CN117730162A - 用于嵌合扩增子形成的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于形成具有嵌合序列的扩增子的组合物和方法，所述嵌合序列部分地来源于靶核酸并且部分地来源于合理设计的寡核苷酸。所提供的组合物在聚合酶延伸期间提供所述靶核酸与作为模板的所述合理设计的寡核苷酸之间的高产率诱导模板转换，从而在仅仅一个循环内实现来自这两者的信息继承。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年4月30日提交的美国临时申请号63/182,154的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的资助号R01CA203964的政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
对序列表的参考
本申请含有已经以ASCII格式经由EFS-Web递交的序列表并且将此序列表通过引用以其整体并入本文。创建于2022年4月25日的所述ASCII副本命名为RICEP0084WO_ST25.txt并且大小为13,303字节。
背景
1.技术领域
本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于形成具有来自两种不同核酸分子的嵌合序列的扩增子的组合物和方法。
2.相关技术的说明
PCR和连接是测序文库制备中经常使用的方法，用于将衔接子序列附加到目标核酸序列的5'和3'端。这两种方法都有一些局限性。连接效率通常较低，在10％至30％之间，无法将衔接子序列添加到大多数分子中，导致这些分子丢失。PCR方法需要至少两个循环才能将衔接子序列附加到扩增子分子的两端。这意味着必须使用热稳定聚合酶，或者必须在第一个循环后将额外的聚合酶添加到反应中。需要能够克服热稳定聚合酶和热循环反应的局限性以及连接效率低的方法。
发明内容
在一个实施例中，本文提供了组合物，该组合物包括：(a)引物寡核苷酸，和(b)终止子寡核苷酸，其中终止子包括5'至3'的：(i)长度在5nt与200nt之间的第一序列，(ii)长度在3nt与50nt之间的第二序列，(iii)长度在3nt与70nt之间的环序列，(iv)长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中第三序列与第二序列互补，以及(v)长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中第四序列与靶核酸上的结合区序列互补，其中第三序列与位于靶核酸上结合区3'的匹配区序列互补，并且其中包括至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于靶核酸上匹配区3'的引发区序列(至少80％)互补。上述互补关系可以具有小于100％的互补性。在一些方面，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。在一些方面，组合物用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子，其中靶核酸包括5'至3'的结合区、匹配区和引发区。该组合物可用于形成具有来自靶核酸分子和终止子核酸分子的嵌合序列的扩增子。该组合物可用于通过聚合酶诱导模板转换。该组合物可用于制备测序文库。
在一个实施例中，本文提供了用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子的组合物，其中靶核酸从5'至3'包括结合区、匹配区和引发区，该组合物包括终止子寡核苷酸，其中终止子包括5'至3'的：(a)长度在5nt与200nt之间的第一序列，(b)长度在3nt与50nt之间的第二序列，(c)长度在3nt与70nt之间的环序列，(d)长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中第三序列与第二序列互补，以及(e)长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中第四序列与靶核酸的结合区互补，并且其中第三序列与靶核酸的匹配区互补。在一些方面，组合物进一步包括引物寡核苷酸，其中包括至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于靶核酸上匹配区3'的引发区序列互补。上述互补关系可以具有小于100％的互补性。在一些方面，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。该组合物可用于形成具有来自靶核酸分子和终止子核酸分子的嵌合序列的扩增子。该组合物可用于通过聚合酶诱导模板转换。该组合物可用于制备测序文库。
在一些方面，组合物进一步包括靶核酸。在一些方面，匹配区的位置紧邻结合区的3'。在一些方面，匹配区与结合区相邻。
在一些方面，组合物进一步包括模板依赖性聚合酶。在一些方面，模板依赖性聚合酶是热稳定的。在一些方面，模板依赖性聚合酶不是热稳定的。
在一些方面，组合物进一步包括聚合酶实现功能所需的试剂和缓冲液。
在一些方面，引物包括与位于引发区3'的靶核酸区域不互补的5'子序列。在一些方面，引物包括与紧邻引发区3'的靶核酸区域不互补的5'子序列。在一些方面，引物包括与位于引发区3'的20个核苷酸区域内的靶核酸区域不互补的5'子序列。在一些方面，引物包括5'子序列，该5'子序列包括测序衔接子或索引序列。
在一些方面，终止子寡核苷酸进一步包括位于第二序列与环序列之间的第五序列，以及位于环序列与第三序列之间的第六序列，其中第五序列与第六序列互补。在一些方面，第六序列不与位于匹配区3'的靶核酸区域互补。在一些方面，第五序列不与紧邻匹配区3'的靶核酸区域互补。在一些方面，第五序列不与位于匹配区3'的20个核苷酸区域内的靶核酸区域互补
在一些方面，终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的子序列，其不与靶标互补。在一些方面，3'端的子序列形成至少一个发夹结构。在一些方面，终止子寡核苷酸包括非天然核苷酸。在一些方面，终止子寡核苷酸在3'端具有阻止聚合酶延伸的化学功能化。在一些方面，化学功能化选自3-碳间臂、反向核苷酸和小沟结合物。
在一些方面，引物寡核苷酸是DNA分子，终止子寡核苷酸是DNA分子，靶标是DNA分子，以及模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。在一些方面，引物寡核苷酸是RNA分子，终止子寡核苷酸是DNA分子，靶标是DNA分子，以及模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。在一些方面，引物寡核苷酸是DNA分子，终止子寡核苷酸是RNA分子，靶标是RNA分子，以及模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面，引物寡核苷酸是DNA分子，终止子寡核苷酸是DNA分子，靶标是RNA分子，以及模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面，引物寡核苷酸是RNA分子，终止子寡核苷酸是RNA分子，靶标是RNA分子，以及模板依赖性聚合酶是逆转录酶。在一些方面，引物寡核苷酸是RNA分子，终止子寡核苷酸是DNA分子，靶标是DNA分子，以及模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。
在一些方面，DNA聚合酶选自由Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或DNA聚合酶I、Hemo Klen Taq、Phusion、Q5、T7 DNA聚合酶和KAPA HiFi组成的组。在一些方面，逆转录酶选自由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶组成的组。
在一些方面，靶标是生物DNA或RNA分子。在一些方面，靶标是从细胞样品、生物流体或组织获得的。在一些方面，生物流体选自由血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液和滑液组成的组。在一些方面，组织是活检组织或手术切除的组织。
在一些方面，靶标是通过RNA样品的逆转录产生的互补DNA分子。在一些方面，RNA样品是生物RNA样品。在一些方面，生物RNA样品获自人类、动物、植物或环境样本。
在一些方面，靶标是通过作用于单链DNA模板的DNA聚合酶产生的扩增子DNA分子。在一些方面，扩增子DNA分子通过单细胞DNA分子的多重置换扩增产生。
在一些方面，靶标是生物DNA分子的物理、化学或酶促生成产物。在一些方面，靶标是片段化过程的产物。在一些方面中，所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。
在一些方面，靶标是亚硫酸氢盐转化反应、APOBEC(“载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样”)反应、TAPS(TET辅助吡啶硼烷测序)反应或其它化学或酶促反应的产物，其中胞嘧啶核苷酸基于甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶。
在一些方面，组合物包括多个终止子和/或多个引物。在一些方面，多个终止子中的每一个共享相同的第四序列，每个终止子可以共享相同的第三序列或具有不同的第三序列。在一些方面，不同的第四序列可以存在于多个终止子之中，每个终止子可以共享相同的第三序列或具有不同的第三序列。这样，多个第三序列和/或第四序列可以存在于多个终止子之中。在一些方面，使用具有不同第四序列的多个终止子，以便结合许多不同的靶标。在一些方面，多个引物中的每一个可以共享相同的3'子序列。在一些方面，多个引物中的每一个可以共享相同的5'子序列。在一些方面，多个引物中的每一个可以包含不同的3'子序列。在一些方面，多个3'子序列存在于多个引物之中，以便结合许多不同的靶标。在一些方面，多个相同的引物与具有不同的第三序列和第四序列的多个终止子一起使用。在一些方面，具有不同3'子序列的多个引物与具有相同的第三序列和第四序列的多个终止子一起使用。在一些方面，使用具有不同3'子序列的多个引物以及使用具有不同的第三序列和第四序列的多个终止子，其中每个靶标具有引物-终止子对以从该靶标产生嵌合扩增子。以这种方式，可以在单个多重反应中从多个靶标产生嵌合扩增子。在一些方面，可以在单个多重反应中从至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多靶标产生嵌合扩增子。
在一个实施例中，本文提供了用于产生嵌合扩增子的方法，该嵌合扩增子包含5'至3'的引物序列、匹配互补序列和第一互补序列，该方法包括：(a)将包含靶分子的样品与以下进行混合，该靶分子从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区：(i)模板依赖性聚合酶，(ii)引物寡核苷酸，其中该引物的3'子序列包括至少15个核苷酸与靶标的引发区互补，以及(iii)终止子寡核苷酸，其中终止子包括从5'至3'的：长度在5nt与200nt之间的第一序列、长度在3nt与50nt之间的第二序列、长度在3nt与70nt之间的环序列以及长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中该第三序列与第二序列和靶标的匹配区互补，以及长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中该第四序列与靶标的结合区互补，以及(b)在有利于聚合酶活性的温度下孵育混合物，其中引物序列与引物寡核苷酸的序列同源，匹配互补序列与靶标的匹配区互补，以及第一互补序列与终止子寡核苷酸的第一序列互补。上述互补关系可以具有小于100％的互补性。在一些方面，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。在一些方面，步骤(a)进一步包括将样品与聚合酶实现功能所需的试剂和缓冲液混合。在一些方面，步骤(a)进一步包括将样品与荧光团功能化的DNA探针混合，任选地其中探针是Taqman探针或分子信标。在一些方面，步骤(a)进一步包括将样品与DNA嵌入染料混合，任选地其中染料包括SybrGreen、EvaGreen或Syto染料。
在一个实施例中，本文提供了用于产生嵌合扩增子的方法，该嵌合扩增子包含5'至3'的引物序列、匹配互补序列和第一互补序列，该方法包括：(a)将包含靶分子的样品与以下进行混合，该靶分子从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区：(i)引物寡核苷酸，其中该引物的3'子序列包括至少15个核苷酸与靶标的引发区互补，以及(ii)终止子寡核苷酸，其中终止子包括从5'至3'的：长度在5nt与200nt之间的第一序列、长度在3nt与50nt之间的第二序列、长度在3nt与70nt之间的环序列以及长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中该第三序列与第二序列和靶标的匹配区互补，以及长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中该第四序列与靶标的结合区互补，以及(iii)退火缓冲液；(b)对混合物进行热退火；(c)添加酶实现功能所需的模板依赖性聚合酶、试剂和缓冲液；(d)在有利于聚合酶活性的温度下孵育混合物，其中引物序列与引物寡核苷酸的序列同源，匹配互补序列与靶标的匹配区互补，以及第一互补序列与终止子寡核苷酸的第一序列互补。上述互补关系可以具有小于100％的互补性。在一些方面，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。在一些方面，步骤(b)包括从不低于78℃的温度冷却至不高于25℃的温度的热循环程序。在一些方面，热循环程序包括从约78℃冷却至约25℃的步骤，其中溶液在每个5℃温度窗口保持至少5分钟。换句话说，对于热循环程序的每5分钟，该程序每5分钟冷却不超过5℃，即，在73℃和78℃之间需要耗时≥5分钟，在68℃和73℃之间需要耗时≥5分钟等等。在一些方面，步骤(b)包括将混合物孵育10分钟至24小时。在一些方面，步骤(b)包括将混合物在室温孵育10分钟至24小时。在一些方面，步骤(a)或步骤(c)进一步包括将样品与荧光团功能化的DNA探针混合，任选地其中探针是Taqman探针或分子信标。在一些方面，步骤(a)或步骤(c)进一步包括将样品与DNA嵌入染料混合，任选地其中染料包括SybrGreen、EvaGreen或Syto染料。
在一些方面，步骤(a)包括将样品与根据本发明实施例中任一项的组合物混合。
在一些方面，扩增子进一步包含引物序列和匹配互补序列之间的插入序列。
在一些方面，孵育发生的温度在约10℃与约74℃之间、约15℃与约74℃、约20℃与约74℃之间、约25℃与约74℃之间、约30℃与约74℃之间、约35℃与约74℃之间、约40℃与约74℃之间、约45℃与约74℃之间、约50℃与约74℃之间、约55℃与约74℃之间，约60℃与约74℃之间、约25℃与约65℃之间、约30℃与约65℃之间、约35℃与约65℃之间、或其中可推论出的任何范围。在一些方面，孵育发生的温度在约10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、或74℃，或其中可推论出的任何值。在一些方面，孵育进行的时间为1秒至20小时、30秒至20小时、1分钟至20小时、2分钟至20小时、5分钟至20小时、10分钟至20小时、30分钟至20小时、60分钟至20小时、2小时至20小时、30秒至2小时、60秒至2小时、2分钟至2小时、5分钟至2小时、10分钟至2小时、30分钟至2小时、或其中可推论出的任何范围。在一些方面，孵育进行的时间为至少1秒、10秒、20秒、30秒、45秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、或60分钟并且至多20小时、15小时、10小时、5小时、2小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟。在一些方面，孵育进行的时间为1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或其中可推论出的任何值。
在一些方面，孵育包括交替进行热循环的温度高于78℃(例如，78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或95℃)持续1秒至30分钟(例如1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或其中可推论出的任何值)以及温度不高于75℃(例如，75℃、74℃、73℃、72℃、71℃、70℃、69℃、68℃、67℃、66℃、65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、52℃、51℃、50℃、49℃、48℃、47℃、46℃或45℃)持续1秒至20小时(例如1秒、5秒、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或其中可推论出的任何值)。在一些方面，该方法进一步包括至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个额外的热循环。
本发明的其它目的、特征和优点将从以下详细描述中变得清楚。然而，应理解，具体实施方式和特定实例虽然指示本发明的优选实施例，但仅以说明方式给出，因为本领域的技术人员将由此实施方式而变得显而易知本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且包含在内以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1：嵌合扩增子形成系统的关键试剂成分。虚线框表示终止子。引物和终止子右侧的灰色箭头表示寡核苷酸的3'端。终止子具有从5'至3'的第一序列、第二序列、环序列、第三序列和第四序列。第二序列与第三序列互补，环序列被图示为发夹结构右侧的弧线。该系统还包括模板依赖性聚合酶。
图2：嵌合扩增子形成系统包括靶核酸。除了图1中提到的成分之外，该系统还包括靶核酸。靶标具有从5'至3'的结合区、匹配区和引发区。靶标左侧的灰色箭头表示寡核苷酸的3'端。引物寡核苷酸和靶标的引发区互补。终止子上的第四序列和靶标上的结合区互补。匹配区与终止子的第三序列互补。
图3：终止子的一种实施例。终止子可以进一步包括位于第二序列与环序列之间的第五序列，以及位于第三序列与环序列之间的第六序列，其中第五序列与第六序列互补。
图4：诱导模板转换的机制。从5'到3'方向，靶标具有引发区(标记为P*)、匹配区(标记为M)和结合区(标记为4*)，并且终止子含有第一序列(标记为1)、第二序列(标记为2)、环序列(标记为L)、第三序列(标记为3)和第四序列(标记为4)。第二序列与第三序列互补，结合序列与第四序列互补，并且匹配区与第二序列同源且与第三序列互补。存在靶标相似物，其大多数区域与靶标相同，但匹配区被靶标相似物上的区域5替换。区域5既不与第三序列互补，也不与第二序列同源。在阶段1，引物(P)结合到靶标的引发区，以及终止子的第四序列结合到靶标的结合区。靶标和终止子之间形成的碱基对将与由终止子的发夹形成的碱基对形成碱基堆叠，其茎由第二序列和第三序列形成。当聚合酶在阶段2将引物延伸至靶标-终止子结合连接点时，交叉几何形状会阻止聚合酶进一步延伸。在左图中，由于匹配区和第三序列之间的互补关系，阶段2的多链分子可以通过分支迁移自发重排到阶段3所示的状态，其中聚合酶延伸产物的3'端桥接交叉连接点并与终止子分子的第二序列结合。然后，聚合酶能够在阶段4继续延伸，此时将终止子识别为模板。在阶段5，嵌合扩增子完成延伸，并具有与靶标互补的5'序列和与终止子互补的3'序列。如图4的右侧所示，由于靶标相似物的区域5与第三序列不互补，分支迁移和重排无法发生，因此聚合酶延伸在阶段2将在终止子与靶标相似物结合的位点处停止。
图5A至图5D：诱导模板转换的实验演示。(图5A)在反应1(左图)中，靶标(SEQ IDNO:1)通过引物(SEQ ID NO:4)和终止子(SEQ ID NO:3)的使用进行预退火。靶标具有与终止子的第三序列互补的匹配区。在反应2(右图)中，混合相同的引物和终止子与靶标相似物(SEQ ID NO:2)并对混合物进行退火程序。靶标相似物不具有与终止子的第三序列互补的匹配区。然后，将等量的T4 DNA聚合酶和缓冲液添加到反应1和反应2中，并将反应在37℃孵育35分钟，然后在75℃孵育10分钟。(图5B&图C)qPCR用于定量输入DNA(靶标或靶标相似物)的量以及通过一次聚合酶延伸反应形成的PCR产物的量。引物和靶标特异性反向引物(RP)(SEQ ID NO:6)用于确定输入qPCR循环阈值(Ct)。产物qPCR Ct值根据引物和终止子特异性RP(SEQ ID NO:5)确定。(图5D)在正确设计的靶标和终止子系统中，嵌合扩增子的Ct值为14.7，与靶标Ct值14.4相似，表明模板转换效率高。在靶标相似物组中，没有与终止子第三序列互补的匹配区，PCR产物的Ct值为30.3，而靶标相似物的Ct值为14.6。这15.7的Ct值差异表明，当靶标没有匹配区时，模板转换的效率大约为2^(-15.7)＝0.002％。
图6：嵌合扩增子的实施例。扩增子由嵌合扩增子形成系统生成，具有引物序列、匹配互补序列和从5’至3'方向的第一互补序列。匹配互补序列与靶标上的匹配区域互补，第一互补序列与终止子上的第一序列互补。
图7：嵌合扩增子的一种实施例。扩增子还可以在引物序列和匹配互补序列之间具有插入序列，该插入序列与靶标上的引发区和匹配区之间的区域互补。
图8：嵌合扩增子的Sanger验证。顶部的实施例显示了设计的漫画和序列细节。DNA引物预退火后(SEQ ID NO:11)、DNA靶标(SEQ ID NO:7)和DNA终止子(SEQ ID NO:9)在2XPBS缓冲液中，将退火产物与T4 DNA聚合酶在37℃孵育35分钟，然后在75℃孵育10分钟。然后，DNA引物(SEQ ID NO:11)和Sanger引物(SEQ ID NO:12)用于扩增生成的嵌合扩增子(SEQ ID NO:8)。然后将PCR产物进行Sanger测序，结果如底部所示(SEQ ID NO:10)。
图9：终止子的结构。如左图所示，x表示茎序列的长度，y表示环序列的长度，z表示与靶标上紧邻匹配区5'的序列互补的环核苷酸的数量。右侧表格列出了所有经过桑格测序确认结果测试的结构。
图10A-图10C：靶标序列的多样性。这里，三个具有不同引发区和相同匹配区序列的不同的靶标序列(分别在图10A-图10C中的SEQ ID Nos:32-34)被测试。三个不同的靶标分别用相应的引物(SEQ ID Nos:35-37)和终止子(SEQ ID NO:38)进行退火，然后与T4 DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶以及所需缓冲液在37℃孵育35分钟，之后在75℃孵育10分钟。桑格测序结果(SEQ ID Nos:29-31)确认生成的嵌合扩增子的序列，证明该系统是通用的并且适用于具有相同匹配区的任何靶标序列。
图11：演示逆转录(RT)中嵌合扩增子的形成。顶部的实施例显示了设计的漫画和序列细节。RNA终止子(SEQ ID NO:40)、DNA引物(SEQ ID NO:41)和RNA靶标(SEQ ID NO:39)在2X PBS缓冲液中用RNase抑制剂预退火。然后将退火产物与dNTP混合并在65℃孵育4分钟。之后，将逆转录酶、RNase抑制剂和RT缓冲液添加到反应中，并将混合物置于50℃反应35分钟和85℃反应5分钟。对来自逆转录的嵌合产物(SEQ ID NO:44)使用Sanger引物(SEQ IDNO:42)和DNA引物(SEQ ID NO:41)在PCR中扩增，所述嵌合产物的序列经Sanger测序确认，如底部所示(SEQ ID NO:43)。这里使用的逆转录酶是Maxima H Minus逆转录酶。
图12：文库制备。引物可以在其5'区域具有与位于靶标引物区3'的靶标子序列不互补的序列，其可以是正向衔接子序列。同样，终止子的第四序列可以包含反向衔接子序列。因此，扩增子将具有附加的测序衔接子序列(或标签序列)。
具体实施方式
本文提供了用于形成具有从靶核酸分子和终止子核酸分子继承的嵌合序列的扩增子的材料和方法。这些方法在聚合酶延伸过程中诱导作为模板的靶标和终止子之间的转换，从而在一个循环内同时实现从两个模板到扩增子的信息继承。终止子的序列经过合理设计，包含一个发夹，所述发夹的茎与靶标区域互补，这种序列互补关系诱导高产模板转换。这些方法与热稳定和非热稳定聚合酶兼容，因此反应不限于热循环，在等温反应中也是可行的。因此，使用这些方法，可以使用单个等温聚合酶延伸步骤将衔接子序列附加到扩增子分子的5'和3'端。实验证明模板转换效率高达100％。该方法克服了热稳定聚合酶和热循环反应的限制以及连接效率低的问题。
I.嵌合扩增子的形成
在DNA或RNA引物的聚合酶延伸过程中，聚合酶将基于被聚合酶识别为模板的核酸序列将核苷酸添加到引物的3'端。通常，被聚合酶识别为模板的核酸分子在聚合酶延伸过程中不会发生变化，即使对于超过5000nt的非常长的扩增子也是如此。
本文提供了用于通过聚合酶诱导模板转换的组合物和方法，所述组合物和方法可以产生具有作为两个不同核酸分子之间的嵌合体的序列的引物(扩增子)的聚合酶延伸产物。靶标作为聚合酶延伸的初始模板，是与引物杂交的核酸分子。终止子寡核苷酸经过合理设计，可与靶序列杂交，并具有序列互补模式，使得延伸聚合酶在靶标和终止子结合的位点处将终止子识别为模板。除了引物区和匹配区(包括引物区和匹配区)之间的靶标上的序列外，终止子上的任何附加5'序列都被并入扩增子中。在一些方面，终止子上的附加5'序列可以包含测序衔接子或标签序列(图12)确定。
终止子是一种核酸物质，从5'至3'包含以下区域：第一序列、第二序列、环序列、第三序列和第四序列。第二序列和第三序列形成发夹茎；第二序列和第三序列之间有一个环序列(图1)确定。
靶标是从5'至3'包含以下区域的核酸物质：结合区、匹配区和引发区。终止子的第四序列与结合区互补。终止子的第二序列被合理地设计为与匹配区具有相同的序列。匹配区与终止子的第三序列互补(图2)确定。引物区与引物的3'区域互补。
在一些实施例中，引物在其5'区域具有与位于靶标引发区3'的靶标子序列不互补的序列。该序列可以包含测序衔接子或标签序列(图12)确定。
在一些实施例中，终止子具有位于第二序列与环序列之间的第五序列，以及位于第三序列与环序列之间的第六序列，并且第五序列与第六序列互补(图3)确定。在一些方面，第五序列不与位于匹配区3'的靶核酸的区域互补。
在一些实施例中，环序列的一部分与位于匹配区紧邻3'的靶核酸的区域互补(图9)确定。环序列的这部分的长度可以为1nt、2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt，或者更多。
可以合理地设计引物和终止子以扩增所需的靶序列，诸如，例如所需的基因。为此，引物序列可被设计为与靶标上3’端的目标区域(即，引发区)序列互补，以及终止子的第四序列可被设计为与靶标上5’端的目标区域(即，结合区)序列互补。最后，终止子的第三序列可被设计为与紧邻结合区3'(即匹配区)的靶标中的序列互补。
在一些实施例中，引发区的长度为15nt与35nt之间、15nt与30nt之间、15nt与25nt之间、15nt与20nt之间、20nt与35nt之间、20nt与30nt之间、20nt与25nt之间、25nt与35nt之间、25nt与30nt之间、30nt与35nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，引发区的长度为15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt或35nt。
在一些实施例中，结合区的长度为6nt与500nt之间、6nt与400nt之间、6nt与300nt之间、6nt与200nt之间、6nt与100nt之间、6nt与75nt之间、6nt与50nt之间、6nt与25nt之间、6nt与15nt之间、15nt与500nt之间、15nt与400nt之间、15nt与300nt之间、15nt与200nt之间、15nt与100nt之间、15nt与75nt之间、15nt与50nt之间、15nt与25nt之间、30nt与500nt之间、30nt与400nt之间、30nt与300nt之间、30nt与200nt之间、30nt与100nt之间、30nt与75nt之间、30nt与50nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，结合区的长度为至少6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt或450nt以及至多500nt、450nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、25nt、20nt或15nt。在一些实施例中，结合区的长度是6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、450nt或500nt，或其中可推论出的任何值。
在一些实施例中，匹配区的长度在3nt与50nt之间、3nt与40nt之间、3nt与30nt之间、3nt与25nt之间、3nt与20nt之间、3nt与15nt之间、3nt与10nt之间、3nt与5nt之间、5nt与50nt之间、5nt与40nt之间、5nt与30nt之间、5nt与25nt之间、5nt与20nt之间、5nt与15nt之间、5nt与10nt之间、10nt与50nt之间、10nt与40nt之间、10nt与30nt之间、10nt与25nt之间、10nt与20nt之间、10nt与15nt之间、15nt与50nt之间、15nt与40nt之间、15nt与30nt之间、15nt与25nt之间、15nt与20nt之间、20nt与50nt之间、20nt与40nt之间、20nt与30nt之间、20nt与25nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，匹配区的长度是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt或50nt。
在一些实施例中，第一序列的长度为5nt与200nt之间、5nt与150nt之间、5nt与100nt之间、5nt与75nt之间、5nt与50nt之间、5nt与25nt之间、5nt与15nt之间、15nt与200nt之间、15nt与150nt之间、15nt与100nt之间、15nt与75nt之间、15nt与50nt之间、15nt与25nt之间、30nt与200nt之间、30nt与150nt之间、30nt与100nt之间、30nt与75nt之间、30nt与50nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，第一序列的长度为至少5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt或175nt以及至多200nt、150nt、100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、25nt、20nt或15nt。在一些实施例中，第一序列的长度是5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、110nt、120nt、130nt、140nt、150nt、160nt、170nt、180nt、190nt、200nt或其中可推论出的任何值。
在一些实施例中，第二序列的长度为3nt与50nt之间、3nt与40nt之间、3nt与30nt之间、3nt与25nt之间、3nt与20nt之间、3nt与15nt之间、3nt与10nt之间、3nt与5nt之间、5nt与50nt之间、5nt与40nt之间、5nt与30nt之间、5nt与25nt之间、5nt与20nt之间、5nt与15nt之间、5nt与10nt之间、10nt与50nt之间、10nt与40nt之间、10nt与30nt之间、10nt与25nt之间、10nt与20nt之间、10nt与15nt之间、15nt与50nt之间、15nt与40nt之间、15nt与30nt之间、15nt与25nt之间、15nt与20nt之间、20nt与50nt之间、20nt与40nt之间、20nt与30nt之间、20nt与25nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，第二序列的长度是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt或50nt。
在一些实施例中，环序列的长度为3nt与70nt之间、3nt与60nt之间、3nt与50nt之间、3nt与40nt之间、3nt与30nt之间、3nt与25nt之间、3nt与20nt之间、3nt与15nt之间、3nt与10nt之间、3nt与5nt之间、5nt与70nt之间、5nt与60nt之间、5nt与50nt之间、5nt与40nt之间、5nt与30nt之间、5nt与25nt之间、5nt与20nt之间、5nt与15nt之间、5nt与10nt之间、10nt与70nt之间、10nt与60nt之间、10nt与50nt之间、10nt与40nt之间、10nt与30nt之间、10nt与25nt之间、10nt与20nt之间、10nt与15nt之间、15nt与70nt之间、15nt与60nt之间、15nt与50nt之间、15nt与40nt之间、15nt与30nt之间、15nt与25nt之间、15nt与20nt之间、20nt与70nt之间、20nt与60nt之间、20nt与50nt之间、20nt与40nt之间、20nt与30nt之间、20nt与25nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，环序列的长度是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt、59nt、60nt、61nt、62nt、63nt、64nt、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt或70nt。
在一些实施例中，第三序列的长度为3nt与50nt之间、3nt与40nt之间、3nt与30nt之间、3nt与25nt之间、3nt与20nt之间、3nt与15nt之间、3nt与10nt之间、3nt与5nt之间、5nt与50nt之间、5nt与40nt之间、5nt与30nt之间、5nt与25nt之间、5nt与20nt之间、5nt与15nt之间、5nt与10nt之间、10nt与50nt之间、10nt与40nt之间、10nt与30nt之间、10nt与25nt之间、10nt与20nt之间、10nt与15nt之间、15nt与50nt之间、15nt与40nt之间、15nt与30nt之间、15nt与25nt之间、15nt与20nt之间、20nt与50nt之间、20nt与40nt之间、20nt与30nt之间、20nt与25nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，第三序列的长度是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt或50nt。
在一些实施例中，第四序列的长度为6nt与500nt之间、6nt与400nt之间、6nt与300nt之间、6nt与200nt之间、6nt与100nt之间、6nt与75nt之间、6nt与50nt之间、6nt与25nt之间、6nt与15nt之间、15nt与500nt之间、15nt与400nt之间、15nt与300nt之间、15nt与200nt之间、15nt与100nt之间、15nt与75nt之间、15nt与50nt之间、15nt与25nt之间、30nt与500nt之间、30nt与400nt之间、30nt与300nt之间、30nt与200nt之间、30nt与100nt之间、30nt与75nt之间、30nt与50nt之间或其中可推论出的任何范围。在一些实施例中，第四序列的长度为至少6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt或450nt以及至多500nt、450nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、25nt、20nt或15nt。在一些实施例中，第四序列的长度为6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt、250nt、300nt、350nt、400nt、450nt或500nt，或其中可推论出的任何值。
在一些实施例中，上述互补关系不一定具有100％的互补性。在一些实施例中，上述互补关系具有≥95％、≥90％、≥85％或≥80％的互补性。换句话说，如果第一序列被定义为与第二序列互补，则第一序列的反向互补序列可以与第二序列100％、≥95％、≥90％、≥85％或≥80％相同。举例来说，如果一个序列被定义为与另一序列至少80％互补，则该序列与另一序列的反向互补序列至少80％相同。
“同一性”或“同源性”是指两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中的相应位置或通过比较所比较的序列的比对来确定同一性。当比较序列中的某个位置被相同碱基占据时，则分子在该位置是相同的。序列之间的同一性程度可以是序列共享的匹配或同源位置的数量的函数。“不相关”或“非互补”序列具有低于40％的同一性，或者可选地低于25％的同一性。序列同一性可以指一个序列与另一序列的％同一性。实际上，当序列被定义为互补时，则序列之一的反向互补将至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％与另一序列相同。适合于确定序列同一性百分比的算法的一个具体示例是BLAST和BLAST2.0算法，Altschul等人在(1977)Nucl.酸研究25:3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.描述了这些算法。Biol.215:403-410。例如，BLAST和BLAST 2.0可用于确定两个或更多个多核苷酸序列的序列同一性百分比。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
在一些实施例中，如果两个核酸分子可以在严格条件下彼此杂交，则它们是互补的。如本文所用，“严格条件”是允许包含互补序列的一条或多条核酸链之间或之内杂交，但排除随机序列杂交的那些条件。严格条件容忍核酸和靶链之间极少的(如果有的话)错配。这样的条件是本领域普通技术人员众所周知的，并且对于需要高选择性的应用来说是优选的。举例来说，严格条件可包括低盐和/或高温条件，例如提供约50℃至约70℃的温度下的约0.02M至约0.15M NaCl。应当理解，所需严格性的温度和离子强度部分地由特定核酸的长度、序列的长度和核碱基含量、核酸的电荷组成，以及杂交混合物中溶剂的存在或浓度决定。还应当理解，这些杂交的范围、组成和条件仅以非限制性实例的方式提及，并且特定杂交反应的所需严格性通常通过与一种或多种阳性或阴性对照比较凭经验确定。在一些实施例中，如果两个核酸分子可以在低严格条件下彼此杂交，则它们是互补的。低严格性的非限制性实例包括在约0.15M至约0.9M NaCl、约20℃至约50℃的温度范围下进行的杂交。当然，进一步修改低严格条件或高严格条件以适应特定应用是在本领域技术人员的技术范围内的。在一些实施例中，如果两个核酸分子在低严格条件下不能彼此杂交，则它们是非互补的。
诱导模板转换的机制如图4所示。在阶段1，引物与靶标结合。匹配区(区域M)的靶标和终止子之间形成的碱基对将与终止子发夹形成的碱基对构成碱基堆叠，包括第二序列(区域2)和第三序列(区域3)。当聚合酶将靶标识别为模板并将引物延伸至阶段2的靶标-终止子结合连接点时，聚合酶在匹配区(区域M)上完成延伸，但由于存在交叉几何形状而无法进一步延伸。
由于匹配区(区域M)和第三序列(区域3)之间的互补关系，阶段2中的多链分子可以通过分支迁移自发重排到阶段3所示的状态，其中聚合酶的3'端延伸产物桥接交叉点并与终止子分子的第二序列(区域2)结合。然后，聚合酶能够在阶段4继续延伸，此时将终止子识别为模板。在阶段5，嵌合扩增子完成延伸，其5'序列依赖于靶标，其3'序列依赖于终止子。
如图4的右侧所示，显示了一种可选的系统，其中终止子的第三序列(区域3)与靶标相似物的区域5不互补，因此从阶段2到阶段3的重排是不可能的，并且聚合酶延伸在阶段2中位于终止子与靶标结合的位点停止。
图5显示诱导模板转换的实验演示。qPCR用于定量最初引入反应中的靶寡核苷酸和靶标相似物寡核苷酸的量，以及通过一次聚合酶延伸反应形成的产物的量。靶标和靶标相似物之间的唯一区别在于是否存在与终止子的第三序列互补的匹配区。靶标或靶标相似物的qPCR循环阈值(Ct)是根据DNA引物和靶标特异性反向引物确定的。根据引物和终止子特异性反向引物确定产物的qPCR Ct值。在正确设计的靶标和终止子系统中，嵌合扩增子的Ct值为14.7，与靶标Ct值14.4相似，表明模板转换效率高。在阴性对照系统中，靶标相似物不具有与终止子第三序列互补的区域，产品的Ct值为30.3，而靶标类似的Ct值为14.6。这15.7的Ct值差异表明，如果靶标不包含与终止子第三序列互补的匹配区，则模板转换效率大约为2^(-15.7)＝0.002％。
反应生成的扩增子从5'至3'具有引物序列、匹配互补序列和第一互补序列(图6)确定。在一些实施例中，扩增子在引物序列和匹配互补序列之间具有插入序列(图7)确定。插入序列和匹配互补序列与靶标区域互补，以及第一互补序列与终止子区域互补。
将衔接子附加到靶核酸序列的5'和3'端是重要的一步。例如，将测序衔接子连接到靶核酸序列的5'和3'端对于高通量测序(如下一代测序(NGS)或第三代测序)是必要的。在一些实施例中，引物具有5'衔接子A序列。在一些实施例中，第一序列具有5'衔接子B序列。在一些实施例中，嵌合扩增子在其5'端具有衔接子A序列并且在其3'端具有衔接子B序列的互补序列。在一些实施例中，衔接子A和衔接子B序列包含用于高通量测序的测序衔接子。
II.引物二聚体的潜在减少
在高度多重PCR反应中，通过引物的非特异性结合形成的不需要的引物二聚体的数量可能是数量增长的重大障碍。在所提供的模板转换方法中，终止子经过合理设计，并且可以在3'端包含阻止聚合酶延伸的序列或化学修饰。因此，形成的引物二聚体的量可能低于传统多重PCR反应中的量。
例如，在典型的N-plex PCR反应中，使用2N种引物，并且任意两个引物可以形成引物二聚体。引物二聚体比率的可能性为2N*(2N-1)/2。如果这些引物的3'端被修饰使得其不可延伸，则引物不太可能形成引物二聚体，但它们也会失去功能并且无法在靶标上延伸。在本方法中，可修饰终止子以使其不可延伸，而不影响嵌合扩增子的产生。这样，只有N个引物能够形成引物二聚体，这样的机会将减少到N*(N-1)/2。这样，引物二聚体比率降低了大约4倍。
III.示例性实验方案和条件示
A.聚合酶链式反应(PCR)中嵌合扩增子生成的实验方案和条件
对于本文提供的实验结果，除非另有说明，否则50μL反应混合物中引物、靶标和终止子的最终浓度均为3nM。使用T4 DNA聚合酶(Thermo Fisher)或T7 DNA聚合酶(ThermoFisher)以及实现酶促功能所需的缓冲液和试剂。使用Bio-Rad T100或Bio-Rad C1000仪器进行热循环。热循环方案如下：
盖子温度：90℃
1. 37℃35分钟。
2. 75℃10分钟。
B.逆转录嵌合扩增子生成的实验方案和条件
对于本文提供的实验结果，除非另有说明，50μL反应混合物中引物、靶标和终止子的最终浓度均为0.5nM。Maxima H Minus逆转录酶(Thermo Fisher)用于逆转录反应。使用Bio-Rad T100或Bio-Rad C1000仪器进行热循环。详细方案和热循环方案如下：
1.将dNTP、靶标、终止子和引物混合在一起，在65℃孵育4分钟，然后在冰上快速冷却。
2.添加500单位的Maxima H Minus逆转录酶、120单位的RiboLock RNase抑制剂(Thermo Fisher)以及酶实现功能所需的缓冲液，然后在50℃孵育35分钟，之后在85℃孵育5分钟。
C.退火实验方案和条件
对于本文提供的实验结果，除非另有说明，50μL反应混合物中引物、靶标和终止子的最终浓度均为3nM。除非另有说明，所有实验均使用2X磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液。使用Eppendorf Mastercycler进行热循环。热循环方案如下：
1. 95℃2分钟。
2.然后程序以每6秒0.01℃的降温速度从95℃冷却至20℃。
当任何起始材料是RNA或含有RNA核苷酸时，在退火之前将160单位的核糖核酸酶(RNase)抑制剂添加到混合物中。
D.桑格测序(Sanger Sequencing)制备的实验方案和条件
对于本文呈现的桑格测序结果，使用一对引物，即引物和终止子特异性RP来扩增嵌合扩增子，以达到桑格测序所需的嵌合扩增子的最小量。10μL反应混合物中每种引物的最终浓度为400nM。除非另有说明，所有实验均使用PowerUp SYBR DNA聚合酶预混液(PowerUp SYBR DNA Polymerase Mastermix，Thermo Fisher)。使用Bio-Rad CFX96qPCR仪器进行热循环和荧光测量。热循环方案如下：
1. 95℃3分钟。
2. 55个循环(95℃10秒，60℃30秒)
荧光信号均在60℃时收集。
IV.定义
如本文在说明书所使用，“一个(“a”或“an”)”可以意指一个或多个。如本文在权利要求中所使用，当与词语“包括”一起使用时，词语“一个”可以意指一个或多于一个。
除非明显表示仅指替代方案或替代方案相互排斥，否则在权利要求书中使用术语“或”用于指“和/或”，但本公开支持仅指代替代方案的定义和“和/或”。如本文所使用，“另一个(another)”可以意味着至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“大约”用于指示包括设备误差的固有变化、用于确定该值的方法的固有变化、研究对象之间存在的变化的值、或在规定值的10％以内的值。
如本文所使用，就指定组分而言，“本质上不含”在本文中用于意指指定组分没有被故意调配成组合物和/或仅作为污染物或以微量存在。因此，由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中使用标准分析方法检测不到指定组分的量的组合物。
“引物”意指天然的或合成的寡核苷酸，该天然的或合成的寡核苷酸在与多核苷酸模板形成双链体时能够充当核酸合成的起始点，并从其3'端沿着模板延伸，从而形成延伸的双链体。延伸过程期间所添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列确定。通常引物通过DNA聚合酶延伸，但RNA聚合酶和逆转录酶也可考虑有这样的作用。引物的长度通常与其在引物延伸产物合成中的用途相容，并且长度通常介于8至100个核苷酸之间的范围内，诸如10至75个、15至60个、15至40个、18至30个、20至40个、21至50个、22至45个、25至40个等，更通常地长度介于18至40个、20至35个、21至30个核苷酸之间的范围内，以及所叙述范围之间的任何长度。通常引物的长度可以在介于10至50个核苷酸之间的范围内，例如15至45个、18至40个、20至30个、21至25个等，以及所叙述范围之间的任何长度。在一些实施例中，引物的长度通常不超过约10个、12个、15个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个或70个核苷酸。
如本文所使用，“掺入”意指成为核酸聚合物的一部分。
如本文所使用，术语“在不存在外源性操纵的情况下”是指在不改变核酸分子被修饰的溶液的情况下对核酸分子进行修饰。在具体实施例中，其在没有人手或者在不存在改变溶液条件的机器的情况下发生，该溶液条件也可以被称为缓冲条件。然而，在修饰期间，温度可能会发生变化。
“核苷”是碱基-糖组合，即缺少磷酸的核苷酸。本领域公认术语核苷和核苷酸的用法有一定的互换性。例如，核苷酸脱氧尿苷三磷酸，dUTP，是脱氧核苷三磷酸。掺入到DNA中后，其充当DNA单体，形式上是脱氧尿苷酸，即dUMP或脱氧尿苷酸。可以说，即使在所得DNA中不存在dUTP部分，也可以将dUTP掺入到DNA中。类似地，可以说，即使其仅是底物分子的一部分，也可以将脱氧尿苷掺入到DNA中。
如本文所使用，“核苷酸”是指碱基-糖-磷酸盐组合的专业术语。核苷酸是核酸聚合物，即，DNA和RNA的单体单元。该术语包含核糖核苷酸三磷酸，诸如rATP、rCTP、rGTP或rUTP，以及脱氧核糖核苷酸三磷酸，诸如dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP。
术语“核酸”或“多核苷酸”通常是指包括至少一个核碱基的DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体或其衍生物或类似物的至少一个分子或链，诸如，例如在DNA(例如，腺嘌呤“A”、“鸟嘌呤”G、“胸腺嘧啶”T和胞嘧啶“C”)或RNA(例如，A、G、尿嘧啶“U”和C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”。如本文所使用，“寡核苷酸”统指并且可互换地指代两个专业术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”。应当注意，尽管寡核苷酸和多核苷酸是本领域的不同术语，但是它们之间没有确切的分界线，并且它们在本文中可以互换地使用。术语“衔接子”也可以与术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换地使用。另外，术语“衔接子”可以指示线性衔接子(单链或双链)或茎环衔接子。这些定义通常是指至少一个单链分子，但是在具体实施例中，这些定义还将涵盖与至少一个单链分子部分、基本上或完全互补的至少一条另外的链。因此，核酸可以涵盖包括有包括分子链的特定序列的一个或多个互补链或“互补序列”的至少一个双链分子或至少一个三链分子。如本文所使用，单链核酸可以由前缀“ss”表示，双链核酸可以由前缀“ds”表示，并且三链核酸可以由前缀“ts”表示。
“核酸分子”或“核酸靶分子”是指包含标准典范碱基、高度修饰碱基、非天然碱基或它们的碱基的任何组合的任何单链或双链核酸分子。例如但不限于，核酸分子含有四种典范DNA碱基-腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，和/或四种典范RNA碱基-腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。当核苷含有2'-脱氧核糖基时，尿嘧啶可以取代胸腺嘧啶。核酸分子可以从RNA转化成DNA，也可以从DNA转化成RNA。例如但不限于，可以使用逆转录酶将mRNA创建成互补DNA(cDNA)，并且使用RNA聚合酶将DNA创建成RNA。核酸分子可以是生物来源或合成来源的。核酸分子的实例包括基因组DNA、cDNA、RNA、DNA/RNA杂交体、扩增的DNA、预先存在的核酸文库等。核酸可以从人类样品获得，诸如血液、血清、血浆、脑脊液、脸颊刮片、活组织检查、精液、尿液、粪便、唾液、汗液等。核酸分子可以接受各种处理，诸如修复处理和片段化处理。片段化处理包含机械剪切、声速剪切和水力剪切。修复处理包含通过延伸和/或连接反应的缺口修复、抛光以产生钝端、去除受损的碱基，如脱氨基、衍生化、脱碱基或交联的核苷酸等。目标核酸分子也可以经受化学修饰(例如，亚硫酸氢盐转化、甲基化/去甲基化)、延伸、扩增(例如，PCR、等温等)等。
“互补的”或“互补序列”核酸是能够根据标准沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦碱(Hoogsteen)或反向胡斯坦碱结合互补规则进行碱基配对的核酸。如本文所使用，术语“互补的”或“互补序列”可以是指基本上互补的核酸，如可以通过上述相同核苷酸比较所评估。术语“基本上互补的”可以指包括至少一个连续核碱基序列的核酸，或者如果分子中不存在一个或多个核碱基部分，则半连续性核碱基能够与至少一条核酸链或双链体杂交，即使并非所有的核碱基均不与对应的核碱基碱基配对。在某些实施例中，“基本上互补”的核酸含有至少一个序列，其中约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％至约100％(以及其中任何范围)的核碱基序列能够在杂交期间与至少一个单链或双链核酸分子碱基配对。在某些实施例中，术语“基本上互补的”是指可以在严格条件下与至少一种核酸链或双链体杂交的至少一种核酸。在某些实施例中，“部分互补的”核酸包括可以在低严格条件下与至少一个单链或双链核酸杂交的至少一个序列，或含有其中少于约70％的核碱基序列能够在杂交期间与至少一个单链或双链核酸分子碱基配对的至少一个序列。
术语“非互补的”是指缺乏通过特异性氢键形成至少一个沃森-克里克碱基对的能力的核酸序列。
如本文所使用，术语“退化的”是指核苷酸或一系列核苷酸，其中同一性可以选自与所定义的序列相反的多种选择的核苷酸。在具体实施例中，可以从两种或更多种不同的核苷酸中进行选择。在另外的具体实施例中，在一个特定位置处选择核苷酸包括仅从嘌呤、仅从嘧啶、或从非配对的嘌呤和嘧啶中选择。
如本文所使用，术语“二级结构”是指碱基对之间的相互作用的集合。例如，在DNA双螺旋中，两个DNA链通过氢键保持在一起。二级结构决定了核酸呈现的形状。对于单链核酸，最简单的二级结构是线性的。对于线性二级结构，核酸分子的任何两个子序列不会形成强度大于-2kcal/mol的分子内结构。作为单链核酸的另一个实例，核酸分子的一部分可以与同一核酸分子的第二部分杂交，从而形成发夹至茎环二级结构。对于非线性二级结构，核酸分子的至少两个子序列来自强度大于-2kcal/mol的分子内结构。
本文所述的嵌合扩增系统的“靶标”可以是任何单链核酸，诸如单链DNA和单链RNA，包括双链DNA和通过热激、不对称扩增而变成单链的RNA，竞争性结合以及本领域标准的其他方法。DNA靶标可以是RNA进行逆转录的产物。在一些情况下，靶标可以是DNA和RNA的混合物(嵌合体)。在其他情况下，靶标包含人工核酸类似物。在一些情况下，靶标可以是天然存在的(例如，基因组DNA)，或者可以是合成的(例如，来自基因组文库)。如本文所用，“天然存在的”核酸序列是存在于生物体或病毒的核酸分子中的序列，所述生物体或病毒在没有人类干预的情况下存在于自然界中或存在于任何生物样品中。在一些情况下，靶标是基因组DNA、信使RNA、核糖体RNA、无细胞DNA、微小RNA、前微小RNA、前体微小RNA、长非编码RNA、小RNA、表观遗传修饰的DNA、表观遗传修饰的RNA、病毒DNA、病毒RNA或piwi-RNA。在某些情况下，靶核酸是生物体或病毒中天然存在的核酸。在一些情况下，靶核酸是病原生物体或病毒的核酸。在某些情况下，目标靶标是线性的，而在其他情况下，靶标是圆形的(例如，质粒DNA、线粒体DNA或质体DNA)。
在某些情况下，目标靶核酸分子的长度为约19至约1,000,000个核苷酸(nt)。在一些情况下，靶标的长度为约19至约100、约100至约1000、约1000至约10,000、约10,000至约100,000、或约100,000至约1,000,000个核苷酸。在一些情况下，靶标是长度为约20、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约2,000、约3,000、约4,000、约5,000、约6,000、约7,000、约8,000、约9000、约10,000、约20,000、约30,000、约40,000、约50,000、约60,000、约70,000、约80,000、约90,000、约100,000、约200,000、约300,000、约400,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或约1,000,000个核苷酸。应当理解，靶核酸可以在较长核酸的背景下提供(例如，诸如染色体或染色体片段内的编码序列或基因)。
“生物样品”是指从新鲜或保存的生物样品或合成来源获得或分离的含有目标核酸的材料。样品可以包含至少一个细胞、胎儿细胞、细胞培养物、组织标本、血液、血清、血浆、唾液、尿液、泪液、阴道分泌物、汗液、淋巴液、脑脊液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水液、粪便物、身体渗出液、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、胚胎组织、多细胞胚胎、裂解物、提取物、溶液或怀疑含有目标免疫核酸的反应混合物。样品还可以包含非人来源，诸如非人灵长类动物、啮齿动物和其它哺乳动物、其它动物、植物、真菌、细菌和病毒。
如本文关于核苷酸序列所使用，“基本上已知”是指具有足够的序列信息以允许制备核酸分子，包含其扩增。这通常为约100％，尽管在一些实施例中，衔接子序列的一些部分是随机的或退化的。因此，在具体实施例中，基本上已知是指约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％或约99％至约100％。
V.试剂盒
本文描述的技术包括包含本文公开的终止子寡核苷酸和任选的引物的试剂盒。示例性试剂盒包含qPCR试剂盒、桑格试剂盒、NGS基因包和纳米孔测序基因包。“试剂盒”是指物理元素的组合。例如，试剂盒可以包括例如一种或多种组分，诸如核酸引物、核酸终止子、酶、反应缓冲液、说明书和可用于实践本文描述的技术的其他元件。这些物理元素可以以适于实施本发明的任何方式布置。
试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置将通常包含组分可以放置有于其中并且优选地是适当等分(例如，等分到微量滴定板的孔中)的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。当试剂盒中存在多于一种组分时，试剂盒通常还将含有第二、第三或其它另外的容器，另外的组分可以单独放置于其中。然而，单个小瓶中可以包括组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还包含一种用于以紧密封闭的方式容纳核酸和任何其它试剂容器以供商业销售的装置。这些容器可以包含注塑成型或吹塑成型塑料容器，其中可以保留所需小瓶。试剂盒还将包括使用试剂盒组分以及试剂盒中未包括的任何其他试剂的使用的说明。说明书可以包含可以实施的变型。
VI.实例
以下实例是为了证明本发明的优选实施例而包含在内。本领域的技术人员应理解，以下实例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中操作良好的技术，并且因此可以视为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实例1-PCR中嵌合扩增子的形成
图8显示了使用DNA引物、DNA终止子和DNA靶寡核苷酸生成嵌合扩增子的实验演示。首先将三种寡核苷酸在2X PBS缓冲液中退火，然后将退火产物与T4 DNA聚合酶在37℃孵育35分钟，之后在75℃孵育10分钟。使用引物和桑格(Sanger)引物对生成的嵌合扩增子进行扩增，以使嵌合扩增子的量达到桑格测序的最小输入量要求。测序结果如图8底部所示，确认嵌合扩增子的序列。
图9左图展示了一幅卡通图，其中x是发夹茎序列的长度，y是发夹环序列的长度，z代表环上与靶标反向互补的核苷酸的数量。所有经过实验测试的终止子结构均列于图9的表格中，以及它们各自的序列为SEQ ID Nos:13-28。
在图10中验证了不同靶标与相同匹配区域的兼容性。将具有不同引物序列的靶标和插入序列与相同的终止子混合，桑格测序产物证明了上述方法的可行性。
实例2-逆转录中嵌合扩增子的形成
嵌合扩增子形成系统不仅限于使用DNA聚合酶的反应，还可以用于使用逆转录或RNA聚合酶的反应。
图11显示了使用DNA引物、RNA终止子和RNA靶标在逆转录中产生扩增子。首先将三种寡核苷酸在含有160单位RNase抑制剂的2X PBS缓冲液中退火，然后将退火产物与dNTP混合，并在65℃放置4分钟，之后在冰上快速冷却。添加500单位的Maxima H minus逆转录酶和120单位的RNase抑制剂后，将反应物在50℃放置35分钟，之后在85℃放置5分钟。使用引物和桑格(Sanger)引物对生成的嵌合扩增子进行扩增，以使嵌合扩增子的量达到桑格测序的最小输入量要求。测序结果如图11底部所示，确认嵌合扩增子的序列。
***
本文中所公开和要求的所有方法均可以在无需过度实验的情况下根据本公开进行和执行。虽然本发明的组合物和方法已结合优选实施例描述，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，可以对方法和本文所述方法中的步骤或步骤顺序进行变更而这些变更不脱离本发明的构思、精神和范围。更具体地，显然，在化学上和生理学上相关的某些药剂可以取代本文所述的药剂，同时实现相同或相似的结果。对本领域的技术人员显而易见的是，所有这类类似取代和修改视为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110> 威廉·马什·莱斯大学
<120> 用于形成嵌合扩增子的组合物和方法
<130> RICE.P0084WO
<140> 尚不清楚
<141> 2022-04-29
<150> US 63/182,154
<151> 2021-04-30
<160> 44
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 1
ctgttggtgg tgcaggaggc attgccttct accctccaga tggtcggtta taaattctga 60
ttagcca 67
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 2
ctgttggtgg tgcaggaggc attgcagaga ctaccgctga tccagatggt cggttataaa 60
ttctgattag cca 73
<210> 3
<211> 135
<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
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catcccgctc aatcacgaca gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgcttct accctcatgg agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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tgttggtggt gcaggagg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
ctgttggtgg tgcaggaggc attgccttct accctccaga tggtcggtta taaattctga 60
ttagcca 67
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<220>
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<220>
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<210> 12
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
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<210> 13
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-3-3-0
<400> 13
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tcatcctggt aatccaggat gtgcgtatag ccactggcaa tgcctcctgc accaccaaca 120
g 121
<210> 14
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-4-4-0
<400> 14
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc tacagcagta gaaggcaatg cctcctgcac 120
caccaacag 129
<210> 15
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-4-4-2
<400> 15
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc tacatgggta gaaggcaatg cctcctgcac 120
caccaacag 129
<210> 16
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-4-4-4
<400> 16
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc tactagggta gaaggcaatg cctcctgcac 120
caccaacag 129
<210> 17
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-4-8-5
<400> 17
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc accaccatgg agaaggctgg gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacagcccgc cggaaacttc ttccca 156
<210> 18
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-8-4-2
<400> 18
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc cttctaccgg agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 19
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-8-5-2
<400> 19
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc ttctacctgg agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 20
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-8-30-0
<400> 20
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc ttctaccaag tgtgtgaacc gcaagttctg 120
tacaagcggt agaaggcaat gcctcctgca ccaccaacag 160
<210> 21
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-8-30-20
<400> 21
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc ttctaccaag tgtgtgataa agtccagctc 120
cagatagggt agaaggcaat gcctcctgca ccaccaacag 160
<210> 22
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-8-34-0
<400> 22
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc ttctaccaag tgtgggtgga aaccgcaagt 120
tctgtacaag cggtagaagg caatgcctcc tgcaccacca acag 164
<210> 23
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-10-4-2
<400> 23
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtcttc taccctatgg agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 24
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-10-5-2
<400> 24
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgcttct accctcatgg agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 25
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-12-4-3
<400> 25
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtcttctacc ctatccatat agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 26
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-12-5-3
<400> 26
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gcttctaccc tataccatat agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 27
<211> 168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-12-30-0
<400> 27
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc ttctacccta tagtgtggtg ataaccgcaa 120
gttctgtaag catagggtag aaggcaatgc ctcctgcacc accaacag 168
<210> 28
<211> 159
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸-终止子-20-5-0
<400> 28
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgtggcc ttctacccta tctggagctc aagtagctcc 120
agatagggta gaaggcaatg cctcctgcac caccaacag 159
<210> 29
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
ctttaccttc atcctggtaa tccaggatgt gcgcttctac cctatctgga caagtggtgg 60
aaaccgcatt 70
<210> 30
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
ctttaccttc atcctggtaa tccaggatgt gcgcttctac cctatctggg acgttactga 60
cgtggtgc 68
<210> 31
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 31
ctttaccttc atcctggtaa tccaggatgt gcgcttctac cctccagatg gtcggttata 60
aattctgatt agcca 75
<210> 32
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 32
ctgttggtgg tgcaggaggc attgccttct accctatctg gacaagtggt ggaaaccgca 60
tt 62
<210> 33
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 33
ctgttggtgg tgcaggaggc attgccttct accctatctg ggacgttact gacgtggtgc 60
<210> 34
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 34
ctgttggtgg tgcaggaggc attgccttct accctccaga tggtcggtta taaattctga 60
ttagcca 67
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 35
aatgcggttt ccaccacttg 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 36
gcaccacgtc agtaacgtc 19
<210> 37
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 37
tggctaatca gaatttataa ccgacc 26
<210> 38
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 38
tcctccagct tcttctgcag gcgagatccc tccaaaatca agtggaactc aactttacct 60
tcatcctggt aatccaggat gtgcgcttct accctcatgg agggtagaag gcaatgcctc 120
ctgcaccacc aacag 135
<210> 39
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 39
cuguuggugg ugcaggaggc auugccuucu acccuaucug gaguacgaac gccaucgacu 60
u 61
<210> 40
<211> 120
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 40
caggcgagau cccuccaaaa ucaaguggaa cucaacuuua ccuucauccu gguaauccag 60
gaugugcgug gccaccacca uggagaaggc ugggcaaugc cuccugcacc accaacagcc 120
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
aagtcgatgg cgttcgtact 20
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 42
caggcgagat ccctccaa 18
<210> 43
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
ggatgtgcgt ggccaccacc atggagaagg cattgccttc taccctatct ggagaacgaa 60
cgc 63
<210> 44
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
aagtcgatgg cgttcgtact ccagataggg tagaaggcaa tgccttctcc atggtggtgg 60
ccacgcacat cc 72
Claims (167)
1.一种组合物，其包含：
(a)引物寡核苷酸，以及
(b)终止子寡核苷酸，其中终止子从5'至3'包含：
(i)长度在5nt与200nt之间的第一序列，
(ii)长度在3nt与50nt之间的第二序列，
(iii)长度在3nt与70nt之间的环序列，
(iv)长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中所述第三序列与所述第二序列互补，以及
(v)长度在6nt与500nt之间的第四序列，
其中所述第四序列与靶核酸上的结合区序列互补，
其中所述第三序列与位于所述靶核酸上结合区的3'的匹配区序列互补，并且
其中包含至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于所述靶核酸上匹配区的3'的引发区序列互补。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子，其中所述靶核酸从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含所述靶核酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述匹配区紧靠地位于所述结合区的3'。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述匹配区邻近所述结合区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其进一步包含模板依赖性聚合酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其进一步包含聚合酶功能所需的试剂和缓冲剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与紧靠地位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的20个核苷酸区域内的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸进一步包含位于所述第二序列与所述环序列之间的第五序列，以及位于所述环序列与所述第三序列之间的第六序列，其中所述第五序列与所述第六序列互补。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的与靶标不互补的子序列。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中在3'端的所述子序列形成至少一个发夹结构。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸包含非天然核苷酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有阻止聚合酶延伸的化学官能化。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述化学官能化选自由3-碳间隔物、反向核苷酸和小沟结合物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是RNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
21.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是RNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
22.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。
23.根据权利要求17至18中任一项所述的组合物，其中所述DNA聚合酶选自由Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或DNA聚合酶I、Hemo Klen Taq、Phusion、Q5、T7 DNA聚合酶和KAPAHiFi组成的组。
24.根据权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶选自由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶组成的组。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是热稳定的。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶不是热稳定的。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物DNA或RNA分子。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述靶标获自细胞样品、生物流体或组织。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述生物流体选自由血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液和滑液组成的组。
30.根据权利要求28所述的组合物，其中所述组织是活检组织或手术切除的组织。
31.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是通过RNA样品的逆转录生成的互补DNA分子。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述RNA样品是生物RNA样品。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述生物RNA样品获自人类、动物、植物或环境样本。
34.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是通过作用于单链DNA模板的DNA聚合酶生成的扩增子DNA分子。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述扩增子DNA分子是通过单细胞DNA分子的多重置换扩增生成的。
36.根据权利要求1至26中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物DNA分子的物理、化学或酶促生成产物。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述靶标是片段化过程的产物。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。
39.根据权利要求36所述的组合物，其中所述靶标是亚硫酸氢盐转化反应、APOBEC(“载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样”)反应、TAPS(TET辅助的吡啶硼烷测序)反应或其他化学或酶促反应的产物，在所述其他化学或酶促反应中，胞嘧啶核苷酸基于甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶。
40.根据权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个终止子。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第四序列。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
43.根据权利要求41所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
44.根据权利要求41所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
45.根据权利要求40所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第四序列。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
48.根据权利要求45所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
49.根据权利要求40所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第四序列。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
51.根据权利要求49所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
52.根据权利要求49所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
53.根据权利要求40至52中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个引物。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含相同的3'子序列。
55.根据权利要求53所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含不同的3'子序列。
56.根据权利要求53所述的组合物，其中在所述多个引物中存在多个3'子序列。
57.根据权利要求1至39中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个引物。
58.根据权利要求57所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含相同的3'子序列。
59.根据权利要求57所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含不同的3'子序列。
60.根据权利要求57所述的组合物，其中在所述多个引物中存在多个3'子序列。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个终止子。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第四序列。
63.根据权利要求62所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
64.根据权利要求62所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
65.根据权利要求62所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
66.根据权利要求61所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第四序列。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
68.根据权利要求66所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
69.根据权利要求66所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
70.根据权利要求61所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第四序列。
71.根据权利要求70所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
72.根据权利要求70所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
73.根据权利要求70所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
74.一种用于通过聚合酶延伸形成靶核酸的嵌合扩增子的组合物，其中所述靶核酸从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区，所述组合物包含终止子寡核苷酸，其中终止子从5'至3'包含：
(a)长度在5nt与200nt之间的第一序列，
(b)长度在3nt与50nt之间的第二序列，
(c)长度在3nt与70nt之间的环序列，
(d)长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中所述第三序列与所述第二序列互补，以及
(e)长度在6nt与500nt之间的第四序列，
其中所述第四序列与所述靶核酸的所述结合区互补，并且其中所述第三序列与所述靶核酸的所述匹配区互补。
75.根据权利要求74所述的组合物，其进一步包含所述靶核酸。
76.根据权利要求74至75中任一项所述的组合物，其中所述匹配区紧靠地位于所述结合区的3'。
77.根据权利要求74至75中任一项所述的组合物，其中所述匹配区邻近所述结合区。
78.根据权利要求74至77中任一项所述的组合物，其进一步包含引物寡核苷酸，其中包含至少15个核苷酸的引物的3'子序列与位于所述靶核酸上所述匹配区的3'的引发区序列互补。
79.根据权利要求74至77中任一项所述的组合物，其进一步包含模板依赖性聚合酶。
80.根据权利要求74至77中任一项所述的组合物，其进一步包含聚合酶功能所需的试剂和缓冲剂。
81.根据权利要求74至78中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
82.根据权利要求74至78中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与紧靠地位于所述引发区的3'的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
83.根据权利要求74至78中任一项所述的组合物，其中所述引物包含与位于所述引发区的3'的20个核苷酸区域内的所述靶核酸的区域不互补的5'子序列。
84.根据权利要求74至83中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸进一步包含位于所述第二序列与所述环序列之间的第五序列，以及位于所述环序列与所述第三序列之间的第六序列，其中所述第五序列与所述第六序列互补。
85.根据权利要求74至84中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有至少3个核苷酸长度的与靶标不互补的子序列。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中在3'端的所述子序列形成至少一个发夹结构。
87.根据权利要求74至86中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸包含非天然核苷酸。
88.根据权利要求74至87中任一项所述的组合物，其中所述终止子寡核苷酸在3'端具有阻止聚合酶延伸的化学官能化。
89.根据权利要求88所述的组合物，其中所述化学官能化选自由3-碳间隔物、反向核苷酸和小沟结合物。
90.根据权利要求74至89中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。
91.根据权利要求74至89中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是DNA聚合酶。
92.根据权利要求74至89中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是RNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
93.根据权利要求74至89中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是DNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
94.根据权利要求74至89中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是RNA分子，所述靶标是RNA分子，并且模板依赖性聚合酶是逆转录酶。
95.根据权利要求74至89中任一项所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸是RNA分子，所述终止子寡核苷酸是DNA分子，所述靶标是DNA分子，并且模板依赖性聚合酶是RNA聚合酶。
96.根据权利要求90至91中任一项所述的组合物，其中所述DNA聚合酶选自由Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或DNA聚合酶I、Hemo Klen Taq、Phusion、Q5、T7 DNA聚合酶和KAPAHiFi组成的组。
97.根据权利要求92至94中任一项所述的组合物，其中所述逆转录酶选自由莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶组成的组。
98.根据权利要求74至97中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶是热稳定的。
99.根据权利要求74至97中任一项所述的组合物，其中所述模板依赖性聚合酶不是热稳定的。
100.根据权利要求74至99中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物DNA或RNA分子。
101.根据权利要求74至100中任一项所述的组合物，其中所述靶标获自细胞样品、生物流体或组织。
102.根据权利要求101所述的组合物，其中所述生物流体选自由血液、尿液、唾液、脑脊液、间质液和滑液组成的组。
103.根据权利要求101所述的组合物，其中所述组织是活检组织或手术切除的组织。
104.根据权利要求74至99中任一项所述的组合物，其中所述靶标是通过RNA样品的逆转录生成的互补DNA分子。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述RNA样品是生物RNA样品。
106.根据权利要求105所述的组合物，其中所述生物RNA样品获自人类、动物、植物或环境样本。
107.根据权利要求74至99中任一项所述的组合物，其中所述靶标是通过作用于单链DNA模板的DNA聚合酶生成的扩增子DNA分子。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述扩增子DNA分子是通过单细胞DNA分子的多重置换扩增生成的。
109.根据权利要求74至99中任一项所述的组合物，其中所述靶标是生物DNA分子的物理、化学或酶促生成产物。
110.根据权利要求109所述的组合物，其中所述靶标是片段化过程的产物。
111.根据权利要求110所述的组合物，其中所述片段化过程是超声处理或酶促片段化。
112.根据权利要求109所述的组合物，其中所述靶标是亚硫酸氢盐转化反应、APOBEC(“载脂蛋白B mRNA编辑酶、催化多肽样”)反应、TAPS(TET辅助的吡啶硼烷测序)反应或其他化学或酶促反应的产物，在所述其他化学或酶促反应中，胞嘧啶核苷酸基于甲基化状态选择性地转化为尿嘧啶。
113.根据权利要求74至107中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个终止子。
114.根据权利要求113所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第四序列。
115.根据权利要求114所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
116.根据权利要求114所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
117.根据权利要求114所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
118.根据权利要求113所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第四序列。
119.根据权利要求118所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
120.根据权利要求118所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
121.根据权利要求118所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
122.根据权利要求113所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第四序列。
123.根据权利要求122所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
124.根据权利要求122所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
125.根据权利要求122所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
126.根据权利要求113至125中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个引物。
127.根据权利要求126所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含相同的3'子序列。
128.根据权利要求126所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含不同的3'子序列。
129.根据权利要求126所述的组合物，其中在所述多个引物中存在多个3'子序列。
130.根据权利要求74至107中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个引物。
131.根据权利要求130所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含相同的3'子序列。
132.根据权利要求130所述的组合物，其中所述多个引物中的每一个包含不同的3'子序列。
133.根据权利要求130所述的组合物，其中在所述多个引物中存在多个3'子序列。
134.根据权利要求130至133中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含多个终止子。
135.根据权利要求134所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第四序列。
136.根据权利要求135所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
137.根据权利要求135所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
138.根据权利要求135所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
139.根据权利要求134所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第四序列。
140.根据权利要求139所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
141.根据权利要求139所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
142.根据权利要求139所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
143.根据权利要求134所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第四序列。
144.根据权利要求143所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含相同的第三序列。
145.根据权利要求143所述的组合物，其中所述多个终止子中的每一个包含不同的第三序列。
146.根据权利要求143所述的组合物，其中在所述多个终止子中存在多个第三序列。
147.一种用于生成嵌合扩增子的方法，所述嵌合扩增子从5'至3'包含引物序列、匹配互补序列和第一互补序列，所述方法包括：
(a)将包含靶分子的样品与以下进行混合，所述靶分子从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区：
(i)模板依赖性聚合酶，
(ii)引物寡核苷酸，其中包含至少15个核苷酸的引物的3'子序列与靶标的引发区互补，以及
(iii)终止子寡核苷酸，其中终止子从5'至3'包含
长度在5nt与200nt之间的第一序列，
长度在3nt与50nt之间的第二序列，
长度在3nt与70nt之间的环序列，以及
长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中所述第三序列与所述第二序列和所述靶标的所述匹配区互补，以及
长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中所述第四序列与所述靶标的所述结合区互补，以及
(b)在有利于聚合酶活性的温度孵育混合物，
其中所述引物序列与所述引物寡核苷酸的序列同源，所述匹配互补序列与所述靶标的所述匹配区互补，并且所述第一互补序列与所述终止子寡核苷酸的所述第一序列互补。
148.根据权利要求147所述的方法，其中步骤(a)进一步包括将所述样品与聚合酶功能所需的试剂和缓冲剂混合。
149.根据权利要求147或148所述的方法，其中步骤(a)包括将所述样品与根据权利要求1至146中任一项所述的组合物混合。
150.根据权利要求147至149中任一项所述的方法，其中扩增子进一步包含所述引物序列与所述匹配互补序列之间的插入序列。
151.根据权利要求147至150中任一项所述的方法，其中所述孵育在10℃与74℃之间的温度持续介于1秒与20小时之间。
152.根据权利要求147至150中任一项所述的方法，其中所述孵育包括在以下之间交替的热循环：高于78℃的温度持续介于1秒与30分钟之间与在不高于75℃的温度持续介于1秒与20小时之间。
153.根据权利要求147至152中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括至少6次额外的热循环。
154.根据权利要求147至153中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括将所述样品与荧光团功能化的DNA探针混合，任选地其中所述探针是Taqman探针或分子信标。
155.根据权利要求147至153中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括将所述样品与DNA嵌入染料混合，任选地其中所述染料包括SybrGreen、EvaGreen或Syto染料。
156.一种用于生成嵌合扩增子的方法，所述嵌合扩增子从5'至3'包含引物序列、匹配互补序列和第一互补序列，所述方法包括：
(a)将包含靶分子的样品与以下进行混合，所述靶分子从5'至3'包含结合区、匹配区和引发区：
(i)引物寡核苷酸，其中包含至少15个核苷酸的引物的3'子序列与靶标的引发区互补，以及
(ii)终止子寡核苷酸，其中终止子从5'至3'包含
长度在5nt与200nt之间的第一序列，
长度在3nt与50nt之间的第二序列，
长度在3nt与70nt之间的环序列，以及
长度在3nt与50nt之间的第三序列，其中所述第三序列与所述第二序列和所述靶标的所述匹配区互补，以及
长度在6nt与500nt之间的第四序列，其中所述第四序列与所述靶标的所述结合区互补，以及
(iii)退火缓冲剂；
(b)对混合物进行热退火；
(c)添加酶功能所需的模板依赖性聚合酶、试剂和缓冲剂；以及
(d)在有利于聚合酶活性的温度孵育所述混合物，
其中所述引物序列与所述引物寡核苷酸的序列同源，所述匹配互补序列与所述靶标的所述匹配区互补，并且所述第一互补序列与所述终止子寡核苷酸的所述第一序列互补。
157.根据权利要求156所述的方法，其中步骤(a)包括将所述样品与根据权利要求1至146中任一项所述的组合物混合。
158.根据权利要求156或157所述的方法，其中步骤(b)包括从不低于78℃的温度冷却至不高于25℃的温度的热循环程序。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述热循环程序包括从78℃冷却至28℃的步骤，其中溶液在每个5℃温度窗口保持至少5分钟。
160.根据权利要求156至159中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括将所述混合物孵育介于10分钟至24小时之间。
161.根据权利要求160所述的方法，其中步骤(b)包括将所述混合物在室温孵育介于10分钟至24小时之间。
162.根据权利要求156至161中任一项所述的方法，其中所述扩增子进一步包含所述引物序列与所述匹配互补序列之间的插入序列。
163.根据权利要求156至162中任一项所述的方法，其中所述孵育在10℃与74℃之间的温度持续介于1秒与20小时之间。
164.根据权利要求156至163中任一项所述的方法，其中所述孵育包括在以下之间交替的热循环：高于78℃的温度持续介于1秒与30分钟之间与在不高于75℃的温度持续介于1秒与20小时之间。
165.根据权利要求156至164中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括至少6次额外的热循环。
166.根据权利要求156至165中任一项所述的方法，其中步骤(a)或步骤(c)进一步包括将所述样品与荧光团功能化的DNA探针混合，任选地其中所述探针是Taqman探针或分子信标。
167.根据权利要求156至165中任一项所述的方法，其中步骤(a)或步骤(c)进一步包括将所述样品与DNA嵌入染料混合，任选地其中所述染料包括SybrGreen、EvaGreen或Syto染料。
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