JP5389638B2

JP5389638B2 - 制限断片に基づく分子マーカーのハイスループットな検出

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Publication number: JP5389638B2
Application number: JP2009504137A
Authority: JP
Inventors: アイク，ミカエル，ヨセフス，テレシアヴァン; ホヘルス，レネ，コルネリス，ヨセフス
Original assignee: キージーンナムローゼフェンノートシャップ
Priority date: 2006-04-04
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2027-04-04
Also published as: WO2007114693A2; US20140303007A1; EP2963127A1; EP2963127B1; EP3239304A1; US20090253581A1; HK1244301A1; US20200181694A1; PT2963127T; DK3239304T3; HK1219761A1; ES2545264T3; JP2013215212A; US10023907B2; EP3239304B1; US20120135871A1; JP2009536817A; DK2002017T3; PL2963127T3; ES2645661T3

Description

本発明は、分子生物学及びバイオテクノロジーの分野に関する。特に、本発明は、核酸の検出及び同定の分野に関する。より詳細には、本発明は、マーカー、特に分子マーカーを検出及び同定する方法に関する。本発明は、分子マーカーをハイスループットで検出及び同定する方法の条件に関係する。本発明はさらに、広範な遺伝的形質、遺伝子、ハプロタイプ及びそれらの組合せに関するヌクレオチド配列の同定、検出の少なくとも一方における方法の適用に関する。本発明は、植物、動物、ヒト、人工物その他、任意の起源に由来する分子マーカーのハイスループットな検出及び同定の分野で使用され得る。

ゲノムＤＮＡの調査は、科学界、特に医学界によって長く望まれてきた。ゲノムＤＮＡは、癌及びアルツハイマー病等の疾患の同定、診断、及び治療の鍵を握る。ゲノムＤＮＡの調査は、疾患の同定及び治療に加えて、植物及び動物の品種改良事業において著しい利点を提供し得るので、世界中の食糧栄養問題に対する解決策が得られる可能性がある。

多くの疾患が、特異的な遺伝要素、特に特異的な遺伝子の多型に関連することが知られている。ゲノム等の大きな試料における多型の同定は、現在、困難な且つ多くの時間を要する課業である。しかしながら、かかる同定は、生物医学研究、医薬品の開発、組織適合試験、遺伝子型決定、及び集団研究等の領域に対して非常に価値がある。

マーカー、具体的には遺伝子マーカーは、非常に長い間、遺伝子型同定法として、即ち、表現型形質をＤＮＡ（遺伝子）の特定部分の有無又は量と結び付けるために使用されてきた。最も用途の広い遺伝子型同定技術の１つが、既に何十年にもわたって知られており、任意の生物体に広く適用可能なＡＦＬＰである（概説に関しては、Savelkoul et al. J. Clin. Microbiol, 1999, 37(10), 3083-3091; Bensch et al. Molecular Ecology, 2005, 14, 2899-2914を参照されたい）。

ＡＦＬＰ技術（Zabeau & Vos, 1993; Vos et al., 1995）は１９９０年代初頭の発明以来、植物の品種改良及び他の分野において普及してきた。これはＡＦＬＰの幾つかの特性に起因するが、中でも最も重要なのは、事前の配列情報を必要とせずに、再現可能な様式で多数の遺伝子マーカーが生成されることである。また、ＡＦＬＰの要である選択的増幅の原理は、増幅断片の数が、ゲノムサイズ又は起源とは無関係に検出システムの分解能と調和し得ることを保証する。

ＡＦＬＰ断片の検出は一般にスラブゲル上での電気泳動（Vos et al., 1995）又はキャピラリ電気泳動（van der Meulen et al., 2002）によって実行される。こうしてスコアリングされるＡＦＬＰマーカーの大部分は、ＡＦＬＰ鋳型調製に使用される制限酵素認識部位又は選択的ＡＦＬＰプライマーによって覆われるそれらのフランキングヌクレオチドのいずれかで生じる（一塩基）多型を表す。残りのＡＦＬＰマーカーは、制限断片の内部配列で生じる挿入／欠失多型、及び小さな制限断片（＜およそ１００ｂｐ）で生じる一塩基置換における非常に小さな画分であり、これらの断片に対し、電気泳動で観察し得る両アレル間での再現可能な移動度の変動を引き起こす。これらのＡＦＬＰマーカーはバンド強度に依存する必要なしに、共優性としてスコアリングされ得る。

それゆえ、典型的なＡＦＬＰフィンガープリント法において、ＡＦＬＰマーカーは増幅断片の少数（５０％未満であるが、２０％未満であることが多い）を構成する一方、残りは一般に定常（constant）ＡＦＬＰ断片と称される。にもかかわらず、後者がゲルスコアリング手順で有用であるのは、それらがＡＦＬＰマーカーの断片移動度を算出するためのアンカーポイントとして機能し、共優性スコアリングのためのマーカーを定量する際の助けとなるからである。現在は、ＡＦＬＰマーカーの共優性スコアリング（ホモ接合性又はヘテロ接合性に対するスコアリング）は、分離集団をフィンガープリントするという状況に制限されている。関連のない系統のパネルでは、優性スコアリングのみが可能である。

増幅工程及び検出工程における高い多重レベルのために、ＡＦＬＰのスループットは非常に高いが、律速段階は電気泳動の分解能である。電気泳動により、制限酵素の組合せ（ＥＣ）、プライマーの組合せ（ＰＣ）及び移動度の組合せに基づく、増幅断片の大部分の一意的な同定が可能となるが、電気泳動は、移動度の差異に基づき増幅断片を区別することが可能であるに過ぎない。同様の移動度を有する断片は、いわゆる「積層（stacked）バンド」として見出されることが多く、電気泳動では、いわゆる「定常バンド」、即ち、比較種間で異ならないように見える増幅制限断片に含有される情報に注目することができない。さらに、典型的なゲル系システム又はＭｅｇａＢＡＣＥ等のキャピラリシステムでは、試料を並行して流す必要があり、ゲル上の１レーン当たり、又は１キャピラリ当たり約１００個〜１５０個のバンドしか分析することができない。こうした制限もスループットを妨害する。

理想的には、検出システムは増幅断片の全配列を求めて、すべての増幅制限断片を捕捉可能であるべきである。しかしながら、ほとんどのハイスループットシークエンシング技術は、依然として典型的には長さ１００ｂｐ〜５００ｂｐのＡＦＬＰ断片全体を包含するシークエンシング読取りを提供することができない。

今のところ、シークエンシングによるＡＦＬＰマーカー／配列の検出は、数ある制限の中でも、Sangerのジデオキシシークエンシング技術及び他の従来のシークエンシング技術のコスト的な制限により経済的に実現不可能となっている。

移動度決定の代わりにシークエンシングによる検出を行うと、スループットが増大する。理由：
１）内部配列に位置する多型は、ほとんどの（又はすべての）増幅断片中に検出される。これによりＰＣ毎のマーカー数がかなり増大する。
２）ＡＦＬＰマーカー及び定常バンドの共遊走（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）によるＡＦＬＰマーカーの減少がない。
３）共優性スコアリングはバンド強度の定量化に依存せず、且つフィンガープリントされる個体の関連性から独立している。

しかしながら、制限断片全体のシークエンシングによる検出は、依然として比較的不経済である。さらに、例えば本明細書中の他の部分で開示される、現行技術水準のシークエンシング技術（454 Life Sciences、www.454.com及びSolexa、www. solexa.comによる）は、その圧倒的なシークエンシング能にも関わらず、制限長断片のシークエンシングしか提供できない。また、現行方法は１回の操作で多くの試料を同時に処理することができない。

定義
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。かかる用語に与えられる範囲を含む、明細書及び特許請求の範囲についての明確な且つ一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書中で特に規定しない限り、使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものと同一の意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示内容全体が、参照により本明細書中に援用される。

核酸：本発明に記載の核酸は、ピリミジン塩基及びプリン塩基、好ましくはシトシン、チミン及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーをそれぞれ含み得る（Albert L. Lehninger著「生化学の原理（Principles of Biochemistry）」、793-800（Worth Pub. 1982）（この全体がすべての目的のために参照により本明細書中に援用される）を参照されたい）。本発明では、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸成分、及びそれらの任意の化学的な変形（例えばこれらの塩基のメチル化された形式、ヒドロキシメチル化された形式又はグリコシル化された形式）等が考えられる。ポリマー又はオリゴマーは、組成物中で不均質でも均質でもよく、天然の供給源から単離してもよく、人為的又は合成的に生成してもよい。また核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの混合物であってもよく、恒久的に又は一時的に、一本鎖形態、又はホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖、及びハイブリッド状態を含む、二本鎖形態で存在してもよい。

ＡＦＬＰ：ＡＦＬＰとは、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼにより核酸を消化して制限断片を生成すること、アダプタを制限断片にライゲートすること、及びアダプタと（一部）相補的であり、制限エンドヌクレアーゼの残部と（一部）相補的であり、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ（又は場合によってはＵ）の中からランダムに選択される少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含有する少なくとも１つのプライマーを用いて、アダプタとライゲートした制限断片を増幅することに基づく核酸の選択的増幅法を指す。ＡＦＬＰには事前配列情報は全く必要なく、ＡＦＬＰは任意の開始ＤＮＡで実施し得る。概してＡＦＬＰは、
（ａ）核酸、特にＤＮＡ又はｃＤＮＡを１つ又は複数の特異的な制限エンドヌクレアーゼで消化する工程であって、対応する一連の制限断片へとＤＮＡを断片化する、消化工程と、
（ｂ）こうして得られた制限断片を、一端が制限断片の一端又は両端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプタとライゲートする工程であって、それによりアダプタとライゲートした（好ましくは、タグ付けした）開始ＤＮＡの制限断片を生成する、ライゲート工程と、
（ｃ）アダプタとライゲートした（好ましくは、タグ付けした）制限断片を、ハイブリダイズする条件下で、その３’−末端に選択ヌクレオチドを含有する１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程と、
（ｄ）プライマーとハイブリダイズした、アダプタとライゲートした（好ましくは、タグ付けした）制限断片を、ＰＣＲ又は同様の技法によって増幅する工程であって、プライマーがハイブリダイズする開始ＤＮＡの制限断片に沿ってハイブリダイズしたプライマーのさらなる伸長を引き起こす、増幅工程と、
（ｅ）こうして得られた増幅又は伸長したＤＮＡ断片を、検出、同定、又は回収する工程とを含む。

したがって、ＡＦＬＰはアダプタとライゲートした断片の再現可能なサブセットを提供する。ＡＦＬＰは欧州特許第５３４８５８号、米国特許第６０４５９９４号、及びVos et al.に記載されている。ＡＦＬＰに関するさらなる詳細に関しては、これらの刊行物が参照される。ＡＦＬＰは複雑度低減技法及びＤＮＡフィンガープリント技術として一般に使用される。ＡＦＬＰをフィンガープリント技術として使用する状況の中で、ＡＦＬＰマーカーの概念が発展してきた。

ＡＦＬＰマーカー：ＡＦＬＰマーカーは、同一のプライマーの組を使用して、ＡＦＬＰを使用して増幅した（フィンガープリントした）２つの試料間で異なる、増幅したアダプタとライゲートした制限断片である。したがって、この増幅したアダプタとライゲートした制限断片の有無は、形質又は表現型と連鎖するマーカーとして使用され得る。従来のゲル技術において、ＡＦＬＰマーカーは、ゲル中に或る特定の移動度で位置するバンドとして現れる。キャピラリ電気泳動等の他の電気泳動技法は、これをバンドと称し得ないが概念は同一のままであり、即ち、核酸が或る特定の長さ及び移動度を有する。バンドの有無は表現型の有無を示唆（又はそれと関連）し得る。典型的には、ＡＦＬＰマーカーはエンドヌクレアーゼの制限部位内の又は選択ヌクレオチド内のＳＮＰを包含する。時として、ＡＦＬＰマーカーは制限断片内のインデルを包含し得る。

定常バンド：ＡＦＬＰ技術における定常バンドは、試料間で比較的不変の、増幅したアダプタとライゲートした制限断片である。したがって、ＡＦＬＰ技術における定常バンドは、様々な試料にわたって、ゲル中のほぼ同一位置に現れ、即ち、同一の長さ／移動度を有する。従来のＡＦＬＰにおいて、これらは典型的には、ゲル上の試料に対応するレーン又はキャピラリ電気泳動によって検出される複数のＡＦＬＰ試料の電気泳動図をアンカーする（anchor）のに使用される。典型的には、定常バンドはＡＦＬＰマーカーよりも情報不足である。にもかかわらず、ＡＦＬＰマーカーが通例（customary）選択ヌクレオチド又は制限部位内にＳＮＰを包含するのと同様に、定常バンドは制限断片自体にＳＮＰを含む可能性があり、定常バンドはＡＦＬＰマーカーと相補的な遺伝情報の興味深い代替供給源となる。

選択塩基：選択塩基は、アダプタと相補的な部分、及び制限部位の残部と相補的な部分を含有するプライマーの３’末端に位置し、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧの中からランダムに選択される。選択塩基を用いてプライマーを伸長することにより、続く増幅ではアダプタとライゲートした制限断片の再現可能なサブセットのみ、即ち、選択塩基を保有するプライマーを使用して増幅し得る断片のみが生成される。選択ヌクレオチドは１個〜１０個の数でプライマーの３’末端に付加され得る。典型的には、１個〜４個で十分である。両プライマーは様々な数の選択塩基を含有し得る。それぞれ付加された選択塩基に応じて、サブセットはサブセット中の増幅したアダプタとライゲートした制限断片の量を約４分の１に低減させる。典型的には、ＡＦＬＰで使用される選択塩基の数は＋Ｎ＋Ｍで示される（この場合、１つのプライマーがＮ個の選択ヌクレオチドを保有し、且つ他のプライマーがＭ個の選択ヌクレオチドを保有する）。したがって、Ｅｃｏ／Ｍｓｅ＋１／＋２ＡＦＬＰとは、開始ＤＮＡのＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩによる消化、適切なアダプタのライゲーション、並びに１つの選択塩基を保有するＥｃｏＲＩ制限位置を対象とする１つのプライマー、及び２つの選択ヌクレオチドを保有するＭｓｅＩ制限部位を対象とするもう１つのプライマーを用いる増幅の省略表現である。少なくとも１つの選択ヌクレオチドをその３’末端に保有する、ＡＦＬＰで使用されるプライマーもＡＦＬＰプライマーとして描写される。選択ヌクレオチドをその３’末端に保有せず、且つ実際はアダプタ及び制限部位の残部と相補的なプライマーは、ＡＦＬＰ＋０プライマーとして示されることもある。

クラスタリング：「クラスタリング」という用語は、短く又は長く続く同一又は類似のヌクレオチドの存在に基づいて、２つ以上のヌクレオチド配列を比較することを意味する。以下でさらに説明するように、幾つかのヌクレオチド配列のアライメント方法が当該技術分野において既知である。「アセンブリ」又は「アライメント」という用語は、同義語として使用されることもある。

識別子：アダプタ又はプライマーに付加され得るか、その配列内に含まれ得るか、そうでなければ標識として使用されて一意の識別子を提供し得る短い配列。かかる配列識別子は、特異的な核酸試料を同定するために一意的に使用される、多様であるが規定された長さを有する一意の塩基配列であり得る。例えば、４ｂｐのタグにより、４^４＝２５６個の異なるタグができる。典型例は、ハイブリダイゼーションによる一意的な検出に一般に使用されるタグとして当該技術分野において既知のＺＩＰ配列である（Iannone et al. Cytometry 39:131-140, 2000）。かかる識別子を使用することによって、さらなる処理時にＰＣＲ試料の起源が求められ得る。異なる核酸試料に由来する処理産物を組み合わせる場合には、概して、異なる核酸試料は異なる識別子を使用して同定される。

シークエンシング：「シークエンシング」という用語は、核酸試料、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ中のヌクレオチド（塩基配列）の順番を決定することを指す。

ハイスループットスクリーニング：
ＨＴＳと略されることの多いハイスループットスクリーニングは、特に生物学及び化学の分野に関連した科学実験用の方法である。現代のロボット工学及び他の専門化した実験ハードウェアの組合せによって、研究者は大量の試料を同時に効率的にスクリーニングすることが可能となる。

制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子中の特異的なヌクレオチド配列（標的部位）を認識し、すべての標的部位又はその近くでＤＮＡ分子の両鎖を切断する酵素である。

制限断片：制限エンドヌクレアーゼによる消化によって生成するＤＮＡ分子は制限断片と称される。任意の所定のゲノム（又はその起源に関わらず核酸）は、特定の制限エンドヌクレアーゼによって制限断片の別個の組へと消化される。制限エンドヌクレアーゼ切断に由来するＤＮＡ断片は、多様な技法でさらに使用することができ、例えばゲル電気泳動によって検出することができる。

ゲル電気泳動：制限断片を検出するために、サイズに基づいてＤＮＡ分子を分画する分析法が必要となり得る。かかる分画を達成するために最も一般に使用される技法は、（キャピラリ）ゲル電気泳動である。かかるゲル中でＤＮＡ断片が移動する速度は、その分子量に依存するので、断片長が増加するにつれて移動距離は減少する。ゲル電気泳動によって分画されたＤＮＡ断片は、パターンの中に含まれた断片数が十分に少ない場合には、染色手順、例えば、銀染色又はエチジウムブロマイドを使用する染色によって直接可視化することができる。代替的には、ＤＮＡ断片のさらなる処理により、好ましくはＡＦＬＰ産物の１つの鎖を標識するのに使用される蛍光体（fluorophore：フルオロフォア）又は放射性標識等の検出可能な標識を断片に組み込み得る。

ライゲーション：２つの二本鎖ＤＮＡ分子を相互に共有結合で結合させるリガーゼ酵素によって触媒される酵素反応は、ライゲーションと称される。概して、両方のＤＮＡ鎖は相互に共有結合で結合するが、鎖の末端の１つの化学的修飾又は酵素的修飾を通じて、２つの鎖のうちの１つの鎖のライゲーションを防ぐことも可能である。その場合には、共有結合が２つのＤＮＡ鎖のうち１つのみで生じる。

合成オリゴヌクレオチド：化学的に合成することができる、好ましくは約１０塩基〜約５０塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドと称される。概して、これらの合成ＤＮＡ分子は、一意又は所望のヌクレオチド配列を有するように設計されるが、関連配列を有し、且つヌクレオチド配列内の特定位置に異なるヌクレオチド組成を有する分子のファミリーを合成することが可能である。「合成オリゴヌクレオチド」という用語は、設計した又は所望のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を指すために使用される。

アダプタ：制限断片末端にライゲーションすることができるように設計されている、限られた数の塩基対、例えば約１０塩基対長〜約３０塩基対長を有する短い二本鎖ＤＮＡ分子。アダプタは概して、互いに一部相補的なヌクレオチド配列を有する２つの合成オリゴヌクレオチドから構成される。適切な条件下、溶液中で２つの合成オリゴヌクレオチドを混合すると、これらは互いにアニーリングして二本鎖構造を形成する。アニーリング後、アダプタ分子の一端は、制限断片の末端と適合し、それとライゲートできるように設計される。アダプタの他端は、ライゲートできないように設計することができるが、そうである必要はない（二重にライゲートしたアダプタ）。

アダプタとライゲートした制限断片：アダプタでキャッピングした制限断片。

プライマー：概して、「プライマー」という用語は、ＤＮＡの合成をプライムすることができるＤＮＡ鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしではＤＮＡをデノボ（ｄｅｎｏｖｏ）合成することができない。即ち、アセンブリするヌクレオチドの順番を指示するための鋳型として相補鎖が使用される反応において、ＤＮＡポリメラーゼは既存のＤＮＡ鎖しか伸長することができない。本発明者らは、プライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用される合成オリゴヌクレオチド分子を指す。

ＤＮＡの増幅：「ＤＮＡの増幅」という用語は、典型的には、ＰＣＲを使用する二本鎖ＤＮＡ分子のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）合成を指し示すために使用される。他の増幅方法が存在し、それらが趣旨を逸脱することなく、本発明で使用され得ることに留意されたい。

本発明者らは、（ＡＦＬＰ）マーカー技術の多用性及び適用性を、現行技術水準のハイスループットシークエンシング技術の多用性及び適用性と組み合わせることができる汎用方法を考案することによって、上記課題及び当該技術分野における他の課題を克服できることを見出した。

したがって、本発明者らは、アダプタとライゲートした制限断片に試料特異的識別子を組み込むこと及び／又は制限断片の配列の一部のみを求めることによって、既存技術の非常に効率的且つ確実な改善が得られることを見出した。試料特異的識別子を組み込むことによって、複数の試料を一回の操作でシークエンスすることができ、制限断片の一部のみをシークエンスするだけで、制限断片の十分な同定を達成できることが見出された。
即ち、本発明によれば、試料中の制限断片を同定する方法であって、
（ａ）試料核酸を提供する工程と、
（ｂ）前記試料核酸を、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化する工程であって、制限断片の組が得られる、消化工程と、
（ｃ）二本鎖合成アダプタを提供する工程であって、
５’プライマー適合配列と、
試料特異的識別子区間と、
前記制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列の残部と相補的な区間とを含む、二本鎖合成アダプタを提供する工程と、
（ｄ）前記二本鎖合成アダプタを、組になった前記制限断片にライゲートする工程であって、アダプタとライゲートした制限断片の組が得られる、ライゲート工程と、
（ｆ）少なくとも前記試料特異的識別子区間の前記配列、前記制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列の残部、及びそれに隣接して位置する、前記アダプタとライゲートした制限断片の前記制限断片の前記配列の一部を求める工程と、
（ｇ）前記試料中の増幅したアダプタとライゲートした制限断片の有無を同定する工程とを含む、試料中の制限断片を同定する方法が得られる。
ここで、本発明において、前記(ｄ)工程と前記（ｆ）工程の間に、更に、以下の（ｅ）前記試料特異的識別子区間、及び前記制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列の残部と相補的な前記区間、と少なくとも相補的な１つ又は複数のプライマーを用いて、アダプタとライゲートした制限断片の前記組を増幅する工程であって、増幅したアダプタとライゲートした制限断片であるアンプリコンが得られる、増幅工程とを有し、前記（ｆ）工程の前記アダプターとライゲートした制限断片は前記（ｄ）工程によって増幅され、前記制限断片が分子マーカーであることが好ましい。

一態様において、本発明は、試料中の制限断片を同定する方法であって、
（ａ）試料核酸を提供する工程と、
（ｂ）試料核酸を、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化する工程であって、制限断片の組が得られる、消化工程と、
（ｃ）二本鎖合成アダプタを提供する工程であって、
５’プライマー適合配列と、
試料特異的識別子区間と、
制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部と相補的な区間とを含む、二本鎖合成アダプタを提供する工程と、
（ｄ）二本鎖合成アダプタを、組になった制限断片にライゲートする工程であって、アダプタとライゲートした制限断片の組が得られる、ライゲート工程と、
（ｅ）以下の：
試料特異的識別子区間、及び
制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部と相補的な区間、
と少なくとも相補的な１つ又は複数のプライマーを用いて、アダプタとライゲートした制限断片の組を増幅する工程であって、増幅したアダプタとライゲートした制限断片（アンプリコン（単位複製配列））が得られる、増幅工程と、
（ｆ）少なくとも試料特異的識別子区間の配列、制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部、及びそれに隣接して位置する、増幅したアダプタとライゲートした制限断片（の一部）の制限断片の配列の一部を求める工程と、
（ｇ）試料中の増幅したアダプタとライゲートした制限断片の有無を同定する工程とを含む、試料中の制限断片を同定する方法に関する。

このように試料核酸を処理することによって、シークエンスされる試料毎に、増幅制限断片の組が得られる。すべての制限断片は、各試料で異なる試料特異的識別子によって、或る特定の試料に起源を有するものとして同定することができる。増幅したアダプタとライゲートした制限断片のシークエンシングにより、アダプタとライゲートした制限断片の少なくとも一部に対する配列情報が得られる。アダプタ由来部分に含有される情報は、断片が得られる試料に関する情報を含有する一方、制限断片自体からの配列情報により、制限断片に関する情報が得られ、制限断片の同定が可能となる。制限断片に関する本配列情報を使用して、求めるヌクレオチド数、及び増幅したアダプタとライゲートした制限断片の組になった制限断片数に応じて決まる精度で制限断片を同定する。

複数の断片の組に含有されるシークエンシングによって分子マーカーを同定する精度に影響を及ぼすサンプリング変動の課題に対する解決法を提供するために、本発明者らは、シークエンシングを介したマーカーの検出が、好ましくは少なくとも１回すべての増幅断片をサンプリングするのに十分な重複（深度）で実施され、呼び出される遺伝子型の精度に比したサンプリング変動の課題を扱う統計的手段を伴うことも見出した。さらに、ＡＦＬＰスコアリングとちょうど同じように、分離集団の状況において、一実験での親個体の同時スコアリングは統計的閾値を求める助けとなる。

したがって、或る特定の実施形態において、タグ付けした増幅したアダプタとライゲートした制限断片の重複は少なくとも６、好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、最も好ましくは少なくとも９である。或る特定の実施形態において、各アダプタとライゲートした制限断片の配列は少なくとも６倍、好ましくは少なくとも７倍、より好ましくは少なくとも８倍、最も好ましくは少なくとも９倍求められる。或る特定の実施形態において、重複は、遺伝子座をホモ接合として正確に同定する可能性が全体で５０／５０であると仮定して、遺伝子座を正確に同定する可能性が９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％より高くなるように選択される。

この点において、以下の計算は例示であり得る。本明細書中の他の部分で記載されるSolexaのシークエンシング技術は、それぞれ約２５ｂｐの４０００００００個の読取りを提供し、一回の操作では合計でなんと１００万ｂｐにも達する。サンプリングにおける重複を１０回と仮定すると、４００００００個の一意の断片を１回の操作で評価することができる。１００個の試料を組み合わせると、各試料に対して４００００個の断片がシークエンスされることが可能となる。ＡＦＬＰの観点から見ると、これは、１６０個のプライマーをそれぞれ２５０個の断片と組み合わせることに相当する。

本方法により、電気泳動に基づく従来のマーカー検出とは異なる方法で制限断片の同定が可能となる。

制限断片を同定する方法の第１の工程において、試料核酸が提供される。試料中の核酸は通常ＤＮＡの形態である。しかしながら、試料中に含有されるヌクレオチド配列情報は、例えば、ＲＮＡ、ポリＡ＋ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ若しくは葉緑体ＤＮＡ等のオルガネラＤＮＡ、合成核酸、ＤＮＡライブラリ（ＢＡＣライブラリ／プールしたＢＡＣクローン等）、クローンバンク、又はそれらの任意の選択若しくは組合せを含む、核酸の任意の供給源由来であり得る。核酸試料中のＤＮＡは二本鎖、一本鎖、及び一本鎖ＤＮＡに変性した二本鎖ＤＮＡであり得る。ＤＮＡ試料は、植物、動物、合成品、又はヒトであれ、任意の生物体由来であり得る。

核酸試料は、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで制限（又は消化）されて、制限断片の組を提供する。或る特定の実施形態では、２つ以上のエンドヌクレアーゼを使用して、制限断片を得ることができる。エンドヌクレアーゼは、フリークエントカッター（frequent cutter）（認識配列３ｂｐ〜５ｂｐ、例えばＭｓｅＩ）又はレアカッター（認識配列＞５ｂｐ、例えばＥｃｏＲＩ）であり得る。或る特定の好ましい実施形態では、レアカッター及びフリークエントカッターの組合せが好ましい。或る特定の実施形態では、特に試料が比較的大きなゲノムを含有するか、又はそれに由来する場合、第３の酵素（レアカッター又はフリークエントカッター）を使用して、より短いサイズの制限断片のより大きな組を得ることが好ましい可能性がある。

制限エンドヌクレアーゼとしては、任意のエンドヌクレアーゼで十分である。典型的には、ＥｃｏＲＩ、ＭｓｅＩ、ＰｓｔＩ等のＩＩ型エンドヌクレアーゼが好ましい。或る特定の実施形態では、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ、即ち、認識配列が制限部位の遠位に位置するエンドヌクレアーゼ、即ち、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＸＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｖＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｃＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｃｅｆＩ、ＢｃｇＩ、ＢｉｎＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ（ＢｓｍＦｌ）、ＢｓｐＭＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ（Ｅｃｏ３ｌＩ）、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＧｓｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｉｎＧＵＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｇｏＶＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＲｌｅＡＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＴａｑＪＩ及びＴｔｈ１１１ＩＩ（ＺｔｈｌｌｌＩＩ）等が使用され得る。この種の制限エンドヌクレアーゼの使用が、本明細書の他の部分で記載する方法への或る特定の適応につながる。

使用するエンドヌクレアーゼに応じて、制限断片は平滑末端化されるか、又は突出末端を有し得る。これらの末端にアダプタがライゲートし得る。典型的には、本発明で使用されるアダプタには特別な設計がある。本発明で使用されるアダプタは、５’−プライマー適合配列を含み得る。これは任意選択であり、引き続くプライマーアニーリング用の十分な長さのアダプタを提供することができ、その後に、４ヌクレオチド〜１６ヌクレオチドを含み得る試料特異的識別子区間が続く。好ましくは、試料特異的識別子は、シークエンシング工程中の読み過しを防ぐために、２つ以上の連続同一塩基を含有しない。さらに、場合によっては、２つ以上の試料を組み合わせ、複数の試料特異的識別子を使用して、試料の起源を区別する。好ましくは、試料特異的識別子間の差異は少なくとも２ｂｐ、好ましくは３ｂｐである。これにより、試料を集めたプール内の異なる試料特異的識別子間の判別の改善が可能となる。アダプタの３’末端には、制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部と相補的な区間が位置する。例えば、ＥｃｏＲＩは、５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’を認識し、ＧとＡＡＴＴＣとの間で切断する。ＥｃｏＲＩに関して、制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部と相補的な区間アダプタは、したがってＣ−ヌクレオチドである。

アダプタは、制限断片の片側又は両側とライゲート（共有結合的に連結）する。消化が２つ以上のエンドヌクレアーゼを用いて実施される場合、アダプタとライゲートした制限断片の異なる組を生成する異なるアダプタが使用され得る。

アダプタとライゲートした制限断片は続けて、１つ又は複数のプライマーの組で増幅される。プライマーはアダプタのみと相補的であり、即ち、非選択的増幅であり得る。好ましくはプライマーは、試料特異的識別子と相補的な区間、及び制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部と相補的な区間を含有する。或る特定の実施形態において、プライマーは、その３’末端に１つ又は複数の選択ヌクレオチドを含有して、増幅したアダプタとライゲートした制限断片のサブセットを提供し得る。プライマーはまた、その５’末端にさらなるヌクレオチドを含有して、プライマーがアダプタとライゲートした制限断片にアンカーする手助けをし得る。或る特定の実施形態において、プライマーは、ＬＮＡ又はＰＮＡ等の、改善したハイブリダイゼーション特性を発現するヌクレオチドを含有し得る。プールに集めた試料からアダプタとライゲートした制限断片を増幅するために、縮重したプライマーの組、即ち、各試料に対して、対応する試料識別子がプライマーに組み込まれるプライマーの組を使用することが可能である。或る特定の実施形態では、識別子区間が完全に（又は少なくともかなりの程度）縮重している、即ち、ヌクレオチドの（ほとんど）すべての組合せが試料識別子区間内に提供される、プライマーの組を使用することが可能である。増幅におけるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件と、ＬＮＡ型ヌクレオチド又はＰＮＡ型ヌクレオチドの任意選択での使用とを組み合わせて、ハイブリダイゼーション特性を増大させると、これは、非常に効率的な増幅につながり得る。

アダプタとライゲートした制限断片の増幅により、増幅したアダプタとライゲートした制限断片（単位複製配列と称されることもある）の組が生じる。

単位複製配列（又はその少なくとも一部）は、少なくとも、試料特異的識別子の配列を求めて、断片の起源、及び制限断片の配列の一部の起源を求めることを含む工程に付される。実際には、これも、例えば制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部の間に位置する区間を求めることに相当する。アダプタに由来する配列と隣接して位置する断片の一部を組み合わせて試料特異的な識別子をシークエンスすることによって、制限断片を一意的に同定することが可能である。表現型の有無と相関がある場合、これら一意的に同定した制限断片は分子マーカーとして使用することができる。これにより、新世代のマーカーの確定が可能となり、したがって多用性の実証されたＡＦＬＰ技術を用いた新規マーカー技術となるが、これはハイスループット技術に好適であり、且つ概して任意種の生物体又は核酸に適用可能である。試料中の制限断片を、本方法でそれらの配列の一部を求めることによって一意的に同定することは、複数の試料に対して繰り返すことができる。試料中の描写配列を有する制限断片の有無は、表現型の有無を示す。

ＡＦＬＰとハイスループットシークエンシングとの組合せに基づく本発明のマーカー技術のさらなる利点は、従来のＡＦＬＰ技術と比較して得ることができるさらなる情報である。ＡＦＬＰにおいて、ＡＦＬＰマーカーとして指定される単位複製配列は、典型的には認識部位、制限部位、又は任意選択で選択ヌクレオチドに多型を含有する。さらに制限断片中に位置する多型は、典型的には、（おそらくインデル多型とは別の）ＡＦＬＰマーカーとは見なされない。本シークエンシング工程では、任意選択の選択ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドも求められ、これは、数の増加した分子マーカーの同定、及び既存のマーカー技術における改善につながる。

本発明で使用されるハイスループットシークエンシングは、特に生物学及び化学の分野に関連した科学実験用の方法である。現代のロボット工学及び他の専門化した実験ハードウェアの組合せによって、研究者は大量の試料を同時に効率的にスクリーニングすることが可能となる。

シークエンシングは、国際公開第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号、及び同第ＷＯ２００５／００３３７５（すべて454 Life Sciences名義）、Seo et al.（2004）による、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93、並びにHelios、Solexa、UＳ Genomics等の技術（これらは参照により本明細書中に援用される）で開示されている方法等のハイスループットシークエンシング法を使用して実施されることが好ましい。

454 Life Sciences技術
或る特定の実施形態において、シークエンシングは、国際公開第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号、及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべて454 Life Sciences名義）（これらは参照により本明細書中に援用される）に開示されている装置及び／又は方法を使用して実施されることが好ましい。記載されている技術は、１回の操作での４０００万塩基のシークエンシングを可能にし、競合技術よりも１００倍速く、且つ安価である。シークエンシング技術は、大まかには５工程：１）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリを作製するための、ＤＮＡの断片化及び特異的なアダプタのライゲーション、２）ｓｓＤＮＡのビーズへのアニーリング、油中水型マイクロリアクタにおけるビーズの乳化、及び個々のｓｓＤＮＡ分子をビース上で増幅するためのエマルジョンＰＣＲの実施、３）表面上に増幅したｓｓＤＮＡ分子を含有するビーズの選択／濃縮、４）ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ（商標）プレートにおける、ＤＮＡ担持ビーズの沈着、及び５）ピロリン酸光シグナルの生成による１０００００ウェルでの同時シークエンシングから構成される。以下、本方法をより詳細に説明する。

好ましい実施形態において、シークエンシングは、
（ａ）アダプタと結合した断片をビーズにアニーリングする（各ビーズは単一のアダプタと結合した断片とアニーリングする）工程と、
（ｂ）ビーズを油中水型マイクロリアクタ中で乳化させる（各油中水型マイクロリアクタは単一のビーズを含む）工程と、
（ｃ）ビーズをウェルに充填する（各ウェルは単一のビーズを含む）工程と、ピロリン酸シグナルを生成する工程とを含む。

第１の工程（ａ）において、シークエンシングアダプタは、組合せライブラリ内で断片とライゲートする。上記シークエンシングアダプタは、少なくともビーズにアニーリングするための「鍵」領域、シークエンシングプライマー領域、及びＰＣＲプライマー領域を含む。したがって、アダプタと結合した断片が得られる。第１の工程では、アダプタと結合した断片をビーズにアニーリングする（各ビーズは単一のアダプタと結合した断片とアニーリングする）。アダプタと結合した断片のプールに過剰のビーズを加えることにより、大部分のビーズに関して、ビーズ毎に単一のアダプタと結合した断片のアニーリングが保証される（ポワソン分布）。

次の工程では、ビーズを油中水型マイクロリアクタ中で乳化させる（各油中水型マイクロリアクタは単一のビーズを含む）。ＰＣＲ試薬が油中水型マイクロリアクタ内に存在することにより、ＰＣＲ反応がマイクロリアクタ内部で起こることが可能となる。続いて、マイクロリアクタを破壊して、ＤＮＡを含むビーズ（ＤＮＡポジティブビーズ）を濃縮する。

続く工程では、ビーズをウェルに充填する（各ウェルは単一のビーズを含む）。ウェルは、好ましくは大量の断片の同時シークエンシングを可能にするＰｉｃｏＴｉｔｅｒ（商標）プレートの一部である。

酵素担持ビーズの添加後、ピロシークエンシングを使用して断片の配列を求める。引き続く工程では、従来のシークエンシング試薬存在下、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ（商標）プレート並びにその中のビーズ及び酵素ビーズを異なるデオキシリボヌクレオチドに曝し、デオキシリボヌクレオチドを取り込む際に、記録される光シグナルが生成される。正確なヌクレオチドの取込みにより、検出し得るピロシークエンシングシグナルが生成される。

ピロシークエンシング自体は当該技術分野において既知であり、とりわけwww.biotagebio.com; www.pyrosequencing.comの技術欄に記載されている。本技術は、例えば、国際公開第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号、同第ＷＯ２００５／００３３７５号（すべて454 Life Sciences名義）（これらは参照により本明細書中に援用される）でさらに適用される。

本発明において、ビーズは好ましくは、場合によっては、単位複製配列と結合することが可能なプライマー（結合）配列又はその一部を備える。他の実施形態において、増幅で使用されるプライマーは、続くエマルジョン重合、その後のシークエンシングを可能にするために、例えばその５’末端に単位複製配列をビーズに結合させる配列を備える。代替的には、単位複製配列は、ビーズ又は表面とのライゲーション前にシークエンシングアダプタとライゲートし得る。単位複製配列をシークエンスすることにより、識別子の同一性、ひいては試料中の制限断片の有無の同一性が明らかになる。

Solexa技術
ハイスループットシークエンシング法の１つは、Solexa（英国）（www.solexa.co.uk）が利用可能であり、とりわけ、国際公開第ＷＯ０００６７７０号、同第ＷＯ００２７５２１号、同第ＷＯ００５８５０７号、同第ＷＯ０１２３６１０号、同第ＷＯ０１５７２４８号、同第ＷＯ０１５７２４９号、同第ＷＯ０２０６１１２７号、同第ＷＯ０３０１６５６５号、同第ＷＯ０３０４８３８７号、同第ＷＯ２００４０１８４９７号、同第ＷＯ２００４０１８４９３号、同第ＷＯ２００４０５０９１５号、同第ＷＯ２００４０７６６９２号、同第ＷＯ２００５０２１７８６号、同第ＷＯ２００５０４７３０１号、同第ＷＯ２００５０６５８１４号、同第ＷＯ２００５０６８６５６号、同第ＷＯ２００５０６８０８９号、同第ＷＯ２００５０７８１３０号に記載されている。本質的に、本方法はゲノムＤＮＡのアダプタとライゲートした断片で開始する。アダプタとライゲートしたＤＮＡは、典型的にはフローセルで、固体表面と結合したプライマーの濃密な叢（lawn）とランダムに結合する。アダプタとライゲートした断片の他端は、表面上で相補的なプライマーとハイブリダイズする。いわゆる固相架橋増幅において、ヌクレオチド及びポリメラーゼの存在下でプライマーを伸長することにより、二本鎖の断片が得られる。本固相架橋増幅は選択的増幅であり得る。変性及び固相架橋増幅の反復の結果、増幅した断片の濃密なクラスタが表面全体に分布して生成する。４つの異なる標識をした可逆性終止ヌクレオチド、プライマー及びポリメラーゼをフローセルに加えることによって、シークエンシングを開始する。プライマー伸長の第１のラウンド後、標識を検出し、第１の取込み塩基の同一性を記録し、ブロックした３’末端及び蛍光体を取込み塩基から除去する。その後、同様に、第２の塩基の同一性を判定し、そのようにシークエンシングが継続する。

本発明において、アダプタとライゲートした制限断片又は単位複製配列は、プライマー結合配列又はプライマー配列を介して表面と結合する。識別子配列及び制限断片（の一部）を含む配列は概説したように求められる。現在利用可能なSolexa技術により、約２５塩基対の断片のシークエンシングが可能である。アダプタ及び表面に結合したプライマーの経済的設計によって、シークエンシング工程は、試料識別子、制限エンドヌクレアーゼの認識配列の残部、及びいずれかの任意選択の選択塩基を読み過ごす。６ｂｐの試料識別子を使用すると、残部はレアカッターＥｃｏＲＩ由来であり（ＡＡＣＣＴ）、２つの選択塩基を使用すると、１２ｂｐの制限断片の内部配列が生成し、これを使用して、試料中の制限断片を一意的に同定することができる。

上記Solexaシークエンシング技術に基づく、好ましい実施形態において、アダプタとライゲートした制限断片の増幅は、その３’末端に最大で１つの選択ヌクレオチドを含有するプライマー、好ましくはその３’末端に選択ヌクレオチドを含有しないプライマー（即ち、プライマーがアダプタのみと相補的である）（＋０プライマー）を用いて実施される。

本明細書中に記載されるシークエンシング法を対象とする代替的な実施形態において、増幅で使用されるプライマーは、（本明細書中に記載されるプライマー又はプライマー結合配列の代用として）特異的区間を含有し得る。これは、次のシークエンシング工程で使用されて、アダプタでキャッピングした制限断片又は単位複製配列を表面に結合させる。これらは、概して鍵領域又は５’−プライマー適合配列として描写される。

本発明の一実施形態において、核酸試料は少なくとも１つの制限酵素で消化され、ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を含む少なくとも１つのアダプタがライゲートされる。続いてのＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼによるアダプタとライゲートした制限断片の消化により、ＩＩｓ型酵素の認識部位と制限部位間との距離は比較的短い（最大約３０ヌクレオチド）ので、ＩＩｓ制限部位適合アダプタがライゲートすることができる短めの制限断片及び長めの制限断片が生成する。典型的には、突出部で縮重したアダプタの組を使用し得るようなＩＩｓ制限部位の突出部は知られていない。（選択的）増幅後、単位複製配列をシークエンスすることができる。本実施形態におけるアダプタ配列は概して、５’−プライマー結合部位−−−試料識別子配列−−−縮重ＩＩｓ型付着末端配列−３’である。関連ＰＣＲプライマーは概して、プライマー配列−−−試料識別子配列−−−縮重ＩＩｓ型付着末端配列−−−選択ヌクレオチド−３’である。次に、合成によるシークエンシングの開始に使用されるプライマーは、概して、５’−プライマー結合部位−３’という構造を有する。サイズ選択工程は、ＩＩｓ酵素で消化して小さめの断片を除去した後が好ましい可能性がある。本実施形態において、制限部位の残部は、本型の酵素では、典型的には２ｂｐ〜４ｂｐ程度であるので、この結果、１５ｂｐ〜１７ｂｐの制限断片のシークエンシングにおいて６ｂｐの試料識別子を組み合わせることとなる。

さらなる態様において、本発明は、キット自体の従来の構成成分の他に、本方法で使用するための１つ若しくは複数のプライマー及び／又は１つ若しくは複数のアダプタを含む、キットに関する。さらに本発明により、用途、とりわけ、遺伝子型同定、バルクセグレガント分析、遺伝子マッピング、マーカー利用戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、連鎖不平衡マッピング目的での、分子マーカーを同定する方法の使用が見出される。

［実施例］
ＤＮＡを、従来法を使用して２つの親及び８８個の子孫から単離した。親（２×）及び子孫（＝４×）を異なる指標で二重化して、再現性を試験した。試料を互いに見分けるのに使用されるタグはそれぞれ、実験で使用される任意の他のタグとは少なくとも２ヌクレオチド異なった。アガロースゲル及びＰＡＡゲルを使用して、各種工程全体にわたって品質を試験している。

［実施例１］
各ＤＮＡ試料に対して、制限−ライゲーション工程を、酵素としてＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩを使用して実施する。アダプタは、Solexaハイスループットシークエンシングシステムの表面上に位置するハイブリダイズする配列に基づき、より詳細には、ＥｃｏＲＩアダプタはＰ５配列（シークエンスプライマー部分）を含有し、ＭｓｅＩアダプタはＰ７配列（架橋ＰＣＲプライマー配列）を含有する。ＥｃｏＲＩアダプタはさらに試料識別タグを含有する。９６個の異なるＥｃｏＲＩアダプタ及び１個のＭｓｅＩアダプタを使用する。縮重したＥｃｏＲＩアダプタを使用することが可能である。鋳型調製は、制限（ＥｃｏＲＩ＋ＭｓｅＩ）工程後であるが、アダプタライゲーション工程前に、８０℃で１０分間、混合物をインキュベートすることによるサイズ選択工程を含む。１３０ｎｔよりも小さな断片を除去する（トウモロコシ試料において）。

混合物の複雑度を、＋１プライマー（即ち、３’末端に１個のランダムな選択ヌクレオチドを含有する）を使用する選択的前増幅、９６個のＥｃｏＲＩ＋１プライマー及び１個のＭｓｅＩ＋１プライマー（又は１個のタグが縮重したＥｃｏＲＩ＋１プライマー及び１個のＭｓｅＩ＋１プライマー）を使用する選択的前増幅によって低減させる。

混合物の複雑度を所望のサイズに低減させるための選択的増幅を、ＥｃｏＲＩ＋２プライマー（＝Ｐ５側）及びＭｓｅＩ＋３（＝Ｐ７側）プライマーを使用して実施し、これには９６個のＥｃｏＲＩ＋２プライマー及び１個のＭｓｅＩ＋３プライマーの使用が必要となる。テールＰＣＲを、Ｐ５架橋ＰＣＲプライマー配列をテールとして含む、ＥｃｏＲＩプライマーを使用して実施する。産物をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムを使用して精製する。濃度を求め、標準化し、プールを作製する。プールを、架橋ＰＣＲ増幅及びシークエンシング、その後のデータ解析を含むSolexa技術に基づく超並列処理シークエンシングに付して、親及び子孫の遺伝子型を求める。

代替的なシナリオでは、テールＰＣＲを使用しないが、リン酸化ＥｃｏＲＩ＋２プライマーを利用する。元々のアダプタとのミスマッチに起因して、増幅プロファイルにおけるアニーリング温度は３℃低くして、タッチダウンの１３サイクル（６２℃〜５３℃）、その後の２３サイクル（５３℃）を実施する。Ｐ５架橋ＰＣＲ配列とのアダプタのライゲーション後、Ｐ５架橋ＰＣＲプライマー及びＰ７架橋ＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲを実施する。

第２の代替的なシナリオは、先に本明細書中で概説したような標準的な鋳型調製、複雑度を低減させるための選択的（前）増幅に基づく。選択的増幅は、再構成したＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩ制限部位を含有するプライマーを用いて実施する。これがシークエンシング前のアダプタ配列の除去を可能にすることにより、分析すべきデータ量が低減される。Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムで産物を精製することにより、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの残部を除去する。ここで、（再構成部位）アダプタ配列を、１０倍増のＥｃｏＲＩアダプタ及びＥｃｏＲＩ酵素を使用するSolexaアダプタで置換して、ゲノムＤＮＡと比較して増加したＥｃｏＲＩ部位数を補償する。SolexaのＥｃｏＲＩアダプタもタグを含有するので、９６個のタグ付けしたSolexaのＥｃｏＲＩアダプタが必要である。アダプタの下鎖の３’末端をブロックして（この場合、３’アミノによる）、ポリメラーゼによる伸長をブロックする。ＰＣＲを、Ｐ５架橋ＰＣＲプライマー及びＰ７架橋ＰＣＲプライマーを用いて実施する。産物をQiagenカラムで精製する。

［実施例２］
ＡＦＬＰ断片のシークエンス系検出を、Solexaのクローナル単分子アレイ（ＣＳＭＡＴＭ）技術、１回のシークエンス操作で最大４０００万個の個々の断片を分析することが可能な、合成によるシークエンシングプラットフォームを使用して実施した。

実験シークエンスは、ＡＦＬＰ鋳型調製、選択的（ＡＦＬＰ）増幅、単分子架橋増幅、及びＡＦＬＰ断片の１つの制限酵素末端からの何百万のシークエンスタグのシークエンシングを包含する。トウモロコシ親系統Ｂ７３及びＭｏ１７並びに８７個の組換え自植系統（ＲＩＬ）を使用し、８９０万個のＥｃｏＲＩＡＦＬＰ断片末端にわたってシークエンスすることにより、シークエンス系ＡＦＬＰ検出に対する原理証明を得た。

親系統Ｂ７３及びＭｏ１７並びに８７個のＲＩＬを選択した。ＡＦＬＰ鋳型を、制限酵素の組合せＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩを使用して調製した。＋２／＋３ＡＦＬＰプライマーを使用して、選択的増幅を実施した。

SolexaのＣＳＭＡ架橋増幅に対する鋳型断片を、一意の５ｂｐの試料識別（ＩＤ）タグ配列を含有するＥｃｏＲＩアダプタを使用して第２の制限／ライゲーションを実施することによって調製した。異なる５ｂｐの試料ＩＤタグを使用する親系統及び３つのＲＩＬ試料を２回含めることにより、実験内での再現性を測定した。

シークエンス系ＡＦＬＰマーカーを、Ｂ７３及びＭｏ１７において異なる頻度で観察される２７ｂｐのシークエンスタグを抽出することによって同定し、ＲＩＬ子孫において分離した。

シークエンス系ＡＦＬＰマーカーデータを、４つの対応するＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ＋３／＋３プライマーの組合せの長さ系検出を使用する従来のＡＦＬＰフィンガープリント法によって得られるＡＦＬＰマーカースコアと比較した。

シークエンス実行統計量（５フローセル）
生成したシークエンスタグ数８９４１４０７
既知の試料ＩＤを有するシークエンスタグ数８０２９５９５
既知の試料ＩＤを有する異なるシークエンスタグ数２０６７５８
生成したＭｂｐ配列データ２４１．４
頻度範囲１試料当たりのシークエンスタグ合計数５５３７４〜１１２５２７
シークエンスタグＡＦＬＰマーカー数１２５
頻度範囲親のスコアリング表示におけるシークエンスタグＡＦＬＰマーカー数９０〜１７２１８
シークエンスタグＡＦＬＰマーカーの確定及びスコアリング
１試料当たりのシークエンスタグ表現を一覧にする
未知の試料ＩＤを有するシークエンスタグを除去する
１試料当たりの全シークエンスタグに基づいて試料表現を標準化する
２つの親で頻度差が２倍を超えるシークエンスタグを除去する
２つの親のタグ頻度を平均する
頻度Ｐ１／Ｐ２が閾値を越える場合、シークエンスタグＡＦＬＰマーカーを確定する
ＲＩＬ子孫におけるシークエンスタグマーカーの有／無をスコアリングする

ＡＦＬＰマーカー分布（ＡＦＬＰ＋３／＋３：シークエンス／ゲル系）

シークエンスタグＡＦＬＰマーカーの再現性（２回、３つのＲＩＬ子孫）
スコアリングしたシークエンスタグＡＦＬＰマーカー数１２５
比較した標本値群数(number of data-points）３７５
２回で一致した標本値群数３７２
２回の実験での一致度（％）９９．２％

従来のスラブゲル検出：

Solexa系検出

SolexaのＣＳＭＡ技術を使用することによって、シークエンス系ＡＦＬＰマーカー検出の実行可能性が生じたことにより、多数のＡＦＬＰマーカーが、分解能（断片サイズ）の改善、及び少量の断片をも捕捉するシークエンシングの深度に起因して、従来のスラブゲルではなく、シークエンス系検出を使用してスコアリングされる。マーカーデータベクトル比較により、シークエンス系検出とスラブゲル検出の間で同様の分離パターンが明らかになる。一致度の証明からは、シークエンシングゲル系ＡＦＬＰマーカーが待望される。

ＡＦＬＰ検出ショートタグシークエンシングに関する正規のＡＦＬＰ系手法で使用されるアダプタ構造を表す概略図である。ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩによるＤＮＡ試料の消化に由来する典型的なＡＦＬＰ断片、及び続いてのアダプタライゲーション、それからＥｃｏＲＩ部位に対する典型的なアダプタを示す。アダプタは、５’末端から３’末端に向かって、５’プライマー配列（任意選択であり、増幅プライマーをアンカーするため又はアダプタとライゲートした断片をビーズ又は表面にアンカーするために使用することができる）を含む。また、識別子（縮重形態のＮＮＮＮＮＮとして与えられる）、その後の制限酵素の認識配列の残部（本ＥｃｏＲＩでは、即ち、ＡＡＴＴＣ）を示す。識別子の最終ヌクレオチドは好ましくは、ＥｃｏＲＩ制限部位を破壊するためにＧを含まない。任意選択の５’プライマー配列、特異的プライマー（ＡＣＴＧＡＣ）の一例、認識部位の残部、及び３’末端に１つ又は複数の選択ヌクレオチドを含有し得る区間を含む、好適なプライマーが提供される。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列がアダプタに組み込まれた実施形態を表す概略図である。ＩＩｓ型酵素による制限の後、ＩＩｓ型適合アダプタは、制限断片Ａ及び制限断片Ｂの一方又は両方とライゲートすることができる。ＩＩｓ型アダプタは、任意選択のプライマー結合（又はアンカー）配列、識別子、及びＩＩｓ制限部位の突出部とハイブリダイズするための（縮重）ヌクレオチド（ＮＮ）を含有する区間を含む。関連プライマーは、その３’末端に１つ又は複数の選択ヌクレオチド（ＸＹＺ）を含有し得る。

Claims

試料中の制限断片を同定する方法であって、
（ａ）試料核酸を提供する工程と、
（ｂ）前記試料核酸を、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼで消化する工程であって、制限断片の組が得られる、消化工程と、
（ｃ）二本鎖合成アダプタを提供する工程であって、
５’プライマー適合配列と、
試料特異的識別子区間と、
前記制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列の残部と相補的な区間とを含む、二本鎖合成アダプタを提供する工程と、
（ｄ）前記二本鎖合成アダプタを、組になった前記制限断片にライゲートする工程であって、アダプタとライゲートした制限断片の組が得られる、ライゲート工程と、
（ｆ）少なくとも前記試料特異的識別子区間の前記配列、前記制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列の残部、及びそれに隣接して位置する、前記アダプタとライゲートした制限断片の前記制限断片の前記配列の一部を求める工程と、
（ｇ）前記試料中の増幅したアダプタとライゲートした制限断片の有無を同定する工程とを含む、試料中の制限断片を同定する方法。
前記(ｄ)工程と前記（ｆ）工程の間に、更に、以下の（ｅ）前記試料特異的識別子区間、及び前記制限エンドヌクレアーゼの前記認識配列の残部と相補的な前記区間、と少なくとも相補的な１つ又は複数のプライマーを用いて、アダプタとライゲートした制限断片の前記組を増幅する工程であって、増幅したアダプタとライゲートした制限断片であるアンプリコンが得られる、増幅工程とを有し、
前記（ｆ）工程の前記アダプターとライゲートした制限断片は前記（ｄ）工程によって増幅され、
前記制限断片が分子マーカーである、請求項１に記載の方法。
前記分子マーカーがＡＦＬＰマーカーである、請求項２に記載の方法。
２つ以上の試料が制限断片、分子マーカーの少なくとも一方の有無に関して比較される、請求項１に記載の方法。
２つ以上の試料が前記アダプタをライゲートする工程の後にプールに集められる、請求項１に記載の方法。
前記プール中の各試料に対して、前記プール中の他の試料特異的識別子とは異なる試料特異的識別子が使用される、請求項５に記載の方法。
前記プライマーが３’末端に１つ又は複数の選択ヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。
前記制限エンドヌクレアーゼがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
前記制限エンドヌクレアーゼがＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
２つ以上の制限エンドヌクレアーゼが使用される、請求項１に記載の方法。
前記シークエンシングがハイスループットシークエンシングを用いて実行される、請求項１に記載の方法。
前記ハイスループットシークエンシングが固体支持体上で実施される、請求項１１に記載の方法。
前記ハイスループットシークエンシングが合成によるシークエンシングに基づく、請求項１１に記載の方法。
前記ハイスループットシークエンシングが、
前記アンプリコン又は前記アダプタとライゲートした制限断片を、各ビーズが単一のアダプタとライゲートした制限断片又はアンプリコンとアニーリングするように前記ビーズにアニーリングする工程と、
前記ビーズを、各油中水型マイクロリアクタは単一のビーズを含むように、油中水型マイクロリアクタ中で乳化させる工程と、
エマルジョンＰＣＲを実施する工程であって、アダプタとライゲートした制限断片又はアンプリコンをビーズ表面上で増幅する、前記実施工程と、
増幅したアンプリコンを含有するビーズを選択／濃縮する工程と、
前記ビーズを、各ウェルが単一のビーズを含むように前記ウェルに充填する工程と、
ピロリン酸シグナルの生成を使用して、前記アダプタとライゲートした制限断片又は前記増幅したアンプリコンの前記ヌクレオチド配列を求める工程とを含む、請求項１１に記載の方法。
前記ハイスループットシークエンシングが、
前記アダプタとライゲートした制限断片又は前記アンプリコンを、第１のプライマー及び第２のプライマー又は第１のプライマー結合配列及び第２のプライマー結合配列をそれぞれ含有する表面にアニーリングする工程と、
架橋増幅を実施する工程であって、増幅したアダプタとライゲートした制限断片又は増幅したアンプリコンのクラスタが得られる、実施工程と、
標識した可逆性終止ヌクレオチドを使用して、前記増幅したアダプタとライゲートした制限断片又は前記増幅したアンプリコンの前記ヌクレオチド配列を求める工程とを含む、請求項１１に記載の方法。
前記識別子が４ｂｐ〜１６ｂｐである、請求項１に記載の方法。
前記識別子が２つ以上の同一連続塩基を含有しない、請求項１６に記載の方法。
２つ以上の試料に対して、前記対応する識別子が少なくとも２つの異なるヌクレオチドを含有する、請求項１６に記載の方法。
請求項１〜１８の内のいずれか一項に記載の分子マーカーを同定する方法の使用であって、遺伝子型同定、バルクセグレガント分析、遺伝子マッピング、マーカー利用戻し交配、量的形質遺伝子座のマッピング、もしくは連鎖不平衡マッピングのための、分子マーカーを同定する方法の使用。