KR20200005660A - 랜덤 프라이머 세트 및 이를 사용하는 dna 라이브러리의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
랜덤 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응을 통해 편리하고 고도로 재현가능한 방식으로 DNA 라이브러리를 제조할 때, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭은 상당한 정도로 감소된다. 랜덤 프라이머는, 3' 말단에서의 2 개 염기가 TG 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNN 으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 군, 및 3' 말단에서의 3 개 염기가 TGC 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNNN 으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 군에서 선택되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
Description
본 발명은 DNA 마커 분석 등에 사용할 수 있는 DNA 라이브러리의 제조 방법에 사용되는 랜덤 프라이머 세트 및 이러한 랜덤 프라이머 세트를 사용하는 DNA 라이브러리의 제조 방법에 관한 것이다.
일반적으로 게놈 분석은 게놈에 포함되는 유전 정보, 예컨대 뉴클레오티드 정보의 종합적 분석을 실시하기 위해 수행된다. 그러나, 전체 게놈에 대한 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위한 분석은 공정의 수 및 비용 면에 있어서 불리하다. 또한 큰 게놈 크기를 갖는 유기체의 경우, 게놈 복잡성으로 인해 뉴클레오티드 서열 분석을 기반으로 한 게놈 분석은 한계를 갖는다.
특허 문헌 1 은 증폭 단편 길이 다형성 (AFLP) 마커 기술을 개시하고 있는데, 어댑터에 라이게이션된 제한 효소 처리 단편에 샘플-특이적 마커가 혼입되고, 제한 효소 처리 단편의 서열 일부만이 결정된다. 특허 문헌 1 에 개시된 기술에 따르면, 게놈 DNA 를 제한 효소로 처리하여 게놈 DNA 의 복잡성이 감소되고, 제한 효소 처리 단편의 표적 부분의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그에 따라 표적 제한 효소 처리 단편이 충분히 식별된다. 그러나, 특허 문헌 1 에 개시된 기술은 게놈 DNA 의 제한 효소로의 처리 및 어댑터를 사용하는 라이게이션 반응과 같은 과정을 필요로 한다. 따라서, 비용 감소를 달성하기에 어렵다.
한편, 특허 문헌 2 는 하기와 같이 개시되고 있다. 즉, 소위 RAPD (임의 증폭 다형성 DNA (randomly amplified polymorphic DNA)) 기술에 의해 적절한 프라이머 존재 하에서 PCR 을 통해 벼 샘플에서 추출한 DNA 를 증폭하여 수득된 DNA 밴드 중, 맛 평가 결과와 상관관계가 높은 식별용 DNA 마커가 발견되었다. 특허 문헌 2 에 개시된 방법은 특정 서열에 의해 식별된 복수의 서열-태깅 위치 (STS, 프라이머임) 의 사용을 포함한다. 특허 문헌 2 에 개시된 방법에 따르면, STS 프라이머를 사용하여 증폭된 식별용 DNA 마커가 전기영동을 통해 검출된다. 그러나, 특허 문헌 2 에 개시된 RAPD 기술은 PCR 증폭의 재현성이 상당히 불량하고, 따라서, 이러한 기술은 일반적으로 DNA 마커 기술로서 채용될 수 없다.
특허 문헌 3 은 게놈 라이브러리의 제조 방법을 개시하고 있는데, 표적 게놈에서 비교적 자주 출현하는 서열을 기반으로 하여 설계한 1 종류의 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행하고, 전체 게놈 영역이 실질적으로 균등하게 증폭되고, 그에 따라 게놈 라이브러리가 제조될 수 있다. 특허 문헌 3 은 랜덤 서열을 포함하는 랜덤 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시함으로써 게놈 라이브러리가 제조될 수 있다는 것을 개시하고 있지만, 어떠한 실제 절차 또는 실험 결과도 기재하고 있지 않다. 따라서, 특허 문헌 3 에 기재된 방법은 게놈 출현 빈도가 식별되도록 게놈의 뉴클레오티드 서열 정보를 필요로 하며 이것이 절차의 수 및 비용을 증가시킨다는 것이 추론된다. 또한 특허 문헌 3 에 기재된 방법에 따르면, 전체 게놈이 증폭되며, 불리하게도, 게놈 DNA 의 복잡성이 감소될 수 없다.
DNA 마커를 사용하여 실시된 유전자 연관 분석과 같은 게놈 정보 분석의 기술을 위해서는, 보다 편리하고 고도로 재현가능한 방식으로 DNA 라이브러리를 제조하는 것이 요구된다. 상기 기재한 바와 같이, DNA 라이브러리를 제조하는 다양한 기술이 공지되어 있다. 그러나 지금까지, 편리함 및/또는 재현성 면에서 충분한 것으로 공지된 기술은 존재하지 않는다. 이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 반응액 중 랜덤 프라이머의 농도를 선결된 범위 내로 조절하는, 랜덤 프라이머를 사용하는 것을 포함하는 PCR 의 매우 편리한 방법으로 고도로 재현가능한 DNA 라이브러리를 제조하기 위한 시스템을 개발하였다.
그러나, 이러한 시스템에서 특정 서열을 포함하는 랜덤 프라이머가 사용되는 경우, 엽록체 게놈에서 유래하는 대량의 DNA 단편이 증폭되는 것으로 발견되었다. 이러한 상황 하에서, 본 발명은 랜덤 프라이머 사용을 포함하는 핵산 증폭 반응을 통해 편리한 방식으로 고도로 재현가능한 DNA 라이브러리를 제조할 때 사용되며 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭을 상당히 감소시킬 수 있는 랜덤 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 랜덤 프라이머 세트 사용을 포함하는 DNA 라이브러리의 제조 방법을 제공한다.
본 발명자들은 특정 서열을 포함하는 랜덤 프라이머를 제외하고, 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭이 상당한 정도로 감소될 수 있다는 것을 발견하였다. 이로써 본 발명이 완성되었다.
본 발명은 하기를 포함한다.
(1) 3' 말단에서 2 개 염기가 TG 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNN (SEQ ID NO: 2060, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 으로 표시되는 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 3 개 염기가 TGC 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNNN (SEQ ID NO: 2061, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 으로 표시되는 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 랜덤 프라이머로서 포함하는 랜덤 프라이머 세트.
(2) 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 3' 말단에서의 2 개 염기가 GG, GT, AT 또는 CC 인 SEQ ID NO: 2060 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는, (1) 에 따른 랜덤 프라이머 세트.
(3) 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 3' 말단에서의 3 개 염기가 GGA, GGG, GTG, GTA, ATA 또는 CCA 인 SEQ ID NO: 2061 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는, (1) 에 따른 랜덤 프라이머 세트.
(4) 게놈 DNA 를 주형으로서 사용하여, 게놈 DNA 및 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 랜덤 프라이머 세트에서 선택되는 랜덤 프라이머를 고농도로 함유하는 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실시하여 DNA 단편을 수득하는 것을 포함하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
(5) 반응액이 4 내지 200 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, (4) 에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법.
(6) 반응액이 4 내지 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, (4) 에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법.
(7) 하기 단계를 포함하는 DNA 라이브러리의 제조 방법:
게놈 DNA 를 주형으로서 사용하여, 게놈 DNA 및 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 랜덤 프라이머 세트에서 선택되는 랜덤 프라이머를 고농도로 함유하는 제 1 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실시하여, 제 1 DNA 단편을 수득하는 단계; 및 제 1 DNA 단편, 및 프라이머로서, 랜덤 프라이머의 5' 말단에서의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 3' 말단에서 포함하는 뉴클레오티드를 함유하는 제 2 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실시하여, 제 1 DNA 단편 및 이에 라이게이션된 뉴클레오티드를 포함하는 제 2 DNA 단편을 수득하는 단계.
(8) 제 1 반응액이 4 내지 200 microM 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, (7) 에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법.
(9) 제 1 반응액이 4 내지 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, (7) 에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법.
(10) 제 2 DNA 단편을 증폭하는 프라이머가 뉴클레오티드 서열분석에 사용되는 영역을 포함하거나, 주형으로서 제 2 DNA 단편 사용을 포함하는 핵산 증폭 반응 또는 반복 핵산 증폭 반응에 사용되는 프라이머가 뉴클레오티드 서열분석에 사용되는 영역을 포함하는, (7) 에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법.
(11) (4) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법에 의해 제조되는 DNA 라이브러리.
본 발명의 랜덤 프라이머 세트가 특정 농도 범위 내에서 핵산 증폭 반응에 사용되는 경우, 매우 편리한 방식으로 고도로 재현가능한 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 랜덤 프라이머 세트가 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 랜덤 프라이머를 함유하지 않으므로, 랜덤 프라이머 세트가 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 랜덤 프라이머를 포함하는 경우와 비교하여, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭이 더 큰 정도로 억제될 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법은 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 랜덤 프라이머를 포함하지 않는 랜덤 프라이머 세트 사용을 포함한다. 따라서, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭을 상당한 정도로 억제할 수 있는 고도로 재현가능한 DNA 라이브러리를 매우 편리한 방식으로 제조할 수 있다.
[도 1] 도 1 은 본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법 및 DNA 라이브러리를 사용하는 게놈 DNA 분석 방법을 설명하는 흐름도를 나타낸다.
[도 2] 도 2 는 주형으로서 일반적인 조건 하에 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하는 PCR 을 통해 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 3] 도 3 은 어닐링 온도 45℃ 에서 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 4] 도 4 는 어닐링 온도 40℃ 에서 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는특성도를 나타낸다.
[도 5] 도 5 는 어닐링 온도 37℃ 에서 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 6] 도 6 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2.5 유닛의 효소를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 7] 도 7 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12.5 유닛의 효소를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 8] 도 8 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 본래 수준으로부터 2 배인 농도로 MgCl2 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 9] 도 9 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 본래 수준으로부터 3 배인 농도로 MgCl2 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 10] 도 10 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 본래 수준으로부터 4 배인 농도로 MgCl2 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 11] 도 11 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 8-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 12] 도 12 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 13] 도 13 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 11-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 14] 도 14 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 15] 도 15 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 14-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 16] 도 16 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 16-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 17] 도 17 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 18-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 18] 도 18 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 19] 도 19 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 20] 도 20 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 4 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 21] 도 21 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 6 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 22] 도 22 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 6 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 23] 도 23 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 8 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 24] 도 24 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 8 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 25] 도 25 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 26] 도 26 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 27] 도 27 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 28] 도 28 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 29] 도 29 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 40 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 30] 도 30 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 40 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 31] 도 31 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 60 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 32] 도 32 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 60 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 33] 도 33 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 34] 도 34 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 35] 도 35 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 200 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 36] 도 36 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 200 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 37] 도 37 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 300 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 38] 도 38 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 300 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 39] 도 39 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 400 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 40] 도 40 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 400 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 41] 도 41 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 500 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 42] 도 42 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 500 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 43] 도 43 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 600 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 44] 도 44 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 700 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 45] 도 45 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 800 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 46] 도 46 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 900 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 47] 도 47 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 1000 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 48] 도 48 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 49] 도 49 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어 (Nipponbare) 의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 50] 도 50 은 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 51] 도 51 은 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 52] 도 52 는 벼 품종 니폰베어의 게놈 정보에서의 MiSeq 리드 (read) 패턴의 위치를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 53] 도 53 은 랜덤 프라이머와 벼 게놈 사이의 미스매치된 염기의 수의 도수 분포를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 54] 도 54 는 마커 N80521152 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 55] 도 55 는 PCR 마커 N80521152 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 56] 도 56 은 마커 N80997192 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 57] 도 57 은 PCR 마커 N80997192 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 58] 도 58 은 마커 N80533142 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다..
[도 59] 도 59 는 PCR 마커 N80533142 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 60] 도 60 은 마커 N91552391 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 61] 도 61 은 PCR 마커 N91552391 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 62] 도 62 는 마커 N91653962 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 63] 도 63 은 PCR 마커 N91653962 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 64] 도 64 는 마커 N91124801 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 65] 도 65 는 PCR 마커 N91124801 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 66] 도 66 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 67] 도 67 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 68] 도 68 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 69] 도 69 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 70] 도 70 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 11-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 71] 도 71 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 11-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 72] 도 72 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 73] 도 73 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 74] 도 74 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 14-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 75] 도 75 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 14-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 76] 도 76 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 16-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 77] 도 77 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 16-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 78] 도 78 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 18-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 79] 도 79 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 18-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 80] 도 80 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 81] 도 81 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 82] 도 82 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 0.6 내지 300 microM 의 농도로 8- 내지 35-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 재현성의 조사 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 83] 도 83 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 단일 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 84] 도 84 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 단일 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 85] 도 85 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 86] 도 86 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 87] 도 87 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 3 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 88] 도 88 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 3 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 89] 도 89 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 90] 도 90 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 91] 도 91 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 24 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 92] 도 92 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 24 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 93] 도 93 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 48 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 94] 도 94 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 48 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 95] 도 95 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 96] 도 96 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 97] 도 97 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 C 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 98] 도 98 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 C 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 99] 도 99 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 D 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 100] 도 100 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 D 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 101] 도 101 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 E 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 102] 도 102 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 E 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 103] 도 103 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 F 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 104] 도 104 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 F 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 105] 도 105 는 주형으로서 인간 게놈 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 A 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 106] 도 106 은 주형으로서 인간 게놈 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 A 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 107] 도 107 은 차세대 서열분석기에 적용된 DNA 라이브러리의 제조 방법을 모식적으로 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 108] 도 108 은 차세대 서열분석기에 적용된 DNA 라이브러리의 제조 방법을 모식적으로 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 109] 도 109 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 110] 도 110 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 111] 도 111 은 주형으로서 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 제조된 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 112] 도 112 는 주형으로서 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 제조된 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 113] 도 113 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 114] 도 114 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 115] 도 115 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 116] 도 116 은 주형으로서 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 제조된 벼 품종 니폰베어의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 117] 도 117 은 주형으로서 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 제조된 벼 품종 니폰베어의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 118] 도 118 은 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석을 통해 수득된 리드 패턴 수 및 랜덤 프라이머와 벼 품종 니폰베어의 참조 서열 사이의 일치 정도의 분포를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 119] 도 119 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 120-1] 도 120-1 은 대량의 리드 데이터가 맵핑되는 옥수수, 벼, 감자 및 대두의 특정 영역의 비교 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다 (영역_1_1_옥수수: SEQ ID NO: 2153, 영역_1_1_벼 (Oryza): SEQ ID NO: 2154, 영역_1_1_감자: SEQ ID NO: 2155, 영역_1_1_대두: SEQ ID NO: 2156, 영역_2_1_옥수수: SEQ ID NO: 2157, 영역_2_1_벼: SEQ ID NO: 2158, 영역_2_1_감자: SEQ ID NO: 2159, 및 영역_2_1_대두: SEQ ID NO: 2160).
[도 120-2] 도 120-2 는 대량의 리드 데이터가 맵핑되는 옥수수, 벼, 감자 및 대두의 특정 영역의 비교 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다 (영역_1_1_옥수수: SEQ ID NO: 2153, 영역_1_1_벼: SEQ ID NO: 2154, 영역_1_1_감자: SEQ ID NO: 2155, 영역_1_1_대두: SEQ ID NO: 2156, 영역_2_1_옥수수: SEQ ID NO: 2157, 영역_2_1_벼: SEQ ID NO: 2158, 영역_2_1_감자: SEQ ID NO: 2159, 및 영역_2_1_대두:SEQ ID NO: 2160).
[도 121] 도 121 은 대량의 리드 데이터가 맵핑되는 벼의 특정 영역의 비교 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다 (영역_3_1_벼: SEQ ID NO: 2161 및 영역_3_2_벼: SEQ ID NO: 2162).
[도 122] 도 122 는 랜덤 프라이머 세트 A ~ F 가 사용될 때 관찰된 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터의 비율의 비교를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 2] 도 2 는 주형으로서 일반적인 조건 하에 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하는 PCR 을 통해 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 3] 도 3 은 어닐링 온도 45℃ 에서 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 4] 도 4 는 어닐링 온도 40℃ 에서 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는특성도를 나타낸다.
[도 5] 도 5 는 어닐링 온도 37℃ 에서 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 6] 도 6 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2.5 유닛의 효소를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 7] 도 7 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12.5 유닛의 효소를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 8] 도 8 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 본래 수준으로부터 2 배인 농도로 MgCl2 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 9] 도 9 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 본래 수준으로부터 3 배인 농도로 MgCl2 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 10] 도 10 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 본래 수준으로부터 4 배인 농도로 MgCl2 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 11] 도 11 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 8-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 12] 도 12 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 13] 도 13 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 11-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 14] 도 14 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 15] 도 15 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 14-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 16] 도 16 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 16-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 17] 도 17 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 18-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 18] 도 18 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 19] 도 19 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 20] 도 20 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 4 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 21] 도 21 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 6 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 22] 도 22 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 6 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 23] 도 23 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 8 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 24] 도 24 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 8 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 25] 도 25 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 26] 도 26 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 27] 도 27 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 28] 도 28 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 29] 도 29 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 40 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 30] 도 30 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 40 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 31] 도 31 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 60 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 32] 도 32 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 60 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 33] 도 33 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 34] 도 34 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 35] 도 35 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 200 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 36] 도 36 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 200 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 37] 도 37 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 300 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 38] 도 38 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 300 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 39] 도 39 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 400 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 40] 도 40 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 400 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 41] 도 41 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 500 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 42] 도 42 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 500 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 43] 도 43 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 600 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 44] 도 44 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 700 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 45] 도 45 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 800 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 46] 도 46 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 900 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 47] 도 47 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 1000 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 48] 도 48 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 49] 도 49 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어 (Nipponbare) 의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 50] 도 50 은 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 51] 도 51 은 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 52] 도 52 는 벼 품종 니폰베어의 게놈 정보에서의 MiSeq 리드 (read) 패턴의 위치를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 53] 도 53 은 랜덤 프라이머와 벼 게놈 사이의 미스매치된 염기의 수의 도수 분포를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 54] 도 54 는 마커 N80521152 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 55] 도 55 는 PCR 마커 N80521152 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 56] 도 56 은 마커 N80997192 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 57] 도 57 은 PCR 마커 N80997192 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 58] 도 58 은 마커 N80533142 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다..
[도 59] 도 59 는 PCR 마커 N80533142 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 60] 도 60 은 마커 N91552391 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 61] 도 61 은 PCR 마커 N91552391 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 62] 도 62 는 마커 N91653962 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 63] 도 63 은 PCR 마커 N91653962 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 64] 도 64 는 마커 N91124801 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 리드 수를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 65] 도 65 는 PCR 마커 N91124801 에서 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9 및 이의 하이브리드 자손 계통의 전기영동 패턴을 설명하는 사진을 나타낸다.
[도 66] 도 66 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 67] 도 67 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 68] 도 68 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 69] 도 69 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 70] 도 70 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 11-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 71] 도 71 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 11-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 72] 도 72 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 73] 도 73 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 74] 도 74 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 14-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 75] 도 75 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 14-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 76] 도 76 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 16-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 77] 도 77 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 16-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 78] 도 78 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 18-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 79] 도 79 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 18-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 80] 도 80 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 81] 도 81 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 82] 도 82 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 0.6 내지 300 microM 의 농도로 8- 내지 35-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 재현성의 조사 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 83] 도 83 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 단일 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 84] 도 84 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 단일 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 85] 도 85 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 86] 도 86 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 2 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 87] 도 87 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 3 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 88] 도 88 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 3 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 89] 도 89 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 90] 도 90 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 12 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 91] 도 91 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 24 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 92] 도 92 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 24 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 93] 도 93 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 48 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 94] 도 94 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 48 개 유형의 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 95] 도 95 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 96] 도 96 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 97] 도 97 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 C 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 98] 도 98 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 C 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 99] 도 99 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 D 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 100] 도 100 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 D 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 101] 도 101 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 E 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 102] 도 102 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 E 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 103] 도 103 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 F 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 104] 도 104 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 F 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 105] 도 105 는 주형으로서 인간 게놈 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 A 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 106] 도 106 은 주형으로서 인간 게놈 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 A 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 107] 도 107 은 차세대 서열분석기에 적용된 DNA 라이브러리의 제조 방법을 모식적으로 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 108] 도 108 은 차세대 서열분석기에 적용된 DNA 라이브러리의 제조 방법을 모식적으로 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 109] 도 109 는 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 110] 도 110 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 111] 도 111 은 주형으로서 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 제조된 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 112] 도 112 는 주형으로서 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 제조된 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 113] 도 113 은 주형으로서 사탕수수 품종 NiF8 의 DNA 및 10-염기 랜덤 프라이머 G 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 114] 도 114 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 115] 도 115 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 116] 도 116 은 주형으로서 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 제조된 벼 품종 니폰베어의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (1 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 117] 도 117 은 주형으로서 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 제조된 벼 품종 니폰베어의 DNA 라이브러리 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 전기영동 패턴 (2 회째에 나타남) 을 기반으로 하여, 증폭된 단편 길이가 결정되는, 증폭된 단편 길이와 형광 유닛 (FU) 사이의 상관관계를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 118] 도 118 은 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석을 통해 수득된 리드 패턴 수 및 랜덤 프라이머와 벼 품종 니폰베어의 참조 서열 사이의 일치 정도의 분포를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 119] 도 119 는 주형으로서 벼 품종 니폰베어의 DNA 및 12-염기 랜덤 프라이머 B 를 사용하여 증폭된 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다.
[도 120-1] 도 120-1 은 대량의 리드 데이터가 맵핑되는 옥수수, 벼, 감자 및 대두의 특정 영역의 비교 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다 (영역_1_1_옥수수: SEQ ID NO: 2153, 영역_1_1_벼 (Oryza): SEQ ID NO: 2154, 영역_1_1_감자: SEQ ID NO: 2155, 영역_1_1_대두: SEQ ID NO: 2156, 영역_2_1_옥수수: SEQ ID NO: 2157, 영역_2_1_벼: SEQ ID NO: 2158, 영역_2_1_감자: SEQ ID NO: 2159, 및 영역_2_1_대두: SEQ ID NO: 2160).
[도 120-2] 도 120-2 는 대량의 리드 데이터가 맵핑되는 옥수수, 벼, 감자 및 대두의 특정 영역의 비교 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다 (영역_1_1_옥수수: SEQ ID NO: 2153, 영역_1_1_벼: SEQ ID NO: 2154, 영역_1_1_감자: SEQ ID NO: 2155, 영역_1_1_대두: SEQ ID NO: 2156, 영역_2_1_옥수수: SEQ ID NO: 2157, 영역_2_1_벼: SEQ ID NO: 2158, 영역_2_1_감자: SEQ ID NO: 2159, 및 영역_2_1_대두:SEQ ID NO: 2160).
[도 121] 도 121 은 대량의 리드 데이터가 맵핑되는 벼의 특정 영역의 비교 결과를 설명하는 특성도를 나타낸다 (영역_3_1_벼: SEQ ID NO: 2161 및 영역_3_2_벼: SEQ ID NO: 2162).
[도 122] 도 122 는 랜덤 프라이머 세트 A ~ F 가 사용될 때 관찰된 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터의 비율의 비교를 설명하는 특성도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법에 따르면, 하기 기재하는 프라이머에 함유된 랜덤 프라이머 (이하, "랜덤 프라이머 세트" 로서 지칭) 를 고농도로 함유하도록 제조되는 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실행하고, 그 결과로 증폭된 핵산 단편의 DNA 라이브러리를 제조한다. 반응액이 고농도로 랜덤 프라이머를 함유하는 경우, 이러한 농도는 일반적인 핵산 증폭 반응에서 사용되는 프라이머의 농도보다 더 높다. 본 발명의 DNA 라이브러리 제조 방법에 따르면, 특히, 일반적인 핵산 증폭 반응에서 사용되는 프라이머의 농도보다 더 높은 농도로 랜덤 프라이머가 사용된다. 반응액에 함유되는 주형으로서, DNA 라이브러리가 그에 대해 제조되는 표적 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 를 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법에서, 표적 유기체 종은 특별하게 제한되지 않는다. 표적의 특정예는 엽록체 게놈을 포함하는 유기체, 예컨대 식물 및 조류를 포함한다. 본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법에 따르면, 특히, 상기 언급된 바와 같은 엽록체 게놈을 포함하는 유기체, 예컨대 식물 및 조류로부터 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법은 하기 상세히 기재되는 랜덤 프라이머 세트를 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 엽록체 게놈에서 유래하는 핵산 단편의 증폭을 상당한 정도로 억제할 수 있다. 하기 상세히 기재되는 랜덤 프라이머 세트를 사용하여, 특히, 핵 게놈에서 유래하는 대량의 핵산 단편을 증폭할 수 있고, 주로 핵 게놈에 관한 DNA 라이브러리를 구축할 수 있다.
DNA 라이브러리의 제조 방법에 따르면, 랜덤 프라이머의 농도를 하기 기재되는 바와 같이 규정할 수 있다. 따라서, 높은 재현성으로 핵산 단편 (핵산 단편군) 을 증폭할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "재현성" 은, 동일한 주형 및 동일한 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 실행된 복수의 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 핵산 단편 중에서의 일치 정도를 의미한다. 즉, 용어 "높은 재현성 (또는 표현 "재현성이 높다")" 은, 동일한 주형 및 동일한 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 실행된 복수의 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 핵산 단편 중에서의 높은 일치 정도를 의미한다.
재현성 정도는, 예를 들어 동일한 주형 및 동일한 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 복수의 핵산 증폭 반응을 실시하고, 수득된 증폭 단편을 전기영동 처리하고, 수득된 형광 유닛 (FU) 에 대한 스피어맨의 순위 상관 계수 (Spearman's rank correlation coefficient) 를 계산하고, 이러한 계수를 기반으로 하여 재현성 정도를 평가함으로써, 평가할 수 있다. 스피어맨의 순위 상관 계수는 일반적으로 기호 ρ (rho) 로 표시된다. 예를 들어, ρ (rho) 가 0.9 초과인 경우, 대상 증폭 반응의 재현성은 충분한 것으로 평가할 수 있다.
-랜덤 프라이머-
일반적으로 핵산 증폭 반응을 통해 특정 앰플리콘을 수득하기 위해서, 대상 앰플리콘에 따라 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 설계한다. 예를 들어, 게놈 DNA 와 같은 주형 DNA 에서의 앰플리콘에 상응하는 위치를 끼워넣도록 한 쌍의 프라이머를 설계한다. 이러한 경우, 프라이머는 주형에서의 특정 영역에 하이브리드화하도록 설계된다. 따라서, 이러한 프라이머를 "특이적 프라이머" 로서 지칭할 수 있다.
특정 앰플리콘을 수득하기 위해 설계되는 프라이머와는 달리, 반대로, 랜덤 프라이머는 주형 DNA 에서의 특정 영역에 하이브리드화하도록 설계되는 것이 아니라, 랜덤 앰플리콘을 수득하기 위해 설계된다.
본 발명의 랜덤 프라이머 세트는, 랜덤 프라이머로서, 3' 말단에서 2 개 염기가 TG 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNN (SEQ ID NO: 2060, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 로 표시되는 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 3 개 염기가 TGC 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNNN (SEQ ID NO: 2061, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 으로 표시되는 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다시 말해서, 본 발명의 랜덤 프라이머 세트는, 랜덤 프라이머로서, TAAGAGACAGTG (SEQ ID NO: 2063) 및 TAAGAGACAGTGC (SEQ ID NO: 2064) 를 제외하고, 이 뉴클레오티드 서열로부터 5' 말단에서 TAAGAGACAG (SEQ ID NO: 2062) 및 3' 말단에서 2 또는 3 개의 임의의 염기를 각각 포함하는 올리고뉴클레오티드 군 중에서 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
하기 표 1 에서 나타낸 바와 같이, 3' 말단에서 2 개 염기가 TG 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNN (SEQ ID NO: 2060, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 로 표시되는 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드는, SEQ ID NO: 2065 ~ 2079 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[표 1]
3' 말단에서 3 개 염기가 TGC 인 올리고뉴클레오티드를 제외하고 TAAGAGACAGNNN (SEQ ID NO: 2061, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드는, 하기 표 2 에서 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 2080 ~ 2142 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
[표 2]
상기 기재된 바와 같이, 랜덤 프라이머는 총 78 개 유형의 올리고뉴클레오티드; 즉, 표 1 에서 나타낸 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드 및 표 2 에서 나타낸 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 임의로 선택될 수 있다. 본 발명의 랜덤 프라이머 세트에 포함된 랜덤 프라이머는 78 개 유형의 올리고뉴클레오티드의 모두, 또는 78 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 단일 유형의 올리고뉴클레오티드, 5 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 10 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 20 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 40 개 유형의 올리고뉴클레오티드 또는 60 개 유형의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 임의의 올리고뉴클레오티드는 특별한 제한없이 이러한 78 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 랜덤 프라이머 세트는 랜덤 프라이머로서 표 1 에서 나타낸 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 랜덤 프라이머로서 표 1 에서 나타낸 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 1 내지 14 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 예컨대 5 개 유형의 올리고뉴클레오티드 또는 10 개 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
랜덤 프라이머가 표 1 에서 나타낸 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 경우, TAAGAGACAGGG (SEQ ID NO: 2079), TAAGAGACAGGT (SEQ ID NO: 2077), TAAGAGACAGAT (SEQ ID NO: 2066) 및 TAAGAGACAGCC (SEQ ID NO: 2074) 중에서의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 제외하고 선택하는 것이 특히 바람직하다. 다시 말해서, 랜덤 프라이머가 표 1 에서 나타낸 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 경우, 4 개 유형의 올리고뉴클레오티드; 즉, TAAGAGACAGGG (SEQ ID NO: 2079), TAAGAGACAGGT (SEQ ID NO: 2077), TAAGAGACAGAT (SEQ ID NO: 2066) 및 TAAGAGACAGCC (SEQ ID NO: 2074) 중에서의 모든, 3 개 유형, 2 개 유형 또는 단일 유형의 올리고뉴클레오티드(들) 를 제외하고 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명의 랜덤 프라이머 세트는 랜덤 프라이머로서 표 2 에 나타낸 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 랜덤 프라이머로서 표 2 에서 나타낸 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 1 내지 62 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 예컨대 10 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 20 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 40 개 유형의 올리고뉴클레오티드 또는 60 개 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
랜덤 프라이머가 표 2 에서 나타낸 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 경우, 특히, TAAGAGACAGGGA (SEQ ID NO: 2120), TAAGAGACAGGGG (SEQ ID NO: 2122), TAAGAGACAGGTG (SEQ ID NO: 2126), TAAGAGACAGGTA (SEQ ID NO: 2124), TAAGAGACAGATA (SEQ ID NO: 2092) 및 TAAGAGACAGCCA (SEQ ID NO: 2100) 중에서의 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 제외하고 선택하는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 랜덤 프라이머가 표 2 에서 나타낸 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드에서 선택되는 경우, 6 개 유형의 올리고뉴클레오티드; 즉, TAAGAGACAGGGA (SEQ ID NO: 2120), TAAGAGACAGGGG (SEQ ID NO: 2122), TAAGAGACAGGTG (SEQ ID NO: 2126), TAAGAGACAGGTA (SEQ ID NO: 2124), TAAGAGACAGATA (SEQ ID NO: 2092) 및 TAAGAGACAGCCA (SEQ ID NO: 2100) 중에서의 모든, 5 개 유형, 4 개 유형, 3 개 유형, 2 개 유형 또는 단일 유형의 올리고뉴클레오티드(들) 를 제외하고 선택하는 것이 바람직하다.
상기 기재된 총 78 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 공통되는 5' 말단에서의 TAAGAGACAG (SEQ ID NO: 2062) 는 차세대 서열분석기에 적용된 어댑터 서열로서 사용된다.
-핵산 증폭 반응-
본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법에 따르면, 상기 기재된 랜덤 프라이머 및 주형으로서 게놈 DNA 를 시용하여 실행된 핵산 증폭 반응을 통해 다수의 증폭된 단편이 수득된다. 특히 핵산 증폭 반응시에, 반응액 중의 랜덤 프라이머의 농도를 종래의 핵산 증폭 반응에서의 프라이머 농도보다 더 높게 규정한다. 따라서, 높은 재현성을 달성하면서, 주형으로서 게놈 DNA 를 사용하여 다수의 증폭된 단편을 수득할 수 있다. 따라서, 다수의 증폭된 단편은 유전자형 판정 또는 다른 목적에 적용가능한 DNA 라이브러리로서 사용할 수 있다.
본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법은, 상기 기재된 랜덤 프라이머 세트의 사용을 포함한다. 따라서, 게놈 DNA (특히, 엽록체 게놈에서 유래하는 핵산 단편) 의 증폭을 상당한 정도로 억제할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법에 의하면 핵 게놈에서 유래하는 대량의 핵산 단편을 증폭할 수 있고, 주로 핵 게놈에 관한 DNA 라이브러리를 구축할 수 있다.
핵산 증폭 반응은, 소정의 열 사이클링 조건 하에 주형으로서 게놈 DNA, 랜덤 프라이머, DNA 폴리머라아제, 기질로서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (즉, dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 의 혼합물인 dNTP) 및 완충제를 함유하는 반응액에서 증폭된 단편을 합성하는 것을 목표로 한다. 소정 농도의 Mg2 + 를 함유하는 반응액에서 핵산 증폭 반응이 실행되는 것이 필요하다. 상기 기재된 조성의 반응액에서, 완충제는 MgCl2 를 함유한다. 완충제가 MgCl2 를 함유하지 않는 경우, 상기 기재된 조성의 반응액은 MgCl2 를 추가로 함유한다.
특히, 핵산 증폭 반응에서, 랜덤 프라이머의 농도는 랜덤 프라이머의 염기 길이에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 상이한 염기 수를 갖는 복수 유형의 뉴클레오티드 서열이 랜덤 프라이머로서 사용되는 경우, 랜덤 프라이머를 구성하는 염기 수는 이러한 복수의 뉴클레오티드 서열의 평균 (평균은 단순 평균이거나 염기량을 고려한 중량 평균일 수 있음) 일 수 있다.
구체적으로, 4 내지 200 microM, 바람직하게는 4 내지 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 핵산 증폭 반응을 실행한다. 이러한 조건 하에, 높은 재현성을 달성하면서, 핵산 증폭 반응을 통해, 다수의 증폭된 단편, 특히, 100 내지 500 개 염기를 포함하는 다수의 증폭된 단편을 수득할 수 있다.
보다 구체적으로, 랜덤 프라이머가 10 내지 14 개 염기를 포함하는 경우, 이러한 랜덤 프라이머의 농도가 부등식: y > 3E + 08x-6.974 에 의해 정의되는 조건을 충족하며, 100 microM 이하인 것이 바람직하다 (단, 랜덤 프라이머의 염기 길이는 "y" 로 표시하고, 랜덤 프라이머의 농도는 "x" 로 표시함).
하기 실시예에서 기재된 바와 같이, 부등식: y > 3E + 08x-6.974 는, 랜덤 프라이머 길이와 랜덤 프라이머 농도 사이의 상관관계를 상세하게 조사한 결과로서, 100 내지 500 개 염기를 포함하는 다수의 DNA 단편이 높은 재현성으로 증폭될 수 있는 랜덤 프라이머의 농도를 나타낼 수 있도록 개발된다.
핵산 증폭 반응에서 주형으로서 역할하는 게놈 DNA 의 양은 특별히 제한되지 않지만, 반응액의 양이 50 ㎕ 일 때 이는 바람직하게는 0.1 내지 1000 ng, 보다 바람직하게는 1 내지 500 ng, 더 바람직하게는 5 내지 200 ng, 가장 바람직하게는 10 내지 100 ng 이다. 주형으로서 게놈 DNA 의 양을 이러한 범위 내로 지정함으로써, 높은 재현성을 달성하면서, 랜덤 프라이머로부터의 증폭 반응이 억제되지 않고 다수의 증폭된 단편을 수득할 수 있다.
게놈 DNA 는 특별한 제한없이 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 또한 시판 키트를 사용하여, 표적 유기체 종으로부터 게놈 DNA 를 쉽게 제조할 수 있다. 종래 기술에 따라 또는 시판 키트를 사용하여 유기체로부터 추출된 게놈 DNA 가 추가 가공 없이 사용될 수 있고, 유기체로부터 추출된 다음 정제된 게놈 DNA 가 사용될 수 있거나, 제한 효소 처리나 초음파 처리한 게놈 DNA 가 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 DNA 라이브러리의 제조 방법에서, 추출된 게놈 DNA 로부터 엽록체 게놈을 제거하는 단계는 필요하지 않으며, 엽록체 게놈 및 핵 게놈을 포함하는 게놈 DNA 를 핵산 증폭 반응을 위한 주형으로서 사용할 수 있다. 이는 상기 기재된 랜덤 프라이머 세트를 사용하는 것이, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭을 상당한 정도로 억제할 수 있기 때문이다.
핵산 증폭 반응에서 DNA 폴리머라아제는 특별히 제한되지 않으며, 핵산 증폭 반응을 위한 열 사이클링 조건 하에 DNA 폴리머라아제 활성을 갖는 효소를 사용할 수 있다. 구체적으로, 일반적인 핵산 증폭 반응에 사용되는 열 안정성 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다. DNA 폴리머라아제의 예는 Taq DNA 폴리머라아제와 같은 호열성 박테리아-유래 DNA 폴리머라아제, 및 KOD DNA 폴리머라아제 및 Pfu DNA 폴리머라아제와 같은 초호열성 고세균-유래 DNA 폴리머라아제를 포함한다. 핵산 증폭 반응에서, 상기 기재된 랜덤 프라이머와 조합으로 DNA 폴리머라아제로서 Pfu DNA 폴리머라아제를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 DNA 폴리머라아제를 사용하여, 높은 재현성을 달성하면서 다수의 증폭된 단편을 더욱 확실하게 수득할 수 있다.
핵산 증폭 반응에서, 기질로서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (즉, dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 의 혼합물인 dNTP) 의 농도는 특별히 제한되지 않으며, 5 microM 내지 0.6 mM, 바람직하게는 10 microM 내지 0.4 mM, 보다 바람직하게는 20 microM 내지 0.2 mM 일 수 있다. 기질로서 역할하는 dNTP 의 농도를 이러한 범위 내로 지정함으로써, DNA 폴리머라아제에 의한 잘못된 혼입에 의해 초래된 에러를 방지할 수 있고, 높은 재현성을 달성하면서 다수의 증폭된 단편을 수득할 수 있다.
핵산 증폭 반응에서 사용되는 완충제는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 MgCl2, Tris-HCl(pH 8.3) 및 KCl 을 포함하는 용액을 사용할 수 있다. Mg2 + 의 농도는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 이는 0.1 내지 4.0 mM, 바람직하게는 0.2 내지 3.0 mM, 보다 바람직하게는 0.3 내지 2.0 mM, 더 바람직하게는 0.5 내지 1.5 mM 일 수 있다. 반응액 중의 Mg2 + 농도를 이러한 범위 내로 지정함으로써, 높은 재현성을 달성하면서 다수의 증폭된 단편을 수득할 수 있다.
핵산 증폭 반응의 열 사이클링 조건은 특별히 제한되지 않으며, 일반적인 열 사이클을 채용할 수 있다. 열 사이클의 구체예는, 주형으로서 게놈 DNA 를 단일 가닥으로 분리시키는 열 변성의 첫번째 단계, 열 변성, 어닐링 및 신장의 복수회 반복 (예를 들어, 20 내지 40 회) 을 포함하는 사이클, 필요에 따라 소정 시간 동안의 신장 단계, 및 저장의 마지막 단계를 포함한다.
열 변성은 예를 들어 93℃ 내지 99℃, 바람직하게는 95℃ 내지 98℃, 보다 바람직하게는 97℃ 내지 98℃ 에서 수행될 수 있다. 어닐링은 랜덤 프라이머의 Tm 값에 따라 가변적이지만, 예를 들어 30℃ 내지 70℃, 바람직하게는 35℃ 내지 68℃, 보다 바람직하게는 37℃ 내지 65℃ 에서 수행될 수 있다. 신장은 예를 들어 70℃ 내지 76℃, 바람직하게는 71℃ 내지 75℃, 보다 바람직하게는 72℃ 내지 74℃ 에서 수행될 수 있다. 저장은 예를 들어 4℃ 에서 수행될 수 있다.
열 변성의 첫번째 단계는 상기 기재된 온도 범위 내에서 예를 들어 5 초 내지 10 분, 바람직하게는 10 초 내지 5 분, 보다 바람직하게는 30 초 내지 2 분의 기간 동안 수행될 수 있다. "열 변성, 어닐링 및 신장" 을 포함하는 사이클에서, 열 변성은 상기 기재된 온도 범위 내에서 예를 들어 2 초 내지 5 분, 바람직하게는 5 초 내지 2 분, 보다 바람직하게는 10 초 내지 1 분의 기간 동안 수행될 수 있다. "열 변성, 어닐링 및 신장" 을 포함하는 사이클에서, 어닐링은 상기 기재된 온도 범위 내에서 예를 들어 1 초 내지 3 분, 바람직하게는 3 초 내지 2 분, 보다 바람직하게는 5 초 내지 1 분의 기간 동안 수행될 수 있다. "열 변성, 어닐링 및 신장" 을 포함하는 사이클에서, 신장은 상기 기재된 온도 범위 내에서 예를 들어 1 초 내지 3 분, 바람직하게는 3 초 내지 2 분, 보다 바람직하게는 5 초 내지 1 분의 기간 동안 수행될 수 있다.
DNA 라이브러리의 제조 방법에서, 증폭된 단편은 핫 스타트 (hot start) 법을 이용하는 핵산 증폭 반응에 의해 수득될 수 있다. 핫 스타트법은, "열 변성, 어닐링 및 신장" 을 포함하는 사이클 전에 미스-프라이밍 (mis-priming ) 또는 프라이머-이량체 형성에 의해 초래되는 비특이적 증폭을 방지하는 것으로 의도된다. 핫 스타트법은 항-DNA 폴리머라아제 항체를 그에 결합시키거나 이의 화학적 개질에 의해 DNA 폴리머라아제 활성을 억제시킨 효소의 사용을 포함한다. 따라서, DNA 폴리머라아제 활성이 억제되고 열 사이클 전의 비특이적인 반응이 방지될 수 있다. 핫 스타트법에 따르면, 첫번째 열 사이클에서 온도를 높게 설정하고, 그에 따라 DNA 폴리머라아제 활성이 회복되고, 후속 핵산 증폭 반응이 진행되게 된다.
상기 기재된 바와 같이, 반응액 중의 랜덤 프라이머 농도를 4 내지 200 microM 로 규정하면서 랜덤 프라이머 세트 및 주형으로서 게놈 DNA 를 사용하여 핵산 증폭 반응을 실시함으로써, 다수의 증폭된 단편 (주로 핵 게놈에서 유래함) 을 수득할 수 있다. 반응액 중의 랜덤 프라이머 농도를 4 내지 200 microM 로 규정함으로써 랜덤 프라이머 세트를 사용하여, 핵산 증폭 반응이 매우 높은 재현성으로 수행될 수 있다. 핵산 증폭 반응에 따르면, 특히, 매우 높은 재현성을 달성하면서 다수의 증폭된 단편 (주로 핵 게놈에서 유래함) 을 수득할 수 있다. 따라서, 이러한 다수의 증폭된 단편은 게놈 DNA (주로 핵 게놈) 를 표적화하는 유전자 분석에서 DNA 라이브러리에 사용될 수 있다.
랜덤 프라이머 세트를 사용하고 반응액 중의 이의 농도를 4 내지 200 microM 로 규정하여 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 특히 게놈 DNA (주로 핵 게놈) 를 주형으로서 사용하여 약 100 내지 500 개 염기를 포함하는 다수의 증폭된 단편을 수득할 수 있다. 약 100 내지 500 개 염기를 포함하는 이러한 다수의 증폭된 단편은 예를 들어 차세대 서열분석기를 사용하는 뉴클레오티드 서열의 대량 분석에 적합하고, 따라서 고도로 정밀한 서열 정보를 수득할 수 있다. 구체적으로, 주로 핵 게놈에서 유래하는 약 100 내지 500 개 염기를 포함하는 DNA 단편을 포함하는 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다.
랜덤 프라이머 세트를 사용하고 반응액 중의 이의 농도를 4 내지 200 microM 로 규정하여 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 특히 전체 게놈 DNA (주로 핵 게놈) 를 균일하게 증폭할 수 있다. 다시 말해서, 이러한 랜덤 프라이머를 사용하는 핵산 증폭 반응에 의해 게놈 DNA 의 특정 영역으로부터 증폭된 DNA 단편이 수득되는 것이 아니라, 증폭된 단편이 전체 핵 게놈으로부터 수득된다. 구체적으로, DNA 라이브러리는 전체 핵 게놈에 걸쳐 균일하게 제조될 수 있다.
상기 기재된 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행한 후, 증폭된 단편을 제한 효소 처리, 크기 선택, 서열 캡처 또는 기타 처리에 적용시킬 수 있다. 따라서, 생성된 증폭 단편 중에서 특정 증폭 단편 (즉, 특정 제한 효소 위치를 갖는 단편, 특정 크기의 증폭된 단편, 또는 특정 서열을 포함하는 증폭된 단편) 을 수득할 수 있다. 이러한 다양한 유형의 처리 결과로서 수득된 특정 증폭 단편을 DNA 라이브러리로서 사용할 수 있다.
-게놈 DNA 분석 방법-
상기 기재된 방식으로 제조된 DNA 라이브러리를 사용하여, 유전자형 분석과 같은 게놈 DNA 분석을 수행할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, DNA 라이브러리는 매우 높은 재현성을 갖고, 차세대 서열분석기에 적합한 크기를 가지며, 전체 게놈에 걸쳐 균일하다. 따라서, DNA 라이브러리는 DNA 마커 (이는 또한 유전 마커 또는 유전자 마커로 지칭됨) 로서 사용할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "DNA 마커" 는 넓은 의미로, 게놈 DNA 에 존재하는 특징적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. DNA 마커는 유전적 형질과 관련된 마커로서 역할하는 게놈에서의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. DNA 마커는, 예를 들어 유전자형 식별, 연쇄 맵, 유전자 맵핑, 또는 마커를 사용하는 선택 단계를 포함하는 브리딩, 마커를 사용하는 역교배 (back crossing), 양적 형질 유전자좌 맵핑, 집단내 표현형별 다형성분석 (bulked segregant analysis), 품종 식별, 또는 불연속 불균형 맵핑 (discontinuous imbalance mapping) 에 사용할 수 있다.
예를 들어, 차세대 서열분석기 등을 사용하여, 상기 기재된 방식으로 제조된 DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있고, 결정된 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하여 DNA 마커의 존재 여부를 확인할 수 있다.
예를 들어, 뉴클레오티드 서열의 리드 수를 기반으로 하여 DNA 마커의 존재 여부를 확인할 수 있다. 차세대 서열분석기는 특별히 제한되지 않지만, 이러한 서열분석기는 제 2 세대 서열분석기로도 지칭되며, 이러한 서열분석기는 수천만의 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 동시에 결정할 수 있는 뉴클레오티드 서열분석용 장치이다. 차세대 서열분석기의 서열분석 원리는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 서열분석은 브릿지 PCR 및 합성에 의한 서열분석 (sequencing-by-synthesis) 을 통해 합성을 실시하면서 플로우 셀 상에서 표적 DNA 를 증폭시키고 서열분석을 실행하는 방법에 따라, 또는 에멀션 PCR 및 DNA 합성시에 방출되는 피로인산의 양을 검정함으로써 서열분석을 실행하는 파이로서열분석 (pyrosequencing) 에 따라 실행될 수 있다. 차세대 서열분석기의 보다 구체예는 MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, 및 HiSeq X Series (Illumina) 및 Roche 454 GS FLX 서열분석기 (Roche) 를 포함한다.
대안적으로, 상기 기재된 방식으로 제조된 DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열을 참조 뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 DNA 마커의 존재 여부를 조사할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "참조 뉴클레오티드 서열" 은 기준으로서 역할하는 공지된 서열을 의미한다. 예를 들어, 이는 데이터베이스에 저장된 공지된 서열일 수 있다. 구체적으로, 특정 유기체에 관하여 상기 기재된 방식으로 DNA 라이브러리를 제조하고, 이의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열을 참조 뉴클레오티드 서열과 비교한다. 참조 뉴클레오티드 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열을 특정 유기체에 관한 DNA 마커 (즉, 게놈 DNA 에 존재하는 특징적인 뉴클레오티드 서열) 로서 지정할 수 있다. 식별된 DNA 마커는 종래의 기술에 따라 추가 분석함으로써 유전적 형질 (표현형) 에 있어서의 관련성을 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 기재된 방식으로 식별된 DNA 마커 중에서, 표현형과 관련된 DNA 마커 ("선택 마커"로서 가끔 지칭됨) 를 식별할 수 있다.
대안적으로, 상기 기재된 방식으로 제조된 DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열을 또 다른 유기체 유래의 게놈 DNA 또는 또 다른 조직 유래의 게놈 DNA 를 사용하여 제조된 DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열과 비교함으로써, DNA 마커의 존재 여부를 조사할 수 있다. 구체적으로, 둘 이상의 유기체 또는 2 개의 상이한 조직의 DNA 라이브러리를 상기 기재된 방식으로 제조하고, 뉴클레오티드 서열을 결정하고, DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열을 또 다른 DNA 라이브러리의 뉴클레오티드 서열과 비교한다. DNA 라이브러리 사이에 상이한 뉴클레오티드 서열을, 조사한 유기체 또는 조직에 관련된 DNA 마커 (즉, 게놈 DNA 에 존재하는 특징적인 뉴클레오티드 서열) 로서 지정할 수 있다. 식별된 DNA 마커는 종래의 기술에 따라 추가 분석함으로써 유전적 형질 (표현형) 에 있어서의 관련성을 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 기재된 방식으로 식별된 DNA 마커 중에서, 표현형과 관련된 DNA 마커 ("선택 마커"로서 가끔 지칭됨) 를 식별할 수 있다.
결정된 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하여 대상 DNA 마커를 특이적으로 증폭하는 한 쌍의 프라이머를 설계할 수 있다. 설계한 한 쌍의 프라이머를 사용하여, 주형으로서 표적 유기체로부터 추출한 게놈 DNA 를 사용하여 핵산 증폭 반응을 실행할 수 있다. 따라서, 추출한 게놈 DNA 에서의 DNA 마커의 존재 여부를 확인할 수 있다.
대안적으로, 상기 기재된 방식으로 제조된 DNA 라이브러리는 미생물의 다양성 조사를 목표로 하는 메타게놈 분석, 종양 조직의 체세포 게놈 변이 분석, 마이크로어레이를 사용하는 유전자형 분석, 배수성 평가, 염색체 수의 계산, 염색체의 증감 분석, 염색체 부분적 삽입, 결실, 복제 및 전좌의 분석, 외래 게놈의 혼입 분석, 부모 진단, 또는 교배 종자의 순도 분석에 사용할 수 있다.
-차세대 서열분석 기술에 대한 적용-
상기 기재된 바와 같이, 반응액 중의 랜덤 프라이머를 고농도로 조정하면서 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 핵산 증폭 반응을 실행한다. 따라서, 높은 재현성으로, 주형으로서 게놈 DNA 를 사용하여 다수의 증폭 단편을 수득할 수 있다. 증폭된 단편이 양 말단에 랜덤 프라이머와 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지므로, 이러한 뉴클레오티드 서열을 사용하여 쉽게 차세대 서열분석을 실행할 수 있다.
구체적으로는, 게놈 DNA 및 고농도의 랜덤 프라이머를 함유하는 반응액 (제 1 반응액) 에서 핵산 증폭 반응을 먼저 실행하고, 주형으로서 게놈 DNA 를 사용하여 핵산 증폭 반응에 의해 다수의 증폭된 단편 (제 1 DNA 단편) 을 수득한다. 이후, 다수의 증폭된 단편 (제 1 DNA 단편) 및 랜덤 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하여 설계한 프라이머 ("차세대 서열분석기용 프라이머" 로서 지칭함) 를 함유하는 반응액 (제 2 반응액) 에서 핵산 증폭 반응을 실행한다. 차세대 서열분석기용 프라이머는 뉴클레오티드 서열 결정에 사용되는 영역을 함유하는 염기이다. 보다 구체적으로는, 차세대 서열분석기용 프라이머의 3' 말단에서의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 제 1 DNA 단편의 5' 말단에서의 뉴클레오티드 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 100% 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열일 수 있는데, 이는 차세대 서열분석기를 사용하는 뉴클레오티드 서열 결정 (서열분석) 에 필요한 영역을 포함한다.
차세대 서열분석기용 프라이머에 포함되는 "뉴클레오티드 서열 결정에 사용되는 영역" 은, 차세대 서열분석기의 유형에 따라 상이하므로, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 차세대 서열분석기가 서열분석용 프라이머를 사용하여 뉴클레오티드 서열 결정을 실행하는 경우, 서열분석용 프라이머의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다. 차세대 서열분석기가 특정 DNA 가 결합한 캡처 비즈를 사용하여 뉴클레오티드 서열 결정을 실행하는 경우, "뉴클레오티드 서열 결정에 사용되는 영역" 은, 캡처 비즈에 결합한 DNA 의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 차세대 서열분석기가 말단에 헤어핀 루프를 포함하는 DNA 가닥이 나노 크기 기공을 포함하는 단백질을 통과할 때의 전류 변화를 기반으로 하여 서열을 판독하는 경우, "뉴클레오티드 서열 결정에 사용되는 영역" 은, 헤어핀 루프를 형성하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
차세대 서열분석기용 프라이머의 3' 말단에서의 뉴클레오티드 서열을 상기 기재된 바와 같이 설계함으로써, 차세대 서열분석기용 프라이머는 제 1 DNA 단편의 3' 말단에 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있고, 주형으로서 제 1 DNA 단편을 사용하여 제 2 DNA 단편을 증폭할 수 있다. 엄격한 조건 하란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되지만 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 엄격한 조건은 예를 들어 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) 을 참조로 하여 적절히 결정할 수 있다. 구체적으로는, 서던 하이브리드화 시의 반응액의 염 농도 및 온도 면에 있어서 엄격도를 결정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 서던 하이브리드화에서의 세척 단계에서 반응액의 염 농도 및 온도 면에서 결정할 수 있다. 더 구체적으로는, 엄격한 조건 하는, 나트륨 농도가 25 내지 500 mM, 바람직하게는 25 내지 300 mM 이고, 온도가 42℃ 내지 68℃, 바람직하게는 42℃ 내지 65℃ 이다. 보다 더 구체적으로는, 42℃ 에서 5 X SSC (83 mM NaCl, 83 mM 나트륨 시트레이트) 의 존재 하에 하이브리드화를 실행한다.
특히, 상기 기재된 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 제 1 DNA 단편을 수득하는 경우, 모든 랜덤 프라이머에 상응하는 차세대 서열분석기용 프라이머를 제조할 수 있거나, 일부 랜덤 프라이머에 상응하는 차세대 서열분석기용 프라이머를 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 랜덤 프라이머 세트가 복수 유형의 랜덤 프라이머를 포함하는 경우, 이러한 프라이머는 3' 말단에서 여러 (예를 들어 1 내지 3 개) 염기를 제외하고는, 그 중에서 공통되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 다수의 제 1 DNA 단편의 5' 말단은 모두 동일한 서열의 것이다. 차세대 서열분석기용 프라이머의 3' 말단에서의 뉴클레오티드 서열을, 제 1 DNA 단편의 5' 말단에서 공통되는 뉴클레오티드 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100% 동일성을 나타내도록 설계한다. 이러한 방식으로 차세대 서열분석기용 프라이머를 설계함으로써, 생성된 차세대 서열분석기용 프라이머는 모든 랜덤 프라이머에 상응한다. 생성된 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여, 모든 제 1 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 제 2 DNA 단편을 증폭할 수 있다.
또한, 본 발명의 랜덤 프라이머 세트는 복수의 랜덤 프라이머의 3' 말단에서 2 또는 3 개 염기 외에 공통되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다수의 제 1 DNA 단편 중 일부를 주형으로서 사용하여 제 2 DNA 단편을 수득할 수 있다. 구체적으로는, 차세대 서열분석기용 프라이머의 3' 말단에서의 뉴클레오티드 서열을 제 1 DNA 단편의 5' 말단에서의 공통되는 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접하는 1 내지 3 개 염기의 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 100% 동일성을 나타내도록 설계하여, 일부 제 1 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 제 2 DNA 단편을 증폭할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭된 제 2 DNA 단편은 차세대 서열분석기용 프라이머에 포함된 차세대 서열분석기를 사용하는 뉴클레오티드 서열 결정 (서열분석) 에 필요한 영역을 갖는다. 서열분석에 필요한 영역은, 차세대 서열분석기에 따라 가변적이므로 특별히 제한되지 않는다. 브릿지 PCR 및 합성에 의한 서열분석을 통해 플로우 셀 상에서 이러한 표적 DNA 를 증폭시키고 합성에 의해 서열분석을 실행하는 원리를 기반으로 하는 차세대 서열분석기를 사용하는 경우, 예를 들어, 차세대 서열분석기용 프라이머는 브릿지 PCR 에 필요한 영역 및 합성에 의한 서열분석에 필요한 영역을 포함하게 된다. 브릿지 PCR 에 필요한 영역은, 플로우 셀 상에 고정된 올리고뉴클레오티드에 하이브리드화하며, 차세대 서열분석기용 프라이머의 5' 말단을 포함하는 9 개 염기를 포함한다. 서열분석에 사용되는 프라이머는 합성에 의한 서열분석에 필요한 영역에 하이브리드화하며, 차세대 서열분석기용 프라이머의 중간에 위치한다.
차세대 서열분석기의 예는 Ion Torrent 서열분석기이다. Ion Torrent 서열분석기를 사용하는 경우, 차세대 서열분석기용 프라이머는 5' 말단에서 소위 이온 어댑터를 포함하며, 에멀션 PCR 을 실행하는 입자에 결합한다. Ion Torrent 서열분석기를 사용하여, 에멀션 PCR 을 통해 증폭한 주형으로 코팅된 입자를 이온 칩에 장착함으로써 서열분석을 수행한다.
차세대 서열분석기용 프라이머 및 제 1 DNA 를 함유하는 제 2 반응액을 사용하는 핵산 증폭 반응은 특별한 제한없이, 일반적인 조건 하에 실행할 수 있다. 구체적으로, 상기 섹션 [핵산 증폭 반응] 에서 기재된 조건을 채용할 수 있다. 예를 들어, 제 2 반응액은 주형으로서 제 1 DNA 단편, 상기 기재된 차세대 서열분석기용 프라이머, DNA 폴리머라아제, 기질로서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (즉, dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 의 혼합물인 dNTP) 및 완충제를 함유한다.
차세대 서열분석기용 프라이머의 농도는 0.01 내지 5.0 microM, 바람직하게는 0.1 내지 2.5 microM, 가장 바람직하게는 0.3 내지 0.7 microM 일 수 있다.
주형으로서 핵산 증폭 반에 사용되는 제 1 DNA 단편의 양은 특별히 제한되지 않는다. 반응액의 양이 50 ㎕ 인 경우, 이러한 양은 바람직하게는 0.1 내지 1000 ng, 보다 바람직하게는 1 내지 500 ng, 더 바람직하게는 5 내지 200 ng, 가장 바람직하게는 10 내지 100 ng 이다.
주형으로서의 제 1 DNA 단편의 제조 방법은 특별히 제한되지 않는다. 상기 기재된 랜덤 프라이머 세트를 사용하는 핵산 증폭 반응이 완료된 후 반응액을 그대로 사용할 수 있거나, 그 반응액으로부터 제 1 DNA 단편을 정제한 것을 사용할 수 있다.
섹션 [핵산 증폭 반응] 에서 기재된 바와 같은 핵산 증폭 반응에 사용하는 DNA 폴리머라아제의 종류, 기질로서 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (즉, dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 의 혼합물인 dNTP) 의 농도, 완충제 조성, 및 열 사이클링 조건을 채용할 수 있다. 또한, 차세대 서열분석기용 프라이머 사용을 포함하는 핵산 증폭 반응은 핫 스타트법에 의해 수행할 수 있거나, 핵산 증폭 반응에 의해 증폭된 단편을 수득할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 주형으로서 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 수득한 제 1 DNA 단편, 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭한 제 2 DNA 단편을 사용함로써, 차세대 서열분석기에 적용가능한 DNA 라이브러리를 편리한 방식으로 제조할 수 있다.
상기 기재된 예에서, 주형으로서 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 수득한 제 1 DNA 단편, 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 증폭한 제 2 DNA 단편을 사용함으로써 DNA 라이브러리를 제조하였다. 본 발명의 기술 범주가 이러한 예로 제한되지 않음에 유의해야 한다. 예를 들어, 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 수득한 제 1 DNA 단편을 주형으로서 사용하여 제 2 DNA 단편을 증폭하고, 주형으로서 제 2 DNA 단편 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 제 3 DNA 단편을 수득하고, 차세대 서열분석기를 사용하여 제 3 DNA 단편을 수득하고, 생성된 제 3 DNA 단편을 차세대 서열분석기에 적용가능한 DNA 라이브러리로서 지정할 수 있다.
차세대 서열분석기에 적용가능한 DNA 라이브러리는, 주형으로서 제 2 DNA 단편을 사용하여 핵산 증폭 반응을 수행하고, 주형으로서 생성된 DNA 단편을 사용하여 핵산 증폭 반응을 반복하고, 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 마지막 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제조할 수 있다. 이러한 경우, 핵산 증폭 반응의 반복 횟수는 특별히 제한되지 않으며, 핵산 증폭 반응은 2 내지 10 회, 바람직하게는 2 내지 5 회, 보다 바람직하게는 2 또는 3 회 반복된다.
상기 기재된 바와 같이, 고농도의 본 발명의 랜덤 프라이머 세트 및 주형으로서 게놈 DNA 를 사용하여 수행된 핵산 증폭 반응에 있어서, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭을 상당한 정도로 억제할 수 있다. 따라서, 상기 기재된 바와 같이 수득한 제 2 DNA 단편은 주로 핵 게놈에서 유래한다. 일반적으로, 엽록체 게놈의 카피 수는 세포 당 수십 내지 수백만큼 많으며, 대량의 특정 영역이 핵산 증폭 반응의 결과로서 증폭될 가능성이 높다. 상기 기재된 바와 같이 차세대 서열분석기 사용을 포함하는 분석에 따르면, 특정 앰플리콘이 대량으로 존재하면, 뉴클레오티드 서열 식별용 계산식 (즉, 매트릭스) 작성에 영향을 주며, 뉴클레오티드 서열 식별 정확도가 저하된다. 또한, 리드 데이터의 추천 용장성 (redundancy) 은 대략 수십이며, 대량의 중복 데이터가 데이터 로스를 초래한다. 또한, 분석한 뉴클레오티드 서열 데이터를 상기 기재된 게놈 분석 처리하는 경우, 엽록체 게놈의 리드 데이터는 불필요하다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 랜덤 프라이머 세트를 사용하여, 차세대 서열분석기 사용을 포함하는 분석에 있어서 엽록체 게놈에서 유래하는 앰플리콘의 양을 감소시킬 수 있다. 따라서, 핵 게놈은 우수한 정확도로 분석될 수 있다.
실시예
이하, 하기 실시예를 참조로 하여 본 발명을 더 상세히 설명하지만, 본 발명의 기술적 범주가 이러한 실시예로 제한되는 것은 아니다.
실시예
1
1. 흐름도
이 실시예에서, 도 1 에 나타낸 흐름도에 따라 주형으로서 각종 유형의 유기체 종으로부터 추출한 게놈 DNA 및 각종 랜덤 프라이머 세트를 사용하는 PCR 을 통해 DNA 라이브러리를 제조하였다. 또한 제조한 DNA 라이브러리를 사용하여, 소위 차세대 서열분석기를 사용하는 서열 분석을 수행하고, 리드 데이터를 기반으로 하여 유전자형을 분석하였다.
2. 재료
이 실시예에서, 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9, 이의 22 하이브리드 자손 계통, 및 벼 품종 니폰베어로부터, DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN) 를 사용하여 게놈 DNA 를 추출하고, 추출한 게놈 DNA 를 정제하였다. 정제한 게놈 DNA 를 각각 NiF8-유래 게놈 DNA, Ni9-유래 게놈 DNA, 22 하이브리드 사탕수수 자손-유래 게놈 DNA, 및 니폰베어-유래 게놈 DNA 로서 사용하였다. 이 실시예에서, 인간 게놈 DNA 는 TakaraBio 로부터 구입하고, 인간-유래 게놈 DNA 로서 사용하였다.
3. 방법
3.1 PCR 조건과 DNA 단편 크기 사이의 상관관계
3.1.1 랜덤 프라이머 설계
랜덤 프라이머를 설계하기 위해서, GC 함량을 20% 내지 70% 로 설정하고, 연속 염기 수를 5 이하로 조정하였다. 서열 길이를 16 개 수준으로 설정하였다 (즉, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 30 및 35 개 염기의 서열). 각 서열 길이에 대해, 96 개 유형의 뉴클레오티드 서열을 설계하고, 96 개의 랜덤 프라이머 세트를 제조하였다. 10-염기 프라이머에 관해서는, 각각 96 개 유형의 랜덤 프라이머를 포함하는 6 개의 랜덤 프라이머 세트를 설계하였다 (이들 6 세트를 각각 "10-염기 프라이머 A" ~ "10-염기 프라이머 F" 로서 지칭함). 이 실시예에서, 구체적으로, 21 개의 상이한 랜덤 프라이머 세트를 제조하였다.
표 3 내지 23 은 이러한 21 개의 상이한 랜덤 프라이머 세트에 함유된 랜덤 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[표 3-1]
[표 3-2]
[표 4-1]
[표 4-2]
[표 5-1]
[표 5-2]
[표 6-1]
[표 6-2]
[표 7-1]
[표 7-2]
[표 8-1]
[표 8-2]
[표 9-1]
[표 9-2]
[표 10-1]
[표 10-2]
[표 11-1]
[표 11-2]
[표 12-1]
[표 12-2]
[표 13-1]
[표 13-2]
[표 14-1]
[표 14-2]
[표 15-1]
[표 15-2]
[표 16-1]
[표 16-2]
[표 17-1]
[표 17-2]
[표 17-3]
[표 18-1]
[표 18-2]
[표 18-3]
[표 19-1]
[표 19-2]
[표 19-3]
[표 20-1]
[표 20-2]
[표 20-3]
[표 21-1]
[표 21-2]
[표 21-3]
[표 22-1]
[표 22-2]
[표 22-3]
[표 23-1]
[표 23-2]
[표 23-3]
3.1.2 표준 PCR
상기 2. 에 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 0.6 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실시예에서, 상기 기재한 표준 PCR 을 포함하여, 랜덤 프라이머를 사용하는 PCR 을 통해 수득한 다수의 핵산 단편을, DNA 라이브러리로서 지칭한다.
3.1.3 DNA 라이브러리의 정제 및 전기영동
상기 3.1.2 에서 수득한 DNA 라이브러리를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) 를 사용하여 정제하고, Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) 를 사용하여 전기영동 처리하여, 형광 유닛 (FU) 을 수득하였다.
3.1.4 어닐링 온도 조사
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 0.6 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 각종 어닐링 온도 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실시예에서, 37℃, 40℃ 및 45℃ 의 어닐링 온도를 조사하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.1.5 효소량의 조사
상기 2. 에 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 0.6 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 2.5 유닛 또는 12.5 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.1.6 MgCl2 농도의 조사
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 0.6 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 소정 농도의 MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실시예에서, 통상의 수준보다 2 배 (2.0 mM), 3 배 (3.0 mM) 및 4 배 (4.0 mM) 초과인 MgCl2 농도를 각각 조사하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.1.7 랜덤 프라이머의 염기 길이 조사
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 0.6 microM), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실시예에서, 8-염기 랜덤 프라이머 (표 9), 9-염기 랜덤 프라이머 (표 10), 11-염기 랜덤 프라이머 (표 11), 12-염기 랜덤 프라이머 (표 12), 14-염기 랜덤 프라이머 (표 13), 16-염기 랜덤 프라이머 (표 14), 18-염기 랜덤 프라이머 (표 15) 및 20-염기 랜덤 프라이머 (표 16) 를 조사하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.1.8 랜덤 프라이머 농도 검사
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 소정 농도의 랜덤 프라이머 (10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실시예에서, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1000 microM 의 랜덤 프라이머 농도를 조사하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다. 이 실험에서, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
3.2 MiSeq 을 통한 재현성 검증
3.2.1 DNA 라이브러리의 제조
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 60 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.2.2 서열 라이브러리의 제조
3.2.1 에서 수득한 DNA 라이브러리로부터, KAPA Library Preparation Kit (Roche) 를 사용하여 MiSeq 분석용 서열 라이브러리를 제조하였다.
3.2.3 MiSeq 분석
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle (Illumina) 을 사용하여, 3.2.2 에서 수득한 MiSeq 분석용 서열 라이브러리를 100 염기 페어-엔드 (paired-end) 서열분석을 통해 분석하였다.
3.2.4 리드 데이터 분석
3.2.3 에서 수득한 리드 데이터로부터 랜덤 프라이머 서열 정보를 삭제하고, 리드 패턴을 식별하였다. 각각의 리드 패턴에 대해 리드 수를 카운트하고, 반복된 분석의 리드 수를 비교하고, 상관 계수를 사용하여 재현성을 평가하였다.
3.3 벼 품종 니폰베어의 분석
3.3.1 DNA 라이브러리의 제조
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, 니폰베어-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 60 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.3.2 서열 라이브러리 제조, MiSeq 분석, 및 리드 데이터 분석
니폰베어-유래 게놈 DNA 로부터 제조한 DNA 라이브러리를 사용한 서열 라이브러리의 제조, MiSeq 분석, 및 리드 데이터의 분석을 각각 3.2.2, 3.2.3 및 3.2.4 에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
3.3.3 게놈 균질성 평가
3.3.2 에서 수득한 리드 패턴을 bowde2 를 사용하여 니폰베어 (NC_008394 ~ NC_008405) 의 게놈 정보에 대해 맵핑하고, 리드 패턴의 게놈 위치를 식별하였다.
3.3.4 비특이적 증폭
3.3.3 에서 식별된 리드 패턴의 위치 정보를 기반으로 하여, 랜덤 프라이머의 서열을 이러한 랜덤 프라이머가 어닐링할 게놈 서열과 비교하고, 미스매치의 수를 결정하였다.
3.4 다형성의 검출 및 유전자형의 식별
3.4.1 DNA 라이브러리의 제조
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA, Ni9-유래 게놈 DNA, 하이브리드 자손-유래 게놈 DNA, 또는 니폰베어-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 60 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.4.2 HiSeq 분석
3.4.1 에서 제조된 DNA 라이브러리의 분석은 100 염기 페어-엔드 서열분석을 통해 레인 당 샘플 수가 16 인 조건 하에 TakaraBio 에 위탁하였고, 리드 데이터를 수득하였다.
3.4.3 리드 데이터 분석
3.4.2 에서 수득한 리드 데이터로부터 랜덤 프라이머 서열 정보를 삭제하고, 리드 패턴을 식별하였다. 각각의 리드 패턴에 대해 리드 수를 카운트하였다.
3.4.4 다형성의 검출 및 유전자형의 식별
3.4.3 에서 실시한 분석 결과로서 수득한 리드 패턴 및 리드 수를 기반으로 하여, NiF8 및 Ni9 에 특유한 다형성이 검출되었고, 이의 리드 패턴을 마커로서 지정하였다. 리드 수를 기반으로 하여, 22 하이브리드 자손 계통의 유전자형을 식별하였다. 유전자형 식별의 정확도는 22 하이브리드 자손 계통에 관한 반복된 데이터의 재현성을 기반으로 하여 평가하였다.
3.5 PCR 마커로의 확인을 위한 실험
3.5.1 프라이머 설계
페어-엔드 서열분석을 통해 수득한 마커 서열 정보를 기반으로 하여, 3.4.4 에서 식별된 마커 중 총 6 개 마커 (즉, 3 개의 NiF8 마커 및 3 개의 Ni9 마커) 에 대해 프라이머를 설계하였다 (표 24).
[표 24]
3.5.2 PCR 및 전기영동
TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2 (TAKARA) 및 주형으로서 상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (15 ng, NiF8-유래 게놈 DNA, Ni9-유래 게놈 DNA, 또는 하이브리드 자손-유래 게놈 DNA) 를 사용하고, 1.25 ㎕ 의 Multiplex PCR 효소 믹스, 12.5 ㎕ 의 2x Multiplex PCR 완충제, 및 3.5.1 에서 설계한 0.4 microM 프라이머를 첨가하여, 최종 반응 수준을 25 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 1 분 동안 94℃, 30 초 동안 94℃, 30 초 동안 60℃ 및 30 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 및 10 분 동안 72℃ 에서 유지, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 증폭한 DNA 단편은 TapeStation (Agilent Technologies) 을 사용하여 전기영동 처리하였다.
3.5.3 유전자형 데이터의 비교
3.5.2 에서 수득한 전기영동 결과를 기반으로 하여, 마커의 유전자형을 밴드의 유무를 기준으로 식별하고, 결과를 마커의 리드 수와 비교하였다.
3.6 랜덤 프라이머 농도와 길이 사이의 상관관계
3.6.1 고농도에서의 랜덤 프라이머 길이의 영향
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 소정 길이의 랜덤 프라이머 (최종 농도: 10 microM), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 이 실험에서, 9 개 염기 (표 10), 10 개 염기 (표 3, 10-염기 프라이머 A), 11 개 염기 (표 11), 12 개 염기 (표 12), 14 개 염기 (표 13), 16 개 염기 (표 14), 18 개 염기 (표 15) 및 20 개 염기 (표 16) 의 랜덤 프라이머 길이를 조사하였다. 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하는 반응 시스템에서, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 37℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 을 실행하였다. 10-염기 이상의 랜덤 프라이머를 사용하는 반응 시스템에서, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 을 실행하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.6.2 랜덤 프라이머 농도와 길이 사이의 상관관계
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 소정 길이의 랜덤 프라이머를 첨가하여 소정 농도가 되도록 첨가하고, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 이 실험에서, 표 3 ~ 23 에서 나타낸 8- 내지 35-염기 랜덤 프라이머를 조사하고, 및 0.6 내지 300 microM 의 랜덤 프라이머 농도를 조사하였다.
8-염기 및 9-염기 랜덤 프라이머를 사용하는 반응 시스템에서, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 37℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 을 실행하였다. 10-염기 이상의 랜덤 프라이머를 사용하는 반응 시스템에서, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 을 실행하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다. 또한, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
3.7 랜덤 프라이머 수
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 표 3 에서 나타낸 96 개 유형의 10-염기 랜덤 프라이머 (10-염기 프라이머 A) 에서 선택되는 1, 2, 3, 12, 24 또는 48 개 유형의 랜덤 프라이머를 60 microM 의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 이 실험에서, 1, 2, 3, 12, 24 또는 48 개 유형의 랜덤 프라이머로서, 랜덤 프라이머를 표 1 에서 나타낸 1 번에서 연속하여 선택한 다음, 선택한 프라이머를 조사하였다. 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 을 실행하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다. 또한, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
3.8 랜덤 프라이머 서열
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, NiF8-유래 게놈 DNA) 에, 표 4 ~ 8 에서 나타낸 5 개 랜덤 프라이머 세트에서 선택된 프라이머 세트를 60 microM 의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다. 또한, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
3.9 인간-유래 게놈 DNA 를 사용하는 DNA 라이브러리
상기 2. 에서 기재된 게놈 DNA (30 ng, 인간-유래 게놈 DNA) 에, 랜덤 프라이머 (최종 농도: 60 microM, 10-염기 프라이머 A), 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 및 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA) 를 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 이 실험에서 수득한 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다. 또한, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
4. 결과 및 조사
4.1 PCR 조건과 DNA 라이브러리 크기 사이의 상관관계
종래의 PCR 조건에 따라 랜덤 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시했을 때 (상기 기재된 3.1.2), 증폭된 DNA 라이브러리 크기는 2 kbp 이상으로 컸으나, 표적 크기의 DNA 라이브러리 (즉, 100 bp 내지 500 bp) 의 증폭은 관찰되지 않았다 (도 2). 100 bp 내지 500 bp 의 DNA 라이브러리가 수득될 수 없었던 것은, 랜덤 프라이머가 500 bp 이하의 영역에서 프라이머로서 기능하는 가능성이 낮기 때문이었다. 표적 크기 (즉, 100 bp 내지 500 bp) 의 DNA 라이브러리를 제조하기 위해서, 높은 재현성을 갖는 비특이적 증폭을 유도할 필요가 있다고 여겨졌다.
PCR 의 특이성에 영향을 줄 수 있는 조건, 즉 어닐링 온도 (상기 3.1.4), 효소량 (상기 3.1.5), MgCl2 농도 (상기 3.1.6), 프라이머 길이 (상기 3.1.7) 및 프라이머 농도 (상기 3.1.8) 와 DNA 라이브러리 크기 사이의 상관관계를 조사하였다.
도 3 은 어닐링 온도 45℃ 에서 얻은 상기 3.1.4 에 기재한 실험 결과를 나타내고, 도 4 는 어닐링 온도 40℃ 에서 얻은 결과를 나타내고, 도 5 는 어닐링 온도 37℃ 에서 얻은 결과를 나타낸다. 도 3 내지 5 에서 나타낸 바와 같이, 어닐링 온도를 45℃, 40℃, 37℃ 로 낮추면, 고분자량 DNA 라이브러리의 증폭량은 증가하지만, 저분자량 DNA 라이브러리의 증폭은 관찰되지 않았다.
도 6 은 효소량을 통상량의 2 배로 증가시켰을 때 얻은 3.1.5 에 기재한 실험 결과를 나타내고, 도 7 은 효소량을 통상량의 10 배로 증가시켰을 때 얻은 결과를 나타낸다. 도 6 및 도 7 에서 나타낸 바와 같이, 효소량을 통상량의 2 배 또는 10 배로 증가시키면, 고분자량 DNA 라이브러리의 증폭량은 증가하지만, 저분자량 DNA 라이브러리의 증폭은 관찰되지 않았다.
도 8 은 MgCl2 농도를 통상량의 2 배로 증가시켰을 때 얻은 3.1.6 에 기재한 실험 결과를 나타내고, 도 9 는 MgCl2 농도를 통상량의 3 배로 증가시켰을 때 얻은 결과를 나타내고, 도 10 은 MgCl2 농도를 통상량의 4 배로 증가시켰을 때 얻은 결과를 나타낸다. 도 8 내지 10 에서 나타낸 바와 같이, MgCl2 농도를 통상량의 2 배, 3 배 및 4 배로 증가시키면, 고분자량 DNA 라이브러리의 증폭량은 달라지지만, 저분자량 DNA 라이브러리의 증폭은 관찰되지 않았다.
도 11 내지 18 은 각각 8 개 염기, 9 개 염기, 11 개 염기, 12 개 염기, 14 개 염기, 16 개 염기, 18 개 염기 및 20 개 염기의 랜덤 프라이머 길이에서 얻은 3.1.7 에 기재한 실험 결과를 나타낸다. 도 11 내지 18 에서 나타낸 바와 같이, 랜덤 프라이머의 길이에 관계없이, 도 2 에 나타낸 결과 (10-염기 랜덤 프라이머) 와 비교하여 큰 변화는 관찰되지 않았다.
3.1.8 에 기재한 실험 결과를 표 25 에 요약한다.
[표 25]
도 19 내지 47 에서 나타낸 바와 같이, 10-염기 랜덤 프라이머를 사용하여, 6 microM 의 랜덤 프라이머 농도에서 1-kbp DNA 단편에서 증폭이 관찰되었다. 농도가 증가함에 따라 DNA 단편의 분자량이 감소한다. 6 내지 500 microM 의 랜덤 프라이머 농도에서 재현성을 조사하였다. 그 결과, 통상 수준보다 10 배 더 높은 6 microM 의 농도에서 0.889 의 상대적으로 낮은 rho 값을 얻었다. 통상 수준보다 13.3 배 더 높은 8 microM 이상의 농도에서, 및 통상 수준보다 833.3 배 더 높은 500 microM 의 농도에서, 0.9 이상의 높은 rho 값을 얻었다. 이 결과는, 일반적인 PCR 조건 하에 이용한 농도보다 상당히 더 높은 수준으로 랜덤 프라이머 농도를 상승시킴으로써, 높은 재현성을 달성하면서 1 kbp 이하의 DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 입증한다. 랜덤 프라이머 농도가 500 microM 를 지나치게 초과하는 경우, 원하는 크기의 DNA 단편의 증폭을 관찰할 수 없다. 따라서, 우수한 재현성으로 저분자량 DNA 단편을 증폭하기 위해서, 랜덤 프라이머 농도가 일반적인 PCR 절차에서 이용한 농도보다 높고 소정 수준 이하인 최적 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 발견되었다.
4.2 MiSeq 을 통한 재현성 확인
상기 3.2 에서 기재한 바와 같이, DNA 라이브러리 제조의 재현성을 확인하기 위해서, 주형으로서 NiF8 에서 추출한 게놈 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 증폭한 DNA 라이브러리를 차세대 서열분석기 (MiSeq) 를 사용하여 분석하고, 결과를 도 48 에 나타낸다. 상기 3.2.4 의 결과로서, 47,484 개의 리드 패턴을 수득하였다. 반복된 측정을 통해 수득한 리드 수를 비교한 결과, 전기영동 결과에서와 같이, 높은 상관관계 (즉, 0.991 의 상관 계수 "r") 를 수득하였다. 따라서, 랜덤 프라이머를 사용하여 만족스러운 재현성으로 DNA 라이브러리를 제조할 수 있다고 여겨졌다.
4.3 벼 품종 니폰베어의 분석
상기 3.3 에서 기재한 바와 같이, 주형으로서 게놈 정보가 개시되어 있는 벼 품종 니폰베어에서 추출한 게놈 DNA, 및 랜덤 프라이머를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하고, 전기영동 처리하고, 결과를 도 49 및 50 에 나타낸다. 도 49 및 50 에서 나타낸 결과를 기반으로 하여, rho 값은 0.979 로 높은 것으로 발견되었다. 또한, 도 51 은 리드 데이터의 MiSeq 분석 결과를 나타낸다. 도 51 에서 나타낸 결과를 기반으로 하여, 상관 계수 "r" 은 0.992 로 높은 것으로 발견되었다. 이들 결과는, 벼의 DNA 라이브러리가 랜덤 프라이머를 사용하여 매우 높은 재현성으로 제조될 수 있다는 것을 입증한다.
3.3.3 에서 기재한 바와 같이, 수득한 리드 패턴을 니폰베어의 게놈 정보에 대해 맵핑하였다. 그 결과, DNA 단편이 6.2 kbp 의 간격에서 게놈 전체에 걸쳐 균등하게 증폭되었다는 것이 발견되었다 (도 52). 랜덤 프라이머의 서열 및 게놈 정보를 비교한 결과, 평균 3.6 개의 미스매치가 발견되었고, 99.0% 의 프라이머 쌍에서 하나 이상의 미스매치가 관찰되었다 (도 53). 이 결과는, 랜덤 프라이머 사용을 포함하는 DNA 라이브러리가 게놈 전체에 걸쳐 균등하게 비특이적 증폭을 통해 만족스러운 재현성으로 제조된다는 것을 입증한다.
4.4 사탕수수의 다형성 검출 및 유전자형 식별
상기 3.4 에서 기재된 바와 같이, 사탕수수 NiF8 및 Ni9, 및 이의 22 하이브리드 자손 계통의 DNA 라이브러리를 랜덤 프라이머를 사용하여 제조하고, 생성된 DNA 라이브러리를 차세대 서열분석기 (HiSeq) 로 분석하고, 리드 데이터를 기반으로 하여 부모 품종의 다형성을 검출하고 하이브리드 자손의 유전자형을 식별하였다. 표 26 는 결과를 나타낸다.
[표 26]
표 26 에서 나타낸 바와 같이, 8,683 개의 NiF8 마커 및 11,655 개의 Ni9 마커; 즉, 총 20,338 개의 마커를 제조하였다. 또한, 하이브리드 자손 계톤의 유전자형 식별을 위한 재현성은 99.97% 로 높았다. 이는 유전자형 식별 정확도가 매우 높다는 것을 나타낸다. 특히, 사탕수수는 다배수체 (8x+n) 여서, 염색체 수가 100 내지 130 으로 크고, 게놈 크기가 10 Gbp 로 인간의 경우보다 적어도 3 배 더 크다. 따라서, 게놈 DNA 전체에 걸쳐 유전자형 식별이 매우 어렵다. 상기 기재된 바와 같이, 랜덤 프라이머를 사용하여 다수의 마커를 제조할 수 있고, 따라서 사탕수수 유전자형을 높은 정확도로 식별할 수 있다.
4.5 PCR 마커로의 확인을 위한 실험
상기 3.5 에서 기재된 바와 같이, 사탕수수 품종 NiF8 및 Ni9, 및 이의 22 하이브리드 자손 계통을 표 22 에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 처리하고, 전기영동을 통해 유전자형을 판별하고 결과를 리드 수와 비교하였다. 도 54 및 55 는 각각 NiF8 마커 N80521152 의 리드 수 및 전기영동 패턴을 나타낸다. 도 56 및 57 은 각각 NiF8 마커 N80997192 의 리드 수 및 전기영동 패턴을 나타낸다. 도 58 및 59 는 각각 NiF8 마커 N80533142 의 리드 수 및 전기영동 패턴을 나타낸다. 도 60 및 61 은 각각 Ni9 마커 N91552391 의 리드 수 및 전기영동 패턴을 나타낸다. 도 62 및 63 은 각각 Ni9 마커 N91653962 의 리드 수 및 전기영동 패턴을 나타낸다. 도 64 및 65 는 각각 Ni9 마커 N91124801 의 리드 수 및 전기영동 패턴을 나타낸다.
도 54 내지 65 에서 나타낸 바와 같이, 상기 3.5 에서 설계한 모든 PCR 마커 결과는 차세대 서열분석기를 사용한 분석 결과와 일치하였다. 따라서, 차세대 서열분석기를 사용한 유전자형 식별은 마커 기술로서 이용가능한 것으로 여겨졌다.
4.6 랜덤 프라이머 농도와 길이 사이의 상관관계
상기 3.6.1 에서 기재된 바와 같이, 9-염기 랜덤 프라이머 (표 10), 10-염기 랜덤 프라이머 (표 3, 10-염기 프라이머 A), 11-염기 랜덤 프라이머 (표 11), 12-염기 랜덤 프라이머 (표 12), 14-염기 랜덤 프라이머 (표 13), 16-염기 랜덤 프라이머 (표 14), 18-염기 랜덤 프라이머 (표 15) 및 20-염기 랜덤 프라이머 (표 16) 를 사용한 DNA 라이브러리 제조 결과를 도 66 내지 81 에 나타낸다. 결과를 표 27 에 요약한다.
[표 27]
도 66 내지 81 에서 나타낸 바와 같이, 통상 수준보다 13.3 배 더 큰 10.0 microM 의 고농도로 랜덤 프라이머를 사용한 경우, 매우 높은 재현성을 달성하면서 9- 내지 20-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 저분자량 DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 발견하였다. 랜덤 프라이머의 염기 길이가 증가하면 (특히 12 개 염기 이상), 증폭된 단편의 분자량이 감소하는 경향이 있었다. 9-염기 랜덤 프라이머를 사용한 경우, 어닐링 온도를 37℃ 로 설정함으로써 DNA 단편의 증폭량이 증가하였다.
상기 3.6.2 에서 기재된 바와 같이, 랜덤 프라이머의 농도와 길이 사이의 상관관계를 명확하게 하기 위해서, 0.6 내지 300 microM 의 농도로 8- 내지 35-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행함으로써 DNA 라이브러리를 제조하였다. 결과를 표 28 에 나타낸다.
[표 28]
표 28 에 나타낸 바와 같이, 4.0 내지 200 microM 의 농도로 9- 내지 30-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 높은 재현성으로 저분자량 (100 내지 500 개 염기) DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 4.0 내지 100 microM 의 농도로 9- 내지 30-염기 랜덤 프라이머를 사용하여 높은 재현성 및 확실성으로 저분자량 (100 내지 500 개 염기) DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 확인하였다.
표 28 에 나타낸 결과를 더욱 상세히 조사한다. 그 결과, 랜덤 프라이머의 길이와 농도 사이의 상관관계는 도 82 에 나타낸 바와 같이, 바람직하게는 프레임에 의해 둘러싸진 범위 내인 것으로 발견된다. 보다 구체적으로, 랜덤 프라이머가 9 내지 10 개 염기를 포함하는 경우, 랜덤 프라이머 농도는 바람직하게는 40 내지 60 microM 이다. 랜덤 프라이머가 10 내지 14 개 염기를 포함하는 경우, 랜덤 프라이머 농도가 부등식: y > 3E + 08x- 6.974 로 표시되는 조건을 충족하고 (단, 랜덤 프라이머의 염기 길이를 y 로 표시하고, 랜덤 프라이머 농도를 x 로 표시함), 100 microM 이하인 것이 바람직하다. 랜덤 프라이머가 14 내지 18 개 염기를 포함하는 경우, 랜덤 프라이머 농도는 바람직하게는 4 내지 100 mM 이다. 랜덤 프라이머가 18 내지 28 개 염기를 포함하는 경우, 랜덤 프라이머 농도는 4 microM 이상이고 부등식: y < 8E +08x- 5.533 으로 표시되는 조건을 충족하는 것이 바람직하다. 랜덤 프라이머가 28 내지 29 개 염기를 포함하는 경우, 랜덤 프라이머 농도는 바람직하게는 4 내지 10 microM 이다. 부등식 y > 3E + 08x-6.974 및 y < 8E +08x-5.533 은 Microsoft Excel 거듭제곱 근사를 기반으로 하여 결정된다.
상기 기재된 바와 같은 소정 농도 내로 랜덤 프라이머의 염기 수 및 농도를 규정함으로써, 저분자량 (100 내지 500 개 염기) DNA 단편을 높은 재현성으로 증폭할 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어 차세대 서열분석기를 사용한 고분자량 DNA 단편 분석을 통해 수득된 데이터 정확도는 상당한 정도로 저하하는 것으로 알려져 있다. 이 실시예에서 기재된 바와 같이, 랜덤 프라이머의 염기 수 및 농도를 소정 범위 내로 규정할 수 있어, 차세대 서열분석기로의 분석에 적합한 분자 크기를 갖는 DNA 라이브러리를 만족스러운 재현성으로 제조할 수 있고, 이러한 DNA 라이브러리가 차세대 서열분석기를 사용하는 마커 분석에 적합할 수 있다.
4.7 랜덤 프라이머 수
상기 3.7 에서 기재된 바와 같이, 1, 2, 3, 12, 24 또는 48 개 유형의 랜덤 프라이머 (농도: 60 microM) 를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하고, 결과를 도 83 내지 94 에 나타낸다. 결과를 표 29 에 요약한다.
[표 29]
도 83 내지 94 에서 나타낸 바와 같이, 매우 높은 재현성을 달성하면서, 1, 2, 3, 12, 24 또는 48 개 유형의 랜덤 프라이머 중 임의의 것을 사용하여 저분자량 DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 발견하였다. 랜덤 프라이머 유형의 수가 증가하면, 특히 전기영동 패턴에서의 피크가 낮아지고, 편차가 사라지는 경향이 있다.
4.8 랜덤 프라이머 서열
상기 3.8 에서 기재된 바와 같이, DNA 라이브러리를 표 4 내지 8 에서 나타낸 랜덤 프라이머 세트 (즉, 10-염기 프라이머 B, 10-염기 프라이머 C, 10-염기 프라이머 D, 10-염기 프라이머 E 및 10-염기 프라이머 F) 를 사용하여 제조하고, 결과를 도 95 내지 104 에 나타낸다. 결과를 표 30 에 요약한다.
[표 30]
도 95 내지 104 에서 나타낸 바와 같이, 매우 높은 재현성을 달성하면서, 10-염기 프라이머 B, 10-염기 프라이머 C, 10-염기 프라이머 D, 10-염기 프라이머 E 또는 10-염기 프라이머 F 중 임의의 세트를 사용하여 저분자량 DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 발견하였다.
4.9 인간 DNA 라이브러리의 생성
상기 3.9 에서 기재된 바와 같이, 인간-유래 게놈 DNA 및 60 microM (10-염기 프라이머 A) 의 최종 농도로 랜덤 프라이머를 사용하여 DNA 라이브러리를 제조하고, 결과를 도 105 및 106 에 나타낸다. 도 105 는 첫번째 반복된 실험의 결과를 나타내고, 도 106 은 두번째 반복된 실험의 결과를 나타낸다. 도 105 및 106 에서 나타낸 바와 같이, 인간-유래 게놈 DNA 를 사용한 경우에도 매우 높은 재현성을 달성하면서 저분자량 DNA 단편을 증폭할 수 있다는 것을 발견하였다.
실시예
2
1. 흐름도
이 실시예에서, 도 107 및 108 에서 나타낸 모식도에 따라 주형으로서 게놈 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 PCR 을 통해 제 1 DNA 단편을 제조한 다음, 주형으로서 제조된 제 1 DNA 단편 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 통해 제 2 DNA 단편을 제조하였다. 서열분석기용 라이브러리로서 제조된 제 2 DNA 단편을 사용하여, 소위 차세대 서열분석기를 사용한 서열 분석을 수행하고, 수득한 리드 데이터를 기반으로 하여 유전자형을 분석하였다.
2. 재료
이 실시예에서, DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN) 를 사용하여 사탕수수 품종 NiF8 및 벼 품종 니폰베어로부터 게놈 DNA 를 추출하고, 추출된 게놈 DNA 를 정제하였다. 정제된 게놈 DNA 를 각각 NiF8-유래 게놈 DNA 및 니폰베어-유래 게놈 DNA 로서 사용하였다.
3. 방법
3.1 사탕수수 품종 NiF8 의 조사
3.1.1 랜덤 프라이머 및 차세대 서열분석기용 프라이머의 설계
이 실시예에서, 랜덤 프라이머는 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 의 3' 말단에서의 10 개 염기를 기반으로 하여 설계하였다. 이 실시예에서, 구체적으로, GTTACACACG (SEQ ID NO: 2041, 10-염기 프라이머 G) 를 랜덤 프라이머로서 사용하였다. 또한 차세대 서열분석기용 프라이머는 Nextera 어댑터 (Illumina) 의 서열 정보를 기반으로 하여 설계하였다 (표 31).
[표 31]
3.1.2 DNA 라이브러리의 제조
상기 2. 에 기재된 NiF8-유래 게놈 DNA (30 ng) 에, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA), 및 60 microM 랜덤 프라이머 (10-염기 프라이머 G) 를 최종 농도로 하여 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 따라서, DNA 라이브러리 (제 1 DNA 단편) 를 제조하였다.
3.1.3 정제 및 전기영동
상기 3.1.2 에서 수득한 DNA 라이브러리를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) 를 사용하여 정제하고, Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) 를 사용하여 전기영동 처리하여, 형광 유닛 (FU) 을 수득하였다. 또한, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
3.1.4 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리의 제조
상기 3.1.3 에서 정제한 제 1 DNA 단편 (100 ng) 에, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA), 0.5 microM 차세대 서열분석기용 프라이머를 최종 농도로 하여 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 98℃, 15 초 동안 55℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 25 사이클, 및 1 분 동안 72℃, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 따라서, 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 을 제조하였다. 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.1.5 MiSeq 분석
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle (Illumina) 를 사용하여, 3.1.4 에서 수득한 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 100 염기 페어-엔드 서열분석을 통해 분석하였다.
3.1.6 리드 데이터 분석
3.1.5 에서 수득한 리드 데이터를 기반으로 하여 리드 패턴을 식별하였다. 각각의 리드 패턴에 대해 리드 수를 카운트하고, 반복된 분석의 리드 수를 비교하고, 상관 계수에 관하여 재현성을 평가하였다.
3.2 벼 품종 니폰베어의 분석
3.3.1 랜덤 프라이머 및 차세대 서열분석기용 프라이머의 설계
이 실시예에서, 랜덤 프라이머는 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 의 3' 말단에서의 10 개 염기를 기반으로 하여 설계하였다. 이 실시예에서, 구체적으로, 총 12 개 염기; 즉, Nextera 어댑터 서열의 3' 말단에서의 10 개 염기 및 10-염기 서열의 3' 말단에 첨가된 임의의 2 개 염기를 포함하는 16 개 유형의 뉴클레오티드 서열을 랜덤 프라이머로서 설계하였다 (표 32, 12-염기 프라이머 B).
[표 32]
이 실시예에서, Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 의 서열 정보를 기반으로 하여 설계된 차세대 서열분석기용 프라이머를 상기 3.1.1 에서와 같이 사용하였다.
3.2.2 DNA 라이브러리의 제조
상기 2. 에 기재된 니폰베어-유래 게놈 DNA (30 ng) 에, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA), 및 40 microM 랜덤 프라이머 (12-염기 프라이머 B) 를 최종 농도로 하여 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 따라서, DNA 라이브러리 (제 1 DNA 단편) 를 제조하였다.
3.2.3 정제 및 전기영동
상기 3.2.2 에서 수득한 DNA 라이브러리를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) 를 사용하여 정제하고, Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) 를 사용하여 전기영동 처리하여, 형광 유닛 (FU) 을 수득하였다. 또한, 반복된 데이터의 재현성은 스피어맨의 순위 상관을 기반으로 하여 평가하였다 (rho > 0.9).
3.2.4 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리의 제조
상기 3.2.3 에서 정제한 제 1 DNA 단편 (100 ng) 에, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA), 및 0.5 microM 차세대 서열분석기용 프라이머를 최종 농도로 하여 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 98℃, 15 초 동안 55℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 25 사이클, 및 1 분 동안 72℃, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 따라서, 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 을 제조하였다. 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리를 3.1.3 에서와 동일한 방식으로 정제 및 전기영동 처리하였다.
3.2.5 MiSeq 분석
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle (Illumina) 를 사용하여, 3.2.4 에서 수득한 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 100 염기 페어-엔드 서열분석을 통해 분석하였다.
3.2.6 리드 데이터 분석
3.2.5 에서 수득한 리드 패턴을 Bowtie2 를 사용하여 니폰베어 (NC_008394 ~ NC_008405) 의 게놈 정보에 대해 맵핑하고, 랜덤 프라이머 서열과 게놈 DNA 사이의 일치 정도를 조사하였다. 또한, 3.2.5 에서 수득한 리드 데이터를 기반으로 하여 리드 패턴을 식별하였다. 각각의 리드 패턴에 대해 리드 수를 카운트하고, 반복된 분석의 리드 수를 비교하고, 상관 계수에 관하여 재현성을 평가하였다.
4. 결과 및 토의
4.1 사탕수수 품종 NiF8 의 조사 결과
도 109 및 도 110 은 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 (Illumina) 의 3' 말단에서의 10-염기 랜덤 프라이머 (10-염기 프라이머 G) 를 60 ㎕ 의 고농도로 사용하여 PCR 을 실행했을 때의 전기영동 결과를 나타낸다. 도 109 및 도 110 에서 나타낸 바와 같이, 100 bp 내지 500 bp 를 포함하는 넓은 범위에서 증폭이 관찰되었다 (제 1 DNA 단편). 넓은 범위에서 증폭이 관찰된 것은, 랜덤 프라이머에 상응하는 게놈 DNA 영역 외의 구역에서도 증폭이 관찰되었기 때문이라고 여겨졌다. 반복된 데이터 중에서 순위 상관 계수가 0.9 이상 (즉, 0.957) 이었으므로, 증폭 패턴에서 높은 재현성이 관찰되었다.
3.1.4 에서 기재된 바와 같이, 도 111 및 도 112 는 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행했을 때의 전기영동 결과를 나타낸다. 연결된 차세대 서열분석기의 Nextera 어댑터를 포함하는 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 제조하기 위해서, 구체적으로, 주형으로서 제 1 DNA 단편, 및 Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 을 포함하는 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행하였다. DNA 라이브러리가 다수의 100 bp 이하의 짧은 단편 또는 1 kbp 이상의 긴 단편을 포함하는 경우, 차세대 서열분석기 (Illumina) 의 분석 정확도는 극단적으로 악화된다. 이 실시예에서 제조한 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 는 도 111 및 도 112 에서 나타낸 바와 같이, 대략 500 bp 에서의 피크로 주로 150 bp 내지 1 kbp 범위 내 분포를 나타내었다. 따라서, 이러한 DNA 라이브러리는 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리로서 이의 적용에 적합하다고 여겨졌다. 반복된 데이터 중에서 순위 상관 계수가 0.9 이상 (즉, 0.989) 이었으므로, 증폭 패턴에서 높은 재현성이 관찰되었다.
생성된 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 차세대 서열분석기를 사용하여 MiSeq 분석 처리하고, 그 결과로 3.5 Gbp 및 3.6 Gbp 의 리드 데이터를 수득하였다. MiSeq 데이터의 정밀도를 나타내는 >=Q30 값은 93.3% 및 93.1% 였다. 제조사에 의해 리드 데이터 3.0 Gbp 이상 및 >=Q30 값 85.0% 이상이 추천되었으므로, 이 실시예에서 제조한 차세대 서열분석기의 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 는 차세대 서열분석기를 사용하는 분석에 이용가능한 것으로 여겨졌다. 재현성을 확인하기 위해서, MiSeq 를 통해 수득한 34,613 개의 리드 패턴에 관해 반복된 분석의 리드 수를 비교하였다. 결과를 도 113 에 나타낸다. 도 113 에서 나타낸 바와 같이, 전기영동의 경우에서와 같이, 리드 수는 반복된 분석 중에서 고도로 상관관계가 있는 것으로 발견되었다 (즉, r = 0.996).
상기 기재된 바와 같이, 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 (Illumina) 의 3' 말단에서 10-염기 랜덤 프라이머를 고농도로 사용하는 PCR 을 통해 DNA 라이브러리 (제 1 DNA 단편) 를 수득하고, Nextera 어댑터 서열을 포함하는 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 추가로 실행하였다. 따라서, 다수의 단편을 포함하는 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 편리하고 고도로 재현가능한 방식으로 제조하였다.
4.2 벼 품종 니폰베어의 조사 결과
도 114 및 도 115 는 총 12 개 염기; 즉, 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 의 3' 말단에서의 10 개 염기 및 이의 3' 말단에 첨가된 임의의 2 개 염기를 각각 포함하는 16 개 유형의 랜덤 프라이머 (12-염기 프라이머 B) 를 40 ㎕ 의 고농도로 사용하여 PCR 을 실행했을 때의 전기영동 결과를 나타낸다. 도 114 및 도 115 에서 나타낸 바와 같이, 100 bp 내지 500 bp 를 포함하는 넓은 범위에서 증폭이 관찰되었다 (제 1 DNA 단편). 넓은 범위에서 증폭이 관찰된 것은, 4.1 의 경우에서와 같이, 랜덤 프라이머와 일치하는 게놈 DNA 영역 외의 구역에서도 증폭이 관찰되었기 때문이라고 여겨졌다. 순위 상관 계수가 0.9 이상 (즉, 0.950) 이었으므로, 증폭 패턴에서 높은 재현성이 관찰되었다.
3.2.4 에서 기재된 바와 같이, 도 116 및 도 117 는 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행했을 때의 전기영동 결과를 나타낸다. 연결된 차세대 서열분석기의 Nextera 어댑터를 포함하는 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 제조하기 위해서, 구체적으로, 주형으로서 제 1 DNA 단편, 및 Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 을 포함하는 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 실행하였다. 그 결과로, 이 실시예에서 제조한 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 는 도 116 및 도 117 에서 나타낸 바와 같이, 대략 300 bp 에서의 피크로 주로 150 bp 내지 1 kbp 범위 내 분포를 나타내는 것으로 발견되었다. 따라서, 이러한 DNA 라이브러리는 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리로서 이의 적용에 적합하다고 여겨졌다. 반복된 데이터 중에서 순위 상관 계수가 0.9 이상 (즉, 0.992) 이었으므로, 증폭 패턴에서 높은 재현성이 관찰되었다.
생성된 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 차세대 서열분석기를 사용하여 MiSeq 분석 처리하고, 그 결과로 4.0 Gbp 및 3.8 Gbp 의 리드 데이터를 수득하였다. MiSeq 데이터의 정밀도를 나타내는 >=Q30 값은 94.0% 및 95.3% 이었다. 결과는, 이 실시예에서 제조한 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 가 상기 4.1.1 에서 기재된 바와 같이 차세대 서열분석기를 사용하는 분석에 이용가능하다는 것을 입증한다. 도 118 은 MiSeq 분석을 통해 수득된 19,849 개의 리드 패턴에 관해 랜덤 프라이머 서열과 게놈 사이의 일치 정도가 평가되도록, 랜덤 프라이머 서열과 니폰베어 참조 서열 사이의 비교 결과를 입증한다. 도 118 에서 나타낸 바와 같이, 랜덤 프라이머 서열과 니폰베어 참조 서열 사이의 평균 일치 정도는 34.5% 였다. 랜덤 프라이머 서열과 니폰베어 참조 서열 사이에 완전히 일치한 리드 패턴이 없었으므로, 특히, 모든 리드 패턴은 이와 일치하지 않는 서열에 랜덤 프라이머가 결합하여 발생하는 것으로 여겨졌다. 이러한 결과는 바이오분석기를 사용하여 얻은 결과와 일치하는 것으로 여겨졌다. 리드 패턴의 재현성을 조사하기 위해, 반복된 데이터 중에서 리드 수를 비교하였다. 결과를 도 119 에 나타낸다. 도 119 에서 나타낸 바와 같이, 전기영동의 경우에서와 같이, 리드 수는 반복된 분석 중에서 고도로 상관관계가 있는 것으로 발견되었다 (즉, r = 0.999).
상기 기재된 바와 같이, 16 유형의, 총 12-염기 랜덤 프라이머 (; 즉 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 (Illumina) 의 3' 말단에서의 10 개 염기 및 이의 3' 말단에 첨가된 임의의 2 개 염기) 를 고농도로 사용하여 PCR 을 통해 DNA 라이브러리 (제 1 DNA 단편) 를 수득하고, Nextera 어댑터 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 을 추가로 수행하였다. 따라서, 다수의 단편을 포함하는 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 를 편리하고 고도로 재현가능한 방식으로 제조하였다.
실시예
3
1. 흐름도
이 실시예에서, 실시예 2 에서와 동일한 방식으로, 주형으로서 게놈 DNA 및 랜덤 프라이머를 사용하여 PCR 을 통해 제 1 DNA 단편을 제조한 다음, 주형으로서 제조된 제 1 DNA 단편 및 차세대 서열분석기용 프라이머를 사용하여 PCR 을 통해 제 2 DNA 단편을 제조하였다. 서열분석기용 라이브러리로서 제조된 제 2 DNA 단편을 사용하여, 소위 차세대 서열분석기를 사용한 서열 분석을 수행하고, 수득한 리드 데이터를 기반으로 하여 유전자형을 분석하였다. 이 실시예에서, 특히 사용하는 랜덤 프라이머의 유형에 따라, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭이 억제될 수 있는지 여부를 조사하였다.
2. 재료
이 실시예에서, DNeasyPlant Mini kit (QIAGEN) 를 사용하여 벼 품종 니폰베어로부터 게놈 DNA 를 추출하고, 추출된 게놈 DNA 를 정제하였다. 정제된 게놈 DNA 를 벼-유래 게놈 DNA 로서 사용하였다. 이 실시예에서 사용한 옥수수, 감자 및 대두의 게놈 DNA 는 Cosmo Bio Co., Ltd. 로부터 구입하였다 (제품 번호: D1634330, D1634350 및 D1634370).
3. 방법
3.1 랜덤 프라이머의 설계
랜덤 프라이머로서, 총 13 개의 염기; 즉, 차세대 서열분석기용 Nextera 어댑터 서열 (Illumina) 의 3' 말단에서의 10 개 염기 (TAAGAGACAG) 및 이의 3' 말단에 첨가된 임의의 3 개 염기를 각각 포함하는 64 개 유형의 뉴클레오티드 서열을 설계하였다 (표 33). 64, 63, 60, 40, 20 및 10 개의 랜덤 프라이머 세트 (랜덤 프라이머 세트 A ~ F) 를 제조하였다. 또한, 총 12 개의 염기; 즉 10 개의 염기 (TAAGAGACAG) 및 이의 3' 말단에 첨가된 임의의 2 개 염기를 각각 포함하는 16 개 유형의 뉴클레오티드 서열을 설계하였다 (표 34, 세트 G). 차세대 서열분석기용 프라이머는 또한, Nextera 어댑터 (Illumina) 의 서열 정보를 기반으로 하여 설계하였다 (표 35).
[표 33]
[표 34]
[표 35]
3.2 DNA 라이브러리의 제조
상기 2. 에 기재된 게놈 DNA (15 ng) 에, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 0.625 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA), 및 40 microM 랜덤 프라이머를 최종 농도로 하여 첨가하고, 최종 반응 수준을 25 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 98℃, 및 10 초 동안 98℃, 15 초 동안 50℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 30 사이클, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 따라서, DNA 라이브러리 (제 1 DNA 단편) 를 제조하였다.
3.3 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리의 제조
상기 3.2 에서 제조한 1 ㎕ 의 DNA 라이브러리 (제 1 DNA 단편) 에, 0.2 mM dNTP 혼합물, 1.0 mM MgCl2, 1.25 유닛의 DNA 폴리머라아제 (PrimeSTAR, TAKARA), 및 0.25 microM 차세대 서열분석기용 프라이머를 최종 농도로 하여 첨가하고, 최종 반응 수준을 50 ㎕ 로 조정하면서 반응액을 제조하였다. 결과물을, 2 분 동안 95℃, 15 초 동안 98℃, 15 초 동안 55℃ 및 20 초 동안 72℃ 의 25 사이클, 및 1 분 동안 72℃, 이후 4℃ 에서 저장을 포함하는 열 사이클링 조건 하에 PCR 처리하였다. 따라서, 차세대 서열분석기용 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 을 제조하였다. DNA 라이브러리를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) 를 사용하여 정제하고 Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies) 를 사용하여 전기영동하고, 이의 파형을 조사하였다.
3.4 차세대 서열분석기를 사용한 분석
MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle (Illumina) 을 사용하여, 3.3 에서 수득한 DNA 라이브러리 (제 2 DNA 단편) 을 100 염기 페어-엔드 서열분석을 통해 분석하였다.
3.5 뉴클레오티드 서열 정보의 분석
3.4 에서 수득한 리드 데이터를, Bowtie2 를 사용하여 관련 식물로부터의 엽록체 게놈의 뉴클레오티드 서열 정보 (옥수수: NC_001666.2 제아 메이스 (Zea mays) 엽록체, 전체 게놈; 벼: NC_001320.1 오리자 사티바 자포니카 그룹 플라스티드 (Oryza sativa japonica group plastid), 전체 게놈; 감자: NC_008096.2 솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum) 엽록체, 전체 게놈; 대두: NC_007942.1 글리시네 막스 (Glycine max) 엽록체, 전체 게놈) 에 대해 맵핑하고, 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터 및 이의 영역을 식별하였다.
4. 결과
4.1 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터의 분석
4.1.1 엽록체 게놈에 대한 맵핑
표 36 은 표 33 에 나타낸 랜덤 프라이머 세트 A 를 사용하여 제조한 DNA 라이브러리의 MiSeq 분석 결과를 나타낸다.
[표 36]
표 36 에서 나타낸 바와 같이, 랜덤 프라이머 세트 A 를 사용하여 옥수수, 벼, 감자 및 대두에 대해 410,000 개 이상의 리드 데이터를 수득하였다. 수득한 리드 데이터를 식물로부터의 엽록체 게놈의 뉴클레오티드 서열 정보에 대해 맵핑하였고, 표 36 에서 나타낸 바와 같이, 9,725 내지 134,709 개의 리드 데이터를 엽록체 게놈에 대해 맵핑하였다. 특히, 감자 및 대두에 관해 수득한 리드 데이터의 28.3% 및 29.1% 는 엽록체 게놈에서 유래한다고 여겨졌다. 따라서, 랜덤 프라이머 세트 A 를 사용한 경우, 핵 게놈을 분석하는데 있어서 데이터 손실이 상당하였다고 결론 내려졌다.
4.1.2 엽록체 게놈의 특정 영역
4.1.1 에서 대량의 리드 데이터가 맵핑된 엽록체 게놈의 위치를 식별하기 위해, 엽록체 게놈에 대해 맵핑된 리드 데이터 중 1% 이상이 맵핑된 영역을 "특정 영역" 으로서 지정하였다. 표 37 은 옥수수로부터의 엽록체 게놈의 특정 영역에 대해 맵핑된 리드 수를 요약하는 결과를 나타낸다. 표 38 은 벼로부터의 엽록체 게놈의 특정 영역에 대해 맵핑된 리드 수를 요약하는 결과를 나타낸다. 표 39 는 감자로부터의 엽록체 게놈의 특정 영역에 대해 맵핑된 리드 수를 요약하는 결과를 나타낸다. 표 40 은 대두로부터의 엽록체 게놈의 특정 영역에 대해 맵핑된 리드 수를 요약하는 결과를 나타낸다.
[표 37]
[표 38]
[표 39]
[표 40]
표 37 ~ 40 에서 나타낸 바와 같이, 옥수수, 감자 및 대두에서는 4 개의 특정 영역이 관찰되었고, 벼에서는 6 개의 특정 영역이 관찰되었다. 이들 특정 영역에 대해 맵핑된 리드의 백분율은 엽록체 게놈에 대해 맵핑된 리드에 관해 96.3% 내지 99.4% 로 높고, 대부분의 리드가 이들의 특정 영역에서 유래한다고 여겨졌다.
도 120-1 및 120-2 는 표 37 ~ 40 에서 나타낸 특정 영역 중에서 영역_1_1 및 영역_2_1 의 뉴클레오티드 서열의 비교 결과를 나타낸다. 도 120-1 및 120-2 에서, 옥수수에서 발견된 특정 영역을 영역_1_1_옥수수 및 영역_2_1_옥수수로서 표시하고, 벼에서 발견된 특정 영역을 영역_1_1_벼 및 영역_2_1_벼로서 표시하고, 감자에서 발견된 특정 영역을 영역_1_1_감자 및 영역_2_1_감자로서 표시하고, 대두에서 발견된 특정 영역을 영역_1_1_대두 및 영역_2_1_대두로서 표시한다. SEQ ID NO: 2153 은 영역_1_1_옥수수의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2154 는 영역_1_1_벼의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2155 은 영역_1_1_감자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2156 은 영역_1_1_대두의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2157 은 영역_2_1_옥수수의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2158 은 영역_2_1_벼의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2159 는 영역_2_1_감자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, SEQ ID NO: 2160 은 영역_2_1_대두의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
특정 영역의 뉴클레오티드 서열 비교의 결과로서, 도 120-1 및 120-2 에서 나타낸 바와 같이, 4 개 영역 (즉, 영역_1_1, 영역_1_2, 영역_2_1 및 영역_2_2)은 모든 식물 중에서 매우 유사하였고, 이들 영역은 따라서 그들 사이에서 공통된다고 여겨졌다. 영역_1_2 및 영역_2_2 (도 120-1 및 120-2 에서 "영역_*_2" 로서 표시함) 는 각각 영역_1_1 및 영역_2_1 의 영역 내에 존재하였고, 영역_1_1 의 상보적 가닥은 영역_2_1 의 상보적 가닥과 유사하였다. 따라서, 회문 (palindrome) 이 형성되었다고 여겨졌다.
이들 4 개 영역의 말단 서열은 대략 3 개 유형으로 분류할 수 있고, 특히, 이러한 영역 각각에서 110 개 염기의 서열은 4 개 영역 중에서 공통된 것이었다. 이러한 영역의 서열 정보를 기반으로 하여, "TAAGAGACAG" 및 이의 3' 말단에 라이게이션된 "TGC", "GGA", "GGG" 또는 "GTG" 를 포함하는, 랜덤 프라이머 세트 A 중에서 선택되는 랜덤 프라이머에 의해 대상 영역이 증폭되었다고 여겨졌다. 특히, 서열 "TAAGAGACAGTGC" 는 모든 이러한 영역의 증폭에 관련된 랜덤 프라이머인 것으로 여겨졌다.
도 121 은 벼에서 발견된 특정 영역 중에서 영역_3_1 및 영역_3_2 의 비교 결과를 나타낸다 (각각 "영역_3_1_벼" 및 "영역_3_2_벼" 로서 표시함). SEQ ID NO: 2161 및 SEQ ID NO: 2162 는 각각 영역_3_1_벼 및 영역_3_2_벼의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 121 에서 나타낸 바와 같이, 영역_3_2 는 영역_3_1 의 내부 서열이었다. 분석 결과는, "TAAGAGACAG", 및 이의 3' 말단에 라이게이션된 "TGC", "GTA", "ATA" 또는 "CCA" 로 구성된 서열을 포함하는 랜덤 프라이머에 의해 대상 영역이 증폭되었음을 입증한다.
4.2 랜덤 프라이머의 선택
4.1.2 에서의 분석 결과는, 엽록체 게놈에서 유래하는 DNA 단편의 증폭이 랜덤 프라이머 세트 A 중에서 랜덤 프라이머 "TAAGAGACAGTGC" 와 상당히 관련된다는 것을 입증한다. 따라서, 랜덤 프라이머 "TAAGAGACAGTGC" 외에 63-염기, 60-염기, 40-염기, 20-염기 및 10-염기 랜덤 프라이머의 5 세트를 선택하였다 (표 33, 랜덤 프라이머 세트 B ~ F).
4.3 선택된 랜덤 프라이머 세트의 분석
4.2 에서 선택된 5 세트의 랜덤 프라이머 (랜덤 프라이머 세트 B ~ F) 를 사용하여, 옥수수, 벼, 감자 및 대두를 랜덤 프라이머 세트 A 를 사용하는 것을 포함하는 방법에서와 동일한 방식으로 분석하였다. 표 41 은 랜덤 프라이머 세트 B 를 사용하여 얻은 결과를 나타내고, 표 42 는 랜덤 프라이머 세트 C 를 사용하여 얻은 결과를 나타내고, 표 43 은 랜덤 프라이머 세트 D 를 사용하여 얻은 결과를 나타내고, 표 44 는 랜덤 프라이머 세트 E 를 사용하여 얻은 결과를 나타내고, 표 45 는 랜덤 프라이머 세트 F 를 사용하여 얻은 결과를 나타낸다.
[표 41]
[표 42]
[표 43]
[표 44]
[표 45]
도 122 는 표 36 에 나타낸 결과와 조합으로 표 41 ~ 45 에서 나타낸 결과를 나타낸다. 결과는, 표 41 ~ 45 및 도 122 에서, TAAGAGACAGTGC 를 포함하지 않는 랜덤 프라이머 세트 B ~ F 를 사용하여, 엽록체 게놈에 대해 맵핑된 리드 데이터의 비율이 통상 수준의 적어도 절반으로 감소되는 것을 입증한다. 랜덤 프라이머 세트 A 로부터 랜덤 프라이머 "TAAGAGACAGTGC" 를 제거함으로써 제조한 랜덤 프라이머 세트 B 를 사용하여, 이러힌 리드 데이터의 비율은 상당한 정도 (즉, 통상 수준의 0.3% 내지 3.3%) 로 감소하였다. 또한 10 개 랜덤 프라이머 세트를 사용하여, 이러한 리드 데이터의 비율이 상당한 정도 (즉, 통상 수준의 0.2% 내지 1.8%) 로 감소하였다.
결과는, 이 실시예에서 발견된 엽록체 게놈에서의 특정 영역의 서열 정보를 기반으로 하여 랜덤 프라이머를 선택할 수 있어, 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터를 상당한 정도로 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다.
4.4 랜덤 프라이머 세트 G 의 분석
이 실시예에서, 4.1.2 에서 발견된 특정 영역과 랜덤 프라이머 길이 사이의 상관관계를 조사하기 위해, 12-염기 랜덤 프라이머 세트 G (표 34) 를 사용하여 벼 품종 니폰베어의 게놈을 분석하였다. 표 46 은 분석 결과를 나타낸다.
[표 46]
표 46 에서 나타낸 바와 같이, 엽록체 게놈에 대해 맵핑된 리드의 97.9% 가 영역_3_2 외의 5 개 영역에 대해 맵핑되었다. 결과는, 랜덤 프라이머 길이에 관계없이, 엽록체 게놈에 대해 맵핑된 리드의 대다수가 이러한 특정 영역에서 유래하였다는 것을 입증한다. 또한, "TAAGAGACAG"의 3' 말단에서 "TG" 를 포함하는 랜덤 프라이머에 의해 이들 영역이 증폭되었다고 여겨졌다.
5. 검토
이 실시예에서 기재된 바와 같이, 그의 5' 말단에서 TAAGAGACAG 를 포함하는 랜덤 프라이머 세트를 사용하고 차세대 서열분석기를 사용하여 수득한 리드 데이터를 분석하였다. 분석 결과로서, 모든 식물 종이 엽록체 게놈에서 유래하는 대량의 리드 데이터를 포함하며, 특정 유형의 식물 종으로부터 수득한 리드 데이터의 대략 30% 가 엽록체 게놈에서 유래하였다는 것이 발견되었다. 차세대 서열분석기의 사용을 포함하는 분석의 성능이 리드 데이터의 양에 따라 상당히 가변적이므로, 표적 리드 데이터의 수율을 개선시키는 것이 중요하다. 일반적으로, 핵 게놈을 분석할 경우, 엽록체 게놈의 리드 데이터는 불필요하며, 이의 감소가 관심사였다.
상기 실시예로부터 명백한 바와 같이, 엽록체 게놈에 대해 맵핑된 리드 데이터의 대다수는 특정 영역에서 유래하였다. 또한 상기 실시예에서 기재된 바와 같이, 특정 랜덤 프라이머를 제외한 랜덤 프라이머 세트를 사용하여 엽록체 게놈의 특정 영역에서 유래하는 리드 데이터를 상당한 정도로 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 특정 영역의 서열 정보를 기반으로 하여, "TAAGAGACAGTGC" 를 제외한 랜덤 프라이머 5 세트를 선택하였다. 임의의 프라이머 세트를 사용하여, 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터가 통상 수준의 적어도 절반으로 감소하였다. 특히, "TAAGAGACAGTGC" 를 제거함으로써 제조한 프라이머 세트 B, 또는 10 개 랜덤 프라이머 세트 F 를 사용하여, 상당한 감소가 관찰되었다. 상기 입증한 결과를 기반으로 하여, 특정 영역에서 유래하는 DNA 단편의 증폭을 방지할 수 있는 랜덤 프라이머 세트를 설계할 수 있고, 랜덤 프라이머 세트에서의 랜덤 프라이머의 수에 관계없이, 엽록체 게놈에서 유래하는 리드 데이터를 상당한 정도로 감소시킬 수 있다.
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<211> 16
<212> DNA
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<211> 16
<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 18
<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<223> synthetic DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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ccactgtgtg cagcagacga 20
<210> 1333
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1336
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1337
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1338
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1339
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1340
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1341
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1342
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1344
ctagagcaca gtaccacgtt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1345
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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gcttcgcagg tctggatgat ggag 24
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<211> 24
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<211> 24
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<211> 24
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tatcagacac atcacaatgg atac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctaggacacc gctagtcggt tgaa 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtataactgc gtgtcctggt gtat 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atgcaatact aaggtggacc tccg 24
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1535
ttgctcgata cacgtagacc agtg 24
<210> 1536
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1536
tactggagga cgattgtcta tcat 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1537
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<223> synthetic DNA
<400> 1554
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<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1562
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agtatcatca tatccattcg cagtac 26
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<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 1620
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<212> DNA
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<220>
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<400> 1620
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<210> 1621
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgcttccggc aggcgtcata taagtc 26
<210> 1623
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<212> DNA
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1627
agactaagac atacgccatc accgct 26
<210> 1628
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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tgtagcgtga tgtatcgtaa ttctgt 26
<210> 1629
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1629
tgtgctattg gcacctcacg ctgacc 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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aattcgccaa ttgtgtgtag gcgcaa 26
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<211> 26
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1632
cgattatgag tacttgtaga ccagct 26
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1633
ttgcaagaac aacgtatctc atatgaac 28
<210> 1634
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1634
caccgtgctg ttattacttg gtattcgg 28
<210> 1635
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1635
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1636
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1637
tatgttgtct gatatggttc atgtggca 28
<210> 1638
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1638
agcgcgacta gttgatgcca acattgta 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1639
ataggcaggt ccaggctcgg aacaagtc 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1640
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1642
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1643
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1644
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1645
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1646
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1651
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1652
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1653
ctacacttga ggttgatgct caagatca 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1656
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1657
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1660
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<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 1670
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1674
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1675
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1676
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1677
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 1680
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1684
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1685
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1691
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<210> 1715
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 28
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<213> Artificial Sequence
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<210> 1720
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 1720
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<210> 1721
<211> 28
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<213> Artificial Sequence
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gaggagagtt gtccgagtgg tgtgatgt 28
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<212> DNA
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<210> 1724
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ccaacagtat gctgacataa ctatgata 28
<210> 1725
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 1725
gatccttgcc acgcctatga gatatcgc 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 2011
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<210> 2012
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 2012
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<210> 2013
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 2013
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 2014
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<213> Artificial Sequence
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<210> 2018
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(13)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2061
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<211> 13
<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<210> 2106
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<400> 2106
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<400> 2107
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taagagacag tct 13
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<400> 2143
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg tcgtgcatcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
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<211> 70
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgctgcatcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc acagtagtcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic DNA
<400> 2146
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gctcgattcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
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<213> Artificial Sequence
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<400> 2147
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gacgagttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
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<211> 70
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 2148
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg catatgttcg tcggcagcgt cagatgtgta 60
taagagacag 70
<210> 2149
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 2149
caagcagaag acggcatacg agataagagg cagtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 2150
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 2150
caagcagaag acggcatacg agataggagt ccgtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 2151
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 2151
caagcagaag acggcatacg agatgtagag aggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 2152
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic DNA
<400> 2152
caagcagaag acggcatacg agatcctctc tggtctcgtg ggctcggaga tgtgtataag 60
agacag 66
<210> 2153
<211> 349
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2153
gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc ccctcgcaaa agggggtcgc agtgaccagg 120
cccgggcgac tgtataccaa aaacacaggt ctccgcaaag tcgtaagacc atgtatgggg 180
gctgacgcct gcccagtgcc ggaaggtcaa ggaagttggt gaactgatga cagggaagcc 240
ggcgaccgaa gccccggtga acggcggccg taactataac ggtcctaagg tagcgaaatt 300
ccttgtcggg taagttccga cccgcacgaa aggcgtaacg atctgggca 349
<210> 2154
<211> 348
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2154
gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc ccctcgcaaa agggggtcgc agtgaccagg 120
cccgggcgac tgtttaccaa aaacacaggt ctccgcaaag tcgtaagacc atgtatgggg 180
gctgacgcct gcccagtgcc ggaagtcaag gaagttggtg aactgatgac agggaagccg 240
gcgaccgaag ccccggtgaa cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc 300
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggcgtaacga tctgggca 348
<210> 2155
<211> 348
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 2155
gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc tcctcacaaa gggggtcgca gtgaccaggc 120
ccgggcgact gtttaccaaa aacacaggtc tccgcaaagt cgtaagacca tgtatggggg 180
ctgacgcctg cccagtgccg gaaggtcaag gaagttggtg acctgatgac aggggagccg 240
gcgaccgaag ccccggtgaa cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc 300
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggcgtaacga tctgggca 348
<210> 2156
<211> 348
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 2156
gtgggtaggt agagaatacc tagaggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc tcctcacaaa gggggtcgca gtgaccaggc 120
ccgggcgact gtttaccaaa aacacaggtc tccgcaaagt cgtaagacca tgtatggggg 180
ctgacgcctg cccagtgccg gaaggtcaag gaagttggtg acctgatgac aggggagccg 240
acgaccgaag ccccggtgaa cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc 300
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggcgtaacga tctgggca 348
<210> 2157
<211> 349
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2157
gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc ccctcgcaaa agggggtcgc agtgaccagg 120
cccgggcgac tgtataccaa aaacacaggt ctccgcaaag tcgtaagacc atgtatgggg 180
gctgacgcct gcccagtgcc ggaaggtcaa ggaagttggt gaactgatga cagggaagcc 240
ggcgaccgaa gccccggtga acggcggccg taactataac ggtcctaagg tagcgaaatt 300
ccttgtcggg taagttccga cccgcacgaa aggcgtaacg atctgggca 349
<210> 2158
<211> 348
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2158
gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc ccctcgcaaa agggggtcgc agtgaccagg 120
cccgggcgac tgtttaccaa aaacacaggt ctccgcaaag tcgtaagacc atgtatgggg 180
gctgacgcct gcccagtgcc ggaagtcaag gaagttggtg aactgatgac agggaagccg 240
gcgaccgaag ccccggtgaa cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc 300
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggcgtaacga tctgggca 348
<210> 2159
<211> 348
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 2159
gtgggtaggt agagaatacc taggggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc tcctcacaaa gggggtcgca gtgaccaggc 120
ccgggcgact gtttaccaaa aacacaggtc tccgcaaagt cgtaagacca tgtatggggg 180
ctgacgcctg cccagtgccg gaaggtcaag gaagttggtg acctgatgac aggggagccg 240
gcgaccgaag ccccggtgaa cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc 300
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggcgtaacga tctgggca 348
<210> 2160
<211> 348
<212> DNA
<213> Glycine max
<400> 2160
gtgggtaggt agagaatacc tagaggcgcg agacaactct ctctaaggaa ctcggcaaaa 60
tagccccgta acttcgggag aaggggtgcc tcctcacaaa gggggtcgca gtgaccaggc 120
ccgggcgact gtttaccaaa aacacaggtc tccgcaaagt cgtaagacca tgtatggggg 180
ctgacgcctg cccagtgccg gaaggtcaag gaagttggtg acctgatgac aggggagccg 240
acgaccgaag ccccggtgaa cggcggccgt aactataacg gtcctaaggt agcgaaattc 300
cttgtcgggt aagttccgac ccgcacgaaa ggcgtaacga tctgggca 348
<210> 2161
<211> 114
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2161
gtattgcgag acagccagaa gcagaaggta aaatacgcgg tactttattg cttagtctag 60
cttttatgga agctttaaca atttatggac tagttgtggc actggcgctt ttat 114
<210> 2162
<211> 87
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2162
ccagaagcag aaggtaaaat acgcggtact ttattgctta gtctagcttt tatggaagct 60
ttaacaattt atggactagt tgtggca 87
Claims (11)
- 3' 말단에서 2 개 염기가 TG 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNN (SEQ ID NO: 2060, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 으로 표시되는 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드, 및 3' 말단에서 3 개 염기가 TGC 인 것을 제외하고 TAAGAGACAGNNN (SEQ ID NO: 2061, 여기서 N 은 A, G, C 또는 T 중 임의의 것을 나타냄) 으로 표시되는 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 랜덤 프라이머로서 포함하는, 랜덤 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서, 15 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 3' 말단에서의 2 개 염기가 GG, GT, AT 또는 CC 인 SEQ ID NO: 2060 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는, 랜덤 프라이머 세트.
- 제 1 항에 있어서, 63 개 유형의 올리고뉴클레오티드 중에서 3' 말단에서의 3 개 염기가 GGA, GGG, GTG, GTA, ATA 또는 CCA 인 SEQ ID NO: 2061 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하지 않는, 랜덤 프라이머 세트.
- 게놈 DNA 를 주형으로서 사용하여, 게놈 DNA 및 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 랜덤 프라이머 세트에서 선택되는 랜덤 프라이머를 고농도로 함유하는 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실시하여 DNA 단편을 수득하는 것을 포함하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서, 반응액이 4 내지 200 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
- 제 4 항에 있어서, 반응액이 4 내지 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
- 하기 단계를 포함하는 DNA 라이브러리의 제조 방법:
게놈 DNA 를 주형으로서 사용하여, 게놈 DNA 및 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 랜덤 프라이머 세트에서 선택되는 랜덤 프라이머를 고농도로 함유하는 제 1 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실시하여, 제 1 DNA 단편을 수득하는 단계; 및 제 1 DNA 단편, 및 프라이머로서, 랜덤 프라이머의 5' 말단에서의 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 3' 말단에서 포함하는 뉴클레오티드를 함유하는 제 2 반응액에서 핵산 증폭 반응을 실시하여, 제 1 DNA 단편 및 이에 라이게이션된 뉴클레오티드를 포함하는 제 2 DNA 단편을 수득하는 단계. - 제 7 항에 있어서, 제 1 반응액이 4 내지 200 microM 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서, 제 1 반응액이 4 내지 100 microM 의 농도로 랜덤 프라이머를 함유하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서, 제 2 DNA 단편을 증폭하는 프라이머가 뉴클레오티드 서열분석에 사용되는 영역을 포함하거나, 주형으로서 제 2 DNA 단편 사용을 포함하는 핵산 증폭 반응 또는 반복 핵산 증폭 반응에 사용되는 프라이머가 뉴클레오티드 서열분석에 사용되는 영역을 포함하는, DNA 라이브러리의 제조 방법.
- 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 DNA 라이브러리의 제조 방법에 의해 제조되는 DNA 라이브러리.
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