性ポリマーが、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、項１～１０のいずれかに記載の方法。
［項１２］ 前記インキュベートの温度が３５℃以上４０℃以下の温度である、項１～１１のいずれかに記載の方法。
［項１３］ 親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、前記核酸増幅反応液中に、前記親水性ポリマー１質量部に対して一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を０．０１～１５００質量部含有させることにより、前記親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制する方法。
［項１４］ 核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む核酸増幅に用いられるキットであって、親水性ポリマーと、核酸増幅反応液中の濃度が４０ｎｇ／μＬ以上となるように調整された濃度の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを含む、キット。
［項１５］ 核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む核酸増幅に用いられるキットであって、親水性ポリマーと、親水性ポリマー１質量部に対して０．０１～１５００質量部の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを含む、キット。

本発明により、例えば親水性ポリマーの存在下でも増幅効率を損なうことなく、核酸増幅反応を長時間行うことができる。特に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法などで鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡの増幅を行う場合であっても、反応時間の延長による増幅阻害を抑制し、高い増幅効率で長時間反応を行うことができる。これによって様々な条件下でＲＴ－ＲａｍＤＡ法などの核酸増幅法を行うことができるようになり、遺伝子解析技術の進展に役立つ。例えば、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）やリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの技術に応用される、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を用いたシングルセル解析などの研究の促進に寄与する。

図１は、実施例１におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を３７℃で１２０分間行った場合の増幅率について、ポリイノシン酸の添加濃度による違いを比較した。βＡＣＴＩＮ遺伝子について評価し、縦軸は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行わない通常の逆転写反応からの差分をΔＣｔ値として増幅率を評価した。 図２は、実施例２におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。ポリイノシン酸を添加し、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を３７℃で３０、１２０、３６０分間行った場合における、逆転写酵素又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の添加量による増幅率の違いを評価した。βＡＣＴＩＮ遺伝子とＮＥＡＴ１遺伝子について評価し、縦軸は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行わない通常の逆転写反応からの差分をΔＣｔ値として増幅率を評価した。 図３は、実施例３におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。実施例２と同様の評価（図２）を、逆転写酵素の種類を替えて行った。βＡＣＴＩＮ遺伝子とＮＥＡＴ１遺伝子について評価し、縦軸は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行わない通常の逆転写反応からの差分をΔＣｔ値として増幅率を評価した。 図４は、実施例４におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質によるポリイノシン酸のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の阻害作用の抑制効果の濃度依存性を評価した。βＡＣＴＩＮ遺伝子について評価し、縦軸は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行わない通常の逆転写反応からの差分をΔＣｔ値として増幅率を評価した。 図５は、実施例５におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。ポリイノシン酸によるＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の阻害作用とそれに対する効果を、異なる核酸ポリマーであるポリシチジル酸においても確認した。βＡＣＴＩＮ遺伝子とＮＥＡＴ１遺伝子について評価し、縦軸は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行わない通常の逆転写反応からの差分をΔＣｔ値として増幅率を評価した。 図６は、実施例６におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。ポリイノシン酸によるＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の阻害作用とそれに対する効果を、異なる親水性ポリマーであるポリエチレングリコールでも確認した。βＡＣＴＩＮ遺伝子について評価し、縦軸は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行わない通常の逆転写反応からの差分をΔＣｔ値として増幅率を評価した。

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明について更に詳説する。
＜核酸を増幅する方法において親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制する方法＞
本発明は、一実施形態において、親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、前記核酸増幅反応液中に特定の濃度で（又は前記親水性ポリマーと特定の量比で）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有させることにより、前記親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制する方法を提供する。当該方法は、前記条件でインキュベートする工程を少なくとも含む任意の核酸増幅において利用され得る。好ましくは、当該方法は、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法により核酸を増幅する場合に利用され得るが、特に限定されない。

１．核酸増幅反応液
核酸増幅反応液は、親水性ポリマー及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に加えて、一般的に核酸増幅に用いられる成分を含有する。
一実施形態において、核酸増幅反応液は、鋳型核酸、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、親水性ポリマー、及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有することが好ましい。また、当該核酸増幅反応液は、逆転写酵素等の他の成分も任意に含有し得る。
別の実施形態において、核酸増幅反応液は、ＲＴ－ＲａｍＤａ法に用いられる成分、親水性ポリマー、及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有することが好ましい。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は、通常、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報２０１７／０２７５６８５（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。従って、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法により核酸を増幅する場合、核酸増幅反応液は、例えば、鋳型ＲＮＡ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、逆転写酵素、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、親水性ポリマー、及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有する。また、当該核酸増幅反応液は、ＤＮＡポリメラーゼ等の他の成分も任意に含有し得る。

（１）親水性ポリマー
親水性ポリマーは、例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法などの核酸増幅法では、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し増幅する際の正確性や合成速度を高める目的や、特定のＲＮＡ（例えば、合成を意図しないｒＲＮＡ）からのｃＤＮＡ合成を阻害する目的など、様々な目的で添加される。しかしながら、親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を長時間所定温度でインキュベートすると、核酸増幅反応が阻害されることが後述の試験例の結果から明らかとなっている。特定の理論に拘束されるわけではないが、これは親水性ポリマーが逆転写酵素や一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質など、核酸増幅反応（例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応）に必要な酵素・成分などと結合し、これらの酵素・成分の活性を低下させるためであると考えられる。従って、親水性ポリマーは、例えば、核酸増幅反応液を長時間所定温度でインキュベートする工程を含む核酸増幅において増幅効率を低下させる阻害剤となり得る。このような親水性ポリマーとしては、特に限定されないが、例えば、核酸ポリマー、ヘパリン、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。なかでも、核酸ポリマー及び／又はポリエチレングリコールが阻害を引き起こす傾向が強い。また核酸ポリマーの中では、ポリイノシン酸及び／又はポリシチジル酸が特に阻害を引き起こす傾向が強い。
親水性ポリマーによって増幅効率の低下が起こる核酸増幅条件（例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の条件）は、３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする条件である限り、特に限定はなく、等温条件であっても、熱サイクル条件であってもよい。特に３５℃以上４５℃以下の温度、なかでも３５℃以上４０℃以下の温度でのインキュベート時間が３０分より長い場合に阻害が起こり易い傾向がある。とりわけ、前記温度で６０分以上のインキュベート時間で阻害が強く、前記温度で１２０分以上のインキュベート時間でより強い阻害が起こる。また、前記温度で２４０分以上のインキュベート時間、更には前記温度で３６０分以上のインキュベート時間で更に強い阻害が起こり得る。前記温度でのインキュベート時間の上限は特に限定されないが、例えば、４２０分以下又は３６０分以下であってもよい。
核酸増幅反応液中の親水性ポリマーの濃度の下限値は、本発明の効果が発揮され得る限り特に限定されないが、一例として、核酸増幅反応液全体に対して０．０１ｎｇ／μＬ以上であり、０．１ｎｇ／μＬ以上であってもよく、１ｎｇ／μＬ以上であってもよい。核酸増幅反応液中の親水性ポリマーの濃度の上限値もまた限定されないが、一例として、３μｇ／μＬ以下であり得る。また、親水性ポリマーが核酸ポリマーである場合は、例えば２ｎｇ／μＬ以下であり得る。
核酸ポリマーは、例えば、逆転写反応と共に核酸増幅反応を行う場合、核酸増幅反応液に添加することで、リボソーマルＲＮＡの逆転写の抑制などに役立つ（国際公開第２０２０／１８４５５１号（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる））。核酸ポリマーとしては、例えば、イノシン酸ポリマー、シチジル酸ポリマー、グアニル酸ポリマー、アデニル酸ポリマー、チミジル酸ポリマー、ウリジル酸ポリマー、デオキシイノシン酸ポリマー、デオキシシチジル酸ポリマー、デオキシグアニル酸ポリマー、デオキシアデニル酸ポリマー、デオキシチミジル酸ポリマー、及びデオキシウリジル酸ポリマーからなる群より選択される少なくとも一種が挙げられる。ここで、例えば、イノシン酸ポリマーは、イノシン酸ホモポリマー（ポリイノシン酸）、イノシン酸コポリマー（例えば、イノシン酸由来の構成単位が５０モル％超、６０モル％以上、７０モル％以上、８０モル％以上、又は９０モル％以上であり、１００モル％未満であるコポリマー）、これらの誘導体（例えば、少なくとも一部の塩基部分に、例えば、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子、アルキル基、アミノ基、メルカプト基などの官能基が導入されたもの、及び／又は、少なくとも一部のリン酸部分がチオリン酸部分に置き換わったもの）、及びこれらの塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩）を包含する意味で用い、ポリイノシン酸とポリシチジル酸とがアニールしたポリ（Ｉ：Ｃ）等と呼ばれる二本鎖のポリマーも包含する意味で用いる。他のシチジル酸ポリマー等についても同様の意味で用いる。
増幅効率を特に低下させる核酸ポリマーとしては、イノシン酸ポリマー、シチジル酸ポリマー、グアニル酸ポリマー、デオキシイノシン酸ポリマー、デオキシシチジル酸ポリマー、及びデオキシグアニル酸ポリマーからなる群より選択される少なくとも一種が挙げられ、イノシン酸ポリマー及び／又はデオキシイノシン酸ポリマー、シチジル酸ポリマー及び／又はデオキシシチジル酸ポリマーがとりわけ増幅効率を低下させる。核酸ポリマーは任意の長さであり得るが、一例として全長が３０～１００００塩基長である核酸ポリマーであり得る。

（２）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。本発明では、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の濃度を４０ｎｇ／μＬ以上にすることにより、３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む核酸増幅において増幅効率を高めることができる。特定の理論に拘束されるわけではないが、これは一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の濃度を高めることで、親水性ポリマーに結合し、親水性ポリマーによる核酸増幅反応（例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応）の阻害作用を抑制するためであると考えられる。
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の核酸増幅反応液中の濃度は、４０ｎｇ／μＬ以上である限り、特に限定されないが、４５ｎｇ／μＬ以上であることが好ましく、５０ｎｇ／μＬ以上であることがより好ましく、５５ｎｇ／μＬ以上であることが更に好ましく、６０ｎｇ／μＬ以上であることが更により好ましく、６５ｎｇ／μＬ以上であることが特に好ましい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の核酸増幅反応液中の濃度の上限値は、特に限定されないが、例えば、１５０ｎｇ／μＬ以下、１４０ｎｇ／μＬ以下、１３０ｎｇ／μＬ以下、１２０ｎｇ／μＬ以下、１１０ｎｇ／μＬ以下、又は１００ｎｇ／μＬ以下とすることができる。このような濃度で一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を核酸増幅反応液中に添加することにより、親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を所定温度で長時間インキュベートする工程を含む核酸増幅であっても、親水性ポリマーによる核酸増幅阻害が抑制されて、増幅効率を十分に維持できる。
一実施形態において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の含有量は、親水性ポリマー１質量部に対して０．０１質量部以上であることが好ましく、０．０１５質量部以上であることがより好ましく、０．０２質量部以上であることがより好ましい。特定の実施形態において、親水性ポリマーが核酸ポリマーである場合には、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の含有量は、核酸ポリマー１質量部に対して１０質量部以上である（又は１０質量部よりも多くする）ことが好ましく、１５質量部以上であることがより好ましく、２０質量部以上であることが更に好ましく、３０質量部以上であることが更により好ましく、４０質量部以上であることが特に好ましい。また、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の含有量は、親水性ポリマー１質量部に対して、１５００質量部以下であることが好ましく、１０００質量部以下であることがより好ましく、５００質量部以下であることが更に好ましく、１００質量部以下であることが特に好ましい。特定の実施形態において、親水性ポリマーがポリエチレングリコールである場合には、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の含有量は、ポリエチレングリコール１質量部に対して１０質量部未満であることが好ましく、５質量部以下であることがより好ましく、１質量部以下であることが更に好ましく、０．５質量部以下であることが更により好ましく、０．１質量部以下であることが特に好ましい。このような比率で親水性ポリマーと一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを共存させることで、本発明の効果がより一層確実に発揮され易くなる。

（３）ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。本発明ではこれらのうち、非特異的ＤＮＡ分解酵素が好ましい。

二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮとも言う）は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、Ｈｌ－ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｈｒｉｍｐ ＤＮａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）などを挙げることができる。

非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さず、好ましくは、一本鎖ＤＮＡを切断する活性がＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性に比較して低くなる酵素を挙げることができる。非特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。このような非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することもでき、例えば、ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、ＤＮａｓｅＩ）等を用いることが可能である。
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。

上記改変体とは、天然由来のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる酵素、並びに天然由来のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる酵素である。

（４）プライマー
プライマーとしては、鋳型ＲＮＡなどの鋳型核酸に対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、オリゴｄＴプライマーやランダムプライマーは、特定の配列に特異的なプライマーと異なり、任意のＲＮＡにアニールして多種多様なＲＮＡの逆転写を開始できるので、網羅的なＲＮＡの逆転写によるＤＮＡ合成が求められる場面などにおいて好ましい。特定の実施形態では、オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーの組合せを用いて逆転写反応を行うことが特に有益である。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーのモル比は、例えば１：５～１：１５、好ましくは１：８～１：１２である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Ｎｏｔ Ｓｏ Ｒａｎｄｏｍ）プライマーが挙げられる。
完全ランダムプライマーとは、種々の塩基配列を有するプライマーの混合物であり、各塩基配列は完全にランダムな塩基配列である。完全ランダムプライマーは、ｒＲＮＡ配列と完全に一致する（又は完全に相補的な）配列を含み得る。完全ランダムプライマーとしては、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘキサマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマー、これらの組合せなどが例示できる。例えば、完全ランダムヘキサマーは、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）で可能な全ての塩基配列（４^６種類）の混合物であってもよい。
ＮＳＲプライマーとは、完全ランダムプライマーから、ｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するプライマーを除去したものである。除去するｒＲＮＡ配列としては、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列、２８Ｓ ｒＲＮＡ配列、１２Ｓ ｒＲＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列、これらの組合せが挙げられる。
ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、生体内ＲＮＡの約８～９割を占めると言われるｒＲＮＡの転写を抑制できるので、ｒＲＮＡ以外のＲＮＡの転写量を相対的に増やすことができ、よって例えば、ｍＲＮＡ等を解析して感度を改善させることができる。
ＮＳＲプライマーの詳細については、１）Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．９，２００９，ｐｐ．６４７－６４９、２）Ｏｚｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｔｏｍｏｌｅ－ｌｅｖｅｌＲＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０，２０１０，ｐｐ．５１９－５２５、３）米国特許出願公開公報２０１０／００２９５１１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
核酸増幅反応液において、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。

（５）デオキシリボヌクレオチド
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。

（６）逆転写酵素
逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）をいい、特に制限されないが、逆転写酵素活性を示すポリメラーゼが好ましい。また、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低いか、又はＲＮａｓｅ Ｈ活性がないものが好ましい。逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＨＩＶ－ＲＴ）、ＥＩＲＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｇｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、ＭＭＬＶ－ＲＴが好ましい。

（７）ＤＮＡポリメラーゼ
核酸増幅反応液は、下記のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい：
Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体

（８）ＲＮａｓｅ阻害剤
核酸増幅反応液は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質等が挙げられる。

（９）鋳型核酸
本発明において、対象となる鋳型核酸は特に制限されないが、ＲＮＡであることが好ましい。鋳型ＲＮＡは特に限定されないが、１細胞～１０００細胞から抽出されたＲＮＡであることが好ましく、１細胞～１００細胞から抽出されたＲＮＡであることがより好ましい。特に好ましくは１細胞から抽出されたＲＮＡである。細胞の数は、セルソータ―により適宜調整することができる。細胞からのＲＮＡの抽出は、当該分野で公知の任意のＲＮＡ抽出法で行うことができ、市販のＲＮＡ抽出キットなどを使用して抽出してもよい。

（１０）添加剤
核酸増幅反応液は、更に他の添加剤を含んでいてもよい。他の添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、界面活性剤、これら２種以上の組合せが挙げられる。
緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビス－トリス（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
界面活性剤には、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）などが挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。特に好ましい様態として、非イオン性界面活性剤を用いることができる。

２．インキュベーション
核酸を増幅する方法は、３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を少なくとも含む。このような条件でのインキュベートを親水性ポリマーを含む核酸増幅反応液で行うと経時的に増幅阻害が生じ得るが、本発明によれば、その増幅阻害を効果的に抑制できる。３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程は、等温条件でもよいし、熱サイクル条件でもよい。３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を熱サイクル条件で行う場合、この温度範囲内での２以上の温度条件における各インキュベーション時間を全て合算した時間が３０分より長い時間となる。

一実施形態において、鋳型ＲＮＡからの核酸増幅がＲＴ－ＲａｍＤＡ法により行われる場合、核酸増幅反応液のインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよいが、等温条件が好ましい。

（１）等温条件
インキュベーション（特に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法でのインキュベーション）を等温条件で行う場合、例えば３０℃より高く５０℃より低い温度の間の所定の温度、好ましくは３５℃以上４５℃以下の間の所定の温度、より好ましくは３５℃以上４０℃以下の間の所定の温度、例えば３７℃で行うことができ、当該温度で所定の時間（例えば、３０分より長く４２０分以下、好ましくは６０分～４２０分、より好ましくは１２０分～４２０分）行うことができる。
３０℃より高く５０℃より低い温度の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば３０℃より高く３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば２０～６０分）インキュベーションしてもよい。
３０℃より高く５０℃より低い温度の間の所定の温度での３０分より長い時間のインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０℃以上９０℃以下の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。

（２）熱サイクル条件
インキュベーション（特に、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法でのインキュベーション）を熱サイクル条件で行う場合、３０℃より高く３５℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば３３℃）と３５℃以上４５℃以下の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行って、３０分より長い時間反応させてもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０℃以上９０℃以下の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。

＜核酸増幅用キット＞
前述のように、本発明によれば、親水性ポリマーのような増幅阻害剤の存在下であっても、高い増幅効率で長時間核酸増幅反応（例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応）を行うことができる。従って、本発明は更に別の観点から、３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む核酸増幅に用いられるキットを提供する。
一実施形態において、当該キットは、親水性ポリマーと、核酸増幅反応液中の終濃度が４０ｎｇ／μＬ以上となるように調整された濃度の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを含む。ここで、核酸増幅反応液中の終濃度が４０ｎｇ／μＬ以上となるように調整された濃度とは、例えば、２倍希釈して使用される試薬とする場合には８０ｎｇ／μＬ以上の濃度で一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む試薬として調製されればよく、３倍希釈して使用される試薬とする場合には１２０ｎｇ／μＬ以上の濃度で一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む試薬として調製されればよいことを意味する。
別の実施形態において、当該キットは、親水性ポリマーと、親水性ポリマー１質量部に対して０．０１～１５００質量部の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを含む。
当該キットは、親水性ポリマーと一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを１つの容器に両成分を充填した態様で提供されても良いし、別々の容器にそれぞれの成分を充填した態様で提供されて使用時に混合される形態であってもよい。また、当該キットは、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、逆転写酵素、プライマー、鋳型核酸、緩衝剤、塩等の他の成分を含んでいてもよい。当該キットに含まれ得る成分の具体的な種類などは上記方法において詳述したものと同様であり得る。また、当該キットを用いて核酸増幅反応を行う際に行われるインキュベーションの反応温度及び反応時間等の反応条件等も上記方法と同様であり得る。当該キットを用いることにより、増幅効率の低下を抑えながら長時間核酸増幅反応を行うことができるので、多量のｃＤＮＡを増幅でき、広範な遺伝子解析を行うことが可能となる。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１：ポリイノシン酸によるＲＴ－ＲａｍＤＡ法での長時間増幅への影響
本実施例では、３７℃での反応時間を２時間とした場合のＲＴ－ＲａｍＤＡ法での増幅率が、核酸ポリマー（ポリイノシン酸）の添加によってどのように変化するのか比較するため、以下の実験を行った。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法での増幅率を解析するために、まずコントロールとして表１に示した逆転写反応液１（通常の逆転写反応）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表２に示した反応サイクル１で逆転写反応を行った。別途、表３に示した各種ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液１（条件１～４）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表４に示した反応サイクル２でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った。核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。

その後、以下の方法でリアルタイムＰＣＲにて解析した。
具体的には、逆転写反応又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後の反応液をそれぞれｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で１０倍に希釈し、希釈後の溶液２μＬ（１／２５量）をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μｌ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）、６ｐｍｏｌ フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ リバースプライマー、２μｌ希釈逆転写反応液又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。
融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
標的遺伝子として、βＡＣＴＩＮ遺伝子の増幅率をリアルタイムＰＣＲによって解析した。
プライマーセットは以下の通りである。（５’→３’）
フォワードプライマー：ＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴ（配列番号１）
リバースプライマー：ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号２）
解析後、逆転写反応液１を添加したサンプルで得られた通常の逆転写反応のＣｔ値から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液１を添加したサンプルで得られたＲＴ－ＲａｍＤＡ法のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることでＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率を評価した。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法は通常の逆転写反応よりも増幅率が高いため、Ｃｔ値が通常の逆転写反応の場合よりも低い値となる。従って、ΔＣｔ値が高いほど、各被験反応液（各ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液）のＣｔ値が小さくなったことを示し、より増幅率が高くなったことを意味する。

実施例１の結果を図１に示す。３７℃での反応時間が１２０分では、ポリイノシン酸の添加量を減らすほど、ＲＴ－ＲａｍＤＡによる増幅率が上昇することがわかった。よって、ポリイノシン酸などの核酸ポリマー（親水性ポリマー）を添加することで、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において長時間のインキュベーションを行うと増幅阻害が起こることが示された。

実施例２：ポリイノシン酸によるＲＴ－ＲａｍＤＡ法での長時間増幅阻害を抑制する成分の評価１
本実施例では、逆転写酵素または一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の濃度を高めることによって、実施例１で見られたポリイノシン酸によるＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の長時間増幅反応阻害に影響があるか検討するため、以下の実験を行った。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法での増幅率を解析するために、まずコントロールとして実施例１と同様に表１に示した逆転写反応液１（通常の逆転写反応）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表２に示した反応サイクルで逆転写反応を行った、別途、表５に示した各種ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液２（条件１～４）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表６に示した反応サイクル３でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った。核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。

逆転写反応又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同様の方法でβＡＣＴＩＮ遺伝子およびＮＥＡＴ１遺伝子を指標としてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率をリアルタイムＰＣＲによって解析した。使用したプライマーセットは、βＡＣＴＩＮ遺伝子は実施例１と同じものを用い、ＮＥＡＴ１遺伝子は以下のプライマーセットを用いた。
フォワードプライマー：ＣＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号３）
リバースプライマー：ＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴ（配列番号４）
またリアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
解析後、逆転写反応液１を添加したサンプルで得られた通常の逆転写反応のＣｔ値から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液２を添加したサンプルで得られたＲＴ－ＲａｍＤＡ法のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることでＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率を評価した。

実施例２の結果を図２に示す。ポリイノシン酸を含む条件（条件１）では、３７℃での反応時間を３０分よりも長くしても増幅率が向上せず、むしろ低下する場合も認められた。逆転写酵素を二倍濃度にした条件（条件２）では条件１と同様の結果となり、長時間反応の増幅阻害を抑制する効果は認められなかった。一方、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ジーン３２プロテインを二倍濃度にした条件（条件３および４）では、反応時間に比例して増幅率が向上する傾向が認められた。よって、ポリイノシン酸（親水性ポリマー）を添加していても、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を増量することで、反応時間に比例してＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率を向上させることができることが示された。

実施例３：ポリイノシン酸によるＲＴ－ＲａｍＤＡ法での長時間増幅阻害を抑制する成分の評価２
本実施例では、実施例２で見られた一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の濃度を高めることによる影響が、他の逆転写酵素を用いた場合でも同様に確認できるか検討した。
実施例２と同様に、まずコントロールとして表１に示した逆転写反応液１（通常の逆転写反応）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表２に示した反応サイクルで逆転写反応を行った。別途、表７に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液３（条件１～４）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、実施例２と同様に表６に示した反応サイクル３でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った。核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。

逆転写反応又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同様の方法でβＡＣＴＩＮ遺伝子およびＮＥＡＴ１遺伝子を指標としてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率をリアルタイムＰＣＲによって解析した。βＡＣＴＩＮ遺伝子と、ＮＥＡＴ１遺伝子のプライマーセットは実施例２と同じものを用いた。
またリアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
解析後、逆転写反応液１を添加したサンプルで得られた通常の逆転写反応のＣｔ値から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液３を添加したサンプルで得られたＲＴ－ＲａｍＤＡ法のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることでＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率を評価した。

実施例３の結果を図３に示す。逆転写酵素を、実施例２で用いていた東洋紡株式会社製、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＲＴ）から、逆転写酵素（タカラバイオ株式会社製、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（ＰＳ））に替えても同様の結果が得られた。よって、ポリイノシン酸（親水性ポリマー）を添加していても、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を増量することで、反応時間に比例してＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率を向上させることできることが、より強く裏付けられた。

実施例４：一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の濃度による影響
本実施例では、長時間反応させる場合のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率と、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の濃度との関係について、更に詳細に解析した。
これまでの実施例と同様に、まずコントロールとして表１に示した逆転写反応液１（通常の逆転写反応）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表２に示した反応サイクルで逆転写反応を行った。別途、表８に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液４（条件１～６）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表９に示した反応サイクル４でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った。核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。

逆転写反応又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同様の方法でβＡＣＴＩＮ遺伝子を指標としてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率をリアルタイムＰＣＲによって解析した。βＡＣＴＩＮ遺伝子のプライマーセットは実施例１と同じものを用いた。
またリアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
解析後、逆転写反応液１を添加したサンプルで得られた通常の逆転写反応のＣｔ値から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液４を添加したサンプルで得られたＲＴ－ＲａｍＤＡ法のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることでＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率を評価した。

実施例４の結果を図４に示す。１２０分のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の反応において、βＡＣＴＩＮ遺伝子の増幅率は、Ｔ４ジーン３２プロテイン濃度に比例して増幅率が向上した。特にβＡＣＴＩＮ遺伝子では４２ｎｇ／μＬ以上のＴ４ジーン３２プロテイン濃度で増幅率が大きく向上した。

実施例５：ポリシチジル酸による増幅阻害に対する抑制効果
本実施例では、長時間のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に他の親水性ポリマー（核酸ポリマー）であるポリシチジル酸（ｐｏｌｙＣ）を用いた場合の効果について検討した。
これまでの実施例と同様に、まずコントロールとして表１に示した逆転写反応液１（通常の逆転写反応）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表２に示した反応サイクルで逆転写反応を行った。別途、表１０に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液５（条件１～３）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表６に示した反応サイクル３でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った。核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。

逆転写反応又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同様の方法でβＡＣＴＩＮ遺伝子およびＮＥＡＴ１遺伝子を指標としてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率をリアルタイムＰＣＲによって解析した。βＡＣＴＩＮ遺伝子と、ＮＥＡＴ１遺伝子のプライマーセットは実施例２と同じものを用いた。
またリアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
解析後、逆転写反応液１を添加したサンプルで得られた通常の逆転写反応のＣｔ値から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液５を添加したサンプルで得られたＲＴ－ＲａｍＤＡ法のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることでＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率を評価した。

実施例５の結果を図５に示す。ポリシチジル酸を添加したサンプルでも、これまでのポリイノシン酸での実施例の場合と同様に、１２０分および３６０分の長時間でのＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率が低下した。また一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ジーン３２プロテイン濃度を３３ｎｇ／μＬから６７ｎｇ／μＬに上げることで、１２０分および３６０分のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の反応時間における増幅率が向上した。よって、ポリイノシン酸以外の親水性ポリマーもＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を阻害し、この阻害はＴ４ジーン３２プロテインなどの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を４０ｎｇ／μＬ以上添加することで緩和できることが示された。

実施例６：ポリエチレングリコールによる増幅阻害に対する抑制効果
本実施例では、長時間のＲＴ－ＲａｍＤＡ反応に他の親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた場合の効果について検討した。
これまでの実施例と同様に、まずコントロールとして表１に示した逆転写反応液１（通常の逆転写反応）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表２に示した反応サイクルで逆転写反応を行った。別途、表１１に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液６（条件１～３）５μＬ中に核酸断片サンプルを供し、表６に示した反応サイクル３でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った。核酸断片サンプルは、ＨｅＬａ細胞からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＲＮＡ１０ｐｇを用いた。

逆転写反応又はＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同様の方法でβＡＣＴＩＮ遺伝子を指標としてＲＴ－ＲａｍＤＡ反応の増幅率をリアルタイムＰＣＲによって解析した。βＡＣＴＩＮ遺伝子のプライマーセットは実施例１と同じものを用いた。
またリアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
解析後、逆転写反応液１を添加したサンプルで得られた通常の逆転写反応のＣｔ値から、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液６を添加したサンプルで得られたＲＴ－ＲａｍＤＡ法のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることでＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率を評価した。

実施例６の結果を図６に示す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加したサンプルでも増幅率の低下が認められ、特に１２０分および３６０分の長時間でのＲＴ－ＲａｍＤＡ反応において、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応による増幅率が著しく低下した。また一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ジーン３２プロテイン濃度を３３ｎｇ／μＬから６７ｎｇ／μＬに上げることで、１２０分および３６０分の長時間ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応における著しい増幅率の低下を有意に抑制することができた。よって、核酸ポリマー以外の親水性ポリマーもＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を阻害し、この阻害はＴ４ジーン３２プロテインなどの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を４０ｎｇ／μＬ以上添加することで抑制できることが示された。

本発明により、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応などの核酸増幅反応を所定温度で長時間行う場合に増幅効率を低下させる阻害剤が添加された系においても、その阻害作用を抑制することが可能となる。この手法は、例えば、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を用いたシングルセル解析など、様々な遺伝子解析法に役立つ。

Claims (15)

1. 親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、前記核酸増幅反応液中に４０ｎｇ／μＬ以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含有させることにより、前記親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制する方法。
2. ＲＴ－ＲａｍＤＡ法により核酸を増幅する、請求項１に記載の方法。
3. 前記増幅反応液が、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、４０ｎｇ／μＬ以上の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、逆転写酵素、プライマー、鋳型ＲＮＡ、及び親水性ポリマーを含有する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素が非特異的ＤＮＡ分解酵素である、請求項３に記載の方法。
5. 前記鋳型ＲＮＡが、１細胞～１０００細胞から抽出されたＲＮＡである、請求項３又は請求項４に記載の方法。
6. 前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質がＴ４ジーン３２プロテインである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 前記インキュベートの時間が６０分以上である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記インキュベートの時間が１２０分以上である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. 前記親水性ポリマーが、核酸ポリマー及びポリエチレングリコールからなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
10. 前記核酸増幅反応液中の前記親水性ポリマーの濃度が０．０１ｎｇ／μＬ以上である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. 前記親水性ポリマーが、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記インキュベートの温度が３５℃以上４５℃以下の温度である、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
13. 親水性ポリマーを含有する核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸を増幅する方法において、前記核酸増幅反応液中に、前記親水性ポリマー１質量部に対して一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を０．０１～１５００質量部含有させることにより、前記親水性ポリマーによる核酸増幅阻害を抑制する方法。
14. 核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸増幅に用いられるキットであって、親水性ポリマーと、核酸増幅反応液中濃度が４０ｎｇ／μＬ以上となるように調整された濃度の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質とを含む、キット。
15. 核酸増幅反応液を３０℃より高く５０℃より低い温度で３０分より長い時間インキュベートする工程を含む、核酸増幅に用いられるキットであって、親水性ポリマーと、親水性ポリマー１質量部に対して０．０１～１５００質量部の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む、キット。

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