WO2005085434A1 - ゲノムライブラリー作製方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリー - Google Patents

ゲノムライブラリー作製方法、および同方法により作製されたゲノムライブラリー Download PDF

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Nobuo Shimamoto
Hideki Nakayama
Hironori Aramaki
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Japan As Represented By The President Of National Institute Of Genetics
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups

Definitions

  • Genome library preparation method and genome library prepared by the same method
  • the present invention relates to a method for easily preparing a genomic library from a very small amount of sample, and a genomic library prepared by the method.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be widely used for research materials for genomic analysis of various organisms, genomic drug discovery, and other researches in various fields of life science. Background art
  • a method for preparing a genomic library a method in which a cut genomic fragment is cloned into a plasmid, cosmid, phage, artificial chromosome vector, or the like by the shotgun Claw-Jung method is usually used.
  • the above-mentioned conventional method requires a large amount of processing such as a cutting treatment with a restriction enzyme and a processing of incorporating a genomic fragment into a vector, so that a large amount of genomic DNA is required as a sample (sample), which is complicated. It involved operations. Therefore, in the case of microorganisms that are difficult to culture, it was not possible to obtain many samples, and it was difficult to produce a library.
  • genomic-level research and analysis of pathogenic bacteria and pathogenic viruses or genomic-level research and analysis of microbial viruses that are present in the environment and have not yet been sufficiently elucidated are public health and public health. It can be said that it is more important from the viewpoint of securing. For such research and analysis, there is a demand for the development of a method for easily producing genomic libraries from a very small amount of samples. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in order to solve the above problems, and has been made to provide a method for easily producing a genomic library from a very small amount of sample, and a genomic library produced by the method. Make it an issue.
  • the present inventor has conducted intensive studies in view of the above problem, and as a result, has performed PCR using one type of primer designed based on a sequence that appears relatively frequently in the genome of interest, thereby obtaining the entire region of the genome. Were amplified almost uniformly, and it was found that a genomic library could be easily prepared. Thus, the present invention was completed.
  • the present invention includes the following inventions A) to M) as industrially useful inventions.
  • a method for preparing a genomic library of an arbitrary species which comprises using genomic DNA of the target species or a fragment thereof as type III and using one type of primer or random primer having a specific sequence.
  • a method for producing a genomic library by performing PCR and amplifying the genome.
  • Oligo DNA designed to have a sequence that has a high frequency of occurrence at the 3 'end and a sequence that does not appear or has a low frequency of occurrence at the 5' end of the target species is used as a primer.
  • Oligo DNA primer designed to have a sequence with a high frequency of appearance at the 3 'end and a lmer or more region consisting of random bases or upper bases at its 3, end
  • oligo DNA designed to have a region of 6 mer or more consisting of a random base Z or a universal base at the terminal end as a primer; Genome library one preparation method.
  • the designed oligo In order to have a 6-mer or more region consisting of random bases and / or universal bases at the terminal end, and to have a sequence that does not appear in the genome of the target species or a sequence with low frequency at the terminal end
  • the designed oligo The method for preparing a genomic library according to F) above, wherein DNA is used as a primer.
  • PCR conditions are as follows: annealing temperature is 30 ° C or more and 45 ° C or less, and temperature rise time from annealing temperature to extension reaction temperature is 5 seconds or more and 20 minutes or less.
  • J A method for preparing a genomic library of an arbitrary species, in which pretreatment is performed on the genome of the target species, followed by PCR using primers consisting of one type of unique sequence, and A method for producing a genomic library by amplification.
  • a genomic library is prepared by performing PCR using the genomic DNA itself of the target organism or a fragment thereof as a direct type II. That is, the genomic DNA itself, to which no sequence other than the genomic sequence such as a linker is added, or a fragment thereof is used for the PCR type II. Therefore, it is not necessary to perform a complicated process such as digestion of the extracted genomic DNA with a restriction enzyme and applying a linker to each of the obtained fragments as a pre-step treatment of PCR, and the loss of the sample accompanying these treatments is unnecessary. Can be prevented.
  • a genomic library can also be prepared by performing PCR using cells / cultured cells or the like as a direct sample. In this case, the step of extracting genomic DNA is not required, so that a genomic library can be prepared by a simpler operation.
  • a genome library is prepared by performing pretreatment on the genome of a target species and then performing PCR using a primer consisting of one kind of unique sequence. Genomic libraries can be easily prepared by PCR using only one type of primer.
  • a genomic library can be easily prepared from a very small amount of sample.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating a method for producing a genomic library according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results obtained by amplifying a genome by PCR using different primers and examining the results by gel electrophoresis in the method of producing a genomic library of this example.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results obtained by amplifying a genome by PCR using primer 2 under different conditions in the method for preparing a genome library in this example, and examining the results by gel electrophoresis.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a genomic region to be performed.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of an experiment performed to confirm whether or not the entire genome region was actually amplified with respect to the genomic library prepared in this example.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of the discussion.
  • the first method for preparing a genomic library according to the present invention comprises preparing a genomic library by performing PCR using genomic DNA itself or a fragment thereof to which no sequence other than a genomic sequence such as a linker has been added, or a fragment thereof I do.
  • genomic DNA itself or a fragment thereof to which no sequence other than a genomic sequence such as a linker has been added, or a fragment thereof I do.
  • PCR is performed using genomic DNA as type I, as described above, in addition to using the extracted genomic DNA, cells such as cells or cultured cells are directly used as the sample without extracting the genomic DNA.
  • this also includes the case where PCR is performed using genomic DNA in cells or cells as type III.
  • Primers used for the PCR of the present invention are roughly classified into (1) one kind of a primer having a specific sequence, and (2) a random primer containing a random sequence.
  • the primers are partially identified on the genome. This is because it is desirable not to specifically anneal (complementary strand binding) to this region, but to non-specifically anneal to multiple regions on the genome.
  • the present inventors have found that the base sequence of the 6-mer is important as an annealing region of the primer, so that the design is made so that a sequence with a high appearance frequency is included in the 6-mer or more. It is preferable to use the oligo DNA thus obtained as a primer.
  • the sequence that appears frequently in the target genome can be determined based on the sequence information of the genome. In this case, not all genomic sequences need to be known, and a sequence having a high appearance frequency may be determined based on a part of known genomic sequences.
  • the target genome may be randomly sequenced, and a sequence having a high appearance frequency may be determined based on the obtained sequence information.
  • the sequence with a high appearance frequency among all the 6-mer sequences included in the genome sequence information is determined in order. Then, an arbitrary sequence is selected from the frequently occurring 1st to 20th sequences, and a primer is designed so as to include the sequence.
  • the “sequence with high appearance frequency” is not limited to the sequence with the highest appearance frequency, and any sequence may be selected from the sequences with relatively high appearance frequency.
  • the length of the primer used in the present invention is not particularly limited, but is preferably shorter than the primer used for ordinary PCR, and specifically, the annealing temperature and the randomness on the genome
  • the length is preferably about 8 mer or more and 15 mer or less in consideration of the need for annealing.
  • the primer when the length of the primer is 15 mers, the primer is designed to include a sequence with a high appearance frequency of 6 mers or more and 15 mers or less.
  • the length of the primer is set to 1 Omer, a primer is designed so as to include the 10-mer sequence with high appearance frequency, and PCR is performed using these primers to obtain a genome.
  • the whole area of the system could be spread almost evenly. Therefore, for example, it is advisable to design the primer so that the length of the primer is about 10 to 12 mer, and the sequence having a high frequency of appearance is included in the range of 6 to 12 m er.
  • the primer to be used is designed so as to have a sequence having a high frequency of appearance on the 3 ′ end side.
  • One or more bases in the frequently occurring sequence contained in the primer to be designed may be universal bases, or random bases (random seeks).
  • the universal base refers to a base capable of forming a hydrogen bond with any of the bases of adene (A), thymine (T), guanine (G), and cytosine (C). Nitropyrrole is exemplified.
  • a random base random sequence refers to a base at a specific position in a sequence which is randomly synthesized into one of A, T, G, and C.
  • Primers containing random bases are prepared in a single synthesis, for example, by adding A, T, G, and C as bases at specific positions in primer-synthesis in approximately equal amounts. can do. As described above, even when a random primer is used in the present invention, the primer can be prepared by a single synthesis, so that the primer can be easily prepared.
  • the primer used in the present invention is desirably designed so as to have a sequence with a high frequency of appearance at the 3 'end, and further, a random base (random sequence) or A primer may be designed so as to have a region equal to or larger than an lmer composed of a universal base.
  • the primer may be designed so as to have a region of at least 6 mer consisting of a random base (random sequence) or a universal base at the terminal end without having a sequence that appears frequently.
  • a random base random sequence
  • a universal base at the terminal end without having a sequence that appears frequently.
  • Primers are designed to have a frequently occurring sequence at the 3 'end, and to have a random sequence or a region consisting of a universal base of lnier or more at the 3' end of the sequence.
  • primers are designed to have a random sequence or a region consisting of universal bases of 6 mer or more at the terminal end, the appearance of the target genome at the terminal end It is preferable to design primers so as to have a sequence that does not exist or a specific sequence that has a low frequency of appearance.
  • a primer having a 6-mer or more region consisting of a random sequence or a universal base at the 3 'end and a 6-mer or more sequence that does not appear in the target genome or has a low frequency of appearance at the 5' end Design Even when the primers are designed in this manner, the first PCR is performed using the primers, and then the second PCR is performed using a primer containing a sequence of 5 or more 6-mer. By doing so, each amplified genomic fragment can be amplified even more stably.
  • the “sequence with low frequency of occurrence” is not limited to the sequence with the lowest frequency of occurrence, like the “sequence with high frequency of occurrence”. Just select.
  • the target genome can be randomized.
  • it performs “random PCR” that expands nonspecifically.
  • genomic DNA is extracted by alkali extraction, phenol extraction, guanidine extraction, or other kit extraction.
  • the extracted genomic DNA may be fragmented by an enzyme, but in the present invention, the extracted genomic DNA itself can be used in type I. Of course, complicated processing such as applying a linker to genomic DNA before PCR is not required.
  • PCR may be performed using genomic DNA, such as cells in a cell or intracellular cells, as a sample, by directly using cells or cultured cells without extracting genomic DNA (FIG. 1). reference).
  • the PCR conditions for preparing the genome library include setting the annealing temperature low to efficiently anneal the short primers to the entire genome, allowing the primers to anneal, and then allowing the primers to reach the extension reaction temperature. It is preferred that the primer be annealed to cause an elongation reaction at a slow rate so that the primer is not dissociated at the elongation reaction temperature.
  • the PCR conditions set the annealing temperature to 30 ° C or more and 45 ° C or less, and set the temperature rise time from the annealing temperature to the extension reaction temperature to 5 seconds or more and 20 minutes or less. It is desirable to include a cycle in which the reaction temperature is set between 0 seconds and 15 minutes. In this way, the cycle in which the annealing temperature is lowered and the temperature is gradually increased, and then the loosening and elongation reactions are performed may be performed only for the first few times. Good. (The extension reaction temperature of 0 seconds means that the temperature is raised from the cooling temperature to the extension reaction temperature, and the temperature is maintained at the denaturation temperature without reaching the extension reaction temperature. Is the case.)
  • PCR conditions other than those described above such as the number of cycles, the transformation temperature for converting DNA to single-stranded DNA, the composition of the PCR buffer, the type of DNA polymerase, etc., may be arbitrarily determined according to known methods, and are particularly limited. It is not done.
  • the method of the present invention does not require complicated processes such as a process of applying a linker to a genome and a process of incorporating a genomic fragment into a vector, and can prevent loss of a sample due to these complicated processes. Genome libraries can be easily prepared.
  • the method for preparing a genomic library of the present invention and the genomic library prepared by the method can be widely used for research materials for genomic analysis of various organisms, genomic drug discovery, and other researches in various fields of life science.
  • the present invention can be used for research and analysis of microorganisms and viruses that are present in the environment and have not been sufficiently elucidated.
  • research analysis of pathogenic bacteria and pathogenic viruses is important from the viewpoint of public health and public health, but the present invention is useful for such research analysis.
  • the species that can produce a genomic library according to the present invention are not particularly limited.
  • it may be a microorganism or a virus, a plant or an animal, or a mammal including a human.
  • the virus or the like to be analyzed is an RNA genome
  • a complementary genomic DNA is synthesized by a reverse transcriptase, and a genomic DNA is prepared based on the synthesized DNA.
  • a genomic library can be easily prepared by performing PCR using one type of primer having a specific sequence or a random primer.
  • primer may be prepared based on the sequence with the highest frequency and the sequence with the second highest frequency, and PCR may be performed using the two types of primers obtained. That is, the present invention may be any method as long as the method performs PCR using at least one kind of primer (or random primer).
  • the primer merging region has a 6-mer base sequence as described above.
  • column is important, as shown in the examples below, in the case different from the sequences on one base about genome of 6in e r, since amplification by PCR has been performed, even without least It is advisable to design 5 bases out of 6mers so as to match the frequently occurring sequence on the genome.
  • the second method for preparing a genomic library according to the present invention comprises pretreating a genome of a target species, performing PCR using primers comprising one kind of unique sequence, and amplifying the genome. Create a genome library.
  • the “primer consisting of one kind of unique sequence” does not include a random primer.
  • this method is a method for preparing a genomic library by PCR using only one kind of primer, and can easily prepare a library.
  • Examples of the pretreatment of the PCR include the following treatments.
  • a pre-treatment for example, among the above-mentioned primers, “5. Oligo DNA designed to have a sequence that does not appear in the genome of the target organism species or a sequence that appears infrequently at the terminal end” is used as a primer, Perform PCR under the conditions described above.
  • the 3 terminal end of the primer may be a 6-mer or more frequently occurring sequence as described above, or may be a 6-mer or more sequence consisting of random bases (random sequences) or universal bases. Good.
  • PCR is performed with a primer consisting of the random sequence and the unique sequence, with the 3 'end as a random sequence and the 5' end as a unique sequence.
  • a second PCR is performed using one type of primer comprising the above unique sequence, and the genome is amplified again to prepare a genomic library.
  • the base sequence of the 6-mer at the 3 'end of the primer is important for annealing to the target genome, and the unique sequence at the 5' end can be arbitrarily determined.
  • the second PCR may be carried out using a primer having a sequence added to the 5 'end of the unique sequence as a primer.
  • the genome is fragmented using restriction enzymes and physical cleavage methods, and an additional sequence such as a linker is linked to each fragment. Using this additional sequence portion as the primer annealing region, the genome is amplified using a primer consisting of one type of unique sequence in a subsequent step of PCR to prepare a genomic library.
  • an arbitrarily determined unique sequence is linked to each genomic fragment, and then the unique sequence (or a sequence obtained by adding a sequence to the 5 'end of this unique sequence) Perform PCR using one type of primer consisting of) to create a genomic library.
  • the PCR may be performed under the conditions described above, but the annealing temperature may be increased. May be performed, and other conditions can be arbitrarily determined.
  • the length of the primer used in the PCR is not particularly limited, but is preferably shorter than that of the primer used in the normal PCR.
  • the length is preferably about 8 mer or more and 15 mer or less in consideration of random annealing.
  • PCR may be performed after extracting and purifying genomic DNA, or PCR may be performed using cells and cells directly as a sample.
  • PCR was performed using the extracted genomic DNA as type III.
  • genomic DNA of E. coli K-12 W3110 strain was amplified by random PCR to prepare a genomic library of E. coli.
  • Primers used for random PCR are frequently appearing in the target genome It was designed based on the sequence of 1 Omer. Specifically, first, a sequence of 1 Omer, which frequently appears on the genome of E. coli K-12 W3110 strain, was searched. Is 46 3 92
  • primers 1 to 4 a primer synthesized from the first to fourth sequences having the highest appearance frequency among the above-mentioned 1 Omer sequences as primer sequences (hereinafter referred to as primers 1 to 4, respectively). ) It was used.
  • the composition of the PCR reaction solution is as follows.
  • Genomic DNA (extracted by standard method after propagation in E. coli) 80 ng / nil Primer: Any one of primers 1-4 4 / ⁇
  • the PCR conditions were as follows: First, denaturation was performed at 98 ° C for 5 seconds, and then the following cycle was performed 40 times.
  • the temperature change gradient (RAMP) from the annealing temperature to the elongation reaction temperature was 5% (5 minutes), and the set value was variously changed.
  • PCR was performed under the above conditions, and after a long time, confirmation was performed by electrophoresis.
  • a band due to specific amplification was observed in primers 1, 3, and 4, but in primer 2, the amplified product was smeared, and the entire genome was amplified.
  • the percentage (%) is the set value of the RAMP. The higher the percentage, the faster the transition from annealing to the elongation reaction, while the lower the percentage, the longer the time for raising the temperature. That would be.
  • FIG. 4 shows the measurement points. The measurement of the concentration ratio was carried out on a genomic fragment amplified by random; PCR, using Light CycLer manufactured by Rosh. In addition, Fig. 4 shows the primers (forward primers and lippers primers) used for the measurement at each location (region).
  • the difference in the concentration ratio (in other words, the amplification ratio) between the regions was within 10 times even at the largest point. It was shown that almost uniform amplification was performed in all regions.
  • the negative part of the genomic library prepared in Example 1 was subjected to sequence analysis. After sequence analysis, comparison with known genomic sequences was performed using BLAST. As a result, it was confirmed that amplification was performed in all regions of the genome.
  • a genomic library can be easily prepared from a very small amount of a sample, and as described above, research and analysis of pathogenic bacteria and pathogenic viruses, or existing in the environment and still sufficient It can be used for research and analysis of microorganisms and viruses that have not been elucidated, and can be widely used as a research material for genomic analysis of various organisms, as well as for research in genomic drug discovery and life sciences.

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Abstract

本発明の第１のゲノムライブラリー作製方法は、対象生物種のゲノムＤＮＡそのもの又はその断片を直接の鋳型とし、かつ、特定の配列からなる１種類のプライマー又はランダムプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する。本発明の第２のゲノムライブラリー作製方法は、対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、１種類の固有配列からなるプライマーを使用してＰＣＲを行い、ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを作製する。いずれも微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製することができる。

Description

明 細 書 ゲノムライプラリ一作製方法、 およぴ同方法により作製されたゲノムライプラリ
技術分野
本発明は、 微少量サンプルから簡便にゲノムライブラリーを作製する方法、 お よび同方法により作製されたゲノムライプラリーに関する。 本発明は、 各種生物 のゲノム解析用の研究材料、 ゲノム創薬、 その他生命科学諸分野の研究に広く利 用し得るものである。 背景技術
従来、 ゲノムライブラリーを作製する方法としては、 通常ショットガンクロー ユング法により、 切断したゲノム断片をプラスミド、 コスミド、 ファージ、 人工 染色体ベクター等にクローエングする方法が用いられている。
しかしながら、上記従来の方法では制限酵素による切断処理やべクタ一にゲノ ム断片を組み込む処理など多くの処理が必要となるため、 サンプル （試料） とし て大量のゲノム D NAを必要とし、煩雑な操作を伴うものであった。 したがって、 培養が困難な微生物の場合は、 サンプルを多く得ることができず、 ライプラリー の作製は困難であった。
一方、 P C R (Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ 'チェーン ' リア クシヨン） を用いたゲノムライプラリー作製方法が、 1 9 9 7年に S i n g e r らによって報告されている （Nucleic Acids Research, vol.25, No.4 (1997) 781-786 頁）。 しかし、 この方法も、 制限酵素によって断片化した後、 各ゲノム 断片に対してリンカ一を施す処理等を必要とし、 P C Rの前段階処理が非常に煩 雑であった。 そのため、 これらの処理に伴うゲノム D N Aの損失が避けられず、 微少量サンプルから簡便にゲノムライプラリーを作製することは困難であった。 また、 この方法は、 P C Rにおいて複数種類のプライマーを使用するものであつ た。
生物学 ·生命科学の諸分野においてゲノムレベルでの研究解析が重要であるこ とはいうまでもないが、実用面においても各種生物をゲノムレベルで研究解析す る重要性は増している。 例えば、 病原菌や病原性ウィルスのゲノムレベルでの研 究解析、 あるいは、 環境中に存在し、 未だ十分に解明が進んでいない微生物ゃゥ ィルスのゲノムレベルでの研究解析は公衆衛生 ·国民の健康確保の観点から今後 一層重要なものといえる。 このような研究解析のためにも、 簡便に微少量サンプ ルからゲノムライプラリーを作製する方法の開発が求められている。 発明の開示
本発明は、 上記の問題点を解決するためになされたものであり、 微少量サンプ ルから簡便にゲノムライプラリーを作製する方法、 および同方法により作製され たゲノムライブラリーを提供することをその課題とする。
本発明者は、 上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、 增幅対象のゲノムに比較的 よく出現する配列をもとに設計した 1種類のプライマーを使用して P C Rを行 うことにより、 ゲノム全領域がほぼ均等に増幅され、 簡便にゲノムライプラリー を作製し得ること等を見出し、 本発明を完成させるに至った。
即ち、 本発明は、 産業上有用な発明として、 下記 A) 〜M) の発明を包含する ものである。
A) 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、 対象生物種 のゲノム D N A又はその断片を铸型とし、 かつ、 特定の配列からなる 1種類のプ ライマー又はランダムプライマーを使用して P C Rを行い、 ゲノムを増幅するこ とによりゲノムライブラリ一を作製する方法。
B ) 対象生物種のゲノムにおいて出現頻度の高い配列を含むように設計したォ リゴ DNAをプライマーとして使用することを特徴とする上記 A)記載のゲノム ライプラリー作製方法。
C) 出現頻度の高い配列を 6me r以上含むように設計したオリゴ DNA.をプ ライマーとして使用することを特徴とする上記 B) 記載のゲノムライプラリー作 製方法。
D) 3' 末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、 5' 末端側に対象生物 種のゲノムにおいて出現.しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するよう に設計したオリゴ DNAをプライマーとして使用することを特徴とする上記 B) 又は C) 記載のゲノムライブラリ 作製方法。
E) 3' 末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、 さらにその 3， 末端側 にランダム塩基おょぴノ又はュュパーサル塩基からなる lme r以上の領域を 有するように設計したオリゴ DN Aをプライマーとして使用することを特徴と する上記 B) 〜D) のいずれかに記載のゲノムライブラリー作製方法。
F) 3， 末端側にランダム塩基おょぴ Z又はユニバーサル塩基からなる 6 me r以上の領域を有するように設計したオリゴ DNAをプライ.マーとして使用す ることを特徴とする上記 A) 記載のゲノムライブラリ一作製方法。
G) 3， 末端側にランダム塩基および 又はユニバーサル塩基からなる 6 me r以上の領域を有すると共に、 5， 末端側に対象生物種のゲノムにおいて出現し ない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴ： DNAを プライマーとして使用することを特徴とする上記 F) 記載のゲノムライブラリー 作製方法。
H) 上記 D) 又は G) 記載のプライマーを使用して第 1の PCRを行った後、 5， 末端側の配列を含むプライマーを使用して第 2の PCRを行うことを特徴と するゲノムライブラリ一作製方法。
I) PCR条件として、アニーリング温度を 30°C以上 45°C以下にし、かつ、 アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を 5秒以上 20分以下 に設定したサイクルを含むことを特徴とする上記 A) 〜H) のいずれかに記載の ゲノムライブラリ一作製方法。
J ) 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、 対象生物種 のゲノムに対し前処理を行つた後、 1種類の固有配列からなるプライマーを使用 して P C Rを行い、 ゲノムを増幅することによりゲノムライプラリーを作製する 方法。
K) 上記 B ) 〜G) のいずれかに記載のオリゴ D NAをプライマーに使用して ゲノムを増幅する前処理を行った後、 1種類の固有配列からなるプライマーを使 用して P C Rを行い、 ゲノムを再度増幅することを特徴とする上記 J ) 記載のゲ ノムライプラリー作製方法。
L) ゲノムを断片化し、 各断片にリンカ一等の付加配列を結合させる前処理を 行った後、 1種類の固有配列からなるプライマーを使用して P C Rを行い、 ゲノ ムを増幅することを特徴とする上記 J ) 記載のゲノムライブラリ一作製方法。 M) 上記 A) 〜L) のいずれかに記載の方法により作製されたゲノムライブラ リー。
本発明の第 1の方法は、対象生物種のゲノム D NAそのもの又はその断片を直 接の铸型として P C Rを行うことにより、ゲノムライブラリーを作製する。即ち、 P C Rの铸型には、 リンカ一等のゲノム配列以外の配列が何ら付加されていない ゲノム D NAそのもの、 又はその断片を使用する。 したがって、 P C Rの前段階 処理として、 抽出したゲノム D NAを制限酵素によって切断し、 得られた各断片 に対してリンカ一を施すといった煩雑な処理が不要であり、 これらの処理に伴う サンプルの損失を防止することができる。
また、 本発明の第 1の方法によれば、 菌体ゃ培養細胞等を直接のサンプルとし て P C Rを行うことにより、 ゲノムライブラリーを作製することも可能である。 この場合、 ゲノム D NAの抽出工程が不要となるので、 更に簡便な操作でゲノム ライブラリ一を作製することができる。 本発明の第 2の方法は、 対象生物種のゲノムに対し前処理を行った後、 1種類 の固有配列からなるプライマ—を使用して P C Rを行うことにより、 ゲノムライ ブラリーを作製する。 1種類のプライマーのみを使用した P C Rによって、 簡便 にゲノムライブラリ一を作製することができる。
このように、 本発明の方法によれば、 微少量サンプルから簡便にゲノムライプ ラリ一を作製することができる。
本発明のさらに他の目的、 特徴、 および優れた点は、 以下に示す記載によって 十分わかるであろう。 また、 本発明の利益は、 添付図面を参照した次の説明で明 白になるであろう。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明のゲノムライブラリ一作製方法を概略的に説明する図である。 図 2は、 本実施例のゲノムライブラリー作製方法において、 互いに異なるブラ イマ一を使用して P C Rによりゲノムを増幅し、 その結果をゲル電気泳動により 調べた結果を示す図である。
図 3は、 本実施例のゲノムライプラリー作製方法において、 互いに異なる条件 でプライマー 2を使用して P C Rによりゲノムを増幅し、 その結果をゲル電気泳 動により調べた結果を示す図である。
図 4は、 本実施例で作製したゲノムライプラリーに対して、 実際にゲノム全領 域が増幅されているかどうかを確認するために行つた実験で使用した各種プラ イマ一、およびこれらプライマーによって増幅されるゲノム領域を説明する図で る。
図 5は、 本実施例で作製したゲノムライブラリーに対して、 実際にゲノム全領 域が増幅されているかどうかを確認するために行った実験の実験結果を示す図 である。
図 6は、本実施例で使用したプライマー 2の配列とゲノム上の配列とを比較検 討した結果を示すグラフである 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の具体的実施態様について詳しく説明する。
( 1 ) 第 1のゲノムライブラリー作製方法
本発明の第 1のゲノムライブラリ一作製方法は、 リンカ一等のゲノム配列以外 の配列が何ら付加されていないゲノム D NAそのもの、又はその断片を铸型とし て P C Rを行い、 ゲノムライブラリーを作製する。 ここで、 ゲノム D NAを铸型 として P C Rを行う場合には、 前述のとおり、 抽出したゲノム D N Aを使用する 場合のほか、 ゲノム D N Aを抽出することなく菌体ゃ培養細胞等を直接サンプル として使用し、 菌体内 ·細胞内等のゲノム D N Aを铸型として P C Rを行う場合 も含まれる。
さらに本発明の特徴をなすプライマ—について説明する。本発明の P C Rに使 用するプライマーには、大別して（1 )特定の配列からなる 1種類のプライマー、 又は （2 ) ランダムシークェンスを含むランダムプライマーを使用する。
このうち、 特定の配列からなる 1種類のプライマーを使用する場合は、 対象ゲ ノムにおいて出現頻度の高い配列を含むように設計したオリゴ D NAをプライ マーとして使用することが好ましい。 本発明における P C Rは、 ゲノム全領域を ランダムに増幅するランダム P C Rであること、 換言すれば、 ゲノム全領域を出 来るだけ均等に増幅することが求められるので、 プライマーは、 ゲノム上の一部 特定の領域に特異的にァニール （相補鎖結合） するものではなく、 ゲノム上の複 数の領域にいわば非特異的にァユールするものが望ましいからである。
さらに、 後述の実施例に示すように、 本発明者はプライマ一のアニーリング領 域として 6 m e rの塩基配列が重要であることを見出したので、 出現頻度の高い 配列を 6 m e r以上含むように設計したオリゴ D N Aをプライマーとして使用 することが好ましい。 対象ゲノムにおける出現頻度の高い配列は、 当該ゲノムの配列情報をもとに決 定することができる。この場合、すべてのゲノム配列が知られている必要はなく、 知られている一部のゲノム配列をもとに出現頻度の高い配列を決定してもよい。 あるいは、 本発明の P CRを行う前に、 対象ゲノムをランダムにシークェンシン グし、 得られた配列情報をもとに出現頻度の高い配列を決定してもよい。
例えば、 出現頻度の高い配列を 6 me r含むようにプライマーを設計する場合、 ゲノムの配列情報に含まれるすべての 6 me rの配列のうち出現頻度の高い配 列を順番に決定する。 そして、 出現頻度の高い 1〜20番目の配列の中から任意 の配列を選択し、 同配列を含むようにプライマーを設計する。 このように、 「出 現頻度の高い配列」 とは、 出現頻度の最も高い配列に限定されるものではなく、 比較的出現頻度の高い配列の中から任意の配列を選択すればよい。
本発明において使用するプライマーの長さは、特に限定されるものではないが、 通常の PC Rに使用するプライマーに比べて短いことが好ましく、具体的にはァ ニーリング温度およぴゲノム上にランダムにァニールさせる点などを考慮して 8me r以上 1 5me r以下程度の長さであることが好ましい。
例えば、 プライマーの長さを 15me rとする場合、 出現頻度の高い配列を 6 me r以上 1 5me r以下含むように設計する。 後述の実施例においては、 ブラ イマ一の長さを 1 Om e rとし、 出現頻度の高い 1 0 m e rの配列を含むように プライマ を設計し、 このプライマーを使用して PCRを行うことにより、 ゲノ ム全領域をほぼ均等に增幅することができた。 したがって、 例えばプライマーの 長さを 10〜1 2me r程度とし、 出現頻度の高い配列を 6 m e r以上 12m e r以下含むようにプライマー設計するとよい。
また、 使用するプライマーは、 3' 末端側に出現頻度の高い配列を有するよう に設計することが好ましい。
尚、設計するプライマーに含まれる出現頻度の高い配列中の 1又は複数の塩基 をユニバーサル塩基にしてもよいし、 あるいは、 ランダム塩基 （ランダムシーク エンス） にしてもよい。 ここで、 ユニバーサル塩基とは、 アデ-ン （A)、 チミ ン （T)、 グァニン （G)、 シトシン （C ) のいずれの塩基とも水素結合し得る塩 基をいい、 5-Nitroindole、 3-Nitropyrroleなどが例示される。 また、 ランダム塩 基 （ランダムシークェンス） とは、 配列中の特定位置の塩基が A、 T、 G、 Cの いずれかにランダムに合成された当該塩基をいう。 ランダム塩基 （ランダムシ一 クエンス） を含むプライマー （即ち、 ランダムプライマー） は、 例えばプライマ 一合成において特定位置の塩基として A、 T、 G、 Cをほぼ等量ずつ加えること によって 1回の合成で作製することができる。 このように、 本発明においてラン ダムプライマーを使用する場合も 1回の合成で作製することができるので、 プラ イマ一作製が容易である。
上記のように、 本発明に使用するプライマーは、 3 ' 末端側に出現頻度の高い 配列を有するように設計することが望ましいが、 さらにその配列の 3 ' 末端側に ランダム塩基 （ランダムシークェンス） もしくはユニバーサル塩基からなる l m e r以上の領域を有するようにプライマーを設計してもよい。
あるいは、 出現頻度の高い配列を有することなく、 3， 末端側にランダム塩基 (ランダムシークェンス） もしくはユニバーサル塩基からなる 6 m e r以上の領 域を有するようにプライマーを設計してもよい。 前述のように本発明者による解 析の結果、 プライマーのアニーリング領域として 6 m e rの塩基配列が重要であ ることが判明したので、 ランダム塩基 （ランダムシークェンス） もしくはュ-バ ーサル塩基からなる領域を 6 m e r以上とすることで、 プライマーをゲノム上に 非特異的にァユールさせることが可能と考えられる。
3 ' 末端側に出現頻度の高い配列を有するようにプライマーを設計する場合に おいて、 5， 末端側には対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い配 列を有するようにプライマーを設計することは好ましい。 例えば、 3 ' 末端側に 出現頻度の高い配列を 6 m e r以上有すると共に、 5 ' 末端側に対象ゲノムに出 現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を 6 m e r以上有するようにプライ マーを設計する。 このようにプライマーを設計することで、 当該プライマーを使 用して第 1の PCRを行った後、 5' 末端側の 6 me r以上の配列を含むプライ マーを使用して第 2の P C Rを行い、 増幅した各ゲノム断片をさらにより安定し て増幅することができる。
同様に、 （1) 3' 末端側に、 出現頻度の高い配列を有すると共に、 さらにそ の配列の 3， 末端側にランダムシークェンスもしくはユニバーサル塩基からなる lnie r以上の領域を有するようにプライマーを設計する場合、 および、 （2) 3， 末端側にランダムシークェンスもしくはユニバーサル塩基からなる 6m e r 以上の領域を有するようにプライマーを設計する場合、のいずれにおいても、 5， 末端側には対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い特定の配列を 有するようにプライマーを設計することは好ましい。 例えば、 3' 末端側にラン ダムシークェンスもしくはユニバーサル塩基からなる 6me r以上の領域を有 すると共に、 5' 末端側に対象ゲノムに出現しない配列もしくは出現頻度の低い 配列を 6me r以上有するようにプライマーを設計する。 このようにプライマー を設計した場合においても、 当該プライマーを使用して第 1の PCRを行った後、 5， 末端側の 6 me r以上の配列を含むプライマーを使用して第 2の P C Rを行 うことで、 増幅した各ゲノム断片をさらにより安定して増幅することができる。 尚、 「出現頻度の低い配列」 についても、 「出現頻度の高い配列」 と同様、 出現 頻度の最も低い配列に限定されるものではなく、比較的出現頻度の低い配列の中 から任意の配列を選択すればよい。
本発明においては、以上説明したいずれかのプライマーを使用して PC Rを行 うことにより、 2つのプライマーで挟まれたゲノム上の特定領域を增幅する通常 の PCRとは異なり、 対象ゲノムをランダムかつ非特異的に增幅する 「ランダム P CR」 を行うものである。
次に、 本発明の PC R条件について説明する。
まず、 抽出したゲノム DNAを铸型 （テンプレート） に使用する場合は、 PC R前に、 アルカリ法による抽出、 フエノール抽出、 グァニジン抽出、 その他キッ ト等を用いた抽出によってゲノム D NAを抽出する。 抽出したゲノム D NAは制 酵素によって断片化してもよいが、 本発明においては、 抽出したゲノム D NA そのものを踌型に使用することができる。 もちろん、 P C R前に、 ゲノム D NA に対してリンカ一を施すなどの煩雑な処理は不要である。 また、 前述のように、 ゲノム D N Aを抽出することなく菌体ゃ培養細胞等を直接サンプルとして使用 し、 菌体内 ·細胞内等のゲノム D NAを铸型として P C Rを行ってもよい （図 1 参照）。
また、 ゲノムライプラリー作製の際の P C R条件としては、 短いプライマーを ゲノム全領域に効率的にァニールさせるためにアニーリング温度を低く設定し、 プライマーをァニールさせ、 そこから伸長反応の温度までゆつくり温度を上げ、 ァニールさせたプライマーに対してゆつくりとした速度で伸長反応を行わせ、 伸 長反応の温度でプライマーが解離しないようにすることが好ましい。
そのため、 P C R条件としては、 アニーリング温度を 3 0 °C以上 4 5 °C以下に し、 かつ、 アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を 5秒以上 2 0分以下に設定し、 さらに伸長反応温度を 0秒以上 1 5分以下に設定したサイク ルを含むことが望ましい。 そして、 このようにアニーリング温度を低くして、 そ こから徐々に温度を上げてゆつくりと伸長反応を行わせるサイクルは、最初の数 回だけでもよいが、 全サイクルをこの方法で行ってもよい。 （尚、 伸長反応温度 0秒の場合とは、 ァユーリング温度から伸長反応温度まで温度を上昇させ、 伸長 反応温度に達しても温度を維持することなく、 そのまま変性温度まで温度を上昇 させるように設定した場合である。）
上記以外の P C R条件、 例えば、 サイクル数、 D NAを一本鎖にするための変 性温度、 P C Rバッファーの組成、 D N Aポリメラーゼの種類などは公知の方法 にしたがって任意に決定すればよく、 特に限定されるものではない。
後述の実施例に示すように、上記条件にしたがってランダム P C Rを行うこと により、 ゲノム全領域をほぼ均等に増幅することができ、 簡便にゲノムライブラ リーを作製できることが確認された。 また、 本発明の方法は、 ゲノムにリンカ一 を施す処理やベクターにゲノム断片を組み込む処理など煩雑な処理が不要であ り、 これら煩雑な処理に伴うサンプルの損失を防止できるので、 微少量サンプル からのゲノムライプラリー作製が容易となる。
本発明のゲノムライブラリ一作製方法、 およぴ同方法により作製されたゲノム ライブラリ一は、 各種生物のゲノム解析用の研究材料、 ゲノム創薬、 その他生命 科学諸分野の研究に広く利用できる。 例えば、 環境中に存在し、 未だ十分に解明 が進んでいない微生物やウィルスの研究解析用に本発明を利用できる。 とりわけ、 病原菌や病原性ウィルスの研究解析は公衆衛生 ·国民の健康確保の観点から重要 であるが、 このような研究解析に本発明は有用である。
. 本発明によってゲノムライブラリーを作製し得る生物種は、特に限定されるも のではない。 例えば、 微生物 'ウィルスのほか、 植物 '動物いずれであってもよ く、 ヒ トを含む哺乳類であっても勿論よい。 また、 解析対象のウィルス等が R N Aゲノムの場合は、 逆転写酵素によって相補鎖 D NAを合成し、 これをもとに铸 型となるゲノム D NAを調製すればよい。
前述のように、 本発明は、 特定の配列からなる 1種類のプライマー又はランダ ムプライマーを使用して P C Rを行うことにより、簡便にゲノムライプラリーを 作製することができる。 このように、 簡便性 ·コスト等の面からは 1種類のブラ イマ一又はランダムプライマーを使用することが好ましいが、 本発明は、 1種類 のプライマーのみ使用する場合に限定されるものではない。 例えば、 出現頻度の 最も高い配列と 2番目に高い配列をもとにそれぞれプライマーを作製し、得られ た 2種類のプライマーを使用して P C Rを行ってもよい。 即ち、 本発明は、 少な くとも 1種類のプライマー （又はランダムプライマー） を使用して P C Rを行う 方法であればよい。
また、 プライマーのァ -ーリング領域としては前述のように 6 m e rの塩基配 列が重要であるが、 後述の実施例に示すように、 6ine rのうち 1塩基程度ゲノ ム上の配列と相違する場合であれば、 PCRによる増幅が行われていたので、 少 なくとも 6me r中 5塩基をゲノム上の出現頻度の高い配列と一致するように 設計するとよい。
(2) 第 2のゲノムライブラリー作製方法
本発明の第 2のゲノムライプラリ一作製方法は、対象生物種のゲノムに対し前 処理を行つた後、 1種類の固有配列からなるプライマーを使用して P C Rを行い、 ゲノムを増幅することによりゲノムライプラリーを作製する。 ここで、 「1種類 の固有配列からなるプライマー」 にはランダムプライマーは含まれない。
このように本方法は、 1種類のプライマーのみを使用した PC Rによりゲノム ライブラリ一を作製する方法であり、 簡便なライプラリ一作製が可能である。 上記 PCRの前処理としては、 例えば次のような処理が挙げられる。
i ) 前処理として、 例えば前述のプライマーのうち、 「5， 末端側に対象生 物種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するよ うに設計したオリゴ DNA」 をプライマーに使用して、 前述の条件で PCRを行 う。 プライマーの 3， 末端側は、 前述のように 6me r以上の出現頻度の高い配 列であってもよいし、 ランダム塩基 （ランダムシークェンス） もしくはュニバー サル塩基からなる 6me r以上の配列であってもよい。 例えば、 3' 末端側をラ ンダム配列、 5' 末端側を固有配列として、 前処理においては、 このランダム配 列 +固有配列からなるプライマーで PCRを行う。
その後、 上記固有配列からなる 1種類のプライマーを使用して第 2の PCRを 行い、 ゲノムを再度増幅することによりゲノムライブラリ一を作製する。
前処理の PCRにおいて、 対象ゲノムとのアニーリングには、 プライマー 3' 末端側の 6 me rの塩基配列が重要であり、 5' 末端側の固有配列は任意に決定 することも可能である。 また、 この固有配列の 5' 末端側に配列を付加したもの をプライマーに使用して第 2の PC Rを行ってもよい。 ii) 他の前処理として、 制限酵素、 物理的切断方法を用いて、 ゲノムを断片 化し、 各断片にリンカ一等の付加配列を結合させる。 この付加配列部分をプライ マーのアニーリング領域として、後工程の P C Rにおいて 1種類の固有配列から なるプライマーを使用してゲノムを増幅し、 ゲノムライブラリ一を作製する。 このように、 この前処理では、 各ゲノム断片に対して、 任意に決定した固有配 列を結合させ、 その後、 この固有配列 （又は、 この固有配列の 5 ' 末端側に配列 を'付加したもの） からなる 1種類のプライマーを使用して P C Rを行い、 ゲノム ライブラリーを作製する。
上記 i ) 又は ii) の前処理の後に行う、 1種類の固有配列からなるプライマー を使用した P C Rにおいて、 P C R条件は前述した条件で行ってもよいが、 ァニ 一リング温度をより高くして行ってもよく、 その他の条件についても任意に決定 することができる。
また、 上記； P C Rにおいて使用するプライマーの長さは、 特に限定されるもの ではないが、 通常の P C Rに使用するプライマーに比べて短いことが好ましく、 具体的にはァニーリング温度おょぴゲノム上にランダムにァニールさせる点な どを考慮して 8 m e r以上 1 5 m e r以下程度の長さであることが好ましい。 以下、 図面を参照して本発明の実施例について説明するが、 本発明はこれら実 施例によって何ら限定されるものではない。
〔実施例 1〕
本発明のゲノムライプラリー作製方法は、 図 1に示すように、 ゲノム D NAを 抽出 ·精製した後 P C Rを行ってもよいし、 細胞 ·菌体等を直接サンプルとして 使用して P C R反応を行ってもよいが、 本実施例においては、 抽出したゲノム D N Aを铸型として P C Rを行った。
また、 本実施例においては、 大腸菌のゲノムライプラリーを作製するため、 大 腸菌 E.coli K-12 W3110株のゲノム D N Aをランダム P C Rによって増幅した。 ランダム P C Rに使用したプライマーは、対象ゲノムにおいて出現頻度の高い 1 Ome rの配列をもとに設計した。 具体的には、 まず、 大腸菌 E.coli K-12 W3110株のゲノム上において、出現頻度の高い 1 Ome rの配列の検索を行った, ゲノムの全長 46 3 922 1塩基において 1 Ome rの配列は合計 46 3 92
1 2個であり、 このうち出現頻度の高い 1番目から 20番目までの配列を抽出 · 決定した。 その結果を下記表 1に示す。
〔表 1〕 a b
1. CGCATCCGGC 149 0 .0032
2. CCAGCGCCAG 143 0 .0031
3. GCATCCGGCA 142 0 .0031
4. GCCGCATCCG 136 0 .0029
5. TGCCGGATGC 136 0 .0029
6. GCCGGATGCG 134 0 .0029
7. CAGCGCCAGC ' 134 0 .0029
8. CTGGCGCTGG 125 0 .0027
9. GCCTGATGCG 124 0 .0027
10. CGCCGCATCC 122 0 .0026
11. GCTGGCGCTG 120 0 .0026
12. CGGATAAGGC 115 0 .0025
13. TGCCTGATGC 114 0 .0025
14. ACGCCGCATC 113 0 .0024
15. CGGATGCGGC 112 0 .0024
16. GGATGCGGCG 111 0 .0024
17. GGCGCTGGCG 109 0 .0023
18. CCGCATCCGG 109 0 .0023
19. CGCCAGCGCC 108 0 .0023
20. GGATAAGGCG 107 0 .0023
4639212 fragments in 4639221 redidues a: 出現する回数 b: lOmer全体に対する割合 上記表 1に掲げた 10 m e rの配列は、 それぞれ配列表の配列番号 1〜 20に あ示される。
本実施例のランダム PC Rには、上記 1 Ome rの配列のうち出現頻度が最も 高かった 1番目から 4番目までの配列をプライマー配列として合成したプライ マー （以下、 それぞれプライマー 1〜4という。） を使用した。 P CR反応液の組成は以下のとおりである。
錚型：ゲノム DNA (大腸菌増殖後に常法により抽出） 80 n g/nil プライマー：プライマー 1〜4のいずれかのプライマー 20/ίΜ
dNTP 0. 2mM
DNAポリメラーゼ： T a k a r a社製 Z— t a q 0. 2U
ゾ ッファ—： X 10 P CR u f f e r 1 /i L
dH20で 10 μ Lにメスアップ
また、 PCR条件は、 最初に 98度 5秒で変性後、 下記のサイクルを 40回行 つた。
変性温度： 98°C 5秒
ァニ一リング温度： 42°C 10秒
アニーリング温度から伸長反応温度までの温度変化勾配 （RAMP) ： 5% (5 分） のほか設定値を様々に変更して行った。
伸長反応温度： 72°C 7分
上記条件で PCRを行い、 增幅後、 電気泳動により確認を行った。 その結果、 図 2に示すように、 プライマー 1 · 3 · 4においては特異的な増幅によるパンド がみられたが、 プライマー 2においては、 增幅産物がスメアーになっており、 ゲ ノム全領域を増幅していると考えられた。 尚、 同図において、 パーセント （％) は上記 RAMPの設定値であり、 このパーセントが高いほどアニーリングから伸 長反応への移行が早くなる一方、パーセントが小さいと温度を上げるのに長い時 間がかかることになる。
上記プライマー 2を用いて、 さらに様々なプライマー濃度で同様に PCRを行 つたところ、 プライマー濃度を低くするとさらに特異的な増幅が減少し、 ゲノム 全体が短い断片として増幅されることが確骣された （図 3参照）。 アニーリング 時の温度 （図中 「d e g」） も様々に変更して PCRを行ったところ、 この温度 とプライマー濃度とを調節することにより、 よりスメアーな泳動結果が得られ、 7
16
ゲノム全般を増幅していると考えられた。
また、増幅されたゲノム断片をテンプレートとして再度同様に増幅を行ったと ころ、長鎖 DNAが増幅されにくくなった。さらに、再々増幅実験をしたところ、 長鎖 DNAがー層増幅されにくくなつたが、 その変化は小さくなつた。
〔実施例 2〕
実施例 1で作製したゲノムライブラリ一に対して、実際にゲノム全領域が増幅 されているかどうかを確認するために、 E.coli K-12 W3110株ゲノムの任意の 1 0力所についての濃度比の測定を行った。 測定箇所を図 4に示す。 濃度比の測定 は、 Ro s h社製 L i g h t Cy c l e rを用いて、 ランダム； PCRにより增 幅したゲノム断片に対して測定を行った。 また、 その際に各箇所 （領域） の測定 に使用したプライマー （フォワードプライマーおょぴリパースプライマー） をあ わせて図 4に示す。
上記測定の結果、 図 5に示すように、 各領域間において濃度比 （換言すれば増 幅比率） の差が一番大きいところでも 10倍以内に収まっており、 作製したゲノ ムライプラリーにおいては、 ゲノム全領域においてほぼ均一な増幅が行われてい ることが示された。
〔実施例 3〕
実施例 1で作製したゲノムライブラリーの—部をシークェンス解析した。 シー クエンス解析後、 BLASTを用いて既知のゲノム配列との比較を行った。 その 結果、 ゲノムの全領域において増幅が行われていることが確認された。
さらに、 増幅された断片をもとに、 本実施例の PCRに使用した上記プライマ 一 2の配列と、ゲノム上の配列との比較を行った。その結果、図 6に示すように、 プライマー配列の 3， 末端側の 6塩基 （6me r) までは、 ゲノム上の配列と非 常に高い一致が認められた （図中、 縦軸は割合を示す)。 したがって、 プライマ 一のアニーリング領域としては、 6 me rの塩基配列が重要である。
また、 上記 6塩基での塩基配列の分散を調べたところ、 1塩基差異程度であれ ば、 増幅が行われていることが確認された。
以上の結果から、 ゲノムライブラリーの作製に使用するプライマーとしては、 3 ' 末端側の 6塩基をゲノム上の出現頻度の高い配列と一致するように設計する ことが望ましく、少なくともその 6塩基中 5塩基をゲノム上の出現頻度の高い配 列と一致するように設計することが望ましいことが示された。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様ま たは実施例は、 あくまでも、 本発明の技術内容を明らかにするものであって、 そ のような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、 次に記載す る特許請求の範囲内で、 様々に変更して実施することができる。 産業上の利用の可能性
以上のように、本発明によれば微小量サンプルから簡便にゲノムライブラリ一 を作製することができるので、 前述したとおり、 病原菌や病原性ウィルスの研究 解析、 あるいは、 環境中に存在し、 未だ十分に解明が進んでいない微生物やウイ ルスの研究解析などに利用できるほか、各種生物のゲノム解析用の研究材料とし て、 さらにゲノム創薬、 生命科学諸分野の研究に広く利用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 任意の生物種のゲノムライブラリーを作製する方法であって、 対象生物種 のゲノム DNA又はその断片を錶型とし、 かつ、 特定の配列からなる 1種類 のプライマー又はランダムプライマーを使用して PCRを行い、 ゲノムを増 幅することによりゲノムライブラリ一を作製する方法。
2. 対象生物種のゲノムにおいて出現頻度の高い配列を含むように設計したォ リゴ DNAをプライマーとして使用することを特徴とする請求項 1記載の ゲノムライブラリ一作製方法。
3. 出現頻度の高い配列を 6 me r以上含むように設計したオリゴ DNAをプ ライマーとして使用することを特徴とする請求項 2記載のゲノムライブラ リ一作製方法。
4. 3' 末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、 5' 末端側に対象生物 種のゲノムにおいて出現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有する ように設計したオリゴ DNAをプライマーとして使用することを特徴とす る請求項 2又は 3記載のゲノムライブラリ一作製方法。
5. 3' 末端側に出現頻度の高い配列を有すると共に、 さらにその 3' 末端側 にランダム塩基おょぴノ又はュ-パーサル塩基からなる lme r以上の領 域を有するように設計したオリゴ DN Aをプライマーとして使用すること を特徴とする請求項 2〜 4のいずれか 1項に記載のゲノムライプラリー作 製方法。
6. 3 ' 末端側にランダム塩基および/又はユニバーサル塩基からなる 6 me r以上の領域 有するように設計したオリゴ DNAをプライマーとして使 用することを特徴とする請求項 1記載のゲノムライブラリ一作製方法。
7. 3， 末端侧にランダム塩基おょぴノ又はユニバーサル塩基からなる 6 me r以上の領域を有すると共に、 5' 末端側に対象生物種のゲノムにおいて出 現しない配列もしくは出現頻度の低い配列を有するように設計したオリゴ
DN Aをプライマーとして使用することを特徴とする請求項 6記載のゲノ ムライブラリー作製方法。
8. 請求項 4又は 7記載のプライマーを使用して第 1の PCRを行った後、 5， 末端側の配列を含むプライマーを使用して第 2の PCRを行うことを特徴 とするゲノムライブラリー作製方法。
9. PCR条件として、アニーリング温度を 30°C以上 45 °C以下にし、かつ、 アニーリング温度から伸長反応温度までの温度上昇時間を 5秒以上 20分 以下に設定したサイクルを含むことを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載のゲノムライブラリ一作製方法。
10. 任意の生物種のゲノムライプラリーを作製する方法であって、 対象生物種 のゲノムに対し前処理を行った後、 1種類の固有配列からなるプライマーを 使用して P C Rを行い、 ゲノムを増幅することによりゲノムライブラリーを 作製する方法。
11. 請求項 2〜 7の何れかに記載のオリゴ DNAをプライマーに使用してゲノ ムを増幅する前処理を行った後、 1種類の固有配列からなるプライマーを使 用して PCRを行い、 ゲノムを再度増幅することを特徴とする請求項 10記 載のゲノムライブラリ一作製方法。
12. ゲノムを断片化し、 各断片にリンカ一等の付加配列を結合させる前処理を 行った後、 1種類の固有配列からなるプライマーを使用して PCRを行い、 ゲノムを増幅することを特徴とする請求項 10記載のゲノムライブラリー 作製方法。
13. 請求項 1〜12のいずれか 1項に記載の方法により作製されたゲノムライ ブラリー。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201013153D0 (en) * 2010-08-04 2010-09-22 Touchlight Genetics Ltd Primer for production of closed linear DNA
CN102533960B (zh) * 2010-12-31 2014-04-30 深圳华大基因科技有限公司 一种单细胞基因组分析方法及试剂盒
EP2847353B1 (en) 2012-05-10 2022-01-19 The General Hospital Corporation Methods for determining a nucleotide sequence
US10450597B2 (en) * 2014-01-27 2019-10-22 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
CN104153004A (zh) * 2014-08-11 2014-11-19 上海美吉生物医药科技有限公司 一种用于扩增子测序的建库方法
JP6515884B2 (ja) * 2016-06-29 2019-05-22 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａプローブの作製方法及びｄｎａプローブを用いたゲノムｄｎａ解析方法
WO2018003220A1 (ja) * 2016-06-29 2018-01-04 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａライブラリーの作製方法及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
JP7343264B2 (ja) * 2016-06-29 2023-09-12 トヨタ自動車株式会社 Ｄｎａライブラリーの作製方法及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法
JP7056012B2 (ja) 2017-05-19 2022-04-19 トヨタ自動車株式会社 ランダムプライマーセット、及びこれを用いたｄｎａライブラリーの作製方法
JP7047373B2 (ja) 2017-12-25 2022-04-05 トヨタ自動車株式会社 次世代シーケンサー用プライマー並びにその製造方法、次世代シーケンサー用プライマーを用いたｄｎａライブラリー並びにその製造方法、及びｄｎａライブラリーを用いたゲノムｄｎａ解析方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030134293A1 (en) * 1999-11-16 2003-07-17 Zhiping Liu Method for rapid and accurate identification of microorganisms
US7176002B2 (en) * 2002-05-16 2007-02-13 Applera Corporation Universal-tagged oligonucleotide primers and methods of use
EP1604040B1 (en) * 2003-03-07 2010-10-13 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GROTHUES D. ET AL: "PCR amplification of megabase DNA with tagged random primers (T-PCR)", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 21, no. 5, 1993, pages 1321 - 1322, XP002126258 *
See also references of EP1721970A4 *
SINGER B.S. ET AL: "Libraries for genomic SELEX", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 25, no. 25, 1997, pages 781 - 786, XP002981302 *
SUN F. ET AL: "Whole genome amplification of single cells: mathematical analysis of PEP and tagged PCR", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 23, no. 15, 1995, pages 3034 - 3040, XP001093666 *
ZHANG L. ET AL: "Whole genome amplification from single cell: Implications for genetic analysis", PNAS USA, vol. 89, 1992, pages 5847 - 5851, XP002130909 *

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