JP3972106B2 - ゲノムライブラリー作製方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリー - Google Patents
ゲノムライブラリー作製方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリー Download PDFInfo
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Description
本発明は、微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製する方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリーに関する。本発明は、各種生物のゲノム解析用の研究材料、ゲノム創薬、その他生命科学諸分野の研究に広く利用し得るものである。
従来、ゲノムライブラリーを作製する方法としては、通常ショットガンクローニング法により、切断したゲノム断片をプラスミド、コスミド、ファージ、人工染色体ベクター等にクローニングする方法が用いられている。
しかしながら、上記従来の方法では制限酵素による切断処理やベクターにゲノム断片を組み込む処理など多くの処理が必要となるため、サンプル（試料）として大量のゲノムＤＮＡを必要とし、煩雑な操作を伴うものであった。したがって、培養が困難な微生物の場合は、サンプルを多く得ることができず、ライブラリーの作製は困難であった。
一方、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）を用いたゲノムライブラリー作製方法が、１９９７年にＳｉｎｇｅｒらによって報告されている（下記の非特許文献１参照）。しかし、この方法も、制限酵素によって断片化した後、各ゲノム断片に対してリンカーを施す処理等を必要とし、ＰＣＲの前段階処理が非常に煩雑であった。そのため、これらの処理に伴うゲノムＤＮＡの損失が避けられず、微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製することは困難であった。また、この方法は、ＰＣＲにおいて複数種類のプライマーを使用するものであった。
Nucleic Acids Research, vol.25, No.4 (1997) 781-786頁
生物学・生命科学の諸分野においてゲノムレベルでの研究解析が重要であることはいうまでもないが、実用面においても各種生物をゲノムレベルで研究解析する重要性は増している。例えば、病原菌や病原性ウイルスのゲノムレベルでの研究解析、あるいは、環境中に存在し、未だ十分に解明が進んでいない微生物やウイルスのゲノムレベルでの研究解析は公衆衛生・国民の健康確保の観点から今後一層重要なものといえる。このような研究解析のためにも、簡便に微少量サンプルからゲノムライブラリーを作製する方法の開発が求められている。
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製する方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリーを提供することをその課題とする。
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、増幅対象のゲノムに比較的よく出現する配列をもとに設計した１種類のプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、ゲノム全領域がほぼ均等に増幅され、簡便にゲノムライブラリーを作製し得ること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な発明として、下記Ａ）〜Ｍ）の発明を包含するものである。
Ａ） 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象生物種のゲノムＤＮＡ又はその断片を鋳型とし、かつ、特定の配列からなる１種類のプライマー又はランダムプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する方法。
Ｂ） 対象生物種のゲノムにおいて出現頻度の高い配列を含むように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ａ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｃ） 出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上含むように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｂ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｄ） ３’末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、５’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｂ）又はＣ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｅ） ３’末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、さらにその３’末端側にランダム塩基および／又はユニバーサル塩基からなる１ｍｅｒ以上の領域を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｂ）〜Ｄ）のいずれかに記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｆ） ３’末端側にランダム塩基および／又はユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ａ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｇ） ３’末端側にランダム塩基および／又はユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有すると共に、５’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｆ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｈ） 上記Ｄ）又はＧ）記載のプライマーを使用して第１のＰＣＲを行った後、５’末端側の配列を含むプライマーを使用して第２のＰＣＲを行うことを特徴とするゲノムライブラリー作製方法。
Ｉ） ＰＣＲ条件として、アニーリング温度を３０℃以上４５℃以下にし、かつ、アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を５秒以上２０分以下に設定したサイクルを含むことを特徴とする上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｊ） 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する方法。
Ｋ） 上記Ｂ）〜Ｇ）のいずれかに記載のオリゴＤＮＡをプライマーに使用してゲノムを増幅する前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを再度増幅することを特徴とする上記Ｊ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｌ） ゲノムを断片化し、各断片にリンカー等の付加配列を結合させる前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することを特徴とする上記Ｊ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｌ）のいずれかに記載の方法により作製されたゲノムライブラリー。
Ａ） 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象生物種のゲノムＤＮＡ又はその断片を鋳型とし、かつ、特定の配列からなる１種類のプライマー又はランダムプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する方法。
Ｂ） 対象生物種のゲノムにおいて出現頻度の高い配列を含むように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ａ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｃ） 出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上含むように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｂ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｄ） ３’末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、５’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｂ）又はＣ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｅ） ３’末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、さらにその３’末端側にランダム塩基および／又はユニバーサル塩基からなる１ｍｅｒ以上の領域を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｂ）〜Ｄ）のいずれかに記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｆ） ３’末端側にランダム塩基および／又はユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ａ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｇ） ３’末端側にランダム塩基および／又はユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有すると共に、５’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする上記Ｆ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｈ） 上記Ｄ）又はＧ）記載のプライマーを使用して第１のＰＣＲを行った後、５’末端側の配列を含むプライマーを使用して第２のＰＣＲを行うことを特徴とするゲノムライブラリー作製方法。
Ｉ） ＰＣＲ条件として、アニーリング温度を３０℃以上４５℃以下にし、かつ、アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を５秒以上２０分以下に設定したサイクルを含むことを特徴とする上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｊ） 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する方法。
Ｋ） 上記Ｂ）〜Ｇ）のいずれかに記載のオリゴＤＮＡをプライマーに使用してゲノムを増幅する前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを再度増幅することを特徴とする上記Ｊ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｌ） ゲノムを断片化し、各断片にリンカー等の付加配列を結合させる前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することを特徴とする上記Ｊ）記載のゲノムライブラリー作製方法。
Ｍ） 上記Ａ）〜Ｌ）のいずれかに記載の方法により作製されたゲノムライブラリー。
本発明の第１の方法は、対象生物種のゲノムＤＮＡそのもの又はその断片を直接の鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ゲノムライブラリーを作製する。即ち、ＰＣＲの鋳型には、リンカー等のゲノム配列以外の配列が何ら付加されていないゲノムＤＮＡそのもの、又はその断片を使用する。したがって、ＰＣＲの前段階処理として、抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素によって切断し、得られた各断片に対してリンカーを施すといった煩雑な処理が不要であり、これらの処理に伴うサンプルの損失を防止することができる。
また、本発明の第１の方法によれば、菌体や培養細胞等を直接のサンプルとしてＰＣＲを行うことにより、ゲノムライブラリーを作製することも可能である。この場合、ゲノムＤＮＡの抽出工程が不要となるので、更に簡便な操作でゲノムライブラリーを作製することができる。
本発明の第２の方法は、対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、ゲノムライブラリーを作製する。１種類のプライマーのみを使用したＰＣＲによって、簡便にゲノムライブラリーを作製することができる。
このように、本発明の方法によれば、微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製することができる。
以下、本発明の具体的実施態様について詳しく説明する。
（１）第１のゲノムライブラリー作製方法
本発明の第１のゲノムライブラリー作製方法は、リンカー等のゲノム配列以外の配列が何ら付加されていないゲノムＤＮＡそのもの、又はその断片を鋳型としてＰＣＲを行い、ゲノムライブラリーを作製する。ここで、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合には、前述のとおり、抽出したゲノムＤＮＡを使用する場合のほか、ゲノムＤＮＡを抽出することなく菌体や培養細胞等を直接サンプルとして使用し、菌体内・細胞内等のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合も含まれる。
本発明の第１のゲノムライブラリー作製方法は、リンカー等のゲノム配列以外の配列が何ら付加されていないゲノムＤＮＡそのもの、又はその断片を鋳型としてＰＣＲを行い、ゲノムライブラリーを作製する。ここで、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合には、前述のとおり、抽出したゲノムＤＮＡを使用する場合のほか、ゲノムＤＮＡを抽出することなく菌体や培養細胞等を直接サンプルとして使用し、菌体内・細胞内等のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う場合も含まれる。
さらに本発明の特徴をなすプライマーについて説明する。本発明のＰＣＲに使用するプライマーには、大別して（１）特定の配列からなる１種類のプライマー、又は（２）ランダムシークエンスを含むランダムプライマーを使用する。
このうち、特定の配列からなる１種類のプライマーを使用する場合は、対象ゲノムにおいて出現頻度の高い配列を含むように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することが好ましい。本発明におけるＰＣＲは、ゲノム全領域をランダムに増幅するランダムＰＣＲであること、換言すれば、ゲノム全領域を出来るだけ均等に増幅することが求められるので、プライマーは、ゲノム上の一部特定の領域に特異的にアニール（相補鎖結合）するものではなく、ゲノム上の複数の領域にいわば非特異的にアニールするものが望ましいからである。
さらに、後述の実施例に示すように、本発明者はプライマーのアニーリング領域として６ｍｅｒの塩基配列が重要であることを見出したので、出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上含むように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することが好ましい。
対象ゲノムにおける出現頻度の高い配列は、当該ゲノムの配列情報をもとに決定することができる。この場合、すべてのゲノム配列が知られている必要はなく、知られている一部のゲノム配列をもとに出現頻度の高い配列を決定してもよい。あるいは、本発明のＰＣＲを行う前に、対象ゲノムをランダムにシークエンシングし、得られた配列情報をもとに出現頻度の高い配列を決定してもよい。
例えば、出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ含むようにプライマーを設計する場合、ゲノムの配列情報に含まれるすべての６ｍｅｒの配列のうち出現頻度の高い配列を順番に決定する。そして、出現頻度の高い１〜２０番目の配列の中から任意の配列を選択し、同配列を含むようにプライマーを設計する。このように、「出現頻度の高い配列」とは、出現頻度の最も高い配列に限定されるものではなく、比較的出現頻度の高い配列の中から任意の配列を選択すればよい。
本発明において使用するプライマーの長さは、特に限定されるものではないが、通常のＰＣＲに使用するプライマーに比べて短いことが好ましく、具体的にはアニーリング温度およびゲノム上にランダムにアニールさせる点などを考慮して８ｍｅｒ以上１５ｍｅｒ以下程度の長さであることが好ましい。
例えば、プライマーの長さを１５ｍｅｒとする場合、出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上１５ｍｅｒ以下含むように設計する。後述の実施例においては、プライマーの長さを１０ｍｅｒとし、出現頻度の高い１０ｍｅｒの配列を含むようにプライマーを設計し、このプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、ゲノム全領域をほぼ均等に増幅することができた。したがって、例えばプライマーの長さを１０〜１２ｍｅｒ程度とし、出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上１２ｍｅｒ以下含むようにプライマー設計するとよい。
また、使用するプライマーは、３’末端側に出現頻度の高い配列を有するように設計することが好ましい。
尚、設計するプライマーに含まれる出現頻度の高い配列中の１又は複数の塩基をユニバーサル塩基にしてもよいし、あるいは、ランダム塩基（ランダムシークエンス）にしてもよい。ここで、ユニバーサル塩基とは、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）のいずれの塩基とも水素結合し得る塩基をいい、5-Nitroindole、3-Nitropyrroleなどが例示される。また、ランダム塩基（ランダムシークエンス）とは、配列中の特定位置の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのいずれかにランダムに合成された当該塩基をいう。ランダム塩基（ランダムシークエンス）を含むプライマー（即ち、ランダムプライマー）は、例えばプライマー合成において特定位置の塩基としてＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃをほぼ等量ずつ加えることによって１回の合成で作製することができる。このように、本発明においてランダムプライマーを使用する場合も１回の合成で作製することができるので、プライマー作製が容易である。
上記のように、本発明に使用するプライマーは、３’末端側に出現頻度の高い配列を有するように設計することが望ましいが、さらにその配列の３’末端側にランダム塩基（ランダムシークエンス）もしくはユニバーサル塩基からなる１ｍｅｒ以上の領域を有するようにプライマーを設計してもよい。
あるいは、出現頻度の高い配列を有することなく、３’末端側にランダム塩基（ランダムシークエンス）もしくはユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有するようにプライマーを設計してもよい。前述のように本発明者による解析の結果、プライマーのアニーリング領域として６ｍｅｒの塩基配列が重要であることが判明したので、ランダム塩基（ランダムシークエンス）もしくはユニバーサル塩基からなる領域を６ｍｅｒ以上とすることで、プライマーをゲノム上に非特異的にアニールさせることが可能と考えられる。
３’末端側に出現頻度の高い配列を有するようにプライマーを設計する場合において、５’末端側には対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するようにプライマーを設計することは好ましい。例えば、３’末端側に出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上有すると共に、５’末端側に対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を６ｍｅｒ以上有するようにプライマーを設計する。このようにプライマーを設計することで、当該プライマーを使用して第１のＰＣＲを行った後、５’末端側の６ｍｅｒ以上の配列を含むプライマーを使用して第２のＰＣＲを行い、増幅した各ゲノム断片をさらにより安定して増幅することができる。
同様に、（１）３’末端側に、出現頻度の高い配列を有すると共に、さらにその配列の３’末端側にランダムシークエンスもしくはユニバーサル塩基からなる１ｍｅｒ以上の領域を有するようにプライマーを設計する場合、および、（２）３’末端側にランダムシークエンスもしくはユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有するようにプライマーを設計する場合、のいずれにおいても、５’末端側には対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い特定の配列を有するようにプライマーを設計することは好ましい。例えば、３’末端側にランダムシークエンスもしくはユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の領域を有すると共に、５’末端側に対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を６ｍｅｒ以上有するようにプライマーを設計する。このようにプライマーを設計した場合においても、当該プライマーを使用して第１のＰＣＲを行った後、５’末端側の６ｍｅｒ以上の配列を含むプライマーを使用して第２のＰＣＲを行うことで、増幅した各ゲノム断片をさらにより安定して増幅することができる。
尚、「出現頻度の低い配列」についても、「出現頻度の高い配列」と同様、出現頻度の最も低い配列に限定されるものではなく、比較的出現頻度の低い配列の中から任意の配列を選択すればよい。
本発明においては、以上説明したいずれかのプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、２つのプライマーで挟まれたゲノム上の特定領域を増幅する通常のＰＣＲとは異なり、対象ゲノムをランダムかつ非特異的に増幅する「ランダムＰＣＲ」を行うものである。
次に、本発明のＰＣＲ条件について説明する。
まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型（テンプレート）に使用する場合は、ＰＣＲ前に、アルカリ法による抽出、フェノール抽出、グアニジン抽出、その他キット等を用いた抽出によってゲノムＤＮＡを抽出する。抽出したゲノムＤＮＡは制限酵素によって断片化してもよいが、本発明においては、抽出したゲノムＤＮＡそのものを鋳型に使用することができる。もちろん、ＰＣＲ前に、ゲノムＤＮＡに対してリンカーを施すなどの煩雑な処理は不要である。また、前述のように、ゲノムＤＮＡを抽出することなく菌体や培養細胞等を直接サンプルとして使用し、菌体内・細胞内等のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ってもよい（図１参照）。
まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型（テンプレート）に使用する場合は、ＰＣＲ前に、アルカリ法による抽出、フェノール抽出、グアニジン抽出、その他キット等を用いた抽出によってゲノムＤＮＡを抽出する。抽出したゲノムＤＮＡは制限酵素によって断片化してもよいが、本発明においては、抽出したゲノムＤＮＡそのものを鋳型に使用することができる。もちろん、ＰＣＲ前に、ゲノムＤＮＡに対してリンカーを施すなどの煩雑な処理は不要である。また、前述のように、ゲノムＤＮＡを抽出することなく菌体や培養細胞等を直接サンプルとして使用し、菌体内・細胞内等のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ってもよい（図１参照）。
また、ゲノムライブラリー作製の際のＰＣＲ条件としては、短いプライマーをゲノム全領域に効率的にアニールさせるためにアニーリング温度を低く設定し、プライマーをアニールさせ、そこから伸長反応の温度までゆっくり温度を上げ、アニールさせたプライマーに対してゆっくりとした速度で伸長反応を行わせ、伸長反応の温度でプライマーが解離しないようにすることが好ましい。
そのため、ＰＣＲ条件としては、アニーリング温度を３０℃以上４５℃以下にし、かつ、アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を５秒以上２０分以下に設定し、さらに伸長反応温度を０秒以上１５分以下に設定したサイクルを含むことが望ましい。そして、このようにアニーリング温度を低くして、そこから徐々に温度を上げてゆっくりと伸長反応を行わせるサイクルは、最初の数回だけでもよいが、全サイクルをこの方法で行ってもよい。（尚、伸長反応温度０秒の場合とは、アニーリング温度から伸長反応温度まで温度を上昇させ、伸長反応温度に達しても温度を維持することなく、そのまま変性温度まで温度を上昇させるように設定した場合である。）
上記以外のＰＣＲ条件、例えば、サイクル数、ＤＮＡを一本鎖にするための変性温度、ＰＣＲバッファーの組成、ＤＮＡポリメラーゼの種類などは公知の方法にしたがって任意に決定すればよく、特に限定されるものではない。
後述の実施例に示すように、上記条件にしたがってランダムＰＣＲを行うことにより、ゲノム全領域をほぼ均等に増幅することができ、簡便にゲノムライブラリーを作製できることが確認された。また、本発明の方法は、ゲノムにリンカーを施す処理やベクターにゲノム断片を組み込む処理など煩雑な処理が不要であり、これら煩雑な処理に伴うサンプルの損失を防止できるので、微少量サンプルからのゲノムライブラリー作製が容易となる。
本発明のゲノムライブラリー作製方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリーは、各種生物のゲノム解析用の研究材料、ゲノム創薬、その他生命科学諸分野の研究に広く利用できる。例えば、環境中に存在し、未だ十分に解明が進んでいない微生物やウイルスの研究解析用に本発明を利用できる。とりわけ、病原菌や病原性ウイルスの研究解析は公衆衛生・国民の健康確保の観点から重要であるが、このような研究解析に本発明は有用である。
本発明によってゲノムライブラリーを作製し得る生物種は、特に限定されるものではない。例えば、微生物・ウイルスのほか、植物・動物いずれであってもよく、ヒトを含む哺乳類であっても勿論よい。また、解析対象のウイルス等がＲＮＡゲノムの場合は、逆転写酵素によって相補鎖ＤＮＡを合成し、これをもとに鋳型となるゲノムＤＮＡを調製すればよい。
前述のように、本発明は、特定の配列からなる１種類のプライマー又はランダムプライマーを使用してＰＣＲを行うことにより、簡便にゲノムライブラリーを作製することができる。このように、簡便性・コスト等の面からは１種類のプライマー又はランダムプライマーを使用することが好ましいが、本発明は、１種類のプライマーのみ使用する場合に限定されるものではない。例えば、出現頻度の最も高い配列と２番目に高い配列をもとにそれぞれプライマーを作製し、得られた２種類のプライマーを使用してＰＣＲを行ってもよい。即ち、本発明は、少なくとも１種類のプライマー（又はランダムプライマー）を使用してＰＣＲを行う方法であればよい。
また、プライマーのアニーリング領域としては前述のように６ｍｅｒの塩基配列が重要であるが、後述の実施例に示すように、６ｍｅｒのうち１塩基程度ゲノム上の配列と相違する場合であれば、ＰＣＲによる増幅が行われていたので、少なくとも６ｍｅｒ中５塩基をゲノム上の出現頻度の高い配列と一致するように設計するとよい。
（２）第２のゲノムライブラリー作製方法
本発明の第２のゲノムライブラリー作製方法は、対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する。ここで、「１種類の固有配列からなるプライマー」にはランダムプライマーは含まれない。
本発明の第２のゲノムライブラリー作製方法は、対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する。ここで、「１種類の固有配列からなるプライマー」にはランダムプライマーは含まれない。
このように本方法は、１種類のプライマーのみを使用したＰＣＲによりゲノムライブラリーを作製する方法であり、簡便なライブラリー作製が可能である。
上記ＰＣＲの前処理としては、例えば次のような処理が挙げられる。
ｉ） 前処理として、例えば前述のプライマーのうち、「５’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴＤＮＡ」をプライマーに使用して、前述の条件でＰＣＲを行う。プライマーの３’末端側は、前述のように６ｍｅｒ以上の出現頻度の高い配列であってもよいし、ランダム塩基（ランダムシークエンス）もしくはユニバーサル塩基からなる６ｍｅｒ以上の配列であってもよい。例えば、３’末端側をランダム配列、５’末端側を固有配列として、前処理においては、このランダム配列＋固有配列からなるプライマーでＰＣＲを行う。
その後、上記固有配列からなる１種類のプライマーを使用して第２のＰＣＲを行い、ゲノムを再度増幅することによりゲノムライブラリーを作製する。
前処理のＰＣＲにおいて、対象ゲノムとのアニーリングには、プライマー３’末端側の６ｍｅｒの塩基配列が重要であり、５’末端側の固有配列は任意に決定することも可能である。また、この固有配列の５’末端側に配列を付加したものをプライマーに使用して第２のＰＣＲを行ってもよい。
ii） 他の前処理として、制限酵素、物理的切断方法を用いて、ゲノムを断片化し、各断片にリンカー等の付加配列を結合させる。この付加配列部分をプライマーのアニーリング領域として、後工程のＰＣＲにおいて１種類の固有配列からなるプライマーを使用してゲノムを増幅し、ゲノムライブラリーを作製する。
このように、この前処理では、各ゲノム断片に対して、任意に決定した固有配列を結合させ、その後、この固有配列（又は、この固有配列の５’末端側に配列を付加したもの）からなる１種類のプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムライブラリーを作製する。
上記ｉ）又はii）の前処理の後に行う、１種類の固有配列からなるプライマーを使用したＰＣＲにおいて、ＰＣＲ条件は前述した条件で行ってもよいが、アニーリング温度をより高くして行ってもよく、その他の条件についても任意に決定することができる。
また、上記ＰＣＲにおいて使用するプライマーの長さは、特に限定されるものではないが、通常のＰＣＲに使用するプライマーに比べて短いことが好ましく、具体的にはアニーリング温度およびゲノム上にランダムにアニールさせる点などを考慮して８ｍｅｒ以上１５ｍｅｒ以下程度の長さであることが好ましい。
以下、図面を参照して本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明のゲノムライブラリー作製方法は、図１に示すように、ゲノムＤＮＡを抽出・精製した後ＰＣＲを行ってもよいし、細胞・菌体等を直接サンプルとして使用してＰＣＲ反応を行ってもよいが、本実施例においては、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
本発明のゲノムライブラリー作製方法は、図１に示すように、ゲノムＤＮＡを抽出・精製した後ＰＣＲを行ってもよいし、細胞・菌体等を直接サンプルとして使用してＰＣＲ反応を行ってもよいが、本実施例においては、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
また、本実施例においては、大腸菌のゲノムライブラリーを作製するため、大腸菌E.coli K-12 W3110株のゲノムＤＮＡをランダムＰＣＲによって増幅した。
ランダムＰＣＲに使用したプライマーは、対象ゲノムにおいて出現頻度の高い１０ｍｅｒの配列をもとに設計した。具体的には、まず、大腸菌E.coli K-12 W3110株のゲノム上において、出現頻度の高い１０ｍｅｒの配列の検索を行った。ゲノムの全長４６３９２２１塩基において１０ｍｅｒの配列は合計４６３９２１２個であり、このうち出現頻度の高い１番目から２０番目までの配列を抽出・決定した。その結果を下記表１に示す。
上記表１に掲げた１０ｍｅｒの配列は、それぞれ配列表の配列番号１〜２０にも示される。
本実施例のランダムＰＣＲには、上記１０ｍｅｒの配列のうち出現頻度が最も高かった１番目から４番目までの配列をプライマー配列として合成したプライマー（以下、それぞれプライマー１〜４という。）を使用した。
ＰＣＲ反応液の組成は以下のとおりである。
鋳型：ゲノムＤＮＡ（大腸菌増殖後に常法により抽出） ８０ｎｇ／ｍｌ
プライマー：プライマー１〜４のいずれかのプライマー ２０μＭ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔａｋａｒａ社製Ｚ−ｔａｑ ０．２Ｕ
バッファー：×１０ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １μＬ
ｄＨ2Ｏで１０μＬにメスアップ
鋳型：ゲノムＤＮＡ（大腸菌増殖後に常法により抽出） ８０ｎｇ／ｍｌ
プライマー：プライマー１〜４のいずれかのプライマー ２０μＭ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔａｋａｒａ社製Ｚ−ｔａｑ ０．２Ｕ
バッファー：×１０ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １μＬ
ｄＨ2Ｏで１０μＬにメスアップ
また、ＰＣＲ条件は、最初に９８度５秒で変性後、下記のサイクルを４０回行った。
変性温度：９８℃ ５秒
アニーリング温度：４２℃ １０秒
アニーリング温度から伸長反応温度までの温度変化勾配（ＲＡＭＰ）：５％（５分）のほか設定値を様々に変更して行った。
伸長反応温度：７２℃ ７分
変性温度：９８℃ ５秒
アニーリング温度：４２℃ １０秒
アニーリング温度から伸長反応温度までの温度変化勾配（ＲＡＭＰ）：５％（５分）のほか設定値を様々に変更して行った。
伸長反応温度：７２℃ ７分
上記条件でＰＣＲを行い、増幅後、電気泳動により確認を行った。その結果、図２に示すように、プライマー１・３・４においては特異的な増幅によるバンドがみられたが、プライマー２においては、増幅産物がスメアーになっており、ゲノム全領域を増幅していると考えられた。尚、同図において、パーセント（％）は上記ＲＡＭＰの設定値であり、このパーセントが高いほどアニーリングから伸長反応への移行が早くなる一方、パーセントが小さいと温度を上げるのに長い時間がかかることになる。
上記プライマー２を用いて、さらに様々なプライマー濃度で同様にＰＣＲを行ったところ、プライマー濃度を低くするとさらに特異的な増幅が減少し、ゲノム全体が短い断片として増幅されることが確認された（図３参照）。アニーリング時の温度（図中「ｄｅｇ」）も様々に変更してＰＣＲを行ったところ、この温度とプライマー濃度とを調節することにより、よりスメアーな泳動結果が得られ、ゲノム全般を増幅していると考えられた。
また、増幅されたゲノム断片をテンプレートとして再度同様に増幅を行ったところ、長鎖ＤＮＡが増幅されにくくなった。さらに、再々増幅実験をしたところ、長鎖ＤＮＡが一層増幅されにくくなったが、その変化は小さくなった。
〔実施例２〕
実施例１で作製したゲノムライブラリーに対して、実際にゲノム全領域が増幅されているかどうかを確認するために、E.coli K-12 W3110株ゲノムの任意の１０カ所についての濃度比の測定を行った。測定箇所を図４に示す。濃度比の測定は、Ｒｏｓｈ社製Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、ランダムＰＣＲにより増幅したゲノム断片に対して測定を行った。また、その際に各箇所（領域）の測定に使用したプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）をあわせて図４に示す。
実施例１で作製したゲノムライブラリーに対して、実際にゲノム全領域が増幅されているかどうかを確認するために、E.coli K-12 W3110株ゲノムの任意の１０カ所についての濃度比の測定を行った。測定箇所を図４に示す。濃度比の測定は、Ｒｏｓｈ社製Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒを用いて、ランダムＰＣＲにより増幅したゲノム断片に対して測定を行った。また、その際に各箇所（領域）の測定に使用したプライマー（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）をあわせて図４に示す。
上記測定の結果、図５に示すように、各領域間において濃度比（換言すれば増幅比率）の差が一番大きいところでも１０倍以内に収まっており、作製したゲノムライブラリーにおいては、ゲノム全領域においてほぼ均一な増幅が行われていることが示された。
〔実施例３〕
実施例１で作製したゲノムライブラリーの一部をシークエンス解析した。シークエンス解析後、ＢＬＡＳＴを用いて既知のゲノム配列との比較を行った。その結果、ゲノムの全領域において増幅が行われていることが確認された。
実施例１で作製したゲノムライブラリーの一部をシークエンス解析した。シークエンス解析後、ＢＬＡＳＴを用いて既知のゲノム配列との比較を行った。その結果、ゲノムの全領域において増幅が行われていることが確認された。
さらに、増幅された断片をもとに、本実施例のＰＣＲに使用した上記プライマー２の配列と、ゲノム上の配列との比較を行った。その結果、図６に示すように、プライマー配列の３’末端側の６塩基（６ｍｅｒ）までは、ゲノム上の配列と非常に高い一致が認められた（図中、縦軸は割合を示す）。したがって、プライマーのアニーリング領域としては、６ｍｅｒの塩基配列が重要である。
また、上記６塩基での塩基配列の分散を調べたところ、１塩基差異程度であれば、増幅が行われていることが確認された。
以上の結果から、ゲノムライブラリーの作製に使用するプライマーとしては、３’末端側の６塩基をゲノム上の出現頻度の高い配列と一致するように設計することが望ましく、少なくともその６塩基中５塩基をゲノム上の出現頻度の高い配列と一致するように設計することが望ましいことが示された。
以上のように、本発明によれば微小量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製することができるので、前述したとおり、病原菌や病原性ウイルスの研究解析、あるいは、環境中に存在し、未だ十分に解明が進んでいない微生物やウイルスの研究解析などに利用できるほか、各種生物のゲノム解析用の研究材料として、さらにゲノム創薬、生命科学諸分野の研究に広く利用することができる。
Claims (6)
- 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、対象生物種のゲノムＤＮＡ又はその断片を鋳型とし、かつ、鋳型とアニーリングする３’末端側の少なくとも６ｍｅｒの領域が、対象生物種のゲノムにおいて出現頻度の高い配列の中から選択された１種類の特定の配列となるように設計されたプライマーのみを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する方法。
- ３’末端側に出現頻度の高い配列を６ｍｅｒ以上含むと共に、５’末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする請求項１記載のゲノムライブラリー作製方法。
- 対象生物種のゲノムについて知られている配列情報をもとに、すべての６ｍｅｒの配列のうち出現頻度の高い１〜２０番目の配列の中から選択された６ｍｅｒの配列を３’末端側に含むオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする請求項１又は２記載のゲノムライブラリー作製方法。
- 対象生物種のゲノムについて知られている配列情報をもとに、すべての１０ｍｅｒの配列のうち出現頻度の高い１〜２０番目の配列の中から選択された１０ｍｅｒの配列からなるオリゴＤＮＡをプライマーとして使用することを特徴とする請求項１記載のゲノムライブラリー作製方法。
- 請求項２記載の１種類の特定のプライマーを使用して第１のＰＣＲを行った後、当該プライマーの５’末端側の固有配列を含む１種類のプライマーを使用して第２のＰＣＲを行うことを特徴とするゲノムライブラリー作製方法。
- ＰＣＲ条件として、アニーリング温度を３０℃以上４５℃以下にし、かつ、アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を５秒以上２０分以下に設定したサイクルを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のゲノムライブラリー作製方法。
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