CN104955962B - 核酸扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及实行模板核酸的解旋酶依赖性扩增(HDA)或嗜热解旋酶依赖性扩增的方法，所述方法包括：(i)在反应混合物中组合所述模板核酸、正向和反向HDA引物、解旋酶、至少一种DNA聚合酶和三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)，(ii)其中所述反应包含下式(I)的线性聚乙二醇，其中n在2至50之间，优选n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。本发明还涉及包含用于实行HDA反应的一种或多种试剂的试剂盒，其中聚乙二醇存在于所述试剂盒中。

Description

核酸扩增方法
发明领域
本发明处于分子生物学领域，特别是核酸扩增领域并且更特别是恒温核酸扩增领域。
发明背景
聚合酶链反应(PCR)革新了我们做生物研究的能力，并且它已经广泛用于生物医学研究和疾病诊断中。手持式诊断装置是当前需要的，其可用于在野外和护理现场检测病原体。然而，对大功耗热循环的需要限制了在这种情况下的PCR应用。已经开发了几种恒温靶扩增方法。链置换扩增(SDA)将限制性核酸内切酶对其靶DNA的未修饰链切口的能力与缺乏核酸外切酶的DNA聚合酶在所述切口处延伸3'端和置换下游DNA链的作用相结合。转录介导扩增(TMA)利用RNA聚合酶从引物区中工程制定的启动子制作RNA，利用逆转录酶从RNA模板产生互补DNA和利用RNase H从cDNA除去RNA。在滚环扩增(RCA)中，DNA聚合酶在圆形模板上延伸引物，生成所述模板的互补序列的串联连接拷贝。然而，这些恒温核酸扩增方法也具有它们的局限性。它们中的大多数具有复杂的反应方案。另外，它们不能扩增对于许多研究和诊断应用有用的足够长度的DNA靶。
在活的有机体中，DNA解旋酶用于在DNA复制期间将两个互补DNA链分开。通过模拟自然，开发了新的恒温DNA扩增技术，解旋酶依赖性扩增(HDA)。HDA利用DNA解旋酶分开双链DNA(dsDNA)并产生单链模板供引物杂交和随后的延伸。因为DNA解旋酶以酶促解旋dsDNA，PCR所需要的初始热变性和随后的热循环步骤全部能够省略。因此，HDA提供了简单的DNA扩增方案：反应自始至终一种温度。
双链DNA的链首先由DNA解旋酶分开并被单链DNA(ssDNA)结合蛋白包被。在第二步中，两个序列特异性引物与所述DNA模板的每个互补链杂交。然后利用DNA聚合酶延伸与所述模板退火的引物以产生双链DNA，然后利用所述两个新合成的DNA产物作为DNA解旋酶的底物，进入下一轮反应。因而，开展了同时的链式反应，导致选定靶序列的指数式扩增。
用于嗜热HDA(tHDA)的解旋酶属于体内错配修复系统。大肠杆菌(E.coli)系统需要多种辅助蛋白(例如，至少mutS、mutL和mutH)在失配位点附加产生切口，然后负载UvrD，UvrD具有结合核酸分子末端的高亲合性。然而，从制造观点来看，纯化这么多的辅助蛋白来实行体外扩增将是过于昂贵的。
解旋酶利用水解核苷三磷酸(例如ATP)产生的能量来破坏在双链体DNA和RNA中将链保持在一起的氢键。解旋酶参与细胞中核酸代谢的每个方面，包括DNA复制、修复、重组、转录和蛋白质翻译。解旋酶可根据解旋机制分为两类：以5’至3’方向转位的那些和以相反的3’至5’方向行进的那些。5’至3’解旋酶通常形成六聚体环结构并主要参与DNA复制。
用于HDA反应的UvrD解旋酶来自于3’至5’转位蛋白的类别。这些蛋白作为单体或二聚体存在，并且与许多其他解旋酶不同，UvrD解旋酶能够完全地解链双链体分子(有平端的DNA片段)和带切口的环状DNA分子。UvrD参与两种主要的DNA修复途径：甲基指导的错配修复和UvrABC介导的核苷酸切除修复。在甲基指导的错配DNA修复途径中，召集UvrD解旋含有DNA生物合成错误的DNA链。
在tHDA中，扩增步骤在升高的温度下发生。
聚乙二醇(PEG)通过排除水和与溶质聚阳离子产生静电相互作用，已用于产生人造的分子拥挤条件(Miyoshi等，Biochemistry 41：15017-15024(2002))。当PEG6000(7.5％)加入DNA连接反应时，反应时间减少到5min(Quick Ligation Kit，New EnglandBiolabs，Inc.(Beverly，Mass.))。
除了甜菜碱、海藻糖、山梨糖醇、DMSO或BSA外，PEG8000例如是PCR反应的一种常用和已知的增强剂。然而在HDA或tHDA反应中，最普遍使用的PCR增强剂如海藻糖、DMSO或山梨糖醇，不引起任何反应改善。恰恰相反，甜菜碱或PEG8000却显著减慢反应，分别彻底抑制反应。
因此，提供能够改善反应的HAD或tHDA反应的添加剂将会是有帮助的。
定义
术语“核酸”是指双链或单链DNA、RNA分子或DNA/RNA杂交分子。作为双链核酸分子的那些分子可以是有切口的或完好的。所述双链或单链核酸分子可以是线性或环状的。所述双链体可以是平端或具有单链尾的。单链分子可以具有发夹或环和茎形式的二级结构。核酸可以从各种各样的来源分离，包括环境、食品、农业、发酵、生物体液例如血液、乳液、脑脊液、痰、唾液、大便、肺吸出物、粘膜组织拭子或者组织样品或细胞。核酸样品可以从细胞或病毒获得并且可以包括下列的任何：染色体DNA，染色体外DNA包括质粒DNA，重组DNA，DNA片段，信使RNA，转移RNA，核糖体RNA，双链RNA，或在细胞或病毒中出现的其他RNA。核酸可以分离、克隆或通过化学合成体外合成。任何上述核酸都可以经受修饰，其中核酸内的个体核苷酸被化学变更(例如，通过甲基化)。修饰可以天然发生或通过体外合成发生。术语“双链体”是指完全或部分双链的核酸分子。
术语“靶”或“模板”核酸是指被选择性扩增并通过3’和5’边界限定的核酸整体或部分。靶核酸也可以称为打算被扩增的片段或序列。待扩增的靶核酸的大小可以，例如，在大约或至少50至1000、50至500、50至250、75至150碱基或千碱基的范围内。靶核酸可以包含在更长的双链或单链核酸内。或者，靶核酸可以是整体双链或单链的核酸。模板也可以是修饰的核酸，例如通过有机基团例如甲基、生物素、甲醛修饰的核酸，等等。
如果RNA用作模板，则在开始HDA之前必须实行反转录成cDNA。CDNA的合成可以在HDA之前在不同的反应和/或不同的反应环境下实行(两步过程)或可在HDA试剂内实行(一步过程)。靶核酸在扩增之前可以是损伤的并可以修复(例如无碱基位点的修复)。靶核酸可以没有引物结合位点。在这种情况下，缺失的引物结合位点可以通过例如连接来附上，以便可实行HDA。
术语“解链”、“解旋”或“变性”是指核酸双链体的两个互补链全部或部分分开。
术语“杂交”是指在引物只特异性结合一条模板链上它的互补序列、而不结合所述模板中其他区域的条件下，寡核苷酸引物与单链核酸模板的区域结合。杂交的特异性尤其可以受到寡核苷酸引物的长度、实行杂交反应的温度、离子强度、GC含量和pH的影响。
术语“引物”是指能够与靶核酸上的单链区域结合以促进所述靶核酸的聚合酶依赖性复制的单链核酸。本发明设想了利用正向和反向引物。优选地，本文中描述的引物在HDA反应的任何给定阶段中(例如，在解链、杂交/退火和/或延伸期间)，不会或预计不会形成完全或部分发夹的二级结构。
通常，适合用于HDA中的引物对是短合成寡核苷酸，例如，具有准确地、大约或至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、或更多个核苷酸碱基的长度。优选所述引物在大约5和60、10和50、15和30个核苷酸碱基之间。
寡核苷酸引物设计包括各种参数，例如基于字符串的比对得分、解链温度、引物长度和GC含量(Kampke等，Bioinformatics 17：214-225(2003))。当设计引物时，重要因素之一是选择靶片段内对于待扩增的核酸分子特异性的序列。其他重要因素是决定用于HDA反应的引物的解链温度。引物的解链温度由该寡核苷酸的长度和GC含量确定。优选所述引物的解链温度超过或低于将发生杂交和扩增的温度准确地、大约或至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25、26、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50摄氏度。更优选地，所述解链温度低于HDA的杂交或扩增温度大约10摄氏度至高于HDA的杂交或扩增温度30摄氏度，或者低于HDA的杂交或扩增温度15摄氏度至高于将发生杂交或扩增的温度25摄氏度。例如，当使用大肠杆菌UvrD解旋酶制剂时，如果杂交和扩增的温度设定在37摄氏度，则设计用于该反应的引物对的解链温度应该在约27摄氏度至约67摄氏度之间的范围内。
在某些实施方式中，当杂交和扩增的温度是60摄氏度时，设计用于该反应的引物对的解链温度应该在45和90摄氏度之间的范围内。为了选择HDA反应的最佳引物，可在平行试验中测试具有各种解链温度的一组引物。关于引物设计的更多信息由Kampke等，Bioinformatics17：214-225(2003)描述。
术语“辅因子”是指解旋酶解旋活性所需要的的小分子作用剂。解旋酶辅因子包括三磷酸核苷(NTP)和脱氧三磷酸核苷(dNTP)和镁(或者其他二阶阳离子)。例如，ATP(三磷酸腺苷)可以在0.1-100mM范围内并优选在1至10mM范围内(例如3mM)的浓度下，用作UvrD解旋酶的辅因子。类似地，dTTP(三磷酸脱氧胸苷)可以在1-10mM的范围内(例如3mM)，用作T7Gp4B解旋酶的辅因子。
术语“解旋酶”在此是指能够酶促解旋双链核酸的任何酶。例如，解旋酶是在所有生物体中并且在涉及核酸的所有过程例如复制、重组、修复、转录、翻译和RNA剪接中都存在的酶。(Kornberg和Baker，DNA Replication(DNA复制)，W.H.Freeman and Company(第二版(1992))，尤其11章)。沿着DNA或RNA以5’至3’方向或以相反的3’至5’方向转位的任何解旋酶可以用于本发明介绍的实施方式中。这包括从原核生物、病毒、古生菌和真核生物获得的解旋酶或者天然存在的酶的重组形式以及具有规定活性的类似物或衍生物。天然存在的DNA解旋酶的例子，由Kornberg和Baker在他们的书，DNA Replication(DNA复制)，W.H.Freeman and Company(第二版(1992))的11章中描述，包括大肠杆菌解旋酶I、II、III、&IV、Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4Gp41解旋酶，T4Dda解旋酶，T7Gp4解旋酶，SV40大T抗原，酵母RAD。可以用于HDA的其他解旋酶包括RecQ解旋酶(Harmon和Kowalczykowski，J.Biol.Chem.276：232-243(2001))，来自腾冲嗜热厌氧菌(T.tengcongensis)和极端嗜热菌(T.thermophilus)的热稳定UvrD解旋酶(Collins和McCarthy，Extremophiles.7：35-41.(2003))，来自水生嗜热菌(T.aquaticus)的热稳定DnaB解旋酶(Kaplan和Steitz，J.Biol.Chem.274：6889-6897(1999))，以及来自古生菌和真核生物的MCM解旋酶((Grainge等，Nucleic Acids Res.31：4888-4898(2003))。
在所介绍的实施方式中使用的解旋酶的非限制性实例也可以在以下网址找到：http://blocks.fhcrc.org(Get Blocks，关键词：解旋酶)。该网址列举了49种Herpes解旋酶，224种DnaB解旋酶，250种UvrD解旋酶和UvrD/Rep解旋酶，276种DEAH_ATP依赖性解旋酶，147种Papillom_E1乳头瘤病毒解旋酶E1蛋白，608种病毒解旋酶1病毒(超家族1)RNA解旋酶和556种DEAD_ATP依赖性解旋酶。总体以5’至3’方向复制的解旋酶的实例是T7Gp4解旋酶、DnaB解旋酶和Rho解旋酶，而以3’-5’方向复制的解旋酶的实例包括UvrD解旋酶，HCV的PcrA、Rep、NS3RNA解旋酶。
最初，HDA是利用UvrD如来自不同的生物体如大肠杆菌或腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的解旋酶进行描述的。其他解旋酶在HDA中可以具有相等的功能性，例如PcrA(葡萄球菌)、来自大肠杆菌的RecD或Rep、Dda(T4-噬菌体)、或其他。
所述解旋酶可提供于“解旋酶制剂”中。解旋酶制剂是指试剂的混合物，其当与DNA聚合酶、核酸模板、四种三磷酸脱氧核苷酸和引物结合时能够达到恒温、指数和特异性的体外核酸扩增。
更具体地，所述解旋酶制剂包括解旋酶、能源例如核苷三磷酸(NTP)或脱氧核苷三磷酸(dNTP)、和单链DNA结合蛋白(SSB)。一种或多种其他试剂可以包括在所述解旋酶制剂中，其中这些选自下列：一种或多种其他解旋酶，辅助蛋白，小分子，化学试剂和缓冲液。
在解旋酶制剂中利用热稳定解旋酶的情况下，单链结合蛋白的存在是任选的。
术语“HDA系统”、“tHDA系统”、“HDA试剂盒”或“tHDA试剂盒”在本文中用于描述根据本文中描述的解旋酶依赖性扩增方法实行核酸扩增功能的一组相互作用元件。HDA系统包括HDA试剂，例如正反向引物、解旋酶制剂、聚合酶和任选的拓扑异构酶。
HDA试剂还可以包括DNA结合蛋白(例如SSB、MutS、MutL或其他)、BSA、焦磷酸酶、激酶、其他聚合酶、逆转录酶(在HDA扩增之前将RNA模板转变为DNA)、糖、糖醇、聚合物(例如PEG)、右旋糖、来自天然源的聚合物(例如来自藻类、植物、真菌)、在扩增之前修复靶核酸的酶、辅因子和/或辅助蛋白。
HDA试剂也可以包括尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)，其是水解尿嘧啶残基处的碱基核糖键的DNA修复酶，可用于消除先前扩增的PCR产物的DNA污染。UNG处理通过引起DNA聚合酶在所生成的无碱基位点处停顿来防止含有尿嘧啶的DNA复制。为了UNG有效对抗污染，先前扩增的产物可以在dUTP存在下合成。这可以通过用dUTP取代反应中一部分或全部的dTTP来达成。
例如，所述UvrD HDA系统可以通过将UvrD解旋酶制剂(例如，大肠杆菌UvrD解旋酶制剂或Tte-UvrD解旋酶制剂)与DNA聚合酶例如Exo-Klenow片段、DNA聚合酶大片段、Exo+Klenow片段或T7测序酶混合在一起构成。
另一个实例是包括T7解旋酶制剂(T7Gp4B解旋酶，T7Gp2.5SSB，和dTTP)和T7测序酶的T7HDA系统。
另一个实例是包括RecBCD制剂(RecBCD解旋酶与T4gp 32)和T7测序酶的RecBCDHDA系统。
任何选定的HDA系统可以通过取代、添加、或减去所述混合物内的成分来优化，如下面更详细地论述。
解旋酶在单链结合蛋白(SSB)存在下显示出改善的活性。在这些情况下，SSB的选择通常不限于特异性蛋白。单链结合蛋白的实例是T4基因32蛋白，大肠杆菌SSB，T7gp2.5SSB，噬菌体phi29SSB(Kornberg和Baker，同上(1992))，和前述的截断形式。
拓扑异构酶可用于长HDA反应以增加HDA扩增长的靶扩增子的能力。当解旋酶分开很长的线性DNA双链体时，拓扑异构酶的转环(松弛)功能消除扭绞和防止过度缠绕(Kornberg和Baker，同上(1992))。例如，大肠杆菌拓扑异构酶I(Fermentas，Vilnius，立陶宛)可通过在一条DNA链中引入切口而用于松弛负超螺旋DNA。相反，大肠杆菌DNA促旋酶(拓扑异构酶II)在DNA中引入临时双链断裂，让DNA链彼此通过(Kornberg和Baker，同上(1992))。
扩增的核酸产物可以通过各种方法检测，包括溴化乙锭染色以及通过选自放射标记、荧光标记和酶的标记来检测扩增序列。例如，HDA扩增产物可利用荧光标记的LUXTM引物(Invitrogen Corporation，Carlsbad，加利福尼亚)实时检测，所述引物是在接近发夹结构中的3’端设计有荧光团的寡聚核苷酸。这种构造固有地提供了荧光猝灭能力，无需单独的淬灭部分。当所述引物变得纳入双链扩增产物中时，所述荧光团被去淬灭，导致显著的荧光信号增加。
虽然其他恒温核酸扩增方法例如链置换扩增可在没有热循环的恒定温度下扩增靶，但它们却需要初始变性步骤以产生单链模板。本文中所描述方法的实施方式的优点在于解旋酶解旋和扩增二者均可自始至终在单一温度下有效发生。或者，升高温度以帮助靶核酸通过解旋酶的初始解旋并然后在单一温度下进行扩增。
HDA可代替PCR用于扩增RNA的逆转录产物。另外，HDA可用于定量扩增，例如被发现可用于基因表达研究和环境分析。因此，在希望确定靶核酸的量的情况下，HDA可用于实时终点试验。因此，HDA在基因表达研究中可以用于确定细胞中信使RNA的相对量。例如，WO01/25473中描述的校准基因表达谱可利用定量解旋酶依赖性扩增或Q-HDA产生。
实时HDA可以用作灵敏的技术来确定污染样品中的生物体例如海水中的大肠杆菌的量。在HDA反应中，实时检测利用灵敏标志物例如荧光。
HDA可以在紧凑装置的环境下使用，以供用于野外活动和/或实验室判断。例如，HDA可以在微流体环境中实施。微流体技术(芯片实验室)通过在通常纳升级的小型化环境中实行生化分析，作为节约成本和时间的关键策略而迅速浮现。微流体技术当与核酸扩增和检测方法相结合时，在用作病原体检测的野外便携式设备上具有重大的潜力。HDA在没有初始热变性的等温条件下扩增核酸的能力使它成为在微流体装置中核酸扩增方法的良好候选。类似地，HDA可以通过试剂盒或通过实验室扩增程序用于生成在国际公布No.WO 02/02740中描述的那类响应谱或用于监测疾病(美国公布No.2001018182)。
HDA可以用于扩增来自不同来源并具有不同序列的靶核酸。例如，较长的靶序列(>2kb)可通过T7Gp4B-基HDA系统扩增。利用解旋酶依赖性扩增来扩增核酸的方法可利用不同的解旋酶制剂实行，例如含有T7Gp4B解旋酶的解旋酶制剂，或含有多于一种解旋酶例如T7Gp4B解旋酶和UvrD解旋酶的解旋酶制剂。
HDA扩增少至10个拷贝的细菌基因组DNA的能力支持了HDA在由病原性细菌例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的感染性疾病的分子诊断应用中的用途。靶序列可从人类基因组DNA样品扩增的论证支持了HDA在识别与特定疾病包括单核苷酸多态性对应的遗传等位基因以及在犯罪现场或在考古场所依靠鉴定少量核酸的司法应用中的用途。
“恒温扩增”是指在单一温度下发生的扩增。这不包括在与扩增程序相同的温度下或在较高的温度下开始扩增时的单独的短暂时间段(小于15分钟)。取决于用于HDA的酶源，所述反应可在低温(<50℃)下实行，例如，至少或大约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49摄氏度；或在高温(≥50℃)下实现，例如，至少或大约51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72,73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115或更高摄氏度。
在本文中使用时，术语“dNTP”是指脱氧核糖核苷三磷酸。这种dNTP的非限制性实例是dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其也可以作为标记衍生物的形式存在，例如包含荧光标记、放射性标记、生物素标记。有修饰的核苷酸碱基的dNTP也包括在内，其中所述核苷酸碱基是例如次黄嘌呤、黄嘌呤7-甲基鸟嘌呤、肌甙、黄嘌呤肌甙(xanthinosine)、7-甲基鸟苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、5-甲基胞苷。此外，上述分子的ddNTP包括在本发明中。
发明内容
通常利用离液盐/二氧化硅方法纯化用于tHDA反应中的核酸样品。在这些方法中，乙醇通常用在纯化缓冲液中。试验样品中乙醇的残余物可能影响tHDA反应的性能。因此优选使用替代物。可能的替代物可以是聚乙二醇。
聚乙二醇是具有以下通式的聚醚：
聚乙二醇在用于本发明时是指其中n在2和50之间的聚乙二醇。在优选实施方式中，所述聚乙二醇是线性的并且不分支。
本发明人意外发现，链长度短(n在2至50之间)的线性聚乙二醇(PEG)、尤其四乙二醇(n＝4，TEG)的存在，对tHDA反应不仅不具有任何负面效果，而且令人惊讶地改善了反应速度。因此，本发明涉及利用聚乙二醇、优选四乙二醇作为解旋酶依赖性扩增反应中的添加剂或优选作为嗜热解旋酶依赖性扩增反应中的添加剂。
本发明还涉及实行模板核酸的解旋酶依赖性扩增(HDA)或优选嗜热解旋酶依赖性扩增(tHDA)的方法，所述方法包括：将所述模板核酸、正向和反向HDA引物、解旋酶和脱氧核苷三磷酸盐(dNTP)组合在反应混合物中，其中所述反应包含下式的线性聚乙二醇：
并且n在2和50之间，优选2和25之间，更优选2和15之间。
在本发明的的更加优选的实施方式中，n选自2(二乙二醇)、3(三乙二醇)、4(四乙二醇)、5(五乙二醇)、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24,.25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40。
在本发明最优选的实施方式中，n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
本发明人发现，使用聚乙二醇，即使较高的浓度，对tHDA反应也没有任何负面效应，并且在反应混合物中2至5体积％的聚乙二醇浓度下，观察到扩增速度的改善。因此本发明涉及实行HDA反应或tHDA反应的方法，其中所述聚乙二醇以0.1％和20％(体积百分比)之间存在，优选在2％至8％(体积百分比)，更加优选2％至4％(体积百分比)。在最优选的实施方式中，所述PEG的浓度是5％(体积百分比)或更低。
所述聚乙二醇可以被改性。
一种改性是聚(乙二醇)二甲醚。
PEG也可以改性为单甲醚。在一种实施方式中，一端或两端具有1-10个C的烷基封端。
PEG也可以用单或二苯醚改性。PEG在本文中也可以是有或者没有刚才提到的修饰的聚丙二醇。
解旋酶依赖性扩增可使用各种各样的解旋酶。因此本发明涉及实行HDA或tHDA扩增，其中所述反应中的解旋酶选自T7Gp4解旋酶、DnaB解旋酶、Rho解旋酶、UvrD解旋酶、PcrA、Rep和NS3RNA解旋酶。
在本发明的优选实施方式中，解旋酶是UvrD解旋酶。在更加优选的实施方式中，解旋酶是腾冲嗜热厌氧菌的UvrD样解旋酶。
本发明不限于单重HDA或tHDA。因此在本发明的一种实施方式中，HDA或tHDA反应是单重HDA或tHDA。在本发明的另一种实施方式中，所述HDA或tHDA反应是多重HDA或tHDA。
本发明人尝试改善HDA或tHDA反应，以规避在核酸纯化期间因使用乙醇可能出现的问题。通常利用离液盐/二氧化硅方法进行核酸纯化，其中纯化缓冲液通常含有乙醇。因此本发明涉及HDA或tHDA的方法，其中利用离液盐/二氧化硅方法制备核酸，其中纯化缓冲液不含乙醇。
在本发明的优选实施方式中，核酸样品利用离液盐/二氧化硅方法制备，其中纯化缓冲液包含下式的线性聚乙二醇
其中n在2-50之间，优选2-25之间，更优选2-15之间，最优选n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，其中所述PEG的浓度是5％(体积百分比)或更低。
另外，本发明涉及产生用于实行HDA或tHDA反应的试剂盒的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供解旋酶和DNA聚合酶；(b)任选提供解旋酶和DNA聚合酶二者在其中均显示出活性的缓冲液；(c)提供下式的线性聚乙二醇
其中n在2-50之间，优选2-25之间，更优选2-15之间，最优选n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，使得所述聚乙二醇在最终反应体积中以5％(体积百分比)或更低存在、或优选以2％和5％(体积百分比)之间存在、或更优选在2％和4％(体积百分比)之间；(d)任选提供用于HDA或tHDA反应的引物；(e)任选提供三磷酸脱氧核苷酸；(f)或者提供缓冲液，其包含聚乙二醇和任选的引物和任选的三磷酸脱氧核苷酸(主混合物)；(g)将所提供的组分组合在试剂盒中，各自为单独的形式，任选包括说明书，准备用于分销。
本发明还涉及包含用于实行HDA或tHDA反应的一种或多种试剂的试剂盒，其中线性聚乙二醇、优选四乙二醇存在于所述试剂盒中。
在本发明的优选实施方式中，所述试剂盒包含活性或无活性形式的解旋酶、活性或无活性形式的DNA聚合酶、和聚乙二醇，优选四乙二醇。
在本发明的更优选实施方式中，所述试剂盒还包含缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸和聚乙二醇。
在本发明的更优选实施方式中，所述试剂盒还包含至少一种或多种正向HDA或tHDA引物和/或至少一种或多种反向HDA或tHDA引物。
在本发明更加优选的实施方式中，试剂盒中的线性聚乙二醇具有下式
并且n在2-50之间，优选2-25，更优选2-15。
在本发明的又一种更优选实施方式中，所述聚乙二醇的n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
在本发明最优选的实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种试剂，以供利用离液盐/二氧化硅方法的核酸样品制备，其中所述纯化缓冲液包含下式的线性聚乙二醇：
并且n在2-50之间，优选2-25之间，更优选2-15之间，并且最优选n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，并且其中所述PEG的浓度是5％(体积百分比)或更低。
本发明可以用于诊断试验，例如包含引物/探针体系的诊断试验。本发明可以用来检测纯化的核酸样品中的特定核酸序列。在本发明的一种实施方式中，利用离液盐/二氧化硅方法纯化所述核酸样品，优选地，其中纯化缓冲液不含乙醇，更加优选，其中纯化缓冲液包含下式的线性聚乙二醇：
其中n在2至50之间，优选2至25之间，更优选2至15之间，并且最优选n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，并且其中所述PEG的浓度是5％(体积百分比)或更低。
所述HDA或tHDA扩增子的检测可以利用荧光/淬灭剂标记的探针进行，所述探针与所述扩增子杂交并随后可检测荧光。
本发明人惊讶地发现，添加聚乙二醇，优选四乙二醇，导致扩增速度改善，产生更迅速的荧光检测。
实施例
实施例1：乙醇和四乙二醇对tHDA反应的效应
在这些试验中，分析四乙二醇对tHDA反应的影响并与乙醇在其他方面相同的条件下对所述反应的影响相比较。
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
480nM反向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
60nM探针(对淋病奈瑟菌特异性)
100cp淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)基因组DNA
0-5％(v/v)乙醇/TEG
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8，10％海藻糖
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，40U Gst Pol.LF，2U Gst Pol.FL(全部得自Biohelix)
所述组分放入两种不同的混合物。混合物1(引物，模板，试验物质)和混合物2(其他物质)放在冰上。15μL等份的混合物2在PCR试管中等分并在PCR循环仪(Biorad CFX96)中在63℃温育1min。随后通过添加10μL混合物1并混合，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
图2和表1显示了在0-5％乙醇存在下试验的结果。所谓的“Ct-值”对应于温育时间，之后所测量的扩增反应荧光超过限定的阈值。
表1：直到在反应混合物中有0-5％EtOH的HDA反应所测量的荧光超过限定阈值的时间(分钟)
EtOH(v/v) 0 0.1 0.2 0.5 1 2 3 5
平均Ct-值 18.74 20.20 22.41 18.82 19.69 22.7 31.37 39.45
所述数据显示少量的乙醇(最多1％)可以引起Ct-值轻度波动，但是没有严重妨碍HDA反应(在0.2％EtOH时的加倍值被认为是异常值)。然而，2％和更高的EtOH浓度确实严重影响了HDA反应。图1显示，除Ct-值增加以外，所述反应的最终荧光强度强烈降低。
图3和表2概括了在反应混合物中存在0-5％TEG的情况下的试验结果。
表2：直到在反应混合物中有0-5％TEG的HDA反应所测量的荧光超过限定阈值的时间(分钟)
TEG(v/v) 0 0.1 0.2 0.5 1 2 3 5
平均Ct-值 18.36 18.70 19.36 18.15 18.12 16.29 15.44 16.40
所述数据显示TEG对HDA反应没有任何负面效应，甚至直到所述反应混合物中使用最多5％时。相反，我们发现，在2％或更高的TEG浓度下，Ct-值降低。这提示所述反应在这些条件下更有效。图2还显示了荧光发展也没有受到添加TEG的负面影响。
实施例2：四乙二醇对tHDA反应–扩增淋病奈瑟菌DNA的效应
在这些试验中，测试TEG对扩增淋病奈瑟菌DNA的影响。
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
480nM反向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
60nM探针(对淋病奈瑟菌特异性)
100cp淋病奈瑟菌基因组DNA
0-5％(v/v)TEG
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，40U Gst Pol.LF，2U Gst Pol.FL(全部得自Biohelix)
所述组分放入两种不同的混合物。混合物1(引物，模板，试验物质)和混合物2(其他物质)放在冰上。15μL等份的混合物2在PCR试管中等分并在PCR循环仪(Biorad CFX96)中在63℃温育1min。随后通过添加10μL混合物1并混合，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表3：有引物/探针组合的tHDA反应在0至5％TEG存在下检测淋病奈瑟菌的平均Ct-和荧光值
TEG(v/v) 0 0.5 1 2 3 4 5
Ct-均值 12.9 12.97 13.83 11.76 13.90 12.59 n.a.
最终荧光 1219 1194 1218 1432 1071 1547 n.a.
实施例3：四乙二醇对tHDA反应–扩增沙眼衣原体(C.trachomatis)DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对沙眼衣原体特异性)
480nM反向引物(对沙眼衣原体特异性)
60nM探针(对沙眼衣原体特异性)
100cp沙眼衣原体基因组DNA
0-5％(v/v)TEG
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，40U Gst Pol.LF，2U Gst Pol.FL(全部得自Biohelix)
所述组分放入两种不同的混合物。混合物1(引物，模板，试验物质)和混合物2(其他物质)放在冰上。15μL等份的混合物2在PCR试管中等分并在PCR循环仪(Biorad CFX96)中在63℃温育1min。随后通过添加10μL混合物1并混合，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表4：有引物/探针组合的tHDA反应在0至5％TEG存在下检测沙眼衣原体的平均Ct-和荧光值
TEG(v/v) 0 0.5 1 2 3 4 5
Ct-均值 12.02 11.39 11.07 10.93 12.19 11.94 12.66
最终荧光 118 186 246 188 169 187 163
实施例4：四乙二醇对tHDA反应–扩增人类DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对人类DNA特异性)
480nM反向引物(对人类DNA特异性)
60nM探针(对人类DNA特异性)
100cp人类基因组DNA
0-5％(v/v)TEG
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，40U Gst Pol.LF，2U Gst Pol.FL(全部得自Biohelix)
所述组分放入两种不同的混合物。混合物1(引物，模板，试验物质)和混合物2(其他物质)放在冰上。15μL等份的混合物2在PCR试管中等分并在PCR循环仪(Biorad CFX96)中在63℃温育1min。随后通过添加10μL混合物1并混合，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表5：有引物/探针组合的tHDA反应在0至5％TEG存在下检测人类DNA的平均Ct-和荧光值
TEG(v/v) 0 0.5 1 2 3 4 5
Ct-均值 14.15 13.14 12.20 12.19 13.73 13.06 12.49
最终荧光 304 371 408 405 425 527 886
实施例5：四乙二醇对tHDA反应–扩增结核分枝杆菌(M.tuberculosis)DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对结核分枝杆菌特异性)
480nM反向引物(对结核分枝杆菌特异性)
60nM探针(对结核分枝杆菌特异性)
100cp结核分枝杆菌基因组DNA
0-5％(v/v)TEG
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，40U Gst Pol.LF，2U Gst Pol.FL(全部得自Biohelix)
所述组分放入两种不同的混合物。混合物1(引物，模板，试验物质)和混合物2(其他物质)放在冰上。15μL等份的混合物2在PCR试管中等分并在PCR循环仪(Biorad CFX96)中在63℃温育1min。随后通过添加10μL混合物1并混合，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表6：有引物/探针组合的tHDA反应在0至5％TEG存在下检测结核分枝杆菌的平均Ct值
TEG(v/v) 0 0.5 1 2 3 4 5
Ct-均值 16.11 17.04 16.05 14.27 13.05 12.06 13.18
以下实施例显示了具有2–12乙烯单体链长的聚乙二醇对tHDA扩增速度显示出同样令人惊讶的效应。
实施例6：不同的乙二醇对tHDA反应–扩增淋病奈瑟菌DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
480nM反向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
60nM探针(对淋病奈瑟菌特异性)
100cp淋病奈瑟菌基因组DNA
2％(v/v)二-、三-、四-、五-或六-乙二醇
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，80U修饰的Gst Pol.LF(全部得自Biohelix)
所述组分移液到冰上的反应管中并且管充分混合。通过将所述反应管放入预热的PCR循环仪(Biorad CFX 96)中，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表7：有引物/探针组合的tHDA反应在2％2-、3-、4-、5-、6-乙二醇存在下检测淋病奈瑟菌的平均Ct值
乙二醇的链长 2 3 4 5 6
Ct-均值 20.28 18.22 17.26 16.53 14.55
实施例7：不同的乙二醇对tHDA反应–扩增沙眼衣原体DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对沙眼衣原体特异性)
480nM反向引物(对沙眼衣原体特异性)
60nM探针(对沙眼衣原体特异性)
100cp沙眼衣原体基因组DNA
2％(v/v)二-、三-、四-、五-或六-乙二醇
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，80U修饰的Gst Pol.LF(全部得自Biohelix)
所述组分移液到冰上的反应管中并且管充分混合。通过将所述反应管放入预热的PCR循环仪(Biorad CFX 96)中，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表8：有引物/探针组合的tHDA反应在2％2-、3-、4-、5-、6-乙二醇存在下检测沙眼衣原体的平均Ct值
乙二醇的链长 2 3 4 5 6
Ct-均值 13.6 13.04 15.1 13.03 13.33
实施例8：不同的乙二醇对tHDA反应–扩增沙眼衣原体DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对沙眼衣原体特异性)
480nM反向引物(对沙眼衣原体特异性)
60nM探针(对沙眼衣原体特异性)
100cp沙眼衣原体基因组DNA
2％(v/v)二-、三-、四-、五-、六-、八-或十二-乙二醇
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，80U修饰的Gst Pol.LF(全部得自Biohelix)
所述组分移液到冰上的反应管中并且管充分混合。通过将所述反应管放入预热的PCR循环仪(Biorad CFX 96)中，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表9：有引物/探针组合的tHDA反应在2％2-、3-、4-、5-、6-、8-、12-乙二醇存在下检测沙眼衣原体的平均Ct值
乙二醇的链长 2 3 4 5 6 8 12
Ct-均值 16.38 18.02 17.61 16.91 18.17 18.75 16.26
实施例9：不同的乙二醇对tHDA反应–扩增淋病奈瑟菌DNA的效应
使用的组分在最终的反应体积中具有以下浓度：
160nM正向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
480nM反向引物(对淋病奈瑟菌特异性)
60nM探针(对淋病奈瑟菌特异性)
100cp淋病奈瑟菌基因组DNA
2％(v/v)二-、三-、四-、五-、六-、八-或十二-乙二醇
40mM NaCl，10mM KCl，5mM MgSO4
20mM Tris/HCl pH 8.8
0.5mM dNTP混合物，5mM dATP
400ng Tte解旋酶，75ng Et SSB，80U修饰的Gst Pol.LF(全部得自Biohelix)
所述组分移液到冰上的反应管中并且管充分混合。通过将所述反应管放入预热的PCR循环仪(Biorad CFX 96)中，开始tHDA反应。在40min内以1min的时间间隔测量荧光。所有测量都双份实行。
表10：有引物/探针组合的tHDA反应在2％2-、3-、4-、5-、6-、8-、12-乙二醇存在下检测淋病奈瑟菌的平均Ct值
乙二醇的链长 2 3 4 5 6 8 12
Ct-均值 19.77 20.77 23.02 20.67 20.89 18.93 17.16
附图说明
图1：四乙二醇，TEG。
图2：在0至5％(v/v)乙醇存在下扩增淋病奈瑟菌特异性DNA序列期间，tHDA反应的时间依赖性荧光。
图3：在0至5％(v/v)四乙二醇存在下扩增淋病奈瑟菌特异性DNA序列期间，tHDA反应的时间依赖性荧光。

Claims (13)

1.实行一种或多种模板核酸的嗜热解旋酶依赖性扩增(tHDA)的方法，所述方法包括：
(a)在反应混合物中组合一种或多种模板核酸、一种或多种正向和反向tHDA引物、解旋酶、至少一种DNA聚合酶、缓冲液和三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)
(b)其中所述反应包含下式的线性聚乙二醇(PEG)：
其中n是2–50并且所述PEG以2％和5％(体积百分比)之间存在。
2.权利要求1的方法，其中n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
3.权利要求1或2的方法，其中所述tHDA反应是多重tHDA。
4.权利要求1或2的方法，其中所述tHDA反应是单重tHDA。
5.权利要求1或2的方法，其中利用离液盐/二氧化硅法纯化核酸模板，其中纯化缓冲液包含下式的线性聚乙二醇
其中n在2至50之间，并且所述PEG的浓度是5％(体积百分比)或更低。
6.权利要求5的方法，其中n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
7.用于实行权利要求1至6任一项的tHDA反应的试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供解旋酶和DNA聚合酶；
(b)任选地提供解旋酶和DNA聚合酶二者在其中均显示出活性的缓冲液；
(c)提供下式的至少一种线性聚乙二醇
其中n在2-50之间，使得所述聚乙二醇在最终反应体积中以2％和5％(体积百分比)之间存在；
(d)或者提供缓冲液，其包含聚乙二醇和任选的引物以及任选的三磷酸脱氧核苷酸；
(e)任选提供用于tHDA反应的引物；
(f)任选提供三磷酸脱氧核苷酸；
(g)将所提供的组分组合在试剂盒中，各自为单独的形式或作为预混合组分，任选包括说明书，准备用于分销。
8.权利要求7的方法，其中n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
9.用于实行权利要求1至6任一项的tHDA反应的试剂盒，其包含至少一种嗜热解旋酶和DNA聚合酶以及至少一种聚乙二醇，其中所述至少一种聚乙二醇具有下式
其中n在2-50之间，并且
其中所述试剂盒以使得聚乙二醇在最终反应体积中以2％和5％(体积百分比)之间存在的方式提供。
10.权利要求9的试剂盒，其中n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
11.权利要求9或10的试剂盒，其还包含利用离液盐/二氧化硅法用于核酸样品制备的一种或多种试剂，其中纯化缓冲液包含TEG。
12.下式的线性聚乙二醇在嗜热解旋酶依赖性扩增反应中作为添加剂的用途，
其中n在2和50个单元之间，其中PEG的浓度是2％-5％(体积百分比)。
13.权利要求12的用途，其中n选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
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