JP2008253219A - 核酸クローニング法 - Google Patents
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Abstract
非特異的な核酸増幅断片を減少させ、目的遺伝子を含む核酸断片を特異的に選別する核酸クローニング法を提供する。
【解決手段】
アダプターを核酸にライゲーションして、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程と、上記核酸断片生成工程にて得られた上記アダプターを付加した核酸断片を3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いたPCRによって増殖して、PCR産物を得るPCR産物生成工程と、上記PCR産物を付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションして、クローニングベクターを得るクローニングベクター生成工程と、上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖させるクローン増殖工程とを有する
【選択図】 図1
Description
まず、Penicillium purpurogenum Stoll(IAM15392)由来のゲノム遺伝子を以下のように抽出した。
次に、上記作業で抽出されたDNAを、アダプターを用いたPCR(GCA−PCR)によって以下のように増幅させた。
アダプターをライゲーションしたDNAを鋳型にアダプタープライマー、目的遺伝子(polyketide synthase)の部分的な配列により設計したプライマー、及びKOD DNAポリメラーゼ(東洋紡績社製)を用いてPCRを行った。ここで、アダプタープライマーを下記に示す。
まず、95℃、2分間で鋳型DNAを熱変性させ、95℃で15秒間→68℃で5分間のサイクルを10回繰り返した。その後、第2サイクルとして、95℃で15秒間→60℃で30秒間→68℃で5分間のサイクルを40回繰り返し、DNAを増幅させた。
そして、PCR産物のDNAをSCによって精製した。
次に、上記アダプターを用いたPCRによって得られたPCR産物を、以下のようにベクターに組み込み、大腸菌に形質転換した。
上述と同様に、DNAを抽出後、アダプターを用いたPCRを行った後、上記実施例とは異なり、そのPCR産物をTaq DNAポリメラーゼにて処理してカラムに回収後、T-easyベクター(Promega社製)にライゲーションする、いわゆるTAクローニングを行い、当該ベクターを大腸菌DH5αに形質転換するクローニング法を比較例として行った。
本実施例に係るクローニング法と上記比較例に係るTAクローニング法によってそれぞれ得られたコロニーをランダムに50個選択し、コロニーPCR法を用いて目的の配列を含むクローンの選別を行った。ここで、コロニーPCR法とは、DNAを抽出することなく、直接コロニーをPCR反応液に懸濁し、PCR反応を起こさせるものである。
Claims (6)
- アダプターを用いたPCRを利用する核酸のクローニング法において、
アダプターを核酸にライゲーションして、アダプターを付加した核酸断片を得る核酸断片生成工程と、
上記核酸断片生成工程にて得られた上記アダプターを付加した核酸断片を3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いたPCRによって増殖して、PCR産物を得るPCR産物生成工程と、
上記PCR産物を付着末端生成制限酵素及び平滑末端生成制限酵素で消化したベクターにライゲーションして、クローニングベクターを得るクローニングベクター生成工程と、
上記クローニングベクターをコンピテントな細胞に導入して、目的遺伝子を含むクローンを増殖させるクローン増殖工程と
を有することを特徴とする核酸クローニング法。 - 上記核酸断片生成工程では、上記アダプターの付着末端と同じ末端を生じさせる制限酵素によって核酸を消化して、上記アダプターを付加した核酸断片を得ることを特徴とする請求項1記載の核酸クローニング法。
- 上記アダプターは、その3'末端が脱リン酸化されていることを特徴とする請求項1記載の核酸クローニング法。
- 上記PCR産物生成工程では、第1のPCR産物でnestedPCRを行うことを特徴とする請求項1記載の核酸クローニング法。
- 上記PCRは、α型DNAポリメラーゼを用いて行うことを特徴とする請求項1記載の核酸クローニング法。
- 請求項1に記載の付着末端生成酵素及び平滑末端生成酵素で消化したベクターを含むことを特徴とする核酸クローニングキット。
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