JPH09503648A - 核酸増幅の促進法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 試験試料中の核酸鎖の増幅方法。本方法は、試験試料からの核酸鎖を少なくとも三つのオリゴヌクレオチドプライマーと同時に接触させることを含む。少なくとも一つのプライマーはプロモーター−プライマーであり、および少なくとも一つの他のプライマーは核酸鎖に相補的であり、および一つの他のプライマーは核酸鎖に相補的な鎖に相補的である。本方法はさらに、核酸鎖およびプライマーを、ＲＮＡ指向性および／またはＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有する一つまたはそれ以上の蛋白質と、本質的に一定の温度で、核酸鎖の標的領域を増幅しうるプライマー伸長条件下で接触させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸増幅の促進法技術分野 本発明は、本質的に一定の温度でＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラー ゼを用いる核酸鎖の増幅に関する。背景技術 特定の核酸配列を検出する能力は、遺伝学的研究、臨床診断試験、法医学、考 古学などのような領域で多くの実際的な利便を提供してきた。多くの場合、問題 とする配列は、非常に高度に特異的な活性標識を有するプローブを用いても直接 的には検出できないほど低濃度でしか存在しないであろう。最近、非常に強力な 指数関数的増幅法を含む、標的配列の新たなコピーを効率的に発生させるための 戦略が考案され、それにより非常に低い標的レベルの存在をより正確に検出する ことができるようになった。 そのような方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（Mullis et al.,米国特許第 ４，６８３，２０２号）であり、この方法では、プライマー、基質、ＤＮＡポリ メラーゼおよび分析核酸の反応混合物を、二本鎖核酸の変性に十分な温度への加 熱およびプライマーアニーリングおよび伸長が起こり得る温度への冷却からなる ｎ回のサイクルにかける。この反応は、各々のサイクルの間に標的配列の各々の 鎖が（最大で）一つの新しい相補鎖へコピーされうるため、２ⁿ倍の最大増幅を 有すると理解されている。 続いての回に使用されるプライマーにより規定される標的領域が前の回に使用 されたプライマーにより発生した標的アンプリコン内に含まれている二つまたは それ以上の連続する増幅反応を実施することにより、標的特異的増幅の実行は増 大した。非標的アンプリコンは通常、組み込まれた（nested）プライマーの組に よるさらなる増幅に対して、存在するその他の非標的配列よりも効率的な鋳型で はないため、非標的配列の同時増幅のために最初の回で所望の標的の増幅が不十 分であっても、発生した標的アンプリコンは次のプライマーの組によるさらなる 増幅のための選択的利点を有するに違いない。この戦略は、非常に低い標的レベ ルを検出するために、ＰＣＲのような増幅法の能力を改良するために使用されて きた(Conway et al.,J.Acquired Immune Def.Syndromes 3:1059(1990);Matsumot o et al.,J.Virol.64:5290(1990);Garson et al.,Lancet 336:1022(1990);およ びNASBA(Kievits et al.,J.Virol.Methods 35:273(1991))。 Kacian et al．PCT/US90/03907の増殖法は、多酵素活性（すなわち、ＲＮＡポ リメラーゼ、ＤＮＡ指向性（directed）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮ ＡポリメラーゼおよびＲＮＡｓｅ Ｈを含む）に依存している。他の反応体とこ れらの活性の各々の一つを有する別々の酵素とを接触させることによりこれらの 活性を提供することが可能であるが、好適な形態では単一の酵素、すなわち逆転 写酵素を上に挙げた最後の三つの活性の主な源として使用する。例えば、この方 法の一つの実施態様では、コリファージＴ７からのＲＮＡポリメラーゼおよびモ ロネイマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）からの逆転写酵素を反応に用いて、１ ０¹²倍またはそれ以上までの増幅度を支持している。 増幅生成物の蓄積の速度は、そのような非同期的、連続的増幅法ではより複雑 であるが、反応成分の簡単な物理的性質に基づいて計算可能である。 増幅生成物の指数的蓄積はこれらのいずれの方法においても無限には進行しな い。存在する利用可能なコピーされるべき鋳型の数により存在する酵素が飽和す るため、新たなコピー生成の時間当たりの速度は極大に達する。従って、この系 での蓄積の速度は時間とともに指数的というより直線的なものに変化する。最後 には、製造される生成物の量は、増幅生成物に物理的に取り込まれるプライマー およびヌクレオシド等の基質の分子数により制限される。発明の要約 本発明はKacian et al.により記載された方法の著しい改良に関する。特に、 本発明はその方法の感度、すなわち、非常に少ない数しか存在しない所望の標的 配列を増幅する能力を改良するための方法に関する。 最高感度を達成するのに最も重要で支配的な障害は、非標的配列の増幅による 反応成分の競合であると考えられる。プライマーアニーリングおよび伸長は、プ ライマーと高度に相補的である標的配列上で最も有効であるべきであるが、プラ イマーの３’末端に相補的である数塩基のみを有する配列にプライマーが複合体 形成し、そこから伸長される可能性が熱力学的に予測されており、本分野で経験 的に知られている。非標的開始の部位当たりの頻度がたとえ低くても、反応中の 非標的塩基の数は、標的配列を選択するのに使用されるプライマーに相補的な標 的塩基の数よりも通常非常に多い。プライマーは開始生成物内に物理的に取り込 まれるため、本来の親配列が所望の標的とほとんど似ていない場合においても続 く相補的コピーはさらなる増幅のための非常に活性な鋳型でありうる。 異なるプライマー配列による開始の相対的特異性は非常に広範囲に変わり得る 。また、特異性は配列のみに基づいて信頼性を持って予測することはできないが 、日常の実験により好適な配列を同定することが可能である。しかしながら、上 記の考察は次のことを暗示する。すなわち、反応のある早い時点において非標的 アンプリコンの集団が標的特異的アンプリコンの集団よりも大きくなるであろう 可能性がより高くなるため、最良のプライマーについてさえも、非標的開始によ る妨害の可能性は標的分子の数が減少するにつれて重大になる。これらの集団の 大きさ間の相違は反応が進行するにつれて指数的に増幅されることができ、この ような場合には、標的特異的生成物が検出可能なレベルに達する前に、非標的増 幅による反応成分の消耗が反応の遅延または停止を起こす可能性がある。 二つの核酸配列間の塩基対複合体の安定性は温度が上昇するにつれて減少する ことが本分野ではよく知られている。ハイブリッド熱安定性は塩基対形成の程度 および連続性に依存するため、上記のことにより検出可能なハイブリッド形成特 異性が見掛け上増加する。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用しうることにより 、ＰＣＲについてより高い反応温度を使用することができる場合、標的特異的ア ンプリコンの収率の改良および非標的生成物の蓄積の減少が観察された（Saiki etal .,Science 239:487(1988)）。反応温度選択の柔軟性は通常の実験によるＰ ＣＲシステムの有効な最適化を簡便化してきた（Rychlik et al.，Nucleic Acid sRes. 18:6409(1990)）。しかしながら、非常に低い標的レベルの（例えば、＜ ５０）信頼できる検出のためのシステムの開発は挑戦すべきこととして残ってい る。 温度を上昇させることは一度形成された塩基対複合体の寿命を減少させるが、 より高い温度はまた分子間の衝突の速度を増加させて、伸長できる可能性がある 複合体を形成する。本出願人は、非標的プライミングの量が測定された最適条件 の上および下の両方の温度で増加することを見いだした。従って、温度制御のみ に基づいて所望の標的のための絶対的な特異性を期待することはほとんどできな い。 プライマー伸長の特異性を増強するために記載されている他の戦略には、化学 変性剤および一本鎖結合タンパク質の使用が含まれる。これらの戦略はいくつか の場合では有用であったが、統一的に良好な条件は記載されていない。 今の時点で、前記の三つすべての活性を保持する逆転写酵素の熱安定変異体は 知られていない。熱安定ＲＮＡポリメラーゼは記載されているが、Ｔ７ＲＮＡポ リメラーゼのようによく特徴付けされたプロモーター特異性を有しているものは ない。本分野では、所望する特性（熱安定性を含む）を有する酵素変異体をスク リーニングし、選択し、および／または遺伝子操作するための方法は知られてい るが、ここに開示される方法は開始特異性の増強、およびその結果としての標的 増幅の感度の増強の挑戦に対する別の解決法を提供する。これらの方法は、莫大 に過剰な非標的核酸存在下に少数の標的配列を有する組成物において特に有効で あり、さらに、高温処理とともに用いることができる。 ここに開示される方法は、アンプリコンネスティング（nesting）の概念を用 いるが、第一のプライマーの組を用いて行われた反応液の一部を第二のプライマ ーの組を含む新しい反応液に移すという、従来記載されている戦略とは著しく異 なるものである。ここに記載される方法においては、組合わさった（nested）ア ンプリコンの範囲を定めるすべてのプライマーは、新しい反応液へ生成物を連続 的に移さなくてもよいように単一の反応液中で混合することができ、さらに、最 適な様式は明らかにそれらの活性間の動的な調整により奨励される。 混合物中に存在するプライマーの数および型を増加すると、競合的な非標的増 幅を導くような反応を含む種々の副反応の可能性を有意に増加させる。加えられ た余分なプライマーはまた主体のプライマーの組の望まれる正常な機能を妨害す る可能性がある。従って、増強の程度が明確であるのみならず劇的な程度である 条件を同定することはできないことが予期された。本方法は、連続的過程を通し て機能し、二本鎖プライマー伸長生成物を熱的に変性するための熱処理を必要と しないまたは用いないことに注意されたい。 したがって、第一の態様において、本発明は、試験試料中の核酸鎖の標的配列 を増幅する方法を特徴とする。この方法は、試験試料からの核酸鎖を少なくとも 三つのオリゴヌクレオチドプライマーと同時に接触させることを含む。少なくと も一つのプライマーはプロモーター−プライマー（すなわち、核酸鎖またはその 相補体と相補的なプライマー領域、およびＲＮＡポリメラーゼによりその二本鎖 形が認識されるプライマー領域の５’の別の領域）であり、および少なくとも一 つの他のプライマーは核酸鎖と相補的であり、および一つの他のプライマーは核 酸鎖に相補的な鎖に相補的である。本方法はさらに、核酸鎖およびプライマーを 、ＲＮＡ指向性および／またはＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡポ リメラーゼ活性およびＲＮＡｓｅ Ｈ活性を有する一つまたはそれ以上の蛋白質 と、本質的に一定の温度で核酸鎖中の標的領域の増幅を可能にするプライマー伸 長条件下で接触させることを含む。 ”試験試料”には臨床、農業または環境試料が含まれ、それらは核酸鎖をプラ イマーとのハイブリッド形成に使用可能にするために前処理されていてもされて いなくてもよい。そのような鎖はここに記載された第一の接触工程の前に他の方 法により増幅されない。すなわち、本発明の方法は、そのような試料中の核酸を 増幅するために直接使用することができる。前もってＰＣＲまたはKacian et al .の方法により増幅する必要はない。本方法は、本質的にKacian et al.の方法を 特徴とするが、追加のプライマーにより非標的増幅を犠牲にして、著しくおよび 予想されなかったように標的増幅の増強が提供される。 ”オリゴヌクレオチド”とは、ホスホジエステル結合または本分野では既知の ホスホジエステル結合の類似結合を介して連結された少なくとも二つのヌクレオ シド残基を有する核酸分子を含む。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基部分 は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたは他の天然に存在す るまたは合成塩基誘導体、特に別の核酸配列中の相補的塩基と複合体を形成して 二本鎖核酸構造に関与することができる塩基でありうる。糖部分はリボース、デ オキシリボース、またはこれらの構造の誘導体または修飾形であろう。ホスホジ エステル部分の多くの誘導体が本分野では知られており、本発明において使用す ることができる。オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオシドではなく、例えば、 標識または固形支持体への連結基としてまたは他の機能性を提供するために使用 されるであろうドメインまたは残基を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは 、本分野ではよく知られた多くの方法を用いて、化学的に、もしくは核酸ポリメ ラーゼを使用することにより、または天然に存在する核酸を処理することにより 合成することができる。 ”プライマー”とは、適したヌクレオシド−５’−ホスホリル（または等価物 ）残基の共有結合による付加のためのレセプターとして核酸ポリメラーゼにより 使用される分子を意味する。プライマーの配列を制御し、それによりポリメラー ゼに影響を及ぼしてプライマーと相補的な配列に隣接する所望の標的配列をコピ ーすることが簡単であるため、３’末端が伸長可能なオリゴヌクレオチドをプラ イマーとして使用するのが都合がよい；しかしながら、いくつかの蛋白質等のプ ライミング活性を有する他の分子も知られている。 ”プロモーター−プライマー”とは、ＲＮＡポリメラーゼと相互作用してＲＮ Ａポリメラーゼに所望の鋳型の転写を起こさせることができる配列または構造的 特質をも有するプライマーを意味する。本実施例で使用されるプロモーター−プ ライマーは、例えばＨＩＶゲノム中の所望の標的に相補的である配列に連結され たＴ７ＲＮＡポリメラーゼのための有効なプロモーターの一部であることが知ら れている配列からなるオリゴヌクレオチドである。他のプロモーター配列も知ら れており、用いることができる。例えば、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターが含まれる。相対的に特異的な転写を 促進するために他の戦略を用いることもでき、これらもこのプロモーター−プラ イマーの定義に含まれることを意図するものである。例えば、ＤＮＡ鋳型、特に 発生期のＲＮＡ転写産物に似ているヘテロトリプレックス構造（時にはＲ−ルー プと呼ばれる）中の鋳型にハイブリダイズするＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｒ ＮＡポリメラーゼにより伸長され、所望の標的鋳型のＲＮＡ相補体が得られる。 ”標的領域”または”増幅標的”とは、連続的な核酸ポリマー化による配列ま たはその相補体の複製により増幅されることが望まれる連続するヌクレオチド残 基の配列を意味する。全標的領域のヌクレオチド配列を知る必要はないが、少な くとも一つの相補的プライマーおよび、標識された相補的プローブとのハイブリ ッド形成によること等による増幅生成物の特異的検出に使用しうる配列を設計す るのに十分な配列を知ることは役に立つ。 句”非標的核酸”には、そのような所望の標的領域中に含まれないすべての配 列が含まれる。これらには、例えば、標的領域と同一のゲノム上に存在する他の 配列、反応系に存在する他のゲノムからの核酸またはそれらの遺伝子生成物（例 えば宿主細胞からのまたは環境夾雑物からのもの）および反応系に計画的に添加 された核酸（例えばプライマー）が含まれるであろう。 好適な実施態様においては、核酸鎖は一本鎖ＤＮＡ鎖であるかまたは二本鎖Ｄ ＮＡの変性により一本鎖に変換されるものである；核酸鎖およびプライマーは、 最初に６０℃またはそれ以上で活性なＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と６ ０℃またはそれ以上で接触させ；第二の接触工程は、逆転写酵素およびＲＮＡポ リメラーゼの存在下４２℃またはそれ以上であり；四つのプライマーが第一の接 触工程で使用され；少なくとも一つのプライマーが他のプライマーと異なる濃度 で提供され；すべての酵素活性は逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼにより提 供され；しかしその酵素活性はＤＮＡポリメラーゼ活性を有しないＲＮｓｅＨに より補充されてもよく；ＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活 性を欠失しており、およびバシラス（Bacillus）種：例えば、種バシラス ステ アロテルモフィラス （Basillus stearothermophilus）またはバシラス カルド テナックス （Bacillus cardotenax）のＤＮＡポリメラーゼＩから誘導され；二 つの外側プライマーは前記核酸鎖またはその相補体に最大２０００、５００また は３５０塩基離れてハイブリダイズし；および一つのプライマーは１から１０μ Ｍの間の濃度で提供され、および別の前記プライマーは１０から５０μＭの間の 濃度で提供される。 別の好適な実施態様においては、二つのプライマーはプラス−センスプライマ ーであり、内側のプラス−センスプライマーはプロモーター−プライマーである ；または二つのプライマーはマイナス−センスプライマーであり、外側のマイナ ス−センスプライマーはプロモーター−プライマーである。位置および極性の参 照は図１の構造に関して下記の意味を有するように意図されており、標的領域が 見いだされる遺伝子系に慣用的な極性呼称には依存しない。従って、図１のＴ７ ４１１６および４１９６は、ここでは内側プライマーと考えられ；Ｔ７４３１２ および／または４００９は外側プライマーであると考えられる。プライマーのこ のアレイにより生じ得るアンプリコンに関して、内側プライマーにより範囲を定 められる標的領域内の配列は高度に増幅されることが期待される。なぜなら、一 つまたは両方の外側プライマーにより範囲を定められる増幅生成物は、相補的内 側プライマーによるアニーリングの標的であるが、逆は必ずしも正しくないから である。従って、図１の内側プライマーにより範囲を定められる標的領域は主標 的領域と考えられ、Ｔ７４１１６は主プロモーター−プライマーの例である。 主プロモーター−プライマーに相補的である内因性標的領域のセンスは負また はマイナスセンスと定義されており、同様に、同一の配列センスを有する存在す るその他の核酸もマイナス標的鎖である。したがって、主プロモーター−プライ マーは陽またはプラスセンスとして定義され、マイナスセンス核酸に相補的であ る存在するその他の核酸も同様である。標的領域を含む内因性鋳型の負の形が一 本鎖核酸分子（例えば、ＲＮＡ）であっても、これらの帰属が有効であることは 当業者には明かであろう。なぜなら、この鎖は相補鎖を独特のものとして特定す るための十分な情報を含み、そのような相補体は反応成分により合成できるから である。 本発明のその他の特色および利点は、下記の好適な実施例および請求の範囲の 記述から明らかになるであろう。好適な実施例の説明 最初に簡単に図について説明する。図 図１はｐｏｌ１標的領域の構造に対して相対的なプライマーの位置の図的表現 であり； 図２は増幅イニシエーション法ＩＭ１、ＩＭ２およびＩＭ３プロトコールの図 的表現であり； 図３は外側Ｔ７プライマーの伸長によるイニシエーションのための可能なスキ ームを示す図的表現であり；そして 図４は標的特異的イニシエーションをより効率的にすることを助けるであろう 、４００９プライマーの続いての伸長によるＴ７４１１６プライマー伸長生成物 の鎖置換活性の可能性を示す図的表現である。実施例 以下の実施例は本発明を制限するためのものではない。当業者はこれらの実施 例の変形は付随する請求の範囲に記載される本発明の範囲内であることを認識す るであろう。特に、試薬の特定の量およびそれらの比率、および使用された特定 の酵素および核酸を変化させて、任意の選択された標的を増幅することができる 。これらの実施例においては、ある種の用語は以下のように用いられる。 ”イニシエーション”とは、内因性鋳型配列がコピーされるかまたは標的領域 またはその相補体（これが所望の標的配列であるにしろないにしろ）のＲＮＡコ ピーへ効率的に転写できるような形へ変換される過程を意味している。Kacian e t al.の増幅法では、特定の標的におけるイニシエーションは、そのようなＲＮ Ａ生成物が反応工程のサイクルに鋳型として関与できるようになったときに完了 し、それは転写されて本質的に同じＲＮＡ分子を生成しうる鋳型のデノボ形成を 導くことができる。（このＲＮＡ分子はその前駆体と配列が同一ではないであろ うが、少なくともさらに増幅されるのに十分な配列類似性を保持している。） ”アンプリコン”とは、増幅サイクル中の一つの反応の生成物であり、さらな る増幅のために鋳型として働く能力を保持している核酸を意味する。 ”プレイニシエーションされた鋳型”とは、アンプリコンの性質を有している 核酸を表すために使用される。すなわち、これは最初にイニシエーション反応の 一つに関与することなく増幅サイクル中の一つの反応の鋳型として働くことがで きる。プレイニシエーションされた鋳型はまさに前の増幅反応のアンプリコン生 成物であるか、またはＰＣＲ、化学合成またはクローニング等の方法によりアン プリコン活性の実験モデルとして合成的に構築されるであろう。 上で示唆したように、増幅反応は二つの段階を有するものとして認識できる。 一つの段階はコピーされるかまたは機能性アンプリコンに変換されるべき内因性 鋳型を生じる反応工程を含み、第二の段階は本質的に周期的な増幅過程の一部で ある工程を含む。増幅工程の中間体および生成物は、本来の内因性鋳型にかかわ らず本質的に類似するが、使用されるイニシエーション工程は内因性鋳型の性質 に依存している。Kacian et al．（上記文献）の標的増幅法に対する種々のイニ シエーション戦略が以前に記載されている；ここで便宜のためにそのいくつかを 簡単に説明し、図２に図式的に示す。 図２を参照すると、イニシエーション法１（ＩＭ１）は内因性鋳型がＤＮＡで あるイニシエーション法を表している。プロモーター−プライマーが相補的標的 にアニーリングしうる条件下、ＤＮＡポリメラーゼ活性を加えてプロモーター− プライマーの伸長による標的鋳型に対する相補体を合成する。反応液を加熱して （例えば、９５℃）二本鎖ＤＮＡ生成物を変性させ、第二のプライマーが新たに 合成された伸長生成物上の相補的配列にアニーリングしうる温度まで冷却する。 適した酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および任意にＲＮＡｓｅ Ｈ）を添加した時、第二のプライマーはＤＮＡポリメラーゼ活性により伸長され ることができ、プロモーターに連結された標的領域の二本鎖コピー、すなわちＲ ＮＡポリメラーゼのための活性な鋳型が生成される。 イニシエーション法２（ＩＭ２）は内因性鋳型がＤＮＡであるイニシエーショ ン法を表している。最初のプライマー伸長生成物を変性させるために反応液を加 熱しなくても、単に酵素（ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および任意にＲＮア ーゼＨを含む）の添加だけで効率的なイニシエーションが十分に得られる。等温 反応液中の固有の過程を通じて適格なアンプリコンが反応液中に生成する。 イニシエーション法３（ＩＭ３）は内因性鋳型がＲＮＡであるイニシエーショ ン法を表している。反応系を組み立て、単一の酵素（例えばＲＮＡポリメラーゼ 、逆転写酵素および任意にＲＮＡｓｅＨを含む）を添加する。プロモーター−プ ライマーの最初の伸長の二本鎖生成物はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。Ｒ ＮＡ鎖は存在するＲＮＡｓｅＨの基質であり、分解されて標的領域に連結された プ ロモーターの一本鎖コピーが得られ、次にこれは上記のように第二のプライマー の伸長のための鋳型となる。 術語”反応失敗”または”増幅失敗”は、ここで使用される限り、増幅が起こ らなかったことを示すことを意味するのではなく、単に所望の標的配列のコピー が生成物の中で検出できなかっただけである。このことは分析される核酸の中に 所望の標的がなかったことを示しているであろう。これはまた、十分に有効でな かった標的特異的イニシエーションまたは増幅から生じたものであろう。例えば 、たとえ多くの特異的イニシエーションが起こったとしても、もし非標的配列上 のイニシエーションにより過剰の競合的アンプリコンが生成すれば、標的特異的 イニシエーションは有効でないかもしれない。下記の実施例に示されるように、 本発明は現存する方法の十分な改良を提供し、反応中間体を変性させるための追 加の加熱工程を必要とせずに試料中の標的核酸の１−５程度の少ないコピーの検 出を可能とする。一般法 この節に記載される操作またはそのわずかな変更を下記の実施例のほとんどに おいて使用した。例外および修正は各々の実施例に詳しく説明されている。 以下はＩＭ２増幅反応の例である。 １）以下の成分を含む溶液を調製し、２５μｌの容量に分配した： ２００ｍＭ トリス・ＨＣｌ（約２０−２５℃でｐＨ８．０） ７０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ８ｍＭ スペルミジン ０．４ｍＭ デフェロキサミン メシレート ２５ｍＭ ＧＴＰ＆ＡＴＰ各々 １０ｍＭ ＵＴＰ＆ＣＴＰ各々 ０．８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各々 ０．６μＭ Ｔ７４１１６プロモーター−プライマー １．２μＭ ４１９５プライマー ２０％（ｖ／ｖ） グリセロール 実施例に使用されたプライマーは図に示されている。それらは以下の配列を有 している：配列ＩＤ番号１（４００９）：5'-ATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAA-3'；配 列ＩＤ番号２（Ｔ７４１１６）：5'-[AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA]CAAATGGCAG TATTCATCCACA-3'；配列ＩＤ番号３（４１９５）：5'-GTTTGTATGTCTGTTGCTATTAT- 3'；および配列ＩＤ番号４（Ｔ７４３１２）：5'-[AATTTAATACGACTCACTATAGGGAG A]CCCTTCACCTTTCCAGAG-3'。（プロモーター配列は括弧内に示されており、本発 明において他のプロモーターを使用することができる。） Ｔ７４１１６、４１ ９５およびＴ７４３１２のＨＩＶ配列は以前に開示されている（McDonough et a l、米国特許出願第０８／０４０，７４５、ここに引例として含まれている）。 ２）この混合物に分析されるべき核酸を含む５０μｌの試料を加えた。モデル 参照系試料は、８０ｍＭの酢酸カリウムに溶解した１から１０μｇの精製ヒト白 血球（ＷＢＣ）ＤＮＡを含む。ＷＢＣ ＤＮＡは種々の既知の方法により調製す ることができる（Maniatis et al.，Molecular Cloning，a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1982参照）。もしくは 、実施例４に記載したように調製された５０μｌの加水分解ＷＢＣ溶解物を使用 した。反応液には陰性対照の場合には５μｌの水を加え、増幅効率試験のために は既知の量の精製クローン化ＨＩＶ核酸を含む５μｌの溶液を加えた。 ３）混合物を９５℃に加熱し、この温度に５分間維持した。次に４２℃に移し 、この温度まで放置して冷却させた。 ４）８００ＵのモロネイＭｕＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）および４００ＵのＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼを含む２０μｌの溶液を、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８． ０）、１０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよ び２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む溶液に加えた。 ５）これを軽く混合し、４２℃で２時間インキュベートした。 ６）意図する標的配列を含む増幅生成物の生成は、特異的ハイブリダイゼーシ ョン法を用いて決定した。ここに記載したすべての実験について、ハイブリダイ ゼーション保護アッセイ（Arnold et al.，Clin.Chem．35:1588(1989)およびＰ ＣＴ／ＵＳ８８／０３１９５）を使用した。 下記の実施例においては、特に指示しない限り、ＩＭ２実験においてｐｏｌ１ プライマーは上に掲げた濃度で使用した（すなわち、１００μｌ反応液当たり１ ５ピコモルのＴ７４１１６および３０ピコモルの４１９５）。ｇａｇ１１プライ マーを使用した場合は、１００μｌ反応液当たり各々３０ピコモルのＴ７８１１ および８７２を加えた。 基本的ＩＭ２法の以下の改良法を用いて、増強されたイニシエーション効率の ための戦略を試験した。 １ａ）反応成分の混合物をＩＭ２法の工程１に記載されたように調製した。任 意に、追加のオリゴヌクレオチドを外側プライマーとして添加した、例えば、ｐ ｏｌ１増幅について各々反応液当たり３ピコモルの４００９およびＴ７４３１２ 。 ２ａ）この混合物に、分析されるべき核酸を含む５０μｌの試料を加えた。モ デル参照系試料は、８０ｍＭのＫＯＡｃに溶解した１から１０μｇの精製ヒトＷ ＢＣ ＤＮＡを含む。もしくは、実施例４に記載したように調製された５０μｌ の加水分解ＷＢＣ溶解物を使用した。反応液には、陰性対照については５μｌの 水、または既知の量の精製クローン化ＨＩＶ核酸を含む５μｌの溶液を加えた。 ３ａ）混合物を９５℃に加熱し、この温度に５分間維持した。次に６０℃に移 し、この温度まで放置して冷却した。 ４ａ）任意に、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ酢酸カリウ ム、１００ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび２０％（ｖ／ｖ）グリセ ロールを含む溶液に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを溶解した溶液１０μｌを加え た。試験された酵素およびその望ましい性質は、以下の実施例において記載され る。 ５ａ）反応液を軽く混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。 ６ａ）反応液を４２℃に移し、この温度まで放置して冷却した。 ７ａ）８００ＵのモロネイＭｕＬＶ逆転写酵素および４００ＵのＴ７ＲＮＡポ リメラーゼを含む溶液１０μｌを、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ ０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび２０％ （ｖ／ｖ）グリセロールを含む溶液に加えた。 ８ａ）反応液を軽く混合し、４２℃で２時間インキュベートした。 ９ａ）意図する標的配列を含む増幅生成物の生成は、ハイブリダイゼーション 保護アッセイ（Arnold et al.、上記文献）等の特異的ハイブリダイゼーション 法を用いて決定した。 用いた外側プライマー（用いた場合には）、およびそれらの濃度は各々の実施 例に記載される。 イニシエーション効率の最も有用な指標は、個々の反応における増幅の程度よ りむしろ特定の鋳型レベルに対する反応失敗の頻度であることが見いだされた。 従って、試験した各々の条件について、改良されたイニシエーション効率が失敗 頻度の統計的に有為な減少により同定できるように、多複製反応を用いて実験を 組み立てた。さらに、複製反応のシグナルの幾何平均（Ｇ．Ｍ．）はイニシエー ション効率と良く相関し、ほとんどの実施例で示されている。 実施例に記載される実験で使用したＨＩＶ鋳型は、ＨＩＶ配列のプラスミドク ローンを含む大腸菌から標準的な方法で精製した（例えば、Maniatis et al.上 記文献を参照されたい）。ＢＨ１０ ＤＮＡを特定する実験においては、鋳型は 、本質的にGenbankにＨＩＶＢＨ１０２（受入番号Ｍ１５６５４号）として記載 されている８９３２のヌクレオチド配列に相補的鎖を加えた精製二本鎖線状ＤＮ Ａであった。他の実験では、標準ｐＵＣクローニングベクター中にＢＨ１０のｇ ａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む線状化プラスミドＤＮＡ（ｐＵＣＨＩＶ）を使用 した。両方の鋳型とも並列比較において分子当たり実質上同一の鋳型活性を有し ていた。 精製後、各々の調製物試料により吸収される２６０ｎｍ紫外光の量（Ａ₂₆₀） を測定することにより、これらの調製物中のＤＮＡ濃度を決定した。これらのＤ ＮＡ化学種の各々のヌクレオチド配列（従ってその長さ）は既知である。そのよ うな調製物のモル濃度は標準変換因子を適用することにより決定した：二本鎖Ｄ ＮＡの質量濃度＝５０μｇｍｌ^-1Ａ₂₆₀ ^-1；二本鎖ＤＮＡの分子量＝長さ（ｂｐ ）ｘ６５０ｇ ｍｏｌ^-1ｂｐ^-1。５μｌ当たり≧１０⁸鋳型濃度での鋳型ＤＮＡ 保存溶液（３３ｐＭ）を別々のアリコートに分けて凍結した。各々の増幅実験に ついて鋳型のアリコートを融解し、反応液に添加するため所望の作業濃度に連続 的に希釈した（例えば、５μｌ当たり５の鋳型）。融解したアリコートおよび希 釈物は各々の実験後に廃棄した。実施例１：イニシエーション効率 イニシエーション効率に対する種々の反応パラメーターの影響を定量的に評価 するため、与えられた変化に応答する増幅効率とイニシエーション効率の変化と を区別する方法を開発することが望まれた。このことは、例えば、最適の増幅実 施に好まれる条件は、最適なイニシエーション効率が得られる条件には必要とさ れないことが見いだされたため、必要であった。これを達成する一つの方法は、 種々の反応組成物または処理概要の固有の増幅実施の指標として、反応液にプレ イニシエーションされた鋳型を加えるか、または、これらの結果を天然の標的配 列の添加により生じる増幅の結果と比較することであった。 この方法を用い、非標的配列の増幅と競合せず、標的由来のアンプリコンのイ ニシエーションがいかに迅速かつ広範囲にちがいないかを決定することが可能で あった。増幅の経時変化を実施した。ここでは、反応系を種々の所望の試験条件 に従って組み立てたが、標的鋳型は除かれている。ＲＴおよびＲＮＡポリメラー ゼ酵素の添加により反応が開始した後の種々の時間に鋳型を加え、生じる最終的 な増幅程度を下記のように決定した： １）下記の成分を含む混合物を調製し、この溶液の８５μｌを各々の反応管に 分配した。掲げた濃度は全反応液１００μｌ中の各々の濃度を示している。 ５０ｍＭ トリス・ＨＣｌ（室温でｐＨ８．０） １７．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ ジチオスレイトール ２ｍＭ スペルミジン ６．２５ｍＭ ＧＴＰ＆ＡＴＰ各々 ２．５ｍＭ ＵＴＰ＆ＣＴＰ各々 ０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各々 ０．３μＭ Ｔ７４１１６プロモーター−プライマーおよび４１９５プ ライマー各々 ３μｇ ヒトＷＢＣ ＤＮＡ ２）反応液を９５℃に７分間加熱し、３７℃に移し、５分間放置してこの温度 まで冷却させた。 ３）モロネイＭｕＬＶ逆転写酵素（６００Ｕ）およびＴ７ ＲＮＡポリメラー ゼ（４００Ｕ）を、緩衝液（１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、１０ｍＭ 酢酸カリウム、および５ｍＭのジチオスレイトール）１０μｌ中の各々の反応液 に加えた。 ４）酵素添加後の種々の時間に、１００コピーの一本鎖ＢＨ１０ ＤＮＡ（精 製クローン化ＨＩＶ ＤＮＡ、前もって煮沸により変性させた）または１０コピ ーのプレイニシエーションされた鋳型を５μｌの容量で各々の反応液に加えた。 それぞれの時間点および条件の３つのレプリカを処理した。 ５）２時間後、標的特異的増幅生成物の収量をハイブリダイゼーション保護ア ッセイ（Arnoldら、上記文献）により決定した。 各々の条件についての３つのレプリカのシグナルの幾何平均の分析は、もし非 標的核酸の存在下、標的核酸の非存在下に、１０分という短い時間に増幅生化学 が進行すれば、１０個のプレイニシエーションされたアンプリコンでさえも検出 可能なレベルには増幅できなかったであろうことを示している。さらに、プレイ ニシエーションされた鋳型について観察されたような増幅の経時変化と本質的に 同様な変化を達成するには、約１０倍以上の内因性鋳型が必要とされた。この相 違は、プレイニシエーションされた鋳型が増幅サイクルに速やかに入るのに対し 、すでに存在している非標的アンプリコンは、コピーされるべき天然の鋳型がイ ニシエーション反応を経て増幅可能形になるために必要な時間の間、指数的に蓄 積を続けることにより説明される。これらの条件の各々について、増幅過程を始 めるために逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼを添加して３−５分後以内に標 的特異的増幅能力の９０％以上が失われた。非標的プライミングおよびイニシエ ーションの有意なレベルを期待していたにもかかわらず、効果的なイニシエーシ ョンのためのこの機会の枠の非常な短さは非常に驚きであった。ここで、並びに 多くの同じような実験において観察された傾向は、阻害が、高レベルの非標的イ ニシエーションに由来する増幅による必須の反応成分の過剰な消耗によるためで あることを示唆している。 Kacianら（上記文献）により記載されている方法の通常の最適化により開発さ れた増幅システムを用いて、多くの場合比較的低い標的レベルを検出することが 可能であった。例えば、ＩＭ２法およびｐｏｌ１プライマーの組を用いて、≧５ ０ＨＩＶゲノムを含むほとんどすべての試料、および２０ＨＩＶゲノムを含む約 ２／３の試料を検出することができた。この性能は非常に強力な増幅を反映して おり、ほとんどの目的に適用できるであろう。しかしながら、さらに高い感度が 望まれる場合があ。ＨＩＶはその核酸が全血等の感染組織中に非常に低濃度でし か存在しない病原体の一つの例である。ＨＩＶ核酸の信頼できる検出には、少な くとも一つの標的が存在することを確実にするため、時にはかなりの試料量（例 えば、≧０．１−１ｍｌまたはそれ以上の血からのＷＢＣ）を必要とする。その ような試料からの核酸抽出物は、非標的ＤＮＡが＞２０μｇ存在する中に一個の ＨＩＶゲノムを含むであろう。実施例１で明らかにしたように競合的非標的増幅 の非常に攻撃的な特性は、そのような試料における標的の検出が非常に挑戦する のに値する目標であり、通常の実験では期待できなかったことを明らかにしてい る。実施例２：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ この実施例は、ここに記載した原理の応用により有意の感度の増加を達成しう ることを示している。表１に示した試料ＡおよびＢヲ、上記の一般法に記載した ような標準ＩＭ２法を用いて処理した；すなわち、試料を９５℃から直接４２℃ に冷却し、逆転写酵素／Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ混合物を添加して反応を開始 した。試料（Ｃ−Ｆ）は、前に記載したように９５℃から６０℃に冷却し、２Ｕ のＢ．ステアロテルモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂ ｓｔ ）ＤＮＡポリメラーゼを各々に加えて１０分間インキュベートした。次に試 料を４２℃に冷却した後、逆転写酵素／Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ混合物を添加 した。各々の反応液に、反応液当たり平均５つの鋳型になるように希釈した精製 クローン化ＨＩＶ ＤＮＡ（ｐＵＣＨＩＶ）を加えた。 生成した標的配列の量は、表１−７において相対的光単位（ＲＬＵ）、すなわ ち検出プローブ上の化学発光標識から得られる信号の量で表現されている。 陰性対照（ｐＵＣＨＩＶなし）のＲＬＵ値は、これらの各々の条件について（ Ａ−Ｆ）各々２５９１、３０９７、２４７１、３５６９、３４５９および６０３ ０であった。 これらの結果は、Ｂｓｔポリメラーゼによる高温イニシエーション工程（Ｃ） を用いるかまたは４２℃でも外側プライマーが含まれていると（Ｂ）、各々単独 でイニシエーション効率を増強しうることを示している。最も劇的な増強は、外 側プライマーのいずれかの存在下、６０℃補充イニシエーション工程を実施した 時（Ｄ、Ｅ）に観察され、最良の条件は両方の外側プライマー、並びにＢｓｔＤ ＮＡポリメラーゼを用いる６０℃補充イニシエーションを含むものであった（Ｆ ）。実施例３：プライマー滴定 この実施例は、増強されたイニシエーション系のいくつかの驚くべき性質を示 しており、それはこれらの増強が従来の技術からでは自明でも予測可能でもない とを明らかにしている。 外側プライマーの最も有効な濃度を滴定により決定した。この実施例において は、表２に示されているように、Ｔ７４３１２プロモーター−プライマーおよび ４００９プライマーの両方が等モルレベルで含まれていた。この実験はまた、イ ニシエーション増強が主としてプライマーネスティングによるものか、高温度工 程のみによるものか、ＤＮＡポリメラーゼ存在下での高温インキュベーションに よるものか、またはこれらの因子のいくつかの組み合わせによるものかを決定す ることも意図していた。Ｂｓｔポリメラーゼおよび外側プライマーを含まない反 応条件（Ａ）を、上記一般法で概説したような標準ＩＭ２法イニシエーション（ すなわち、６０℃工程なし）を用いて実行した。他のすべての試料には６０℃イ ンキュベーション工程を施し、Ｂｓｔポリメラーゼが反応液に含まれる場合と含 まれない場合があった。 表に示した各々の試料には、平均で５分子のｐＵＣＨＩＶ ＤＮＡを加えた。 陰性対照もまた各々の反応条件で行った；陰性対照に対するＲＬＵ値はＡ−Ｇに ついて各々１４８１、３０７３、１８８８、１５７９、２１５０、１６８５、お よび２０３８であった。 前記のごとく、反応に含まれる余分なプライマーは、標的配列上の余分なイニ シエーションを促進することにより標的特異的増幅を阻害することが可能である 。このような反応中の余分なプライマーによる所望の増幅の妨害の可能性がここ で観察されている、すなわち、より高い温度のプレイニシエーション工程なしに 各々０．５または１ピコモルの外側プライマーを用いる反応において（Ｂ、Ｃ） 。対照的に、各々３ピコモルの外側プライマー（Ｄ）からは、標準ＩＭ２イニシ エーション条件（Ａ）よりも著しく良好なイニシエーション効率が得られた。６ ０℃プライマー伸長工程が含まれると（Ｅ−Ｇ）、組み合わされた（nested）プ ライマー戦略が有効な範囲が広がったのみでなく、前の実施例のように最良の外 側プライマー条件（Ｇ）との相乗効果により印象的なイニシエーション効率が得 られた。実施例４：粗溶解物 この実施例は、適当な処理後の患者の試料の典型である粗溶解物に応用された 場合、イニシエーション増強が機能的であるだけではなく、より価値を有するこ とを示している。そのような溶解物の複雑で変化しやすい化学組成のため、少な くともいくつかの増幅法では精製された成分を含む系よりも溶解物では効率が悪 いことが典型的である。従って、モデル参照系反応のような精製された成分を含 む反応系と同じような標的レベルでも、信号はおそらくしばしばより低くおよび ／または観察されないであろう。 １）抗凝血物質としてのＥＤＴＡで処理された全血を、０．２５Ｍスクロース 中に１．１１０ｇ／ｍｌの密度でパーコールを含む等量の密度遠心分離培地（Ｄ ＣＭ）と混合した。混合物は１６００×ｇで２０分間遠心分離した。 ２）平衡化混合物のメニスカスに形成されたバンドをピペッティングすること により、単核ＷＢＣ（ＭＮＣ）を採取した。ＤＣＭ／ＭＮＣ懸濁液を等量の０． １４Ｍ ＫＯＨと混合し、良く混ぜて９５℃で３０分間加熱した。 ３）室温まで冷却後、得られた加水分解物に： ０．６５Ｎ 酢酸 ０．０６６Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン［トリス塩基］ ０．０８４Ｍ トリス・ＨＣｌ を含む溶液を１０分の１容量加えてｐＨ８．０±０．５に調整した。 ４）増幅反応液にこの溶解液を５０μｌ、または１μｇの精製ヒトＷＢＣ Ｄ ＮＡの８０ｍＭ酢酸カリウム溶液を５０μｌ（比較系）加えた。 試験反応には表３に示した数のｐＵＣＨＩＶ鋳型を加えた。各々の条件（Ａ− Ｄ）に対して１回の陰性対照反応を行い、これらの値は各々２９８８、２１７９ 、５７４０および５６０２ＲＬＵであった。 参照系（標準ＩＭ２）（Ａ）の結果は良好なイニシエーション効率を示したが 、増強系（Ｂ）は有意により良好であるのは明らかである；これらの条件下、１ ０の信号すべてが事実上飽和している。さらに、溶解物試料の結果（Ｃ、Ｄ）は 、 イニシエーション増強を用いることによりいかに多くの利点が達成できるかを非 常に明瞭にしている。実施例５：外側プライマー この実施例は、溶解物の存在下、低い標的レベル（３ｐＵＣＨＩＶ）の挑戦的 条件のもとでの各々の外側プライマーを用いて得られた増強効果の再試験である 。すべての反応にＩＵのＢＳｔ ＤＮＡポリメラーゼを加え、６０℃で１０分間 インキュベーションした。使用した外側プライマー（反応当たり各々３ピコモル ）および試験された組み合わせは表４の最初の列に示されている。プライマー４ ３１２ｂはＴ７４３１２と同様にＨＩＶに相補的な配列と同一の配列を有するが 、プロモーター配列を有していない。 各々の条件について、１０個のレプリカ反応から得られたＲＬＵ値を表４に示 す。表４の最下列はその条件の個々のレプリカの結果の幾何平均を示す。各々の 条件（Ａ−Ｅ）について、陰性対照の結果は各々７７６、２８５０、４０５３、 ３８７５および４１２６ＲＬＵであった。 実施例２で以前に見られたように、これらの結果は、４００９不在下でも外側 プロモーター−プライマーＴ７４３１２が増強されたイニシエーションを促進す ることができることを示している。さらに、相同的非プロモーター−プライマー ４３１２ｂが外側プライマーなしの対照条件ではイニシエーションを有意に促進 しなかったため、これらの結果はＴ７４３１２の増強能力はプロモーター部分か らの恩恵であることを強く示唆している。これらの結果を説明する一つの可能な 機構は図３に示されている。Ｔ７４３１２が通常の方法でその相補体上に伸長さ れることによりＩＭ２過程をイニシエーションしうることはありそうである。主 プロモーター−プライマーＴ７４１１６によりプライミングされる正常のイニシ エーション工程は異なった鎖で起こるため、これは上述の工程により妨害される はずがないことに注目されたい。 Ｔ７４３１２はより低い濃度で存在しているため、この反応におけるＴ７４３ １２によるイニシエーションは、Ｔ７４１１６によるものより効率的ではないこ とが予測されるであろう；しかしながら、首尾よく完了したＴ７４３１２イニシ エーションは多数の一本鎖ＲＮＡを生じ、それらはＴ７４１１６による高度に効 率的なＩＭ３型イニシエーションの鋳型であり、反応の初期の段階の間に反応性 を有するｐｏｌ１アンプリコンの蓄積を著しくかつ好ましく加速することができ る。両方の鎖上の高度に効率のよい転写は有効な増幅を阻害することが観察され ているため、外側プロモーター−プライマー（例えば、Ｔ７４３１２）が内側プ ロモーター−プライマー（例えば、Ｔ７４１１６）よりも反応においてより低い 活性を有することがおそらく望ましい。 異なる配列は、同一の濃度においてさえもその各々の相補体へのハイブリッド 形成の異なる速度を有することができることに注目されたい。従って、二つの異 なるオリゴヌクレオチド配列に対するプライミング活性の比はそれらの濃度の比 と同一ではないであろう。しかしながら、二つの異なるプロモーター−プライマ ーの相対的な活性の最初の見積としてはモル濃度が有用であり、最適の比は通常 の実験により決定することができる。さらに、ハイブリッド形成速度を定量する ための方法は本分野ではよく知られており、有効濃度の明かな例外の解決に使用 できる。 Ｔ７４３１２の伸長によりイニシエーションされた転写的に活性な化学種の形 成の完了に働くであろうという役割（図３に図解されている）に加えて、４００ ９がイニシエーション効率を改良していることは明かである。非プロモーター− プライマー４３１２ｂと対を形成する時でさえも、４００９の存在はこの実験に おいて明かな促進を起こすだけでなく、それはいずれかの４３１２化学種の不在 下でも実施例２における増強されたイニシエーションも促進させた。 これらの観察と一致する可能な促進機構が図４に示されている。ここで、プラ イマー４００９はＤＮＡ合成をプライミングすることができ、これは内側プロモ ーター−プライマーＴ７４１１６から伸長された以前に合成されたＤＮＡを置換 しうる。外側プライマーが最初に伸長され、主標的領域を二本鎖にして内側プロ モーター−プライマー（例えば、Ｔ７４１１６）によるイニシエーションができ ないようにすることがないように、この外側プロモーター−プライマーは内側プ ロモーター−プライマーよりも低い活性を有することが望ましい。実施例６：ＤＮＡポリメラーゼ特性 この実施例で示されている実験は、補充したＤＮＡポリメラーゼの熱安定性以 外の性質がイニシエーション増強機構に重要であるかどうかを決定するために行 った。表５に示された結果は各々それ自体の目的を有する三つの異なった実験か らのものであるが、各々の酵素の相対的長所を判断するために参照系として比較 しうる同様の対照を各々含む。”ナシ”と付けた下段の群のＲＬＵ値は、外側プ ライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリメラーゼなしでインキュベートされた標準Ｉ Ｍ２反応からのものである。”Ｂｓｔ−１”と付けられた中段の群は、一般法に 記載され、およびBio-RadからのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した増強イ ニシエーション法を用いて処理した。上段の群は、カラムの頭に示した別の熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼの一つに置換した同じ増強イニシエーション法の結果を 示している。”Ｂｓｔ−２”は第二の販売元（Molecular Biology Resources） からのＢｓｔポリメラーゼの試料を示している；”Ｂｃａ”はバシラス カルド テナックス （Bacillus caldotenax）からのＤＮＡポリメラーゼ（Takara）に対 応する；”ＲＥＰＬＩＴ−ＨＥＲＭ^TM”はEpicentreから入手可能なＤＮＡポリ メラーゼである；”ＫＬＥＮＴＡＱ^TM”ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｂペプチド）は 以下に記載するようにテルムス アクアチカス（Thermus aquaticus）ＤＮＡポ リメラーゼの誘導体である。試料はすべて一般法に記載した増強イニシエーショ ン法を用いて取り扱った。示された各々のＤＮＡポリメラーゼを、１０分間の６ ０℃インキュベーション工程で使用した。反応液はＷＢＣ溶解物を含むか、また は参照系であり、表５に示された平均鋳型接種物を加えた。 表５は、Ｂｓｔ以外のいくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼもまた外側プラ イマーと提携して増強されたイニシエーション効率を支持することができること を示している。別の実験において、いくつかの他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ は組み込まれたプライマーと共働して作用せず、促進されたイニシエーションが 得られないように思われた。これらにはテルムス アクアチカス（Thermus aqua ticus ）（Ｔａｑ）、テルムス フラバス（Thermus flavus）（Ｔｆｌ）、テル ムス テルモフィラス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）、テルモコッカス リトラリス （Thermococcus litoralis）（Ｖｅｎｔ^TM、New England Biolabs） またはＲｅｔｒｏｔｈｒｍ^TM（Epicentre）からの天然のＤＮＡポリメラーゼが 含まれる。これらのいくつかは、外側プライマーなしで反応の最初の１０分の６ ０℃プライマー伸長工程に用いた場合、標準ＩＭ２と比較して改良されたイニシ エーション効率を与えた；しかし、この改良は上述の完全に増強された系と同等 の程度になることはなかった。 完全な促進イニシエーションを支持した４つのポリメラーゼ酵素は、少なくと も一つの共通の性質を有している。すなわち、それらの効率に寄与するであろう ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠失している。Ｂｓｔ、ＢｃａおよびＫＬ ＥＮＴＡＱは各々大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの相同体である。これらの群の酵 素に通常観察される５’→３’エキソヌクレアーゼは、両方の販売元によりＢｓ ｔ の精製の間に蛋白質分解により除去される。ＢｃａおよびＫｌｅｎＴａｑは両 方ともこの活性に欠陥のある突然変異体遺伝子の各々のクローンからの発現によ り製造される。ＲＥＰＬＩＴＨＥＲＭはその販売元からエキソヌクレアーゼ活性 が欠失していると報告されている。この相関から、増強機構が５’→３’エキソ ヌクレアーゼ欠失から恩恵を受けることが示唆され、Ｔａｑポリメラーゼの天然 の親形に比較して優れたＫＬＥＮＴＡＱの効力によりさらに確証される。 これらおよび他の実験において、バシラス（Bacillus）種からの三つのポリメ ラーゼはＲＥＰＬＩＴＨＥＲＭまたはＫＬＥＮＴＡＱよりもより一貫した、安定 な増強を支持するようであった；従って、これらの三つの関連する酵素はそれら を他の二つから区別する性質を共有しているのであろう。一つの可能性は、ＤＮ Ａポリメラーゼ間で異なることが知られている効率的鎖置換活性が図４に示した ような機構に寄与しているかもしれないことであるが、他の可能性も排除できな い。 これらの洞察は、完全増強系により与えられた恩恵は、単に熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼにより可能となった高められたプライマーアニーリングストリンジェ ンシーという簡単な窓口に依存するのみではなく、ここに形成されたような系が 従来の技術からでは自明ではなく予測できない機構的利点を有することを示して いる。実施例７：他の標的領域 ｐｏｌ１以外の標的領域についてもイニシエーション増強を試験し、これが働 くことが示された。ここに示した内側標的領域はｇａｇ１１と称され、プロモー ター−プライマーＴ７８１１および非プロモータープライマー８７２を使用した 。組み込まれているｇａｇ１１標的領域のためのプライマー配置は図１に対応し 、４００９、Ｔ７４１１６、４１９５およびＴ７４３１２を各々７８０、Ｔ７８ １１、８７２およびＴ７１０６２に置換した。これらのプライマーの配列は： 配列ＩＤ番号：５（７８０）：5'-TGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCA-3' 配列ＩＤ番号：６（Ｔ７８１１） 5'-[AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA]AGTGACATAGCAGGAACTA-3' 配列ＩＤ番号：７（８７２）： 5'-AGATTTCTCCTACTGGGATAGGT-3' 配列ＩＤ番号：８（Ｔ７１０６２）： 5'-[AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA]TTGGACCAGCAAGGTTTCTGTC-3' ここで括弧内の配列は以前に記載されているような（Kacianら、上記文献）Ｔ７ プロモーター配列に対応している。上記のように、プロモーター部分は他の機能 的プロモーター配列に置換することができる。Ｔ７８１１および８７２のＨＩＶ 配列はMcDonoughら（上記文献）により開示されている。 この実施例においては、８７２は３０ピコモル／反応で使用した。主プロモー ター−プライマー、Ｔ７８１１、および外側プライマーＴ７１０６２および７８ ０は示された濃度で存在した。もしくは、反応を、反応当たりＩＵのＢＳｔ Ｄ ＮＡポリメラーゼを用いて、一般法に記載したように取り扱った。 すべての反応は実施例４に記載したような５０μｌのＫＯＨ−加水分解溶解物 を含み、陽性反応には平均で５のｐＵＣＨＩＶ鋳型を加えた。これらの条件（Ａ −Ｈ）の各々に対する陰性対照の結果は、各々５６８２、６５０１、５７７５、 ４９５４、５６８９、５１４０、５０７９および４８０５ＲＬＵであった。 この実施例は各々のプライマーを独立して滴定することの恩恵を示している。 この結果および他の類似の実験の結果は、前に議論したような、外側プライマー の最適濃度は内側プライマーの濃度より低くなければならないという予想と一致 した。さらなる最適化により、次の実施例のデータに示されるように、ｇａｇ１ １イニシエーション増強はさらに改良された。実施例８：マルチプレックス増幅 ある場合には同じ反応で二つまたはそれ以上の異なる標的領域を増幅すること が望まれる。各々が別の標的領域の範囲を定めている二つまたはそれ以上のプラ イマーの組の対を含むような、”マルチプレックス”増幅反応は本分野では既知 である。そのような反応においては、各々の標的領域は、各々の標的領域が別々 の反応で増幅される場合よりも低く増幅することが最も一般的である。増幅反応 成分に対し両方（または全部）の真の標的アンプリコンが互いに競合するだけで なく、非標的イニシエーションおよび競合的増幅の可能性が（約）ｐ_p×ｐ_t（こ こでｐ_pは反応液中のすべてのプロモーター−プライマーの総濃度であり、ｐ_tは 存在するすべてのプライマーの総濃度である）、またはすべてのプライマーがイ ニシエーションに対して機能的に等価である通常のＰＣＲのような場合は〜ｐ_t ² だけ増加するに違いない、。 これらの複雑性は、非常に低い鋳型レベルについて信頼できる検出感度でのマ ルチプレックス増幅系の開発に対する著しい障害である。それにもかかわらず、 ここに記載した標的特異的イニシエーション増強を用いると、ｐｏｌ１およびｇ ａｇ１１標的の両方に対して高感度でマルチプレックス反応組成物を同定するこ とに成功した。 表７は、一つのそのような実験の結果を要約している。条件Ａは１０個のレプ リカ反応の各々にｐｏｌ１内側プライマー（Ｔ７４１１６および４１９５）およ びｇａｇ１１プライマー（Ｔ７８１１および８７２）が加えてあるが外側プライ マーが存在しない標準ＩＭ２法であった。増幅後、各々の反応液の５０μｌを採 り、ｐｏｌ１プローブを用いるハイブリッド形成により分析した。各々の反応液 の残りの５０μｌをｇａｇ１１プローブを用いて分析した。欄Ａのｐｏｌ部分の 結果はｇａｇ１１の結果と同一の試料順で並べられている（すなわち、５０μｌ の試料＃１はｐｏｌ１プローブで分析した場合７，４４８のＲＬＵが得られ；残 りの５０μｌはｇａｇ１１プローブで分析した場合１９，５９６のＲＬＵを与え た）。 同様に、欄ＣのＲＬＵ値は、示されるように、ｐｏｌ１またはｇａｇ１１プロ ーブを用いた各々の反応液の半分の分析を反映している。条件Ｃは上記一般法に 記載された増強イニシエーション法であるが、ただし八つのオリゴヌクレオチド プライマーが存在している（７８０、Ｔ７８１１、８７２、Ｔ７１０６２、４０ ０９、Ｔ７４１１６、４１９５およびＴ７４３１２、各々５、３０、３０、１０ 、３、１５、３０および３ピコモル／反応）。 条件Ｂは四つのｐｏｌ１プライマーのみを用いた増強イニシエーション法であ り、条件Ｄの試料には４つのｇａｇ１１プライマーのみを加えた。ＢおよびＤの 各々のレプリカ反応は、全反応容量を用いてハイブリッド形成により分析した。 表７に示した反応には、各々平均で５つの鋳型および実施例４に記載したよう に調製された溶解物５０μｌを加えた。これらの条件（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ａ’、Ｄお よびＣ’）に対応する陰性対照は各々２０９４、２９０７、２９２５、１７９９ 、２０１４および２３１５であった。 増強系を用いたｇａｇ１１の結果から、この標的領域は、ｇａｇ１１プライマ ーのみを含む反応（Ｄ）において、ｐｏｌ１およびｇａｇ１１プライマーを含む 反応（Ｃ’）よりもはるかに増幅されたことが明らかであった。さらに、両方の 標的領域（特にｐｏｌ１）について、検出効率はマルチプレックスＩＭ２系（Ａ ）よりも増強マルチプレックス系（Ｃ）で著しく大きいことが明らかであった。 標準ＩＭ２におけるｐｏｌ１（Ａ）に比較したｇａｇ１１（Ａ’）の優れたイニ シエーション効率は、多くの既述の結果と一致していることに注目されたい。 各々のプローブによるハイブリッド形成により分析した場合、ベースライン信 号レベル（ｐｏｌ１ ＲＬＵ＝３１２０、ｇａｇ１１ ＲＬＵ＝２１２９）が同 一の促進マルチプレックス試料（Ｃ、Ｃ’）で観察され、これらの試料中には増 幅されるべきＨＩＶ ＤＮＡが存在しないことを示している。ポアソン分布に基 づくと、５つの鋳型を加えたレベルでは１０個のレプリカでの１回の失敗が予期 されないわけではない（ｐ≧０．０６５）。従って、これらの結果はこのマルチ プレックス系は同じ反応で二つの異なる標的領域の単一のコピーを検出できるこ とを示している。 その他の実施態様も以下の請求の範囲内に含まれている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダッタグプタ，ナニブフシャン アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，カーウッド・コート 4221

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試験試料中の核酸鎖を増幅する方法であって、 第一に、前記試験試料からの前記核酸鎖を、同時に少なくとも三つのオリゴヌ クレオチドプライマーと接触させ、ここで少なくとも一つのプライマーはプロモ ーター−プライマーであり、少なくとも一つの前記プライマーは前記核酸鎖に相 補的であり、および少なくとも一つの他の前記プライマーは前記核酸鎖に相補的 な鎖に相補的である；そして 第二に、前記核酸鎖およびプライマーを、ＲＮＡ指向性および／またはＤＮＡ 指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮＡｓｅ Ｈ 活性を有する一つまたはそれ以上の蛋白質と、一定の温度で前記核酸鎖が増幅し うるプライマー長条件下で接触させる； の各工程を含む方法。 ２．前記核酸鎖がＤＮＡ鎖であり、前記第二の接触工程の前に前記核酸鎖およ びプライマーを約６０℃またはそれ以上で活性なＤＮＡポリメラーゼ活性を有す る酵素と約６０℃またはそれ以上で接触させる、請求項第１項に記載の方法。 ３．前記第二の接触工程が、逆転写酵素の存在下、約４２℃またはそれ以上で 行われる、請求項第１項に記載の方法。 ４．前記核酸鎖および前記プライマーが前記第二の接触工程の前に、約９５℃ またはそれ以上に加熱される、請求項第１項に記載の方法。 ５．前記第一の接触工程において４つのプライマーがに使用される、請求項第 １−４項に記載の方法。 ６．一つの前記プライマーが一つの他の前記プライマーと異なる濃度で提供さ れる、請求項第１項に記載の方法。 ７．一つの前記プライマーが一つの他の前記プライマーと異なる濃度で提供さ れる、請求項第５項に記載の方法。 ８．二つの前記プライマーが前記他のプライマーと異なる濃度で提供される、 請求項第５項に記載の方法。 ９．二つの前記プライマーがプラス−センスプライマーであり、内側プラス− センスプライマーがプロモーター−プライマーである、請求項第１項に記載の方 法。 １０．二つの前記プライマーがマイナス−センスプライマーであり、前記外側 プライマーがプロモーター−プライマーである、請求項第１項に記載の方法。 １１．すべての前記酵素活性が逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼにより提 供される、請求項第１項に記載の方法。 １２．前記酵素活性がＤＮＡポリメラーゼ活性を有しないＲＮＡｓｅ Ｈによ り補給される、請求項第１１項に記載の方法。 １３．前記ＤＮＡポリメラーゼが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し ている、請求項第２項に記載の方法。 １４．前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をその 天然形では保持しているＤＮＡポリメラーゼから誘導される、請求項第１３項に 記載の方法。 １５．前記ＤＮＡポリメラーゼが、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のＤＮＡ ポリメラーゼＩである請求項第１３または１４項に記載の方法。 １６．前記種がバシラス ステアロテルモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）またはバシラス カルドテナックス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）である、請求項第１５項に記載の方法。 １７．二つの外側プライマーが前記核酸鎖またはその相補体に最大２０００塩 基離れてハイブリダイズする、請求項第１項に記載の方法。 １８．二つの外側プライマーが前記核酸鎖またはその相補体に最大５００塩基 離れてハイブリダイズする、請求項第１項に記載の方法。 １９．二つの外側プライマーが前記核酸鎖またはその相補体に最大３５０塩基 離れてハイブリダイズする、請求項第１項に記載の方法。 ２０．一つの前記プライマーが１から１０μＭの間の濃度で提供され、別の前 記プライマーが１０から５０μＭの間の濃度で提供される、請求項第６項に記載 の方法。