TWI686482B - 隨機引子組及使用其之ｄｎａ基因庫的製作方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於藉由使用隨機引子的核酸增幅反應簡便地製造出再現性優良的DNA基因庫時，來自葉綠體基因組的DNA片段之增幅被大幅度地減少。 　　含有作為隨機引子的TAAGAGACAGNN所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的2鹼基為TG及TAAGAGACAGNNN所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的3鹼基為TGC之寡核苷酸的寡核苷酸。

Description

隨機引子組及使用其之ＤＮＡ基因庫的製作方法
本發明係關於，例如使用利用於DNA標記物解析的DNA基因庫的製作方法所利用的隨機引子組及該隨機引子組之DNA基因庫的製作方法。
對於一般基因組解析，含於基因組的遺傳資料，例如綜合分析鹼基序列資料。然而，在決定基因組全體的鹼基序列之解析中有著工時長及成本高之問題。又，對於基因組尺寸大的生物，由基因組的複雜性問題，使得以鹼基序列解析為基準的基因組解析上有著極限。
於專利文獻1中揭示，對於增幅片段長多型(AFLP)標記物技術，於經接頭(adapter)與連接(ligate)的限制酶處理片段合併試料特異性(專一性)識別子，僅決定限制酶處理片段的序列之一部分的方法。於專利文獻1中所揭示的方法中，藉由對基因組DNA的限制酶處理，減低基因組DNA之複雜性，將限制酶處理片段的一部分作為對象來決定鹼基序列而可充分鑑定限制酶處理片段。但，於專利文獻1中所揭示的方法中，對於基因組DNA的限制酶處理或使用接頭(adapter)的連接反應之操作時間為必要，故在成本降低上有著困難。
另一方面，於專利文獻2中揭示藉由所謂的RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA)法，將自米試料所萃取的DNA藉由適當的引子存在下之PCR使其增幅後所得之DNA帶中，發現與食味評估結果之相關性高的識別用DNA標記物。於專利文獻2中揭示的方法中，使用以特定序列限定的複數STS(Sequence Tagged Sites)化引子。且在於專利文獻2所揭示的方法中，將使用STS化引子而增幅的識別用DNA標記物藉由電泳進行檢測。然而，於專利文獻2所揭示的RAPD法的PCR增幅之再現性為顯著的低，無法作為一般DNA標記物技術而採用。
又，於專利文獻3中記載製作基因組基因庫的方法，將與對象基因組相比較下較容易出現的序列為基準，使用所設計的1種類引子進行PCR後，可使基因組全區域幾乎均等地增幅，其結果可製作出基因組基因庫。且，於專利文獻3中雖記載藉由使用含有無規序列的隨機引子進行PCR時可製造出基因組基因庫，但對於實際的方案及實驗結果則完全無記載。因此，於專利文獻3所記載的方法中必須有欲特定基因組出現頻度的基因組鹼基序列資料，因此可預料其工時及成本。且在專利文獻3所記載的方法中，欲達到基因組全體之增幅，有著無法減低基因組DNA的複雜性之問題。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]專利第5389638號公報 　　[專利文獻2]特開2003-79375號公報 　　[專利文獻3]專利第3972106號公報
[發明所解決的問題]
另一方面，利用DNA標記物的基因連鎖解析等基因組資料解析中，以更簡便且再現性優良的方法製作DNA基因庫之技術受到期待。如上述，作為製作DNA基因庫的方法已知有各式各樣種方法，在現狀對於簡便性及/或再現性為充分的方法為未知。因此，本發明者們對於使用隨機引子的PCR，藉由將反應液中之該隨機引子的濃度設定在所定範圍之非常簡便的方法，開發出可製作出再現性優良的DNA基因庫之系統。
然而，對於該系統，得知使用具有特定序列的隨機引子時，來自葉綠體基因組的DNA片段可大量地增幅。因此，本發明有鑑於如此實情，提供藉由使用隨機引子的核酸增幅反應，可簡便且製造出再現性優良的DNA基因庫時所利用的來自葉綠體基因組之DNA片段的增幅可被大幅地減低的隨機引子組及使用該隨機引子組的DNA基因庫之製作方法作為目的。 [解決課題的手段]
本發明者們發現藉由使用除去具有特定序列的隨機引子之隨機引子組時，可大幅度地減少來自葉綠體基因組的DNA片段之增幅，而完成本發明。
本發明包含以下者。 　　(1)一種隨機引子組，其為含有作為隨機引子的選自由TAAGAGACAGNN(序列號碼2060，N為A、G、C或T中任一者)所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的2鹼基為TG的寡核苷酸之15種類寡核苷酸群，及TAAGAGACAGNNN(序列號碼2061，N為A、G、C或T中任一者)所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的3鹼基為TGC之寡核苷酸的63種類寡核苷酸群的1或複數的寡核苷酸。 　　(2)如(1)記載的隨機引子組，其特徵為上述15種類寡核苷酸群中，未含有序列號碼2060的鹼基序列中之3’末端的2鹼基為GG、GT、AT或CC的寡核苷酸中至少1個寡核苷酸者。 　　(3)如(1)記載的隨機引子組，其特徵為上述63種類寡核苷酸群中，未含有序列號碼2061的鹼基序列中之3’末端的3鹼基為GGA、GGG、GTG、GTA、ATA或CCA的寡核苷酸中至少1個寡核苷酸者。 　　(4)一種DNA基因庫的製作方法，其特徵為以高濃度含有基因組DNA及如(1)～(3)中任一項之隨機引子組的隨機引子之反應液中進行核酸增幅反應，取得將基因組DNA作為模具而藉由該核酸增幅反應所得之DNA片段。 　　(5)如(4)記載的DNA基因庫的製作方法，其特徵為上述反應液為含有4～200μM的上述隨機引子者。 　　(6)如(4)記載的DNA基因庫的製作方法，其特徵為上述反應液為含有4～100μM的上述隨機引子者。 　　(7)一種DNA基因庫的製作方法，其特徵為含有以下步驟者： 　　以高濃度含有基因組DNA及如請求項1～3中任一項之隨機引子組的隨機引子之第1反應液中進行核酸增幅反應，取得將基因組DNA作為模具而藉由該核酸增幅反應所得之第1DNA片段之步驟，與 　　在含有所得的第1DNA片段與以下引子的第2反應液中進行核酸增幅反應，取得於上述第1DNA片段連結上述核苷酸的第2DNA片段之步驟； 　　該引子為，於3’末端含有與上述隨機引子中之至少5’末端側的鹼基序列為70%以上一致的鹼基序列之核苷酸者。 　　(8)如(7)記載的DNA基因庫之製作方法，其特徵為上述第1反應液為含有4～200μM的上述隨機引子者。 　　(9)如(7)記載的DNA基因庫之製作方法，其特徵為上述第1反應液為含有4～100μM的上述隨機引子者。 　　(10)如(7)記載的DNA基因庫之製作方法，其特徵為增幅上述第2DNA片段的引子為含有使用於鹼基序列決定反應的區域，或使用於將上述第2DNA片段作為模具的核酸增幅反應或者重複核酸增幅反應的引子為含有使用於鹼基序列決定反應的區域。 　　(11)一種DNA基因庫，其特徵為藉由如上述(4)至(10)中任一項所記載的DNA基因庫之製作方法所製作者。 [發明之效果]
有關本發明的隨機引子組在所定濃度範圍下使用於核酸增幅反應時，可在非常簡便下製作出再現性優良的DNA基因庫。此時，有關本發明的隨機引子組因不具有由特定鹼基序列所成的隨機引子，故與具有由該特定鹼基序列所成的隨機引子之情況相比較，可大幅度地抑制來自葉綠體基因組的DNA片段之增幅。
又，有關本發明的DNA基因庫之製作方法，因使用未具有由特定鹼基序列所成的隨機引子之隨機引子組，故非常簡便地製作出再現性優良的DNA基因庫，且大幅度抑制來自葉綠體基因組的DNA片段之材料的DNA基因庫。
[實施發明的形態]
以下詳細說明本發明。
有關本發明的DNA基因庫之製作方法中，使用以下規定之引子群(以下稱為隨機引子組)，在調製以高濃度含於該隨機引子組的隨機引子之反應液中進行核酸增幅反應，將經增幅的核酸片段作為DNA基因庫。其中，所謂高濃度表示與在一般核酸增幅反應中之引子濃度做比較時為高濃度的意思。即，有關本發明的DNA基因庫製作方法係以含有使用與一般核酸增幅反應中之引子濃度相比較為高濃度的隨機引子之特徵者。其中，作為含於反應液的模具，可使用自製作DNA基因庫的對象生物所調製的基因組DNA。
且，對於有關本發明的DNA基因庫之製作方法，雖對於對象生物種類並無特別限定，特別可將具有葉綠體基因組的生物，例如植物、藻類等作為對象。即，依據有關本發明的DNA基因庫之製作方法，可製造出具有這些葉綠體基因組的生物，例如可由植物、藻類等製作出DNA基因庫。
特別有關本發明的DNA基因庫之製作方法因使用如後面詳細敘述的隨機引子組，可大幅度抑制來自葉綠體基因組的核酸片段之增幅。即，藉由使用如後面詳細敘述的隨機引子組，可大量地增幅來自核基因組的核酸殘片，主要可構築與核基因組相關的DNA基因庫。
又，在本發明的DNA基因庫之製作方法中，藉由將隨機引子的濃度規定在上述時，可高再現性下增幅核酸片段(核酸片段群)。其中，所謂再現性表示使用相同模具及相同隨機引子組進行數次核酸增幅反應時，在數次的核酸增幅反應之間所增幅的核酸片段呈一致程度的意思。換言之，所謂高再現性(再現性較高)表示使用相同模具及相同隨機引子組進行數次核酸增幅反應時，在數次核酸增幅反應之間所增幅的核酸片段呈現高一致性的意思。
對於再現性的高低而言，例如使用相同模具及相同隨機引子組進行數次核酸增幅反應，將在各次所得之增幅片段藉由電泳所得之螢光單位(Fluorescence Unit：FU)而算出斯皮爾曼等級相關係數，依據該係數可進行評估。所謂斯皮爾曼等級相關係數一般以ρ表示，作為一例子可藉由ρ＞0.9評估為具有再現性。
[隨機引子] 　　通常使用核酸增幅反應欲得到特定擴增子(Amplicon)時，配合該擴增子設計出引子的鹼基序列。例如設計出一對引子來夾住對應基因組DNA等模具DNA中之擴增子的位置。此時，引子因設計成在含於模具的特定區域中雜交，而稱為「特異性(專一性)引子」。
相對於此，隨機引子與欲得到特定擴增子為目的所設計的引子相異，並非設計成於在模具DNA中之特定區域進行雜交，其為設定成為了得到無規擴增子。
所謂有關本發明的隨機引子組為，將選自由於TAAGAGACAGNN(序列號碼2060、N為A、G、C或T中任一者)所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的2鹼基為TG的寡核苷酸之15種類寡核苷酸群及於TAAGAGACAGNNN(序列號碼2061、N為A、G、C或T中任一者)所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的3鹼基為TGC之寡核苷酸的63種類寡核苷酸群的1或複數個寡核苷酸作為各隨機引子而含有者。
換言之，所謂有關本發明的隨機引子組為含有作為各隨機引子的以下寡核苷酸，該寡核苷酸為選自由於5’末端側具有TAAGAGACAG(序列號碼2062)，且於該鹼基序列的3’末端側上具有任意2或3鹼基之寡核苷酸群中，除去TAAGAGACAGTG(序列號碼2063)及TAAGAGACAGTGC(序列號碼2064)的寡核苷酸群的1或複數的寡核苷酸者。
TAAGAGACAGNN(序列號碼2060，N為A、G、C或T中任一者)所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的2鹼基為TG的寡核苷酸之15種類寡核苷酸群中，如下述表1所示，含有具有序列號碼2065～2079所示鹼基序列的15種類寡核苷酸。
Figure 02_image001
又，TAAGAGACAGNNN(序列號碼2061，N為A、G、C或T中任一者)所示寡核苷酸群之中，除去3’末端的3鹼基為TGC之寡核苷酸的63種類寡核苷酸群中，如下述表2所示，含有具有序列號碼2080～2142所示鹼基序列的63種類寡核苷酸。
Figure 02_image003
如以上，隨機引子可任意選自如表1所示15種類寡核苷酸及表2所示63種類寡核苷酸的合計78種類之寡核苷酸。其中，有關本發明之隨機引子組所含的隨機引子可為上述78種類寡核苷酸全部，又亦可為選自78種類寡核苷酸的1種類寡核苷酸、5種類寡核苷酸、10種類寡核苷酸、20種類寡核苷酸、40種類寡核苷酸、60種類寡核苷酸。這些78種類寡核苷酸之中，如何選擇怎樣序列之寡核苷酸並無特別限定而為任意。
又，有關本發明的隨機引子組係將如表1所示15種類寡核苷酸作為隨機引子含有，或亦可將選自如表1所示15種類寡核苷酸的1～14種類寡核苷酸，例如5種類寡核苷酸或10種類寡核苷酸作為隨機引子而含有者。
特別選自如表1所示15種類寡核苷酸的隨機引子時，選擇未含TAAGAGACAGGG(序列號碼2079)、TAAGAGACAGGT(序列號碼2077)、TAAGAGACAGAT(序列號碼2066)或TAAGAGACAGCC(序列號碼2074)中至少1個寡核苷酸者為佳。換言之，自如表1所示15種類寡核苷酸選擇隨機引子時，在TAAGAGACAGGG(序列號碼2079)、TAAGAGACAGGT(序列號碼2077)、TAAGAGACAGAT(序列號碼2066)及TAAGAGACAGCC(序列號碼2074)的4種類中，選擇完全不含、不含3種類、不含2種類，或不含1種類之隨機引子者為佳。
且，有關本發明的隨機引子組中所含的作為隨機引子的寡核苷酸可係如表2所示63種類寡核苷酸、選自如表2所示63種類寡核苷酸的1～62種類寡核苷酸，例如10種類寡核苷酸、20種類寡核苷酸、40種類寡核苷酸或60種類寡核苷酸。
特別選擇如表2所示63種類寡核苷酸的隨機引子時，以選擇未含TAAGAGACAGGGA(序列號碼2120)、TAAGAGACAGGGG(序列號碼2122)、TAAGAGACAGGTG(序列號碼2126)、TAAGAGACAGGTA(序列號碼2124)、TAAGAGACAGATA(序列號碼2092)或TAAGAGACAGCCA(序列號碼2100)中至少1種寡核苷酸者為佳。換言之，自如表2所示63種類寡核苷酸中選擇隨機引子時，在TAAGAGACAGGGA(序列號碼2120)、TAAGAGACAGGGG(序列號碼2122)、TAAGAGACAGGTG(序列號碼2126)、TAAGAGACAGGTA(序列號碼2124)、TAAGAGACAGATA(序列號碼2092)及TAAGAGACAGCCA(序列號碼2100)的6種類中，選擇完全不含、不含5種類、不含4種類、不含3種類、不含2種類或不含1種類的隨機引子為佳。
且，上述合計78種類寡核苷酸所共通的5’末端側之TAAGAGACAG(序列號碼2062)為作為使用於次世代排序的接頭(adapter)序列使用之序列。
[核酸增幅反應] 　　有關本發明的DNA基因庫之製作方法中，藉由使用上述隨機引子及作為模具的基因組DNA的核酸增幅反應，取得多數增幅片段。特別對於核酸增幅反應，將反應液中的隨機引子之濃度設定為與一般核酸增幅反應中之引子濃度比較下的高濃度。藉此，一邊達成高再現性下，一邊可得到將基因組DNA作為模具的多數增幅片段。藉此，所得之多數增幅片段可作為可利用於基因型判定等的DNA基因庫使用。
且，有關本發明的DNA基因庫之製作方法中，因使用上述隨機引子組，可大幅度抑制基因組DNA中來自葉綠體基因組的核酸片段之增幅。因此，依據有關本發明的DNA基因庫之製作方法，可大量增幅來自核基因組的核酸殘片，主要可構築與核基因組相關的DNA基因庫。
其中，所謂核酸增幅反應為，在由作為模具的基因組DNA、上述隨機引子、DNA聚合酶、作為基質的去氧核苷酸三磷酸(dNTP，即dATP、dCTP、dTTP及dGTP的混合物)及緩衝液所成的反應液中，藉由加入所定溫度循環條件，可合成增幅片段之反應。且，於核酸增幅反應中，於反應液中所定濃度的Mg2+ 為必要，對於上述組成中於緩衝液中含有MgCl2 。於緩衝液中未含有MgCl2 時，除上述組成以外亦含有MgCl2 。
特別對於核酸增幅反應，隨機引子的濃度以配合隨機引子之鹼基長度而做適宜設定者為佳。其中，隨機引子的鹼基長為將相異鹼基長之複數種類核苷酸作為隨機引子使用時，可取其平均值(亦可為單純平均，亦可為加入核苷酸量的加重平均)。
具體而言，在將該隨機引子濃度設定在4～200μM之條件，較佳為設定在4～100μM之條件下進行核酸增幅反應。依據該條件，藉由核酸增幅反應，一邊可達成較高再現性，一邊可得到多數增幅片段，特別為可得到100～500鹼基長之多數增幅片段。
更具體為，隨機引子的濃度為，在隨機引子為10～14鹼基長時，將隨機引子的鹼基長作為y，將隨機引子的濃度作為x時，滿足y＞3E+08x-6.974 且100μM以下者為佳。
且，上述y＞3E+08x-6.974 的不等式如後述實施例的說明，對隨機引子的長度與濃度之關係做詳細調查結果，將100～500鹼基長之多數DNA片段作為再現性優良而可增幅的範圍而算出者。
又，對於核酸增幅反應成為模具的基因組DNA並無特別限定，當反應液量設定在50μl時，以0.1～1000ng者為佳，1～500ng者為較佳，5～200ng者為更佳，10～100ng者為最佳。將作為模具的基因組DNA之量設定在該範圍時，自隨機引子的增幅反應不被阻礙下，可一邊達到高再現性，一邊得到多數增幅片段。
基因組DNA之調製方法並無特別限定，可適用過去公知方法。又，藉由利用市售的套組，可由對象生物種以簡便方式調製出基因組DNA。且，作為基因組DNA，亦可直接使用由過去公知方法或市售套組的自生物所萃取者，或可為純化自生物經萃取者，或可使用經限制酶處理或超音波處理後者。特別在有關本發明的DNA基因庫之製作方法中，不需要自經萃取的基因組DNA除去葉綠體基因組之步驟，可將含有葉綠體基因組及核基因組之基因組DNA作為核酸增幅反應的模具使用。此為藉由使用上述隨機引子組，可大幅度抑制來自葉綠體基因組的DNA片段的增幅之故。
又，作為於核酸增幅反應中之DNA聚合酶，並無特別限定，在欲進行核酸增幅反應的溫度循環條件下可使用具有DNA聚合酶活性之酵素。具體而言，可使用一般使用於核酸增幅反應的耐熱性DNA聚合酶。例如作為DNA聚合酶，可舉出Taq DNA聚合酶等來自好熱細菌的DNA聚合酶、KOD DNA 聚合酶或Pfu DNA聚合酶等來自超好熱Archaea的DNA聚合酶。特別對於核酸增幅反應，可與上述隨機引子同時使用作為DNA聚合酶的Pfu DNA聚合酶為佳。藉由使用這些DNA聚合酶，可達成高再現性且可更確實地得到多數增幅片段。
進一步對於核酸增幅反應，作為基質的去氧核苷酸三磷酸(dNTP、即dATP、dCTP、dTTP及dGTP之混合物)的濃度並無特別限定，可為5μM～0.6mM，以10μM～0.4mM者為佳，以20μM～0.2mM者為較佳。將作為基質的dNTP之濃度設定在該範圍時，可防止因DNA聚合酶產生的錯誤攝取，可達成高再現性且可更確實地得到多數增幅片段。
且對於核酸增幅反應，作為緩衝液並無特別限定，可舉出如上述含有MgCl2 ，例如含有Tris-HCl(pH8.3)及KCl之溶液。其中，作為Mg2+ 的濃度，並無特別限定，例如可為0.1～4.0mM，以0.2～3.0mM者為佳，以0.3～2.0mM者為較佳，以0.5～1.5mM者為更佳。將反應液中之Mg2+ 濃度設定在該範圍時，可達成高再現性且可更確實地得到多數增幅片段。
進一步作為於核酸增幅反應中之溫度循環條件，並無特別限定，可採用一般溫度循環。所謂具體的溫度循環為，首先為欲分離模具的基因組DNA成單股之最初熱變性溫度，其後進行數次(例如20～40次)的「熱變性溫度→熱處理(annealing)溫度→伸長反應溫度」，最後若需要可例示出所定時間伸長反應溫度及最後欲保存的溫度之循環。
作為熱變性溫度，例如為93～99℃，較佳為95～98℃，更佳為97～98℃。作為熱處理(annealing)溫度，雖亦取決於上述隨機引子之Tm值，例如可設定為30～70℃，以35～68℃為佳，較佳為37～65℃。作為伸長反應溫度，例如可設定為70～76℃，以71～75℃為佳，較佳為72～74℃。又，作為欲保存的溫度，例如可設定為4℃。
又，最初熱變性在上述溫度範圍時，例如可設定為5秒～10分，以10秒～5分為佳，較佳為30秒～2分。於「熱變性溫度→熱處理(annealing)溫度→伸長反應溫度」的循環中之熱變性在上述溫度範圍時，例如可設定為2秒～5分，以5秒～2分為佳，較佳為10秒～1分。於「熱變性溫度→熱處理(annealing)溫度→伸長反應溫度」的循環中之熱處理(annealing)為上述溫度範圍時，例如可設定為1秒～3分，以3秒～2分為佳，較佳為5秒～1分。於「熱變性溫度→熱處理(annealing)溫度→伸長反應溫度」的循環中之伸長反應於上述溫度範圍時，例如可設定為1秒～3分，以3秒～2分為佳，較佳為5秒～1分。
又，作為有關本發明的DNA基因庫之製作方法，以採用藉由熱啟動方法之核酸增幅反應而取得增幅片段者亦可。所謂熱啟動方法為，防止「熱變性溫度→熱處理(annealing)溫度→伸長反應溫度」的循環前之錯誤引發或來自引子二聚物的非特異增幅之方法。在熱啟動方法中，藉由鍵結抗DNA聚合酶抗體，或進行化學修飾，使用DNA聚合酶活性被抑制的狀態之酵素。在該狀態中，DNA聚合酶活性受到抑制，可防止溫度循環前之非特異性(專一性)反應。在熱啟動方法中，藉由在最初溫度循環時設定較高溫度時，可回復DNA聚合酶活性，可進行其後的核酸增幅反應。
如以上，使用上述隨機引子組，將反應液中的隨機引子濃度設定在4～200μM，進行核酸增幅反應時，可得到將基因組DNA作為模具自隨機引子的多數增幅片段(主要來自核基因組)。使用上述隨機引子組，將反應液中之隨機引子濃度設定在4～200μM時，可成為再現性非常高的核酸增幅反應。即，依據上述核酸增幅反應，一邊達成非常高再現性，一邊得到多數增幅片段(主要來自核基因組)。因此，所得之多數增幅片段為，將基因組DNA(主要為核基因組)作為對象的基因解析中可作為DNA基因庫使用。
又，使用上述隨機引子組，將反應液中之隨機引子濃度設定在4～200μM而進行核酸增幅反應時，特別可得到將基因組DNA(主要為核基因組)作為模具的約100～500鹼基長之多數增幅片段。該約100～500鹼基長之多數增幅片段，例如其為適用於藉由次世代排序的鹼基序列之大量解析的尺寸，可得到高精度序列資料。即，依據本發明，可製造出含有主要來自核基因組之約100～500鹼基長的DNA片段之DNA基因庫。
進一步使用上述隨機引子組，可藉由將反應液中之該隨機引子濃度設定在4～200μM而進行核酸增幅反應，特別可得到基因組DNA(主要為核基因組)之全體皆均勻的增幅片段。換言之，在使用該隨機引子之核酸增幅反應中，並未有偏差下基因組DNA之所定區域的DNA片段被增幅，其為主要分散於核基因組全體的DNA片段被增幅。即，依據本發明，可製作出對於主要核基因組全體而言為均勻之DNA基因庫。
且，使用上述隨機引子組進行核酸增幅反應後，對於所得之增幅片段可進行限制酶處理、尺寸選擇處理及序列捕獲處理等。藉由對於增幅片段進行這些限制酶處理、尺寸選擇處理及序列捕獲處理時，可自所得之增幅片段中得到特定增幅片段(具有特定限制酶部位之片段、特定尺寸範圍之增幅片段、具有特定序列的增幅片段)。而藉由這些各種處理所得之特定增幅片段可作為DNA基因庫使用。
[基因組DNA解析方法] 　　藉由使用如上述所製作的DNA基因庫，可進行基因型解析等基因組DNA解析。如上述，DNA基因庫具有非常高再現性，具有適用於次世代排序的尺寸，基因組全體皆具有均勻性。因此，DNA基因庫可作為DNA標記物(有時亦稱為遺傳標記物、基因標記物)使用。其中，所謂DNA標記物在廣義上為存在於基因組DNA內之具有特徵的鹼基序列之意思。又，作為DNA標記物，特別可成為作為與遺傳性狀關連之標識的基因組上之鹼基序列。DNA標記物，例如可利用於基因型鑑定、連鎖地圖、基因基因定位、含有利用標記物的選拔步驟之育種、利用標記物的回交選種、定量形質基因座之基因定位、批量隔離分析(Bulk Segregant)、品種識別、或連鎖不均衡基因定位等。
例如使用次世代排序等，決並如上述所製作的DNA基因庫之鹼基序列，依據所得之鹼基序列可確認DNA標記物之存在與否。
作為一例子，自所得的鹼基序列之讀取數來可確認DNA標記物的存在與否。其中，所謂次世代排序雖並無特別限定，亦稱為第2世代排序，其為可將數千萬的DNA片段之鹼基序列同時並行地決定之鹼基序列決定裝置。作為次世代排序中之排序原理，並無特別限定，例如藉由橋式PCR方法與Sequencing-by-synthesis法，在流動池上增幅目的DNA，合成下進行排序之原理，或藉由測定於乳液PCR法與DNA合成時所釋放的焦磷酸的量而進行序列決定之焦磷酸測序方法而進行排序之原理可舉出。更具體為，作為次世代排序可舉出Illumina公司(Illumina)的MiniSeq、MiSeq、NextSeq、HiSeq及HiSeq X系列、羅氏公司的Roche 454 GS FLX排序等。
又，作為其他例子，將對於如上述所製作的DNA基因庫所得之鹼基序列與參照用鹼基序列做比較時，可確認DNA標記物的存在與否。其中，所謂參照用鹼基序列表示作為基準的已知序列，例如歸納於數據之已知序列。即對於所定生物，如上述製作出DNA基因庫，決定該鹼基序列，將DNA基因庫之鹼基序列與參照用鹼基序列做比較。而將與參照用鹼基序列相異的鹼基序列，可作為與該所定生物相關的DNA標記物(存在於基因組DNA內之具有特徵的鹼基序列)。又，對於特定DNA標記物，依據一定方法進行進一步解析後，可決定遺傳性狀(表現型)之關連性。即，自如上述經特定的DNA標記物之中，特定出與表現型關連之DNA標記物(有時稱為選拔標記物)。
進一步作為其他例子，將對於如上述所製作的DNA基因庫所得之鹼基序列，藉由與使用來自其他生物的基因組DNA或來自其他組織的基因組DNA所製作之上述DNA基因庫的鹼基序列進行比較，可確認DNA標記物的存在與否。即，對於2個以上的生物或2個相異組織，各製作出如上述之DNA基因庫，決定這些鹼基序列，比較DNA基因庫之鹼基序列彼此。而可將在DNA基因庫間相異的鹼基序列作為提供於與生物或組織相關的DNA標記物(存在於基因組DNA內之具有特徵的鹼基序列)。又，對於經特定的DNA標記物，藉由依據定法做進一步解析時，可決定與遺傳性狀(表現型)之關連性。即，由如上述經特定的DNA標記物之中，可特定與表現型關連之DNA標記物(有時亦稱為選拔標記物)。
另外亦可依據所得之鹼基序列設計出將該DNA標記物進行特異性(專一性)增幅的一對引子。使用設計的一對引子，將自對象生物所萃取的基因組DNA作為模具進行核酸增幅反應後，可確認於經萃取的基因組DNA中之DNA標記物的存在與否。
或著如上述所製作的DNA基因庫可利用於調查微生物等多種多樣性的原基因組解析或腫瘤組織等體細胞基因組變異解析、利用基因芯片(Microarray)的基因型解析、倍數性判定解析、染色體數算出解析、染色體增減解析、染色體的部分性插入･缺失･複製･易位解析、外來基因組之混入解析、親子判定解析、交配種子純度檢定解析的解析上。
[對於次世代序列技術之應用] 　　如上述，使用上述隨機引子組，將反應液中之隨機引子設定在高濃度而進行核酸增幅反應後，可再現性良好下得到將基因組DNA作為模具的多數增幅片段。所得之增幅片段因於其兩末端上具有與隨機引子相同的鹼基序列，故藉由利用該鹼基序列可簡便地提供於次世代序列技術上。
具體而言，首先如上述，以含有基因組DNA及高濃度隨機引子之反應液(第1反應液)進行核酸增幅反應，藉由將基因組DNA作為模具的該核酸增幅反應取得多數增幅片段(第1DNA片段)。其次以含有所取得的多數增幅片段(第1DNA片段)與依據上述隨機引子的鹼基序列所設計的引子(稱為次世代排序用引子)之反應液(第2反應液)進行核酸增幅反應。其中，次世代排序用引子為含有使用於鹼基序列決定反應的區域之核苷酸。更具體而言，例如次世代排序用引子為將該3’末端的鹼基序列與第1DNA片段的5’末端側之鹼基序列設定為70%以上一致之鹼基序列，以設定在80%以上一致的鹼基序列為佳，較佳為設定在90%以上一致的鹼基序列，更佳為設定在95%以上一致的鹼基序列，更較佳為設定在97%以上一致的鹼基序列，最佳為設定在100%一致之鹼基序列者，可得到具有藉由次世代序列裝置之鹼基序列決定反應(序列反應)所必要的區域之核苷酸。
其中，所謂於次世代排序用引子所含的「使用於鹼基序列決定反應之區域」，因依次世代排序之種類而相異，故並無特別限定，例如次世代排序使用序列用引子實行鹼基序列決定反應時，可得到對於該序列用引子之鹼基序列的互補鹼基序列。又，次世代排序為使用鍵結所定DNA之捕獲小珠而實行鹼基序列決定反應時，所謂「使用於鹼基序列決定反應的區域」為可得到對於鍵結於該捕獲小珠的DNA之鹼基序列的互補鹼基序列。且次世代排序有時會自將具有奈米尺寸的孔之蛋白質通過於末端具有配對針環(Pair Pin Loop)之DNA鏈時的電流變化而讀取序列，所謂「使用於鹼基序列決定反應的區域」表示，可得到對於形成該配對針環之鹼基序列的互補鹼基序列。
藉由將次世代排序用引子的3’末端之鹼基序列設計如上述所示，次世代排序用引子可於第1DNA片段的3’末端在嚴苛條件下進行雜交，將第1DNA片段作為模具可增幅第2DNA片段。其中，所謂嚴苛條件下表示形成所謂特異性(專一性)混合動力，而未形成非特異性混合動力之條件，例如可參照Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Third Edition)做適宜決定。具體為可藉由南方雜交時的溫度或含於溶液的鹽濃度及南方雜交的洗淨步驟時的溫度或含於溶液的鹽濃度而設定出嚴苛性。更詳細為，作為嚴苛條件，例如，鈉濃度為25～500mM，較佳為25～300mM，溫度為42～68℃，較佳為42～65℃。更具體為5×SSC(83mM NaCl，83mM檸檬酸鈉)，溫度42℃。
特別在使用上述隨機引子組取得第1DNA片段時，可準備次世代排序用引子而對應所有隨機引子，亦可準備次世代排序用引子而對應一部分隨機引子。
特別為有關本發明的隨機引子組含有複數種類隨機引子時，除3’末端的數個鹼基(例如1～3鹼基程度)以外具有共通鹼基序列。因此，所得之多數第1DNA片段的5’末端具有全部共通的序列。其中，將次世代排序用引子的3’末端之鹼基序列與對於第1DNA片段的5’末端側為共通的鹼基序列成70%以上一致，較佳為80%以上一致，更佳為90%以上一致，最佳為100%一致的鹼基序列。藉由設計如此次世代排序用引子，得到對應所有隨機引子的次世代排序用引子。藉由使用該次世代排序用引子，可將第1DNA片段的全部作為模具而增幅第2DNA片段。
又，同樣地，對於有關本發明的隨機引子組，雖複數種類隨機引子的3’末端之2或3個鹼基以外係由共通鹼基序列所成，但將所得之多數第1DNA片段中一部分作為模具可得第2DNA片段。具體為將次世代排序用引子的3’末端之鹼基序列對於第1DNA片段的5’末端側之共通鹼基序列及於此繼續的1～3個鹼基數鹼基之序列為70%以上一致，較佳為80%以上一致，更佳為90%以上一致，最佳為100%一致的鹼基序列，而可使將一部分第1DNA片段作為模具的第2DNA片段增幅。
如以上所述，使用次世代排序用引子進行增幅的第2DNA片段為，具有含於次世代排序用引子的藉由次世代序列裝置進行鹼基序列決定反應(序列反應)時的必要區域。所謂對於序列反應為必要的區域因依次世代序列裝置而相異，故無特別限定。例如藉由橋式PCR方法與Sequencing-by-synthesis法，在流動池上使目的DNA增幅，使用一邊合成一邊進行排序之原理的次世代序列裝置時，次世代排序用引子為含有在橋式PCR時為必要的區域及在Sequencing-by-synthesis法時為必要的區域。所謂在橋式PCR為必要的區域表示，於流動池上與經固定的寡核苷酸進行雜交之區域，其為含有次世代排序用引子的5’末端之9鹼基長的區域。又，所謂在Sequencing-by-synthesis法為必要的區域為，使用於序列反應的序列引子進行雜交的區域，其為次世代排序用引子之中途部的區域。
又，作為次世代序列裝置，可舉出離子激流(Ion Torrent)序列裝置。使用離子激流序列裝置時，次世代排序用引子為於5’末端側具有所謂的離子接頭(adapter)，鍵結於實施乳膠PCR的粒子。又，在離子激流序列裝置中，將藉由乳膠PCR進行增幅的模板(template)進行塗布的粒子載置於離子片，提供於序列反應上。
且，使用含有次世代排序用引子及第1DNA的第2反應液進行的核酸增幅反應並無特別限定，可適用一般的核酸增幅反應之條件。即，可採用上述[核酸增幅反應]欄所記載的條件。例如第2反應液為含有作為模具的第1DNA片段、上述次世代排序用引子、DNA聚合酶、作為基質的去氧核苷酸三磷酸(dNTP，即dATP、dCTP、dTTP及dGTP之混合物)及緩衝液。
特別作為次世代排序用引子的濃度可設定為0.01～5.0μM，以0.1～2.5μM者為佳，以0.3～0.7μM者為最佳。
又，對於核酸增幅反應作為模具的第1DNA片段並無特別限定，將反應液的量設定在50μl時，以0.1～1000ng者為佳，以1～500ng者為較佳，以5～200ng者為更佳，以10～100ng者為最佳。
作為模具的第1DNA片段之調製方法並無特別限定，可直接使用使用上述隨機引子組的核酸增幅反應結束後之反應液，亦可使用自該反應液純化第1DNA片段者。
又，對於使用於核酸增幅反應的DNA聚合酶之種類、作為基質的去氧核苷酸三磷酸(dNTP，即dATP、dCTP、dTTP及dGTP之混合物)的濃度、緩衝液組成、溫度循環條件，可為上述[核酸增幅反應]欄上所記載的條件。又，對於使用次世代排序用引子的核酸增幅反應，亦可採用熱啟動方法(Hot start method)，或藉由核酸增幅反應而取得增幅片段。
如以上所述，將使用隨機引子組所取得的第1DNA片段作為模具，藉由使用使用次世代排序用引子進行增幅的第2DNA片段，可簡單地製作出可適用於次世代序列裝置的DNA基因庫。
且在上述例子中，將使用隨機引子組所取得的第1DNA片段作為模具，將使用次世代排序用引子進行增幅的第2DNA片段作為DNA基因庫，但本發明之技術範圍並未限定於該例子者。例如有關本發明的DNA基因庫為，將使用隨機引子組而取得的第1DNA片段作為模具使第2DNA片段增幅，進一步將該第2DNA片段作為模具使用次世代排序用引子取得第3DNA片段，可將該第3DNA片段作為可適用於次世代序列裝置的DNA基因庫。
在製作可適用於次世代序列裝置的DNA基因庫時，同樣地將第2DNA片段作為模具進行核酸增幅反應後，重複將所得之DNA片段作為模具的核酸增幅反應，於最後核酸增幅反應使用次世代排序用引子而可製作。此時，重複的核酸增幅反應之次數並無特別限定，可為2～10次，較佳為2～5次，更佳為2～3次。
以上依據有關本發明的隨機引子組，可大幅度地抑制將基因組DNA作為模具的藉由高濃度隨機引子的核酸增幅反應中來自葉綠體基因組的DNA片段之增幅。因此，藉由上述所得之第2DNA片段成為主要來自核基因組。一般葉綠體基因組為每細胞的複製數為數十個至數百個之多，特定區域藉由核酸增幅反應而大量增幅的可能性為高。在如上述的次世代排序解析中，若特定擴增子大量存在時，對鹼基序列區別用之計算式(matrix)的作成有著影響，會降低鹼基序列區別之精度。又，讀取數據的最佳長度為數十個程度，、大量的重複數據與數據缺失有關。又，將解析的鹼基序列數據利用於上述基因組解析時，葉綠體基因組之讀取數據並不需要。
依據有關本發明的隨機引子組，如上述所述，對於次世代排序解析，因會減低來自葉綠體基因組的擴增子，進行核基因組的解析時可進行判定精度優良的解析。 [實施例]
以下使用實施例對本發明做更詳細說明，但本發明之技術範圍並未限定於以下實施例。
[實施例1] 1.流程圖 　　在本實施例中，依據圖1所示流程圖，將自各種生物種所萃取的基因組DNA作為模具，藉由使用各種隨機引子組的PCR製作出DNA基因庫。又，使用所製作的DNA基因庫，進行所謂使用次世代排序的序列解析，依據所得之讀取數據解析基因型。
2.材料 　　在本實施例中，自甘蔗品種NiF8、Ni9及其雜交後代22系統，以及稻子品種日本晴使用DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)將基因組DNA進行萃取及純化，使用各來自NiF8的基因組DNA、來自Ni9的基因組DNA、來自雜交後代22系統的基因組DNA、來自日本晴的基因組DNA。又，在本實施例中，對於人類DNA購入Takara Bio之Human Genomic DNA，作為來自人類的基因組DNA使用。
3.方法 3.1 PCR條件與DNA片段之尺寸的關係 3.1.1 隨機引子之設計 　　在設計隨機引子時，將GC含量設定在20～70%之範圍，將連續鹼基數設定在5以下之條件。又，對於鹼基長度，設定為8鹼基長、9鹼基長、10鹼基長、11鹼基長、12鹼基長、14鹼基長、16鹼基長、18鹼基長、20鹼基長、22鹼基長、24鹼基長、26鹼基長、28鹼基長、29鹼基長、30鹼基長及35鹼基長之16種類。對於各鹼基長，各設定96種類鹼基序列，製作出由96種類隨機引子所成的組。且，對於10鹼基長，設計6組(各組中含有96種類隨機引子)(將這些6組稱為10鹼基A～10鹼基F)。即，在本實施例中製作出21種類隨機引子組。
含於這些21種類隨機引子組的隨機引子之鹼基序列如表3～23所示。
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3.1.2 標準PCR 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度為0.6μM的隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃下2分鐘，其後在98℃下10秒，在50℃下15秒及在72℃下20秒作為1循環，進行30循環後，在4℃進行保存的條件。且，對於本實施例，含有於此說明的標準PCR以外，藉由使用隨機引子的PCR所得之多數核酸片段皆稱為DNA基因庫。
3.1.3 DNA基因庫之純化及電泳 　　將在3.1.2所得之DNA基因庫以MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)進行純化後，以Agilent 2100生化分析儀(Agient Technologies)進行電泳後得到螢光單位(Fluorescence Unit：FU)。
3.1.4 熱處理(annealing)溫度之檢討 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度0.6μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之 dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit之 DNA Polymerase(TAKARA，PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件，為首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在種種熱處理(annealing)溫度下進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃下保存的條件。且，對於本實施例，檢討作為熱處理(annealing)溫度之37℃、40℃及45℃。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.1.5 酵素量之檢討 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度0.6μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及2.5unit或12.5unit之DNA DNA Polymerase(TAKARA，PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.1.6 MgCl2 濃度之檢討 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度0.6μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、所定濃度的MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。且，對於本實施例，作為MgCl2 濃度，檢討一般的2倍(2.0mM)、3倍(3.0mM)及4倍(4.0mM)。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.1.7 隨機引子的鹼基長之檢討 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度0.6μM之隨機引子、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。且，對於本實施例，作為隨機引子，檢討上述8鹼基長(表9)、9鹼基長(表10)、11鹼基長(表11)、12鹼基長(表12)、14鹼基長(表13)、16鹼基長(表14)、18鹼基長(表15)及20鹼基長(表16)。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.1.8 隨機引子濃度之檢討 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入所定濃度的隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。且，對於本實施例，作為隨機引子濃度，檢討2、4、6、8、10、20、40、60、100、200、300、400、500、600、700、800、900及1000μM。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。又，在本實驗中評估藉由斯皮爾曼(Spearman)之順位相關的重複數據之再現性(ρ＞0.9)。
3.2 藉由MiSeq的再現性之確認 3.2.1 DNA基因庫之製作 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度60μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.2.2 序列基因庫之製作 　　自3.2.1所得之DNA基因庫，使用KAPA Library Preparation Kit(Roche)，製作出MiSeq解析用序列基因庫。
3.2.3 MiSeq解析 　　使用MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)，將在3.2.2所得之MiSeq解析用序列基因庫依據讀取長100鹼基的末端配對條件進行解析。
3.2.4 讀取數據解析 　　由在3.2.3所得之讀取數據，刪除隨機引子之序列資料，特定讀取圖型。而計算出讀取圖型單位的讀取數，比較重複間之讀取數，以相關係數評估再現性。
3.3 稻子品種日本晴之解析 3.3.1 DNA基因庫之製作 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自日本晴的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度60μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.3.2 序列基因庫製作、MiSeq解析及讀取數據解析 　　使用自來自日本晴的基因組DNA所製作的DNA基因庫之序列基因庫製作、MiSeq解析及讀取數據解析各依據3.2.2、3.2.3及3.2.4所記載的方法。
3.3.3 基因組一致性之評估 　　對於在3.3.2所得之讀取圖型，對於日本晴之基因組資料(NC_008394～NC_008405)，將讀取圖型以bowtie2進行基因定位，特定各讀取圖型之基因組位置。
3.3.4 非特異性(專一性)增幅 　　依據在3.3.3所特定的各讀取圖型之位置資料，比較隨機引子之序列與該隨機引子經退火的基因組上之序列，計算錯配數。
3.4 多型檢測及基因型區別 3.4.1 DNA基因庫之製作 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA、來自Ni9的基因組DNA、來自雜交後代的基因組DNA或來自日本晴的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度60μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.4.2 HiSeq解析 　　將在3.4.1所製作的各DNA基因庫，在各1泳道16試樣及讀取長100鹼基之末端配對條件下進行Takara Bio的解析，由此取得讀取數據。
3.4.3 讀取數據解析 　　自在3.4.2所得之讀取數據刪除隨機引子之序列資料，特定讀取圖型。而於讀取圖型單位上計算出讀取數。
3.4.4 多型檢測及基因型區別 　　自作為3.4.3的解析結果所得之讀取圖型的讀取數，檢測NiF8及Ni9特有之多型，將該讀取圖型作為標記物。又，將讀取數與原先的雜交後代22系統之基因型做區別。基因型區別的精度以在雜交後代2系統的重複數據之再現性為準下進行評估。
3.5 藉由PCR標記物之確認實驗 3.5.1 引子之設計 　　在3.4.4所特定的標記物中，對於NiF8型3標記物、Ni9型3標記物之合計6標記物，自末端配對的標記物序列資料設計出各引子(表24)。
Figure 02_image103
3.5.2 PCR及電泳 　　使用TaKaRa Multiplex PCR Assay Kit Ver.2 (TAKARA)，將於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA、來自Ni9的基因組DNA或來自雜交後代的基因組DNA：15ng)作為模具，加入1.25μl Multiplex PCR Enzyme Mix、2 X Multiplex PCR Buffer 12.5μl、在3.5.1所設計的0.4μM引子，以最終反應量25μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先94℃進行1分鐘，其後在94℃進行30秒，在60℃進行30秒及在72℃進行30秒作為1循環而進行30次循環後，在72℃維持10分鐘，其後在4℃進行保存的條件。經增幅的DNA片段在TapeStation(Agilent Technologies)進行電泳。
3.5.3 基因型數據比較 　　由在3.5.2所得之電泳結果，藉由帶的有無區分標記物之基因型，與標記物之讀取數進行比較。
3.6 隨機引子濃度與長度的關係 3.6.1 在高濃度條件下的隨機引子長之影響 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入最終濃度10μM之所定長度的隨機引子、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。對於本實驗，作為隨機引子之長度，檢討9鹼基長(表10)、10鹼基長(表3、10鹼基A)、11鹼基長(表11)、12鹼基長(表12)、14鹼基長(表13)、16鹼基長(表14)、18鹼基長(表15)及20鹼基長(表16)。PCR的溫度循環條件為，在使用9鹼基長的隨機引子的反應系中，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在37℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。PCR的溫度循環條件為，使用10鹼基長以上長度的隨機引子之反應系中，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。
3.6.2 隨機引子之濃度與長度的關係 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入所定長度的隨機引子成為所定濃度，加入0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。對於本實驗，作為隨機引子的長度，檢證於表3～23所示的自8鹼基長至35鹼基長的隨機引子，作為隨機引子之濃度檢證0.6～300μM之範圍。
PCR的溫度循環條件在使用8鹼基長及9鹼基長的隨機引子之反應系中，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在37℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。PCR的溫度循環條件為，在使用10鹼基長以上的長度之隨機引子的反應系中，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。又，藉由斯皮爾曼之順位相關評估重複數據之再現性(ρ＞0.9)。
3.7 隨機引子數 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入選自由表3所示的10鹼基長所成的96種類隨機引子(10鹼基A)的1種、2種、3種、12種、24種或48種隨機引子至最終濃度為60μM，加入0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase (TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。對於本實驗，作為1種、2種、3種、12種、24種或48種隨機引子，選擇自表3的No.1之順序的隨機引子而進行檢證。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。又，藉由斯皮爾曼之順位相關對重複數據之再現性進行評估(ρ＞0.9)。
3.8 隨機引子序列 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自NiF8的基因組DNA：30ng)中加入選自表4～8所示的隨機引子之5組的1組使最終濃度成為60μM，加入0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。又，藉由斯皮爾曼之順位相關對重複數據之再現性進行評估(ρ＞0.9)。
3.9 使用來自人類的基因組DNA之DNA基因庫 　　於在2.所記載的基因組DNA(來自人類基因組DNA：30ng)中加入最終濃度為60μM之隨機引子(10鹼基A)、0.2mM之dNTP mixture、1.0mM之MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，以最終反應量50μl調製出反應液。PCR的溫度循環條件為，首先在98℃進行2分鐘，其後在98℃進行10秒，在50℃進行15秒及在72℃進行20秒作為1循環而進行30次循環後，在4℃進行保存的條件。在本實驗所得的DNA基因庫之純化與電泳進行與3.1.3之同樣方法。又，藉由斯皮爾曼之順位相關對重複數據之再現性進行評估(ρ＞0.9)。
4.結果及考察 4.1 PCR條件與DNA基因庫之尺寸的關係 　　依照通常PCR條件，在利用隨機引子的PCR(上述3.1.2)中，經增幅的DNA基因庫之尺寸為2kbp以上的高分子，目的尺寸的100bp～500bp中並未見到增幅(圖2)。未得到100bp～500bp之DNA基因庫的原因被考慮為，隨機引子在500bp以下的區域中作為引子時發揮其功能的機率為低之故。在製作目的之尺寸的100bp～500bp之DNA基因庫時，考慮到再現性良好下誘發非特異性(專一性)增幅為必要。
其中，對該PCR的特異性產生影響時，對於熱處理(annealing)溫度(上述3.1.4)、酵素量(上述3.1.5)、MgCl2 濃度(上述3.1.6)、引子長(上述3.1.7)及引子濃度(上述3.1.8)與DNA基因庫尺寸之關係進行檢討。
對於在上述3.1.4所記載的實驗中，將熱處理(annealing)溫度設定在45℃時的結果如圖3所示，將熱處理(annealing)溫度設定在40℃時的結果如圖4所示，將熱處理(annealing)溫度設定在37℃時的結果如圖5所示。如圖3～5所示，將熱處理(annealing)溫度設定在45℃、40℃及37℃逐漸降低下，雖增加高分子DNA基因庫的增幅量，但未見到低分子DNA基因庫之增幅。
對於上述3.1.5所記載的實驗，將酵素量設定在2倍時的結果如圖6所示，將酵素量設定在10倍時的結果如圖7所示。如圖6及7所示，即使將酵素量增加為通常2倍、10倍，雖增加高分子DNA基因庫，但於低分子未見到DNA基因庫之增幅。
對於上述3.1.6所記載的實驗，將MgCl2 濃度設定在通常2倍時的結果如圖8所示，將MgCl2 濃度設定在通常3倍時的結果如圖9所示，將MgCl2 濃度設定在通常4倍時的結果如圖10所示。如圖8～10所示，即使將MgCl2 濃度增加為通常2倍、3倍、4倍，雖高分子DNA基因庫的增幅量有變化，但未見到低分子DNA基因庫之增幅。
對於上述3.1.7所記載的實驗，將隨機引子長設定在8鹼基長、9鹼基長、11鹼基長、12鹼基長、14鹼基長、16鹼基長、18鹼基長及20鹼基長時的結果各表示於圖11～18。如圖11～18所示，即使使用任一長度的隨機引子，與圖2所示結果(10鹼基長的隨機引子)相比較未見到大變化。 　　上述3.1.8所記載的實驗結果歸納於表25。
Figure 02_image105
如圖19～47所示得知，使用10鹼基長的隨機引子時，在隨機引子濃度為6μM時，見到1kbp的DNA片段之增幅，隨著濃度上昇，會使DNA片段低分子化。又，針對隨機引子濃度設定在6～500μM時的再現性進行檢討結果，通常10倍的6μM中ρ為稍低的0.889，但相當於通常13.3倍之8μM以上時，進一步相當於833.3倍 之500μM時，所有ρ皆為顯示較高的0.9以上。由該結果得知，藉由將隨機引子的濃度比在通常PCR條件下的濃度更大幅度地提高，一邊達成高再現性下，可一邊增幅1kbp以下之DNA片段。但，若隨機引子的濃度過度超過500μ時，未見到所望尺寸的DNA片段之增幅。因此，欲得到優良再現性，且使低分子的DNA片段進行增幅，得知使隨機引子的濃度設定在比通常PCR時更高，且所定值以下的最適範圍為存在。
4.2 藉由MiSeq的再現性之確認 　　如在上述3.2所說明，欲確認DNA基因庫製作的再現性，將自NiF8經萃取的基因組DNA作為模具，對於以隨機引子進行增幅的DNA基因庫，藉由次世代排序MiSeq進行解析的結果如圖48所示。且，作為上述3.2.4的結果，得到47,484個讀取圖型。在重複間比較讀取數的結果，與電泳結果同樣地，顯示在重複間的相關係數r=0.991之較高相關性。由以上結果得知，藉由隨機引子的再現性良好，且可製作DNA基因庫。
4.3 稻子品種日本晴之解析 　　如在上述3.3所說明，將自基因組資料所公開的稻子日本晴所萃取的基因組DNA作為模具，藉由隨機引子製作出DNA基因庫，將電泳結果顯示於圖49及50中。由如圖49及50所示結果得知，ρ顯示0.979之非常高的值。又，藉由MiSeq解析讀取數據的結果如圖51所示。由圖51所示結果得知，顯示相關係數r為0.992的非常高值。由這些結果得知，即使將稻子作為對象，藉由使用隨機引子，可製作出具有非常高再現性的DNA基因庫。
又，如在上述3.3.3所說明，將所得之讀取圖型在日本晴基因組資料上基因定位結果得知，以於6.2 kbp為l處的比例下，可無偏差下以基因組增幅均勻的DNA片段(圖52)。又，比較隨機引子的序列與基因組資料之結果，存在平均3.6個的錯配，在99.0%的引子對中產生1個以上的錯配(圖53)。由以上結果得知，利用隨機引子的DNA基因庫為基因組全體皆為均勻，且再現性良好，可藉由非特異性(專一性)增幅而製作。
4.4 甘蔗多型檢測及基因型區別 　　如在上述3.4所說明，使用甘蔗NiF8、Ni9及其雜交後代22系統，藉由隨機引子製作DNA基因庫，以次世代排序HiSeq進行解析，依據讀取數據可區分兩親的多型檢測及雜交後代的基因型。其結果如表26所示。
Figure 02_image107
如表26所示，NiF8型為8,683個標記物，Ni9型為11,655個標記物，可製作出合計20,338個標記物。又，在雜交後代的基因型區別之再現性為較高的99.97%，其被認為為基因型區別精度極高者。特別為甘蔗在多倍數性(8x+n)的染色體數亦為極多的100～130股，基因組尺寸為10Gbp時為人類的3倍以上為極大。因此，區分基因組DNA全體所有基因型極為困難係為現狀。如上述所示，藉由使用隨機引子，可製作出極多數的標記物，對於甘蔗亦可區別精度高的基因型。
4.5 藉由PCR標記物的確認實驗 　　如上述3.5所說明，使用如表22所示引子，對於NiF8與Ni9、該雜交後代22系統進行PCR後以電泳區別基因型，再與讀取數做比較。NiF8型的標記物N80521152之讀取數及電泳圖像各如圖54及55所示。NiF8型的標記物N80997192之讀取數及電泳圖像各如圖56及57所示。NiF8型的標記物N80533142之讀取數及電泳圖像各如圖58及59所示。Ni9型的標記物N91552391之讀取數及電泳圖像各如圖60及61所示。Ni9型的標記物N91653962之讀取數及電泳圖像各如圖62及63所示。Ni9型的標記物N91124801之讀取數及電泳圖像各如圖64及65所示。
如圖54～65所示，在上述3.5所設計的所有PCR標記物之結果亦與次世代排序的解析結果一致，故得知使用次世代排序的基因型區別可作為標記物技術利用。
4.6 隨機引子濃度與長度的關係 　　如在上述3.6.1所說明，使用9鹼基長(表10)、10鹼基長(表3、10鹼基A)、11鹼基長(表11)、12鹼基長(表12)、14鹼基長(表13)、16鹼基長(表14)、18鹼基長(表15)及20鹼基長(表16)之隨機引子，製作DNA基因庫的結果如圖66～81所示。又，表27為歸納這些結果。
Figure 02_image109
如圖66～81所示，使用相當於通常13.3倍的10.0μM之高濃度隨機引子時，對於9鹼基長～20鹼基長的範圍，一邊達成非常高再現性，一邊可增幅低分子的DNA片段。特別為隨機引子的鹼基長越長(特別為12鹼基長以上)，見到增幅片段進行低分子化的傾向。且，使用9鹼基長的隨機引子時，藉由將熱處理(annealing)溫度設定在37℃時，可增加DNA片段的增幅量。
又，如在上述3.6.2所說明，欲明確隨機引子的濃度與長度的關係，可將隨機引子在8～35鹼基長，將隨機引子濃度設定在0.6～300μM之範圍下進行PCR，嘗試製作DNA基因庫。結果如表28所示。
Figure 02_image111
如表28所示，藉由隨機引子的長度為9～30鹼基長，且隨機引子的濃度設定在4.0～200μM時，可使低分子(100～500鹼基)的DNA片段在再現性高下進行增幅。特別為隨機引子的長度為9～30鹼基長，且隨機引子的濃度設定在4.0～100μM時，可將低分子(100～500鹼基)的DNA片段確實在再現性高下進行增幅。
又，將表28所示結果做更詳細檢討時，判斷出隨機引子的長度與濃度如圖82所示，特別於框架包圍的區域內進行調製者為佳。更具體為，隨機引子之濃度在隨機引子為9～10鹼基長時，以設定在40～60μM者為佳。隨機引子的濃度在隨機引子為10～14鹼基長時，將隨機引子的鹼基長作為y，將隨機引子的濃度作為x時，滿足y＞3E+08x-6.974 且100μM以下者為佳。隨機引子的濃度在隨機引子為14～18鹼基長時，設定在4～100mM者為佳。隨機引子的濃度在隨機引子為18～28鹼基長時為4μM以上，且滿足y＜8E+08x-5.533 者為佳。隨機引子的濃度在隨機引子為28～29鹼基長時，設定在4～10μM者為佳。且，這些y＞3E+08x-6.974 及y＜8E+08x-5.533 為依據Microsoft Excel的累乘近似所算出的式。
如以上所示，藉由將隨機引子的鹼基長與濃度規定在所定範圍時，可將低分子(100～500鹼基)的DNA片段在高再現性下進行增幅。例如，對於次世代排序，解析高分子DNA片段時，得知數據精度顯著降低。如本實施例所示，藉由將隨機引子的鹼基長與濃度規定在所定範圍時，可將適用於次世代排序的解析之分子尺寸的DNA基因庫在再現性良好下製作，故適用於次世代排序標記物解析。
4.7 隨機引子數 　　如在上述3.7所說明，使用1種、2種、3種、12種、24種或48種隨機引子(濃度為60μM)，製作DNA基因庫的結果如圖83～94所示。又，於表29歸納這些結果。
Figure 02_image113
如圖83～94所示，在1種、2種、3種、12種、24種或48種隨機引子中任一種情況下，亦可達成非常高的再現性，且可增幅低分子之DNA片段。特別隨著隨機引子之種類增加，電泳圖像的吸收峰會變小，偏差有變小的傾向。
4.8 隨機引子序列 　　如在上述3.8所說明，使用表4～8所示的各隨機引子組(10鹼基B、10鹼基C、10鹼基D、10鹼基E及10鹼基F)，製作出DNA基因庫的結果如圖95～104所示。又，表30中歸納這些結果。
Figure 02_image115
如圖95～104所示，即使使用10鹼基B、10鹼基C、10鹼基D、10鹼基E及10鹼基F中任一組，亦可一邊達成非常高再現性且可增幅低分子的DNA片段。
4.9 人類DNA基因庫製作 　　如在上述3.9所說明，使用來自人類基因組DNA及最終濃度60μM的隨機引子(10鹼基A)而製作DNA基因庫的結果如圖105及106所示。圖105表示重複實驗的第一次結果，圖106表示重複實驗的第二次結果。如圖105及106所示，即使用來自人類的基因組DNA，亦可一邊達成非常高再現性且可增幅低分子的DNA片段。
[實施例2] 1.流程圖 　　在本實施例中，依據圖107及108所示模式圖，將基因組DNA作為模具，使用隨機引子藉由PCR製作出第1DNA片段，繼續將所製作的第1DNA片段作為模具，使用次世代排序用引子藉由PCR製作出第2DNA片段，將製作的第2DNA片段作為排序用基因庫，進行所謂使用次世代排序的序列解析，依據所得之讀取數據進行基因型的解析。
2.材料 　　在本實施例中，由甘蔗品種NiF8及稻子品種日本晴使用DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)，將基因組DNA進行萃取及純化，作為各來自NiF8的基因組DNA及來自日本晴的基因組DNA使用。
3.方法 3.1 在甘蔗NiF8之檢討 3.1.1 隨機引子與次世代排序用引子之設計 　　在本例中，隨機引子為以Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter)Nextera adapter中之3’末端的10鹼基為基準下設計。即，在本例中作為隨機引子，使用GTTACACACG(序列號碼2041，10鹼基G)。又，次世代排序用引子為同樣地，將Illumina公司的Nextera adaptor之序列資料最為基準下設計(表31)。
Figure 02_image117
3.1.2 DNA基因庫之製作 　　在上述2.所說明的來自NiF8的基因組DNA(30 ng)中各加入最終濃度0.2 mM之dNTP mixture、1.0 mM MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，再加入60μM隨機引子(10鹼基G)，在最終反應量50μl下進行PCR(在98℃進行2分鐘後，在98℃進行10秒，在50℃進行15秒，在72℃進行20秒的30次循環反應後，在4℃下保存)後製作出DNA基因庫(第1DNA片段)。
3.1.3 純化及電泳 　　將3.1.2的DNA基因庫以MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)進行純化後，以Agilent 2100 生化分析儀(Agilent Technologies)進行電泳，得到螢光單位(Fluorescence Unit：FU)。又，藉由斯皮爾曼之順位相關對重複數據之再現性進行評估(ρ＞0.9)。
3.1.4 次世代排序用之DNA基因庫的製作 　　於在3.1.3所純化的第1DNA片段(100 ng)中各加入最終濃度0.2 mM之dNTP mixture、1.0 mM MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，再加入0.5μM的次世代排序用引子，在最終反應量50μl進行PCR(在95℃進行2分鐘後，在98℃進行15秒，在55℃進行15秒，在72℃進行20秒的25循環反應後，在72℃進行1分鐘後，在4℃下保存)而製作出次世代排序用的DNA基因庫(第2DNA片段)。次世代排序用的DNA基因庫之純化與電泳以與3.1.3之同樣方法進行。
3.1.5 MiSeq解析 　　將3.1.4的次世代排序用之DNA基因庫(第2DNA片段)使用MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)，以讀取長100鹼基的末端配對條件為準下以MiSeq進行解析。
3.1.6 讀取數據解析 　　自3.1.5之讀取數據特定讀取圖型。而對於各讀取圖型計算出讀取數，比較重複間之讀取數並以相關係數評估再現性。
3.2 在稻子品種日本晴之檢討 3.2.1 隨機引子與次世代排序用引子之設計 　　在本例中，隨機引子係以Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter)Nextera adapter中之3’末端的10鹼基為基準下設計。即，在本例中，作為隨機引子為設計成由位置於Nextera adapter中之3’末端的10鹼基，於該10鹼基的3’末端加成2鹼基的任意序列之全長12鹼基所成的16種類鹼基序列(表32、12鹼基B)。
Figure 02_image119
又，在本例中，與3.1.1同樣地，使用將Illumina公司的Nextera adaptor之序列資料為準所設計的次世代排序用引子。
3.2.2 DNA基因庫之製作 　　在上述2.所說明的來自日本晴之基因組DNA(30 ng)中各加入最終濃度0.2 mM之dNTP mixture、1.0 mM MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，再加入40μM隨機引子(12鹼基B)，在最終反應量50μl下進行PCR(在98℃進行2分鐘後，在98℃進行10秒，在50℃進行15秒，在72℃進行20秒的30循環反應後，在4℃下保存)而製作出DNA基因庫(第1DNA片段)。
3.2.3 純化及電泳 　　將3.2.2的DNA基因庫以MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)進行純化後，以Agilent 2100 生化分析儀(Agilent Technologies)進行電泳後得到螢光單位(Fluorescence Unit：FU)。又，藉由斯皮爾曼之順位相關對重複數據之再現性進行評估(ρ＞0.9)。
3.2.4 次世代排序用之DNA基因庫的製作 　　在3.2.3進行純化的第1DNA片段(100ng)中各加入最終濃度0.2 mM之dNTP mixture、1.0 mM MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)，再加入0.5μM的次世代排序用引子，在最終反應量50μl下進行PCR(在95℃進行2分鐘後，在98℃進行15秒，在55℃進行15秒，在72℃進行20秒的25循環反應後，在72℃進行1分鐘後，在4℃下保存)而製作出次世代排序用的DNA基因庫(第2DNA片段)。次世代排序用的DNA基因庫之純化與電泳以與3.1.3之同樣方法進行。
3.2.5 MiSeq解析 　　將3.2.4的次世代排序用之DNA基因庫(第2DNA片段)使用MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)，以讀取長100鹼基的末端配對條件為準以MiSeq進行解析。
3.2.6 讀取數據解析 　　將3.2.5的讀取圖型對於日本晴之基因組資料(NC_008394～NC_008405)以bowtie2進行基因定位，確認隨機引子之序列與基因組DNA之一致率。又，自3.2.5之讀取數據特定讀取圖型，對於各讀取圖型計算讀取數，比較重複間之讀取數並以相關係數評估再現性。
4.結果及考察 4.1 在甘蔗NiF8中之檢討結果 　　利用由 Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter) Nextera adaptor中之3’末端的10鹼基所成的隨機引子(10鹼基G)，以60μl的高濃度條件下進行PCR時的電泳結果如圖109及110所示。如圖109及110所示，在含有100bp～500bp的廣範圍區域中見到增幅(第1DNA片段)。作為在廣範圍區域的增幅被確認的理由，推測為對於與隨機引子為一致的基因組DNA區域以外者亦見到增幅之故。又，又因重複數據間之順位相關係數為0.957與0.9以上，故對於增幅圖型確認到高再現性。
其次，如在3.1.4所說明，使用次世代排序用引子進行PCR時的電泳結果如圖111及112所示。即，欲製造使次世代排序的接頭(adapter)Nextera adaptor進行連結的DNA基因庫(第2DNA片段)，將第1DNA片段作為模具，利用由Illumina公司的Nextera adaptor序列所成的次世代排序用引子進行PCR。Illumina公司的次世代排序為於DNA基因庫中含有多數100bp以下的短片段或1kbp以上的長片段時，解析精度會極端地降低。在本實施例所製作的次世代排序用之DNA基因庫(第2DNA片段)係如圖111及112所示，因由將500bp附近作為吸收峰時主要分布於150bp～1kbp之範圍得知，可作為次世代排序用之DNA基因庫。又，重複數據間之順位相關係數為0.989與0.9以上故確認到增幅圖型之高再現性。
又，將所得之DNA基因庫(第2DNA片段)以次世代排序MiSeq進行解析結果，得到3.5Gbp及3.6Gbp之讀取數據。又，表示MiSeq的數據精度之＞=Q30的值為93.3%及93.1%。由製造商推薦值為讀取數據3.0Gbp以上及＞=Q30 85.0%以上得知，在本實施例所製作的次世代排序之DNA基因庫(第2DNA片段)可利用於次世代排序之解析。欲確認再現性時，對於在MiSeq所得之34,613個讀取圖型，比較在重複間之讀取數。結果如圖113所示。如圖113所示，與電泳結果同樣地，讀取數在重複間為顯示較高的r=0.996之相關性。
如在以上說明，將由Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter)Nextera Adaptor的3’末端之10鹼基所成的隨機引子以在高濃度利用的PCR並得到DNA基因庫(第1DNA片段)後，藉由利用由Nextera Adaptor的序列所成的次世代排序用引子之PCR，可簡便且再現性良好下，製作出由多數片段所成的次世代排序用之DNA基因庫(第2DNA片段)。
4.2 在稻子日本晴之檢討結果 　　利用由位置於Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter)Nextera adapter中之3’末端的10鹼基、於該10鹼基的3’末端加成2鹼基之任意序列的全長12鹼基所成的16種類隨機引子(12鹼基B)，在40μl的高濃度條件下進行PCR時的電泳結果如圖114及115所示。如圖114及115所示，在含有100bp～500bp的廣範圍區域中見到增幅(第1DNA片段)。作為在廣範圍的增幅被確認的理由，推測為與4.1同樣地，對於與隨機引子一致的基因組DNA區域以外亦增幅之故。又，因在本例中順位相關係數為0.950與0.9以上，故確認增幅圖型具有高再現性。
其次，如在3.2.4所說明，使用次世代排序用引子進行PCR時的電泳結果如圖116及117所示。即，欲製作連結次世代排序之接頭(adapter)Nextera adaptor的DNA基因庫(第2DNA片段)，將第1DNA片段作為模具，利用由Illumina公司的Nextera adaptor序列所成的次世代排序用引子進行PCR。其結果，在本實施例所製作的次世代排序用之DNA基因庫(第2DNA片段)如圖116及117所示，由將300bp附近作為吸收峰，主要分布於150bp～1kbp的範圍得知，適用於次世代排序用之DNA基因庫。又，重複數據間之順位相關係數為0.992與0.9以上，故確認增幅圖型具有高再現性。
又，將所得之DNA基因庫(第2DNA片段)以次世代排序MiSeq進行解析結果，得到4.0Gbp及3.8Gbp之讀取數據。又，表示MiSeq的數據精度之＞=Q30的值為94.0%及95.3%。由該結果得知，與4.1.1同樣地，得知在本實施例所製作的次世代排序之DNA基因庫(第2DNA片段)，可利用於次世代排序之解析。對於在MiSeq所得之19,849個讀取圖型，欲評估隨機引子序列與基因組之一致率，比較隨機引子序列與日本晴參照序列結果如圖118所示。如圖118所示，隨機引子序列與日本晴參照序列之平一致致率為34.5%。特別由並無隨機引子序列與日本晴參照序列為完全一致的讀取圖型得知，其為所有讀取圖型皆未與隨機引子一致的序列上鍵結隨機引子後進行增幅。此考慮為與生化分析儀之結果一致的結果。欲確認讀取圖型之再現性，在重複間比較讀取數。結果如圖119所示。如圖119所示，與電泳結果同樣地，在重複間顯示較高r = 0.999之相關性。
如以上所說明，將由位置於Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter)Nextera Adaptor中之3’末端的10鹼基，與於該10鹼基之3’末端加成2鹼基的任意序列之全長12鹼基所成的16種類隨機引子，以在高濃度下利用的PCR，得到DNA基因庫(第1DNA片段)後，藉由利用由Nextera Adaptor的序列所成的引子之PCR，在簡便且再現性良好下，可製作出由多數片段所成的次世代排序用之DNA基因庫(第2DNA片段)。
[實施例3] 1.流程圖 　　在本實施例中，與實施例2同樣地，將基因組DNA作為模具，藉由使用隨機引子的PCR而製作出第1DNA片段，接著將所製作的第1DNA片段作為模具，藉由使用次世代排序用引子的PCR，製作出第2DNA片段，將所製作的第2DNA片段作為排序用基因庫，進行所謂使用次世代排序的序列解析，依據所得之讀取數據解析基因型。在本實施例中，特別對於是否可藉由使用的隨機引子來抑制來自葉綠體基因組的DNA片段之增幅做檢討。
2.材料 　　在本實施例中，自稻子品種日本晴使用DNeasy Plant Mini kit(QIAGEN)，萃取基因組DNA，將經純化者作為來自稻子的基因組DNA使用。又，在本實施例中，使用的玉米、馬鈴薯及黃豆之基因組DNA皆由Cosmo Bio Inc.所購入者(各為行號D1634330、D1634350及D1634370)。
3.方法 3.1 隨機引子之設計 　　隨機引子設計為由於Illumina公司的次世代排序用之接頭(adapter)Nextera adapter中之3’末端的10鹼基TAAGAGACAG，與於該10鹼基的3’末端加成3鹼基的任意序列之全長13鹼基所成的64種類鹼基序列(表33)。隨機引子組為調製出64股、63股、60股、40股、20股、10股(組A～F)。又，設計成由於該10鹼基之3’末端加成2鹼基的任意序列之全長12鹼基所成的16種類鹼基序列(表34，組G)。又，次世代排序用引子設計為同樣地以Illumina公司的Nextera adaptor之序列資料為準者(表35)。
Figure 02_image121
Figure 02_image123
Figure 02_image125
3.2 DNA基因庫之製作 　　於2.的基因組DNA(15 ng)中各加入最終濃度0.2 mM之dNTP mixture、1.0 mM MgCl2 及0.625 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)及40μM隨機引子，在最終反應量25μl藉由PCR(於98℃進行2分鐘後，於98℃進行10秒，於50℃進行15秒，在72℃進行20秒的30循環反應後，在4℃下保存)製作出DNA基因庫(第1DNA片段)。
3.3 次世代排序用之DNA基因庫的製作 　　於在3.2所製作的DNA基因庫(第1DNA片段)1μl中各加入最終濃度0.2 mM之dNTP mixture、1100.0 mM MgCl2 及1.25 unit的DNA Polymerase(TAKARA、PrimeSTAR)及0.25μM的次世代排序用引子，在最終反應量50μl藉由PCR(在95℃進行2分鐘後，在98℃進行15秒，在55℃進行15秒，在72℃進行20秒的25循環反應後，在72℃進行1分鐘後，在4℃下保存)，製作出次世代排序用的DNA基因庫(第2DNA片段)。將製作之DNA基因庫以MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)進行純化後，以Agilent 2100 生化分析儀(Agilent Technologies)進行電泳並確認波形。
3.4 藉由次世代排序之解析 　　對於在3.3所製作的DNA基因庫(第2DNA片段)，使用 MiSeq Reagent Kit V2 500 Cycle(Illumina)，以讀取長100鹼基之末端配對條件為準藉由MiSeq進行解析。
3.5 鹼基序列資料之解析 　　對於在3.4所得之讀取數據，於各植物之葉綠體基因組鹼基序列資料(玉米：NC_001666.2 Zea mays chloroplast, complete genome、稻子：NC_001320.1 Oryza sativa Japonica Group plastid, complete genome、馬鈴薯：NC_008096.2 Solanum tuberosum chloroplast, complete genome、黃豆：NC_007942.1 Glycine max chloroplast, complete genome)使用bowtie2進行基因定位，特定來自葉綠體基因組的讀取數據及其區域。
4. 結果 4.1 來自葉綠體基因組的讀取數據之解析 4.1.1 對於葉綠體基因組之基因定位 　　由如表33所示的隨機引子組A所製作的DNA基因庫，藉由MiSeq進行解析的結果如表36所示。
Figure 02_image127
如表36所示，藉由使用隨機引子組A，對於玉米、稻子、馬鈴薯及黃豆，得到各41萬以上之讀取數據。將所得之讀取數據基因定位為各植物之葉綠體基因組的鹼基序列資料之結果，如表36所示，9,725～134,709之讀取數據基因定位成葉綠體基因組。特別對於馬鈴薯及黃豆，推測所得之讀取數據中各28.3%及29.1%為來自葉綠體基因組。藉由該結果，得到使用隨機引子組A時，因解析核基因組而失去大量的數據之結論。
4.1.2 葉綠體基因組之特定區域 　　欲特定在4.1.1多數讀取數據被基因定位之葉綠體基因組的位置，基因定位為葉綠體基因組之讀取數據中，將1%以上經基因定位的區域作為特定區域。對於玉米，葉綠體基因組之特定區域與被基因定位之讀取數的歸納結果如表37所示，對於稻子，葉綠體基因組之特定區域與被基因定位之讀取數的歸納結果如表38所示，對於馬鈴薯，葉綠體基因組之特定區域與被基因定位之讀取數的歸納結果如表39所示，對於黃豆，葉綠體基因組之特定區域與被基因定位之讀取數的歸納結果如表40所示。
Figure 02_image129
Figure 02_image131
Figure 02_image133
Figure 02_image135
如表37～40所示得知，在玉米、馬鈴薯、黃豆中有4個特定區域，在稻子中有6個特定區域。基因定位為這些特定區域之讀取的比例為，基因定位為葉綠體基因組之讀取的96.3%～99.4%之較高比率，幾乎所有讀取來自這些特定區域。
對於在表37～40所示的特定區域中之Region_1_1及Region_2_1，將比較鹼基序列之結果如圖120-1及120-2所示。且，對於圖120-1及120-2，將在玉米中發現的特定區域記載為Region_1_1_Corn及Region_2_1_Corn，在稻子中發現的特定區域記載為Region_1_1_Oryza及Region_2_1_Oryza，在馬鈴薯中發現的特定區域記載為Region_1_1_Potato及Region_2_1_Poteto，在黃豆中發現的特定區域記載為Region_1_1_Soybean及Region_2_1_Soybean。又，將Region_1_1_Corn之鹼基序列以序列號碼2153表示，將Region_1_1_Oryza的鹼基序列以序列號碼2154表示，將Region_1_1_Potato的鹼基序列以序列號碼2155表示，將Region_1_1_Soybean的鹼基序列以序列號碼2156表示，將Region_2_1_Corn的鹼基序列以序列號碼2157表示，將Region_2_1_Oryza的鹼基序列以序列號碼2158表示，將Region_2_1_Potato的鹼基序列以序列號碼2159表示，將Region_2_1_Soybean的鹼基序列以序列號碼2160表示。
而比較特定區域之鹼基序列的結果，如圖120-1及120-2所示，推測4區域(Region_1_1、Region_1_2、Region_2_1、Region_2_2)與所有植物極為類似，其為共通區域。且，Region_1_2與Region_2_2(圖120-1及120-2中，標記為Rigion_*_2)存在於各Region_1_1與Region_2_1之區域內，Region_1_1與Region_2_1之互補鏈為類似，形成回文序列(Palindrome)。
這些4區域之末端序列可大概分為3種類，特別為區域之110鹼基為4區域共通之序列。由這些區域之序列資料得知，隨機引子組A中，藉由由「TAAGAGACAG」之3’末端上連結「TGC」、「GGA」、「GGG」或「GTG」之序列所成的隨機引子進行增幅。特別以其中「TAAGAGACAGTGC」被認為與這些所有區域之增幅有關的隨機引子。
另外，在稻子所發現的特定區域中，比較Region_3_1與Region_3_2之結果如圖121所示(各標記為Region_3_1_Oryza及Region_3_2_Oryza)。將Region_3_1_Oryza及Region_3_2_Oryza的鹼基序列各以序列號碼2161及2162表示。如圖121所示，Region_3_2為Region_3_1之內部序列。藉由該解析結果得知，藉由於「TAAGAGACAG」之3’末端上連結「TGC」、「GTA」、「ATA」或「CCA」之序列所成的隨機引子進行增幅。
4.2 隨機引子之選定 　　由4.1.2中之解析結果得知，於來自葉綠體基因組的DNA片段之增幅，隨機引子組A中之「TAAGAGACAGTGC」的隨機引子顯示較大關連性。因此，選定除該「TAAGAGACAGTGC」之隨機引子以外由63股、60股、40股、20股、10股所成的隨機引子5組(表33，組B～F)。
4.3 選定隨機引子組之解析 　　使用在4.2所選定的隨機引子5組(組B～F)，與使用隨機引子組A的方法同樣地，解析玉米、稻子、馬鈴薯及黃豆。使用隨機引子組B時的結果如表41所示，使用隨機引子組C時的結果如表42所示，使用隨機引子組D時的結果如表43所示，使用隨機引子組E時的結果如表44所示，使用隨機引子組F時的結果如表45所示。
Figure 02_image137
Figure 02_image139
Figure 02_image141
Figure 02_image143
Figure 02_image145
又，合併表41～45所示結果與表36所示結果於圖122所示。其結果如表41～45及圖122所示結果得知，藉由利用未含TAAGAGACAGTGC的隨機引子組B～F，基因定位成葉綠體基因組的讀取數據之比例減少至半分以上。特別對於自隨機引子組A僅除去1股隨機引子「TAAGAGACAGTGC」之組B，該比例大幅度減少到0.3～3.3%。又，對於由隨機引子10股所成的組F，該比例亦大幅度減少到0.2%～1.8%。
由該結果得知，藉由依據在本實施例所發現的葉綠體基因組中之特定區域的序列資料為準而選定隨機引子，可大幅度替減少來自葉綠體基因組的讀取數據
4.4 隨機引子組G之解析 　　又，在本實施例中，欲得知在4.1.2發現的特定區域與隨機引子之長度的關係，使用由12鹼基所成的隨機引子組G(表34)，解析稻子日本晴基因組。解析結果如表46所示。
Figure 02_image147
如表46所示，基因定位成葉綠體基因組的讀取之97.9%被基因定位成除去Region_3_2的5個區域。由以上結果得知，即使改變隨機引子的長度，基因定位成葉綠體基因組之大多數讀取為來自這些特定區域。又，推測藉由於「TAAGAGACAG」的3’末端具有「TG」的隨機引子可增幅這些區域。
5.考察 　　如本實施例所示，利用於5’末端具有TAAGAGACAG的隨機引子組，對於由次世代排序所得之讀取數據進行解析時，得知在所有植物種含有大量來自葉綠體基因組的讀取數據，以及藉由植物種所得之讀取數據的約3成為來自葉綠體基因組。藉由次世代排序的解析，該性能強烈取決於讀取數據量，作為目的之讀取數據的產率提高為重要。通常解析核基因組時，並不需要葉綠體基因組之讀取數據，該減低程序成為課題。
如在本實施例所示得知，基因定位成葉綠體基因組的讀取數據之大半為來自特定區域。而如在本實施例所示，藉由利用除去特定隨機引子的隨機引子組，可大幅度地減低來自葉綠體基因組的特定區域之讀取數據。具體而言，依據特定區域之序列解析，選定除去「TAAGAGACAGTGC」之5種類隨機引子組。即使利用任一組，亦可減少來自葉綠體基因組的讀取數據到半分以上，特別對於由僅除去1股「TAAGAGACAGTGC」的組B或10股隨機引子所成的組F，可確認大幅度的減低。由該結果得知，藉由迴避來自特定區域的DNA片段之增幅的隨機引子組之設計，在與隨機引子組內之隨機引子的股數無關係下，可大幅度減低來自葉綠體基因組之讀取數據。
[圖1]表示有關本發明的DNA基因庫之製作方法及利用DNA基因庫的基因組DNA解析方法的流程圖。 　　[圖2]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，藉由一般條件的PCR而進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖3]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以熱處理(annealing)溫度45℃進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖4]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以熱處理(annealing)溫度40℃進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖5]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以熱處理(annealing)溫度37℃進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖6]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以酵素量2.5 unit進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖7]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以酵素量12.5 unit進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖8]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以MgCl2 濃度2倍進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖9]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以MgCl2 濃度3倍進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖10]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以MgCl2 濃度4倍進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖11]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以8鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖12]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以9鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖13]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以11鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖14]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以12鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖15]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以14鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖16]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以16鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖17]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以18鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖18]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以20鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖19]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度2μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖20]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度4μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖21]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度6μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖22]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度6μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖23]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度8μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖24]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度8μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖25]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度10μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖26]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度10μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖27]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度20μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖28]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度20μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖29]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度40μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖30]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度40μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖31]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度60μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖32]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度60μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖33]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度100μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖34]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度100μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖35]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度200μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖36]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度200μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖37]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度300μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖38]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度300μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖39]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度400μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖40]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度400μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖41]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度500μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖42]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度500μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖43]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度600μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖44]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度700μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖45]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度800μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖46]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度900μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖47]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子濃度1000μM進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖48]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子進行增幅的DNA基因庫之MiSeq解析結果表示特性圖。 　　[圖49]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖50]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖51]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子進行增幅的DNA基因庫之MiSeq解析結果表示特性圖。 　　[圖52]表示自MiSeq所得之讀取圖型的稻子日本晴基因組資料之位置特性圖。 　　[圖53]表示隨機引子與稻子基因組的錯配鹼基數之度數分布特性圖。 　　[圖54]表示標記物N80521152中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代之讀取數特性圖。 　　[圖55]表示PCR標記物N80521152中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的電泳圖像的照片。 　　[圖56]表示標記物N80997192中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的讀取數特性圖。 　　[圖57]表示PCR標記物N80997192中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的電泳圖像之照片。 　　[圖58]表示標記物N80533142中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的讀取數特性圖。 　　[圖59]表示PCR標記物N80533142中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的電泳圖像之照片。 　　[圖60]表示標記物N91552391中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的讀取數特性圖。 　　[圖61]表示PCR標記物N91552391中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的電泳圖像之照片。 　　[圖62]表示標記物N91653962中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的讀取數特性圖。 　　[圖63]表示PCR標記物N91653962中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的電泳圖像之照片。 　　[圖64]表示標記物N91124801中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的讀取數特性圖。 　　[圖65]表示PCR標記物N91124801中之甘蔗NiF8與Ni9、該雜交後代的電泳圖像之照片。 　　[圖66]表示表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，9鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖67]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，9鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖68]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，10鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖69]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，10鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖70]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，11鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖71]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，11鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖72]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，12鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖73]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，12鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖74]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，14鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖75]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，14鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖76]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，16鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖77]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，16鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖78]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，18鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖79]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，18鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖80]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，20鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖81]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，20鹼基長的隨機引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖82]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，將8～35鹼基長的隨機引子在0.6～300μM的濃度範圍下使用而進行增幅的DNA基因庫之再現性做檢討的結果特性圖。 　　[圖83]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子1種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖84]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子1種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖85]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子2種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖86]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子2種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖87]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子3種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖88]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子3種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖89]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子12種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖90]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子12種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖91]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子24種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖92]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子24種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖93]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子48種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖94]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子48種進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖95]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基B進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖96]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基B進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖97]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基C進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖98]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基C進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖99]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基D進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖100]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基D進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖101]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基E進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖102]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基E進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖103]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基F進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖104]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基F進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖105]表示將人類基因組DNA作為模具，隨機引子10鹼基A進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖106]表示將人類基因組DNA作為模具，隨機引子10鹼基A進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖107]表示提供於次世代序列裝置的DNA基因庫之製作方法的模式特性圖。 　　[圖108]表示提供於次世代序列裝置的DNA基因庫之製作方法的模式特性圖。 　　[圖109]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基G進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖110]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，隨機引子10鹼基G進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖111]表示對於甘蔗NiF8，使用隨機引子10鹼基G所製作的DNA基因庫作為模具，以次世代排序用引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖112]表示對於甘蔗NiF8，使用隨機引子10鹼基G所製作的DNA基因庫作為模具，以次世代排序用引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖113]表示將甘蔗NiF8的DNA作為模具，以隨機引子10鹼基G進行增幅的DNA基因庫之MiSeq解析結果特性圖。 　　[圖114]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子12鹼基B進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖115]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子12鹼基B進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖116]表示對於稻子日本晴，使用隨機引子12鹼基B所製作的DNA基因庫作為模具，以次世代排序用引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第一次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖117]表示對於稻子日本晴，使用隨機引子12鹼基B所製作的DNA基因庫作為模具，以次世代排序用引子進行增幅的DNA基因庫之電泳圖像(第二次)所得之增幅片段長與螢光單位(FU)的關係特性圖。 　　[圖118]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子12鹼基B進行增幅的DNA基因庫以MiSeq進行解析所得之讀取圖型，與隨機引子序列及稻子日本晴參照序列的一致率之分布特性圖。 　　[圖119]表示將稻子日本晴的DNA作為模具，以隨機引子12鹼基B進行增幅的DNA基因庫之MiSeq解析結果特性圖。 　　[圖120-1]表示對於多數讀取數據經基因定位(mapping)的特定區域，在玉米、稻子、馬鈴薯及黃豆間做比較的結果特性圖(Region_1_1_Corn：序列號碼2153、Region_1_1_Oryza：序列號碼2154、Region_1_1_Potato：序列號碼2155、Region_1_1_Soybean：序列號碼2156、Region_2_1_Corn：序列號碼2157、Region_2_1_Oryza：序列號碼2158、Region_2_1_Potato：序列號碼2159、Region_2_1_Soybean：序列號碼2160)。 　　[圖120-2]表示對於多數讀取數據經基因定位的特定區域，在玉米、稻子、馬鈴薯及黃豆間做比較的結果特性圖(Region_1_1_Corn：序列號碼2153、Region_1_1_Oryza：序列號碼2154、Region_1_1_Potato：序列號碼2155、Region_1_1_Soybean：序列號碼2156、Region_2_1_Corn：序列號碼2157、Region_2_1_Oryza：序列號碼2158、Region_2_1_Potato：序列號碼2159、Region_2_1_Soybean：序列號碼2160)。 　　[圖121]表示對於多數讀取數據經基因定位的稻子之特定區域做比較的結果特性圖(Region_3_1_Oryza：序列號碼2161、Region_3_2_Oryza：序列號碼2162)。 　　[圖122]表示使用隨機引子組A～F時被觀察的來自葉綠體基因組的讀取數據比例做比較的特性圖。
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Claims (11)

  1. 一種隨機引子組，其特徵含有作為隨機引子的選自由TAAGAGACAGNN(序列號碼2060，N為A、G、C或T中任一者)所示含12鹼基所成的寡核苷酸群之中，除去3’末端的2鹼基為TG的寡核苷酸之15種類的含12鹼基所成的寡核苷酸群，及TAAGAGACAGNNN(序列號碼2061，N為A、G、C或T中任一者)所示含13鹼基所成的寡核苷酸群之中，除去3’末端的3鹼基為TGC的寡核苷酸之63種類的含13鹼基所成的寡核苷酸群的1或複數的寡核苷酸。
  2. 如請求項1之隨機引子組，其中上述15種類寡核苷酸群中，未含有序列號碼2060的鹼基序列中之3’末端的2鹼基為GG、GT、AT或CC的寡核苷酸中至少1個寡核苷酸者。
  3. 如請求項1之隨機引子組，其中上述63種類寡核苷酸群中，未含有序列號碼2061的鹼基序列中之3’末端的3鹼基為GGA、GGG、GTG、GTA、ATA或CCA的寡核苷酸中至少1個寡核苷酸者。
  4. 一種DNA基因庫的製作方法，其特徵為於以高濃度含有基因組DNA及如請求項1~3中任一項之隨機引子組的隨機引子之反應液中進行核酸增幅反應，取得將基因組DNA 作為模具而藉由該核酸增幅反應所得之DNA片段。
  5. 如請求項4之DNA基因庫的製作方法，其中上述反應液為含有4~200μM的上述隨機引子者。
  6. 如請求項4之DNA基因庫的製作方法，其中上述反應液為含有4~100μM的上述隨機引子者。
  7. 一種DNA基因庫的製作方法，其特徵為含有以下步驟者；以高濃度含有基因組DNA及如請求項1~3中任一項之隨機引子組的隨機引子之第1反應液中進行核酸增幅反應，取得將基因組DNA作為模具而藉由該核酸增幅反應所得之第1DNA片段之步驟，與在含有所得的第1DNA片段與以下引子的第2反應液中進行核酸增幅反應，取得於上述第1DNA片段連結上述核苷酸的第2DNA片段之步驟；該引子為，於3’末端含有與上述隨機引子中之至少5’末端側的鹼基序列為70%以上一致的鹼基序列之核苷酸者。
  8. 如請求項7之DNA基因庫的製作方法，其中上述第1反應液為含有4~200μM的上述隨機引子者。
  9. 如請求項7之DNA基因庫的製作方法，其中上述第1反 應液為含有4~100μM的上述隨機引子者。
  10. 如請求項7之DNA基因庫的製作方法，其中增幅上述第2DNA片段的引子為含有使用於鹼基序列決定反應的區域，或含有將上述第2DNA片段作為模具的核酸增幅反應或者使用於重複核酸增幅反應的引子含有使用於鹼基序列決定反應的區域。
  11. 一種DNA基因庫，其特徵為藉由如請求項4~10中任一項之DNA基因庫的製作方法所製作者。
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