JP2024002889A - Ｄｎａライブラリーの作製キット及び作製方法、遺伝子多型の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、簡便で低コストで遺伝子多型を検出する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製するためのキットは、所定の複数種類の標的配列に対応する複数種類の第１のプライマーセットであって、前記第１のプライマーセットが第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、複数種類の第１のプライマーセットと、所定の第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーからなる第２のプライマーセットとを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーの作製キット及び作製方法、並びに遺伝子多型の検出方法に関する。

ゲノム解析技術の進展等により、作物育種に利用できるＤＮＡマーカーの種類は年々増加しており、作物育種では耐病性及び作物の形質等について、年間数千個体に対してＤＮＡマーカー選抜が実施されている。ＤＮＡマーカー選抜は、ある特定の遺伝形質等を有する品種を識別する際に、その品種で特異的にみられるＤＮＡの塩基配列を目印として利用する手法であり、例えば、遺伝子多型がこれに利用される。

従来のＤＮＡマーカー選抜方法は、サンガーシーケンサーによって得られた波形データ等から人が判定する手法であった。一方、次世代シーケンサーを利用した遺伝子多型の検出方法として、例えば特許文献１には、高濃度のランダムプライマーを用いることで、ゲノムＤＮＡ全体における遺伝子多型を検出できることが記載されている。さらに、例えば非特許文献１には、ゲノムＤＮＡ上の特異的な塩基配列を増幅可能なプライマーを用いることで、ゲノムＤＮＡ中の特定の領域における遺伝子多型を検出できることが記載されている。

特開２０１８－４２５４８号公報

イルミナ株式会社、２０１４年６月１３日「ＮＧＳの新たな利用法 Ｔａｉｌｅｄ ＰＣＲ法を用いたライブラリー調製」；https://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/2014_techsupport_session5.pdf

しかしながら、上述したサンガーシーケンサーによる手法では、得られた波形データ等から人が判定するため、労力がかかるうえに人為的なエラーが発生してしまう。また、特許文献１に記載の方法では、ゲノム全体の遺伝子多型を特定することになるため、数種類～数十種類の遺伝子多型を検出するためには、費用対効果が低い。また、非特許文献１に記載の方法では、長鎖のプライマーが必要になるため、数千個体の数種類～数十種類の遺伝子多型を検出しようとすると費用が高くなってしまう。たとえ長鎖のプライマーを用いないとしても、複数回の実験工程を経る必要がある等の問題がある。

本発明は、簡便で低コストで遺伝子多型を検出する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、遺伝子多型の検出方法で使用するＤＮＡライブラリーを作製するためのキット及び方法を提供することを目的とする。

本発明者は、所定のシーケンサー用プライマーセット、及び所定の標的配列に特異的な標的配列用プライマーセットを用いることにより、ワンステップで次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製でき、これにより、従来よりも簡便で低コスト、かつ比較的少数の遺伝子多型を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、例えば、以下の発明を提供する。
［１］
次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製するためのキットであって、
複数種類の標的配列に対応する複数種類の第１のプライマーセットであって、上記第１のプライマーセットが第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、複数種類の第１のプライマーセットと、
第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーからなる第２のプライマーセットと
を含み、
上記第１のフォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第１のシーケンスプライマーの塩基配列、及び上記標的配列を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列（フォワードマーカー配列）を含み、
上記第１のリバースプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第２のシーケンスプライマーの塩基配列、及び上記標的配列を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（リバースマーカー配列）を含み、
上記第２のフォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第１のアダプター配列、第１のバーコード配列、及び上記第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列（フォワードオーバーラップ配列）を含み、
上記第２のリバースプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第２のアダプター配列、第２のバーコード配列、及び上記第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（リバースオーバーラップ配列）を含み、
上記第１のアダプター配列が、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第１の１本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列であり、
上記第２のアダプター配列が、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第２の１本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列であり、
上記第１及び第２のバーコード配列が、長さが４～１６ヌクレオチドの任意の塩基配列であり、
上記第１のシーケンスプライマーの塩基配列が、次世代シーケンサーを用いた配列決定に用いるプライマー（第１のプライマー）と同一の塩基配列を含む塩基配列であり、上記第２のシーケンスプライマーの塩基配列が、次世代シーケンサーを用いた配列決定に用いるプライマーであって上記第１のプライマーと異なる塩基配列を有するプライマー（第２のプライマー）と同一の塩基配列を含む塩基配列である、キット。
［２］
２種類～１０種類の前記第１のプライマーセットを含む、［１］に記載のキット。
［３］
上記キットが複数種類の第２のプライマーセットを含み、各第２のプライマーセットがそれぞれ、異なる第１のバーコード配列及び／又は異なる第２のバーコード配列を有する、［１］又は［２］に記載のキット。
［４］
２種類～５０００種類の上記第２のプライマーセットを含む、［１］～［３］のいずれかに記載のキット。
［５］
上記第１のアダプター配列が、配列番号１で示される塩基配列を含み、上記第２のアダプター配列が、配列番号２で示される塩基配列を含む、［１］～［４］のいずれかに記載のキット。
［６］
上記各第１のプライマーセットの濃度に対する、上記第２のプライマーセットの濃度比が、１．０～２０．０である、［１］～［５］のいずれかに記載のキット。
［７］
検体から得られたＤＮＡを鋳型として、［１］～［６］のいずれかに記載のキットを用いてＰＣＲを実施することを含む、次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製する方法。
［８］
上記検体が２種類～５０００種類の検体であり、ＰＣＲの際に異なる検体に異なる第２のプライマーセットを用いられる、［７］に記載の作製方法。
［９］
［７］に記載の作製方法により、検体のＤＮＡライブラリーを作製する工程、
上記ＤＮＡライブラリーについて、次世代シーケンサーを用いてシーケンス反応を行う工程、
上記フォワードマーカー配列及びリバースマーカー配列に基づき、上記標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する工程（標的配列選別工程）、及び、
上記選別されたＤＮＡ断片の配列及び／又は長さに基づき、遺伝子多型を検出する工程、
を含む、検体の遺伝子多型の検出方法。
［１０］
上記検体が複数の検体である場合、
ＤＮＡライブラリーを作製する工程において、検体毎にＤＮＡライブラリーを作製し、各検体由来のＤＮＡライブラリーにおける標的配列を含むＤＮＡ断片が異なる第１のバーコード配列及び／又は異なる第２のバーコード配列を有し、
シーケンス反応において、全てのＤＮＡライブラリーについてシーケンス反応を行い、
上記方法が、標的配列選別工程の前に、上記第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列の組合せに基づき、検体毎にＤＮＡ断片を選別する工程（検体選別工程）を更に含み、
標的配列選別工程において、検体毎に標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する、［９］に記載の検出方法。
［１１］
上記検体が、２種類～５０００種類の検体である、［９］又は［１０］に記載の検出方法。
［１２］
上記遺伝子多型が、反復配列多型である、［９］～［１１］のいずれかに記載の検出方法。

本発明のＤＮＡライブラリーの作製キット及び作製方法並びに遺伝子多型の検出方法によれば、簡便で低コストで遺伝子多型を検出する方法を提供することができる。本発明によれば、比較的少数の遺伝子多型であっても検出できる。

一実施形態の次世代シーケンス用ＤＮＡライブラリーの作製方法のフローチャートである。 一実施形態の遺伝子多型の検出方法のフローチャートである。

＜ＤＮＡライブラリー作製キット＞
本実施形態に係る次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製するためのキット（以下、「本実施形態に係るキット」ともいう。）は、所定の複数種類の標的配列に対応する複数種類の第１のプライマーセットと、所定の第２のプライマーセットとを含む。ここで、第１のプライマーセットは、標的配列を特異的に増幅できる、フォワードマーカー配列及びリバースマーカー配列を含むため、「標的配列用プライマーセット」と呼ぶ場合がある。第２のプライマーセットは、使用する次世代シーケンサーに検出されるための特異的な配列を含むため、「シーケンサー用プライマーセット」と呼ぶ場合がある。

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）とは、数千から数百万ものシーケンシング反応が並行して実行され、配列決定の処理量が増大しているシーケンシング技術である。次世代シーケンシングでは、複数個体を同時に配列決定できる等高度かつ高速な処理が可能であることから、個の医療、遺伝性疾患、及び臨床診断学などの分野において利用されている。次世代シーケンシングのためのサンプルは、カスタムアダプター配列を利用して増幅又はライゲーションしたＤＮＡライブラリーである。次世代シーケンシングのためのシーケンシング機械（次世代シーケンサー）は、メーカーによって読み取るメカニズム等が異なるものの、基本的にＤＮＡライブラリー断片は、ライブラリーアダプターとハイブリダイズする共有結合済ＤＮＡリンカーと共に固体表面上で増幅される。シーケンシング終了時に生データが出力され、この生データをさらに解析することで、様々な分析結果を得ることができる。

本実施形態に係るキットは、上記複数種類の第１のプライマーセット及び上記第２のプライマーセットを含むことで、検体由来のＤＮＡを鋳型として１回のＰＣＲ（ｏｎｅ ｓｔｅｐ）を行うことで、簡便かつ低コストで、次世代シーケンサーに供することが可能となる配列（アダプター配列等）が融合された複数の標的配列を含む、次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製することができる。

（第１のプライマーセット）
本実施形態に係るキットに含まれる第１のプライマーセット（標的配列用プライマーセット）は、第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる。第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーの模式図は図１に示す。

本明細書における「標的配列」とは、次世代シーケンサーを用いた検出の目的のＤＮＡ断片の配列を意味し、標的配列はＰＣＲによって増幅可能な任意の塩基配列であってよい。標的配列としては、例えばゲノム配列の一部であってよく、遺伝子又はその一部の配列、非コード配列等であってもよく、遺伝子多型を有する可能性のある塩基配列であってもよい。作物育種の分野において、標的配列は育種に関わるＤＮＡマーカー又はその一部であってよく、例えば、ナシ黒星病に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーであるＴｓｕＥＮＨ１０１、ＴｓｕＥＮＨ１５７．ｍｏｄ ＳＳＲＧＢＳ（ＴｓｕＥＮＨ１５７）、１－アミノシクロプロパン－１－カルボン酸合成酵素の遺伝子（ＰＰＡＣＳ２．ｍｏｄ．ＳＳＲ－ＧＢＳ（ＰＰＡＣＳ２））、ナシ果皮色に連鎖するＤＮＡマーカーであるＰｓｃ７、ナシ黒斑病に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーであるＭｄｏ．ｃｈｒ．３４．ｍｏｄ．ＳＳＲ－ＧＢＳ（Ｍｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ａ）、クリの渋皮剥皮性に連鎖するＤＮＡマーカーであるＣｍＳｃａ０６７１６．２（ＣｍＳｃａ０６７１６）、及びＣＣＲ１．０Ｆ．５６１７７０３３．ＭＡＳＧＢＳ（ＣＣＲ１．０Ｆ．５６１７７０６１）、リンゴのカラムナー遺伝子（ＭｄＤＯＸ－Ｃｏ）、リンゴ黒星病抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーであるＣＨ－Ｖｆ１、リンゴの果肉紛質化に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーであるＭｄＰＧ１、リンゴ斑点落葉病高度罹患性に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーであるＭｄＡｌｔ＿ｉｎｄｅｌ、リンゴ斑点落葉病中度罹患性に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカーであるＭｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ｂ等が挙げられる。

標的配列の長さは、シーケンサーによって測定できる長さであれば特に制限されないが、５００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、又は１５０ｂｐ以下であってもよい。また、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、又は１５０ｂｐ以上であってもよい。例えば、１００ｂｐ～５００ｂｐ、１００ｂｐ～４００ｂｐ、１５０ｂｐ～５００ｂｐ、１５０ｂｐ～４００ｂｐであってもよい。

本実施形態に係るキットは、複数種類の標的配列に対応する、複数種類の標的配列用プライマーセットを含む。ここで、標的配列の数は、２種類以上であればよく、より効率的に標的配列を増幅することができるという観点から、２種類～１０種類であってもよく、３種類～８種類であってもよく、４種類～６種類であってもよい。複数種類の標的配列用プライマーセットは、別々の容器に収容されていてもよく、同じ容器に収容されていてもよい。

本実施形態に係るキットに含まれる複数種類の第１のプライマーセットは、複数種類の標的配列に対応しており、すなわち、１種類の第１のプライマーセットが１種類の標的配列に対応している。例えば、標的配列が２種類ある場合、第１のプライマーセットが２種類あり、標的配列が１０種類ある場合、第１のプライマーセットが１０種類ある。

第１のプライマーセットに含まれる第１のフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に、第１のシーケンスプライマーの塩基配列、及び標的配列を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列（フォワードマーカー配列）を含むように設計される。第１のフォワードプライマーの長さとしては、特に制限されないが、例えば、３５～８０ヌクレオチド、４０～７５ヌクレオチド、４５～７０ヌクレオチドであってもよい。

「第１のシーケンスプライマーの塩基配列」とは、次世代シーケンサーを用いた配列決定に用いるプライマー（「第１の次世代シーケンサーのシーケンスプライマー」又は「第１のプライマー」）と同一の塩基配列を含む、塩基配列である。第１のシーケンスプライマーの塩基配列を含むことで、増幅されたＰＣＲ産物は、次世代シーケンサーのシーケンスプライマーとハイブリダイズできるため、次世代シーケンサーを用いて配列決定が可能となる。第１の次世代シーケンサーのシーケンスプライマーは特に限定されず、使用する次世代シーケンサーによって異なり得る。例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製次世代シーケンサーの場合は、配列番号３に示す塩基配列を有するＲ１ Ｓｅｑ Ｐｒｉｍｅｒであってよい。

第１のシーケンスプライマーの塩基配列の長さは、第１の次世代シーケンサーのシーケンスプライマーの長さと同一又はそれよりも１～１０塩基長い長さであるように設計すれば特に制限されないが、例えば、１５～５０ヌクレオチド、１５～４０ヌクレオチド、２０～３５ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチドであってもよい。

「標的配列を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列」（「フォワードマーカー配列」ともいう）は、標的配列に特異的な配列であり、標的配列の上流側（２本鎖ＤＮＡのセンス鎖の５’末端側）のアンチセンス鎖にハイブリダイズして標的配列を増幅可能なフォワードプライマーとして機能するための配列である。フォワードマーカー配列の長さは、標的配列が増幅可能となるように設計すれば特に制限されず、例えば、１５～４０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチドであってもよい。

第１のフォワードプライマーは、第１のシーケンスプライマーの塩基配列、及びフォワードマーカー配列を連続して配列するように設計してもよく、これらの配列の間に任意の１～５個の塩基配列を含んでいてもよい。

第１のプライマーセットに含まれる第１のリバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に、第２のシーケンスプライマーの塩基配列、及び前記標的配列を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（リバースマーカー配列）を含むように設計される。第１のリバースプライマーの長さとしては、特に制限されないが、例えば、３５～８０ヌクレオチド、４０～７５ヌクレオチド、４５～７０ヌクレオチドであってもよい。

「第２のシーケンスプライマーの塩基配列」は、次世代シーケンサーを用いた配列決定に用いるプライマーであって、上記第１のプライマーと異なる塩基配列を有するプライマー（「第２の次世代シーケンサーのシーケンスプライマー」又は「第２のプライマー」）と同一の塩基配列を含む塩基配列である。第２のシーケンスプライマーの塩基配列を含むことで、増幅したＰＣＲ産物は次世代シーケンサーのシーケンスプライマーとハイブリダイズできるため、次世代シーケンサーを用いて配列決定が可能となる。また、第２のプライマーの塩基配列は、第１のプライマーの塩基配列とは異なる塩基配列であるため、次世代シーケンサーによって、標的配列の５’末端側及び３’末端側の両側から配列を決定すること（ペアエンドシーケンス）ができ、解析の精度が高くなる。第２のプライマーの塩基配列は、第１のプライマーと異なる塩基配列であれば特に限定されず、また、使用する次世代シーケンサーによって異なり得る。例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製次世代シーケンサーの場合は、配列番号５に示す塩基配列を有するＲ２ Ｓｅｑ Ｐｒｉｍｅｒであってよい。

第２のシーケンスプライマーの塩基配列の長さは、第２の次世代シーケンサーのシーケンスプライマーの長さと同一又はそれよりも１～１０塩基長い長さであるように設計すれば特に制限されないが、例えば、１５～５０ヌクレオチド、１５～４０ヌクレオチド、２０～３５ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチドであってもよい。

「標的配列を増幅できるリバースプライマーの塩基配列」（リバースマーカー配列ともいう）とは、上述した標的配列に特異的な配列であり、標的配列の下流側（２本鎖ＤＮＡのセンス鎖の３’末端側）のセンス鎖にハイブリダイズして標的配列を増幅可能なリバースプライマーとして機能するための配列である。リバースマーカー配列の長さは、標的配列が増幅可能となるように設計すれば特に制限されないが、例えば、１５～４０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチドであってもよい。

第１のリバースプライマーは、第２のシーケンスプライマーの塩基配列、及びリバースマーカー配列を連続して配列するように設計してもよく、これらの配列の間に任意の１～５個の塩基配列を含んでいてもよい。

（第２のプライマーセット）
本実施形態に係るキットに含まれる第２のプライマーセット（シーケンサー用プライマーセット）は、第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーからなる。第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーの模式図は図１に示す。

第２のフォワードプライマーは、５’末端から３’末端の方向に、第１のアダプター配列、第１のバーコード配列、及び上記第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列（フォワードオーバーラップ配列）を含むように設計される。第２のフォワードプライマーの長さとしては、特に制限されないが、例えば、４５～８０ヌクレオチド、５０～７５ヌクレオチド、５５～７０ヌクレオチドであってもよい。

「第１のアダプター配列」とは、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第１の１本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列である。固体支持体としては、特に制限されないが、例えば、基盤、アレイ、磁性ビーズ、カラム等が挙げられる。また、次世代シーケンサーがｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉｓｅｑ又はＭｉｓｅｑ等である場合、固体支持体はフローセルであってもよく、次世代シーケンサーがロシュ社のＧＳ ＦＬＸ又はＧＳｊｕｎｉｏｒ等である場合、固体支持体はビーズであってもよい。次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第１の１本鎖ＤＮＡは、特に限定されず、次世代シーケンサーによって異なり得る。

第１のアダプター配列は、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第１の１本鎖ＤＮＡと相補的な配列であればよく、特に限定されない。第１のアダプター配列の長さは、特に制限されないが、例えば、１５～４０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチドであってもよい。第１のアダプター配列は、使用する次世代シーケンサーによって異なり得る。例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製次世代シーケンサーの場合、配列番号１に示す塩基配列を有するＰ５配列であってもよい。

「第１のバーコード配列」は、長さが４～１６ヌクレオチドの任意の塩基配列である。第１のバーコード配列の長さは、５～１０ヌクレオチドであってもよく、６～８ヌクレオチドであってもよい。

第１のバーコード配列は、検体を識別するために利用することができる。一つの検体に対して、第１のバーコード配列と、後述の第２のバーコード配列との組み合わせを当てることで、検体毎の検出・解析が可能となる。ここで、「検体」とは、検査される対象物を意味し、ＤＮＡを得ることができる検体であれば特に制限されないが、例えば植物、動物、菌類、又はウイルス等が挙げられ、植物が好ましく、果樹がより好ましい。

第２のフォワードプライマーに含まれる「第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列」（「フォワードオーバーラップ配列」ともいう）は、第１のフォワードプライマーに含まれる「第１のシーケンスプライマーの塩基配列」の５’末端側の塩基配列と同一である。これによって、第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の上流側（２本鎖ＤＮＡのセンス鎖の５’末端側）のアンチセンス鎖にハイブリダイズでき、第１のアダプター配列及び第１のバーコード配列が融合された当該ＤＮＡ断片の全長を増幅することができる。すなわち、フォワードオーバーラップ配列は、第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるよう、少なくとも「第１のシーケンスプライマーの塩基配列」の５’末端側の一部の塩基配列（例えば、５’末端側の１０以上、１２以上、１５以上のヌクレオチドの塩基配列）と同一であればよく、「第１のプライマー」の塩基配列と同一の塩基配列であってもよく、「第１のシーケンスプライマーの塩基配列」と同一の塩基配列であってもよい。第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるようにフォワードオーバーラップ配列を設計するには、第１のシーケンスプライマーの塩基配列の５’末端側から１０以上、１２以上、１５以上のヌクレオチドと同一の塩基配列を有するようにすればよい。また、例えば図１に示した模式図の場合、フォワードオーバーラップ配列は第１のシーケンスプライマーの塩基配列と同一の塩基配列であってもよい。

第２のフォワードプライマーは、第１のアダプター配列、第１のバーコード配列、及びフォワードオーバーラップ配列を連続して配列するように設計してもよく、これらの配列の間に任意の１～５個の塩基配列を含むように設計してもよい。

第２のリバースプライマーは、５’末端から３’末端の方向に、第２のアダプター配列、第２のバーコード配列、及び上記第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（リバースオーバーラップ配列）を含むように設計される。第２のリバースプライマーの長さとしては、特に制限されないが、例えば、４５～８０ヌクレオチド、５０～７５ヌクレオチド、５５～７０ヌクレオチドであってもよい。

「第２のアダプター配列」とは、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第２の１本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列であり、かつ上述の第１のアダプター配列とは異なる塩基配列である。固体支持体は上述のとおりである。次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第２の１本鎖ＤＮＡは、特に限定されず、次世代シーケンサーによって異なり得る。

第２のアダプター配列は、上述した塩基配列であればよく、特に限定されない。第２のアダプター配列の長さは、特に制限されないが、例えば、１５～４０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチドであってもよい。第２のアダプター配列は、使用する次世代シーケンサーによって異なり得る。例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製次世代シーケンサーの場合、配列番号２に示す塩基配列を有するＰ７配列であってもよい。

「第２のバーコード配列」は、長さが４～１６ヌクレオチドの任意の塩基配列である。第２のバーコード配列の長さは、５～１０ヌクレオチドであってもよく、６～８ヌクレオチドであってもよい。第２のバーコード配列は、上述の第１のバーコード配列と併せて、検体を識別するために利用することもできる。また、一つ（１種類）の第２のプライマーセットにおいて、第１のバーコード配列と第２のバーコード配列とは同じ塩基配列であっても、異なる塩基配列であってもよい。

第２のリバースプライマーに含まれる「プライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（「リバースオーバーラップ配列」ともいう）は、第１のリバースプライマーに含まれる「第２のシーケンスプライマーの塩基配列」の５’末端側の塩基配列と同一である。これによって、第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の下流側（２本鎖ＤＮＡのセンス鎖の３’末端側）のセンス鎖にハイブリダイズでき、第２のアダプター配及び第２のバーコード配列が融合された当該ＤＮＡ断片の全長を増幅することができる。すなわち、リバースオーバーラップ配列は、第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるよう、少なくとも「第２のシーケンスプライマーの塩基配列」の５’末端側の一部の塩基配列（例えば、５’末端側の１０以上、１２以上、１５以上のヌクレオチドの塩基配列）と同一であればよく、「第２のプライマー」の塩基配列と同一の塩基配列であってもよく、「第２のシーケンスプライマーの塩基配列」と同一の塩基配列であってもよい。第１のプライマーセットにより増幅されたＤＮＡ断片の全長を増幅できるようにリバースオーバーラップ配列を設計するには、第２のシーケンスプライマーの塩基配列の５’末端側から１０以上、１２以上、１５以上のヌクレオチドと同一の塩基配列を有するようにすればよい。また、例えば図１に示した模式図の場合、リバースオーバーラップ配列は第２のシーケンスプライマーの塩基配列と同一の塩基配列であってよい。

第２のリバースプライマーは、第２のアダプター配列、第２のバーコード配列、及びリバースオーバーラップ配列を連続して配列するように設計してもよく、これらの配列の間に任意の１～５個の塩基配列を含むように設計してもよい。

本実施形態に係るキットは、１種類の第２のプライマーセットを含んでもよく、複数種類の第２のプライマーセットを含んでもよい。複数種類の第２のプライマーセットは、複数の検体に対応しており、すなわち、１種類の第２のプライマーセットが１種類の検体に対応している。本実施形態に係るキットが複数種類の第２のプライマーセットを含む場合、より効率的に目的のＤＮＡ断片を増幅することができるという観点から、２種類～５０００種類の第２のプライマーセットであってもよく、１０種類～３０００種類の第２のプライマーセットであってもよく、５０種類～２５００種類の第２のプライマーセットであってもよく、１５０種類～２０００種類の第２のプライマーセットであってもよい。

本実施形態に係るキットが複数の第２のプライマーセットを含む場合は、各第２のプライマーセットがそれぞれ、異なる第１のバーコード配列及び／又は異なる第２のバーコード配列を有する第１のバーコード配列となるように設計してもよい。ここで、複数種類の第２のプライマーセットは、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列の組み合わせで、区別することができる。

本実施形態に係るキットが、複数種類の第２のプライマーセットを含む場合、種類毎に、別々の容器に収容することが好ましい。これによって、検体毎にＤＮＡライブラリーを作製することができる。

本実施形態に係るキットにおいて、複数種類の第１のプライマーセットと１種類の第２のプライマーセットが一つの容器に収容されることが好ましく、また、水溶液（プライマーミックス）として保存されていることがより好ましい。該水溶液において、各第１のプライマーセットの濃度に対する第２のプライマーセットの濃度比は、特に制限されないが、より効率的に目的のＤＮＡ断片を増幅することができるという観点から、１．０～２０．０であってもよく、好ましくは１．５～１０．０であってもよく、より好ましくは２．０～５．０である。

本実施形態に係るキットは、上述した第１のプライマーセット及び第２のプライマーセット以外の試薬も含んでもよく、そのような試薬としては特に制限はないが、例えば、ＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、緩衝剤等が挙げられる。

＜ＤＮＡライブラリーの作製方法＞
本実施形態に係る次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製する方法（以下、「本実施形態に係る作製方法」ともいう。）は、検体から得られたＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡライブラリーの作製キットを用いてＰＣＲを実施することを含む。一実施形態のＤＮＡライブラリーの作製方法のフローチャートを図１に示す。

本発明のＤＮＡライブラリーの作製キットを用いた、１回のＰＣＲで、簡易で低コストで、次世代シーケンサーに供することが可能となる配列（アダプター配列等）が融合された複数の標的配列を含む、次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーが作製できる。

「検体」は上述のとおりである。検体の種類は、１種類であっても、２種類以上であってもよい。例えば、２種類～５０００種類、１０種類～３０００種類、又は５０種類～２５００種類の検体であってもよい。

鋳型のＤＮＡは、常法に従って検体から得ることができる。「検体から得られたＤＮＡ」は、検体から抽出されたＤＮＡであってもよく、検体から抽出した後、精製したＤＮＡであってもよい。精製方法としては公知の方法であればよく、例えば、市販のキットを用いて精製することができる。

ＰＣＲを実施する方法は、当業者に公知の方法により行うことができる。ＰＣＲでは、通常最初の変性工程があり、続いてＰＣＲ増幅サイクルが行われる。ＰＣＲ増幅の各サイクルにおいて、二本鎖標的配列を変性し（変性工程）、変性した標的の各鎖にプライマーをアニーリングさせ（アニーリング工程）、ＤＮＡポリメラーゼの作用によりプライマーを伸長させる（伸長工程）。

ＰＣＲ増幅サイクルにおける変性工程は、例えば、９０℃～９５℃で３０秒～６０秒であってよく、９４℃で３０秒であってもよい。ＰＣＲ増幅サイクルにおけるアニーリング工程における温度は、適宜設定すればよいが、例えば、５５℃～６５℃であってもよい。ＰＣＲ増幅サイクルにおけるアニーリング工程における時間は、適宜設定すればよいが、例えば、３０秒～１２０秒であってよく、３０秒～６０秒であってもよい。ＰＣＲ増幅サイクルにおける伸長工程における温度は、適宜設定すればよいが、６５℃～７５℃であってもよい。ＰＣＲ増幅サイクルにおける伸長工程における時間は、標的配列の長さ又は使用するＤＮＡポリメラーゼによって適宜設定すればよいが、３０秒～２分であってもよく、３０秒～１分であってもよい。

ＰＣＲ反応液における各第１のフォワードプライマー又は各第１のリバースプライマーの濃度は、例えば、０．００５μＭ～０．５μＭであってよく、０．０１μＭ～０．２μＭであってもよく、０．０２μＭ～０．１μＭであってもよい。

ＰＣＲ反応液における第２のフォワードプライマー又は第２のリバースプライマーの濃度は、例えば、０．０１μＭ～１μＭであってよく、０．０５μＭ～０．５μＭであってよく、０．１μＭ～０．２５μＭであってよい。

各第１のプライマーセットの濃度に対する第２のプライマーセットの濃度比は、特に制限されないが、より効率的に目的のＤＮＡ断片を増幅することができるという観点から、１．０～２０．０であってもよく、好ましくは１．５～１０．０であってもよく、より好ましくは２．０～５．０である。

本実施形態に係る作製方法によって作製したＤＮＡライブラリーは、次世代シーケンサーに供することが可能となる配列（アダプター配列等）が融合され、増幅された複数種類の標的配列断片が含まれている。作製したＤＮＡライブラリーは酵素、ｄＮＴＰ、及び未反応のプライマー等を除去する精製をしたのちに次世代シーケンサーに供してもよく、また、後述の方法で精製したのちに、次世代シーケンサーに供してもよい。

＜多型検出方法＞
本実施形態に係る検体の遺伝子多型の検出方法は、本発明のＤＮＡライブラリーの作製方法により、検体のＤＮＡライブラリーを作製する工程（以下、「ＤＮＡライブラリー作製工程」ともいう。）、ＤＮＡライブラリーについて、次世代シーケンサーを用いてシーケンス反応を行う工程（以下、「シーケンス工程」ともいう。）、フォワードマーカー配列及びリバースマーカー配列に基づき、標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する工程（以下、「標的配列選別工程」ともいう。）、及び、選別されたＤＮＡ断片の配列及び／又は長さに基づき、遺伝子多型を検出する工程（以下、「検出工程」ともいう。）を含む。ＤＮＡライブラリー作製工程は、上述した次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリー作製方法のとおりである。一実施形態の遺伝子多型の検出方法のフローチャートを図２に示す。

本実施形態に係る遺伝子多型の検出方法は、これらの工程を含むため、簡便で低コストに、かつ比較的少数の遺伝子多型を検出することができる。また、本実施形態に係る遺伝子多型の検出方法は、例えば、遺伝子多型を利用したＤＮＡマーカー選抜、疾患の診断等にも適用することができる。

シーケンス工程では、得られたＤＮＡライブラリーについて、次世代シーケンサーを用いてシーケンス反応を行うことによりＤＮＡライブラリー中に存在するＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、配列情報を提供する。次世代シーケンサーとしては、例えば、ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑ、Ｍｉｓｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、又はＭＧＩ社のＤＮＢ－ＳＥＱ等が挙げられる。

標的配列選別工程（図２の（Ｂ））では、シーケンス工程において得られた配列情報について、フォワードマーカー配列及びリバースマーカー配列に基づき、標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する（標的配列選別工程）。標的配列選別工程は、標的配列毎のＤＮＡ断片を選別することが可能となる任意のプログラムを作成することを含んでいてもよい。

検出工程（図２の（Ｃ））では、選別されたＤＮＡ断片の配列及び／又は長さに基づき、遺伝子多型を検出する。「選別されたＤＮＡ断片の配列及び／又は長さに基づき」とは、アレル頻度を算出することであってもよい。「アレル頻度」とは、選別された各標的配列のＤＮＡ断片中に存在する目的の塩基配列を有するＤＮＡ断片の出現頻度である。

検出する遺伝子多型の種類は特に制限されないが、１塩基多型、反復配列多型、塩基の挿入、又は塩基の欠失等であってもよく、反復配列多型であることが好ましい。

本実施形態に係る検体の遺伝子多型の検出方法は、検体が複数の検体であってもよい。検体が複数である場合、ＤＮＡライブラリー作製工程において、検体毎にＤＮＡライブラリーを作製し、各検体由来のＤＮＡライブラリーにおける標的配列を含むＤＮＡ断片が異なる第１のバーコード配列及び／又は異なる第２のバーコード配列を有する。また、シーケンス反応において、全てのＤＮＡライブラリーについてシーケンス反応を行い、ＤＮＡライブラリー中に存在するＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、配列情報を提供する。また、標的配列選別工程の前に、第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列の組合せに基づき、検体毎にＤＮＡ断片を選別する工程（検体選別工程；（図２の（Ａ）））を更に含み、標的配列選別工程において、検体毎に標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する。検体選別工程を含むことにより、上述した複数の検体であっても次世代シーケンサーの１回のランで同時に解析することができる。

検体選別工程は、検体毎にＤＮＡ断片を選別することが可能となる任意のプログラムを作成することを含んでいてもよい。

本実施形態に係る検体の遺伝子多型の検出方法は、ＤＮＡライブラリー作製工程の後、シーケンス工程の前に、特定の長さのＤＮＡ断片を精製する工程（以下、「精製工程」ともいう。）を更に含んでいてもよい。精製工程を含むことにより、目的の長さのＤＮＡ断片を選択的に回収できるため、シーケンス工程における解析精度を向上させることができる。精製方法としては公知の方法であればよく、例えば、市販のキットを用いて精製することができる。

以下に本発明を、実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

［試験例１：９６品種のナシにおける遺伝子多型の検出］
（１．第２のプライマーセットの調製）
９６品種に対応する９６種の第２のプライマーセット１～９６を設計し、人工合成した。第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーの塩基配列を表１に示す。全ての第２のフォワードプライマーは、同じ第１のアダプター配列（Ｐ５配列、ｉｌｌｕｍｉｎａ社）及び第１のシーケンスプライマー（Ｒ１ Ｓｅｑ Ｐｒｉｍｅｒ、ｉｌｌｕｍｉｎａ社）の塩基配列を有し、全ての第２のリバースプライマーは同じ第２のアダプター配列（Ｐ７配列、ｉｌｌｕｍｉｎａ社）及び第２のシーケンスプライマー（Ｒ２ Ｓｅｑ Ｐｒｉｍｅｒ、ｉｌｌｕｍｉｎａ社）の塩基配列を有した。第１のバーコード配列は、表２に示すＦ００１～Ｆ００８から選ばれ、第２のバーコード配列は、表２に示すＲ００１～Ｒ０１２から選ばれ、Ｆ００１～Ｆ００８とＲ００１～Ｒ０１２との組み合わせで、９６通りの異なる第２のプライマーセットを設計した。なお、表２中の数字は、第２のプライマーセットの番号を示している。作製した各第２のプライマーセット毎に、第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、それぞれの濃度が１μＭとなるような第２のプライマーセット溶液を調製した。

（２．第１のプライマーセットの調製）
下記表３に示す第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、第１のプライマーセット１～４を設計し、人工合成した。第１のプライマーセット１～４はそれぞれ、ナシ黒星病に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＴｓｕＥＮＨ１０１、又はＴｓｕＥＮＨ１５７）、ナシ果皮色に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（Ｐｓｃ７）、又はナシ収穫期に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＰＰＡＣＳ２）となる塩基配列を含む遺伝子座を標的配列として作製した。これらのＤＮＡマーカーは、全て反復配列多型である。その後、作製した第１のプライマーセット１～４全てを混合し、混合液中における各プライマーの濃度が、２μＭとなるように第１のプライマーセットミックスを調製した。

（３．ＤＮＡライブラリーの作製）
上記１．及び２．で調製したプライマーの混合液を用いて、以下の手順でＤＮＡライブラリーを作製した。検体とする品種のナシから常法で得られたゲノムＤＮＡに、各プライマーの最終濃度が０．０４μＭの第１のプライマーセットミックス、各プライマーの最終濃度が０．１μＭの第２のプライマーセット溶液（第２のプライマーセット１～９６のいずれか１つ）、ＧｏＴａｑ Ｇ２ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘｅｓ（登録商標、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を加え、検体毎９６種類のＰＣＲ反応液を調製し、それぞれのＰＣＲ反応液に対してＰＣＲを実施した。ＰＣＲの条件は、９５℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で３０秒間のサイクルを３５サイクル行い、７２℃で１０分間の処理後、１０℃で保存する条件とした。その後、９６種類のＰＣＲ産物を１μｌずつ２ｍｌチューブに入れて混合した。混合したＰＣＲ産物は、ＡＭＰｕｒｅ－ＸＰ（ベックマン・コールター社）を用いて、２００ｂｐ以上のＤＮＡ断片を精製した。具体的にはまず、混合したＰＣＲ産物１μｌあたり１μｌのＡＭＰｕｒｅを加え、ピペッティングで１０回混合したのち、室温（２０℃）で５分間静置した。その後、磁気プレート上で２分間静置し、上清を除去した。続いて、磁気プレート上で７０％エタノール２００μｌを加えて３０秒間静置した後、上清を除去し、この操作をさらに２～３回程度繰り返した。混合したＰＣＲ産物を磁気プレートから下ろし、そこに０．１×のＴＥを４０μｌ加え、ピペッティングで１０回混合した。２分間静置後、再度磁気プレート上で１分間静置して上清を回収し、これをＤＮＡライブラリーとした。

（４．遺伝子多型の検出）
上記３．で得られたＤＮＡライブラリーを、次世代シーケンサーＭｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）に供し、シーケンス反応によりＤＮＡライブラリーの塩基配列を解析した。解析した第１及び第２のバーコード配列に基づき、検体毎にＤＮＡ断片を選別したのち、解析したフォワードマーカー配列又はリバースマーカー配列に基づき、標的配列毎にＤＮＡ断片を選別した。また、上記４種類のＤＮＡマーカーは反復配列多型であるため、選別された各標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数（アリル頻度）を、解析したデータを基に算出することで、遺伝子多型を検出した。遺伝子多型を検出するにあたり、選別された各標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＴｓｕＥＮＨ１０１の場合は０．３以上、ＴｓｕＥＮＨ１５７の場合は０．３以上、ＰＰＡＣＳ２の場合は０．２以上、Ｐｓｃ７の場合は０．１以上であれば、ＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有すると判定した。その結果の一部を表４に示す。表４中の＃Ｎ／Ａは、標的配列が存在しなかったことを示す。

表４に示すように、例えば、検体番号１の検体は、選別された標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＴｓｕＥＮＨ１０１については０．７、ＴｓｕＥＮＨ１５７については０．４８であり、ＰＰＡＣＳ２及びＰｓｃ７については該当するＤＮＡ断片が検出されなかった。このことから、検体番号１の検体は、ＴｓｕＥＮＨ１０１及びＴｓｕＥＮＨ１５７としてＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有していることが検出された。その他の各検体全てについても同様に、４種類のＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型のうち、いずれを有しているのか検出することができた。

［試験例２：４８０検体のナシにおける遺伝子多型の検出］
（１．第２のプライマーセットの調製）
ナシ４８０検体に対応する４８０種のナシ用第２のプライマーセットを、バーコード配列以外は表１と同じ配列にして設計し、人工合成した。その後、作製した各ナシ用第２のプライマーセット毎に、第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、それぞれの濃度が１μＭとなるようなナシ用第２のプライマーセット溶液を調製した。ナシ用第２のプライマーセットにおける第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列は表５に示す。

（２．第１のプライマーセットの調製）
下記表６に示す第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、ナシ用第１のプライマーセット１～５を設計し、人工合成した。ナシ用第１のプライマーセット１～５はそれぞれ、ナシ黒星病に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＴｓｕＥＮＨ１０１、又はＴｓｕＥＮＨ１５７）、ナシ果皮色に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（Ｐｓｃ７）、ナシ収穫期に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＰＰＡＣＳ２）、又はナシ黒斑病抵抗性に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（Ｍｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ａ）となる塩基配列を含む遺伝子座を標的配列として作製した。これらのＤＮＡマーカーは、全て反復配列多型である。その後、作製したナシ用第１のプライマーセット１～５全てを混合し、混合液中における各プライマーの濃度が、２μＭとなるようにナシ用第１のプライマーセットミックスを調製した。

（３．ＤＮＡライブラリーの作製）
上記試験例２の１．及び２．で調製したプライマーの混合溶液を用いたこと、ゲノムＤＮＡを得た検体が異なること以外は、試験例１と同様の方法により、ＤＮＡライブラリーを作製した。

（４．遺伝子多型の検出）
試験例２の上記３．で作製したＤＮＡライブラリーを用いたこと以外は試験例１と同様の方法により、ナシ検体の遺伝子多型を検出した。遺伝子多型を検出するにあたり、選別された各標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＴｓｕＥＮＨ１０１の場合は０．３以上、ＴｓｕＥＮＨ１５７の場合は０．３以上、ＰＰＡＣＳ２の場合は０．２以上、Ｐｓｃ７の場合は０．１以上、Ｍｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ａの場合は０．３以上であれば、ＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有すると判定した。その結果の一部を表７に示す。表７中の＃Ｎ／Ａは、標的配列が存在しなかったことを示す。

表７に示すように、例えば、検体雲井は、選別された標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＴｓｕＥＮＨ１０１については０．０２、ＰＰＡＣＳ２については０．６９、Ｐｓｃ７については０．１４、ＴｓｕＥＮＨ１５７、及びＭｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ａについては該当するＤＮＡ断片が検出されなかった。このことから、検体雲井は、ＰＰＡＣＳ２及びＰｓｃ７としてＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有していることが検出された。その他の各検体全てについても同様に、５種類のＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型のうち、いずれを有しているのか検出することができた。また、試験例１よりも多くの検体の遺伝子多型を検出できることが示された。

［試験例３：１０４検体のリンゴにおける遺伝子多型の検出］
（１．第２のプライマーセットの調製）
リンゴ１０４検体に対応する１０４種のリンゴ用第２のプライマーセットを、バーコード配列以外は表１と同じ配列にして設計し、人工合成した。その後、作製した各リンゴ用第２のプライマーセット毎に、第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、それぞれの濃度が１μＭとなるようなリンゴ用第２のプライマーセット溶液を調製した。リンゴ用第２のプライマーセットにおける第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列は表８に示す。

（２．第１のプライマーセットの調製）
下記表９に示す第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、リンゴ用第１のプライマーセット１～５を設計し、人工合成した。リンゴ用第１のプライマーセット１～５はそれぞれ、カラムナー遺伝子（ＭｄＤＯＸ－Ｃｏ）、リンゴ黒星病抵抗性遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＣＨ－Ｖｆ１）、リンゴ果肉粉質化に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＭｄＰＧ１）、リンゴ斑点落葉病高度罹病性に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＭｄＡｌｔ＿ｉｎｄｅｌ）、又はリンゴ斑点落葉病中度罹病性に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（Ｍｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ｂ）となる塩基配列を含む遺伝子座を標的配列として作製した。ＣＨ－Ｖｆ１、ＭｄＰＧ１、及びＭｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ｂは反復配列多型であり、カラムナー遺伝子は優性マーカーであり、ＭｄＡｌｔ＿ｉｎｄｅｌは塩基の挿入と欠失の多型である。その後、作製したリンゴ用第１のプライマーセット１～５全てを混合し、混合液中における各プライマーの濃度が、２μＭとなるようにリンゴ用第１のプライマーセットミックスを調製した。

（３．ＤＮＡライブラリーの作製）
上記試験例３の１．及び２．で調製したプライマーの混合溶液を用いたこと、ゲノムＤＮＡを得た検体が異なること以外は、試験例１と同様の方法により、ＤＮＡライブラリーを作製した。

（４．遺伝子多型の検出）
試験例３の上記３．で作製したＤＮＡライブラリーを用いたこと以外は試験例１と同様の方法により、リンゴ検体の遺伝子多型を検出した。遺伝子多型を検出するにあたり、選別された各標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、カラムナーの場合は０．５以上、ＣＨ－Ｖｆ１の場合は０．３以上、ＭｄＰＧ１の場合は０．３以上、ＭｄＡｌｔ＿ｉｎｄｅｌの場合は０．３以上、Ｍｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ｂの場合は０．２以上であれば、ＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有すると判定した。その結果の一部を表１０に示す。表１０中の＃Ｎ／Ａは、標的配列が存在しなかったことを示す。

表１０に示すように、例えば、検体Ｃａｔａｒｉｎａは、選別された標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＣＨ－Ｖｆ１については０．４、ＭｄＰＧ１については０．００、カラムナー、ＭｄＡｌｔ＿ｉｎｄｅｌ、及びＭｄｏ．ｃｈｒ．１１．３４Ｂについては該当するＤＮＡ断片が検出されなかった。このことから、検体Ｃａｔａｒｉｎａは、ＣＨ－Ｖｆ１としてＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有していることが検出された。その他の各検体全てについても同様に、５種類のＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型のうち、いずれを有しているのか検出することができた。

［試験例４：３１２検体のクリにおける遺伝子多型の検出］
（１．第２のプライマーセットの調製）
クリ３１２検体に対応する３１２種のクリ用第２のプライマーセットを、バーコード配列以外は表１と同じ配列にして設計し、人工合成した。その後、作製した各クリ用第２のプライマーセット毎に、第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーを含み、それぞれの濃度が１μＭとなるようなクリ用第２のプライマーセット溶液を調製した。クリ用第２のプライマーセットにおける第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列は表１１に示す。

（２．第１のプライマーセットの調製）
下記表１２に示す第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、クリ用第１のプライマーセット１～２を設計し、人工合成した。クリ用第１のプライマーセット１～２はそれぞれ、クリの渋皮剥皮性に関する形質を支配する遺伝子に連鎖するＤＮＡマーカー（ＣｍＳｃａ０６７１６、ＣＣＲ１．０Ｆ＿５６１７７０６１）となる塩基配列を含む遺伝子座を標的配列として作製した。ＣｍＳｃａ０６７１６は反復配列多型であり、ＣＣＲ１．０Ｆ＿５６１７７０６１は、一塩基多型である。その後、作製したクリ用第１のプライマーセット１～２全てを混合し、混合液中における各プライマーの濃度が、２μＭとなるようにクリ用第１のプライマーセットミックスを調製した。

（３．ＤＮＡライブラリーの作製）
上記試験例４の１．及び２．で調製したプライマーの混合溶液を用いたこと、ゲノムＤＮＡを得た検体が異なること以外は、試験例１と同様の方法により、ＤＮＡライブラリーを作製した。

（４．遺伝子多型の検出）
試験例４の上記３．で作製したＤＮＡライブラリーを用いたこと以外は試験例１と同様の方法により、クリ検体の遺伝子多型を検出した。遺伝子多型を検出するにあたり、選別された各標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＣｍＳｃａ０６７１６の場合は０．２以上、ＣＣＲ１．０Ｆ＿５６１７７０６１の場合は０．３以上であれば、ＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有すると判定した。その結果の一部を表１３に示す。表１３中の＃Ｎ／Ａは、標的配列が存在しなかったことを示す。

表１３に示すように、例えば、検体乙宗は、選別された標的配列のＤＮＡ断片数に対する目的の長さのＤＮＡ断片数が、ＣｍＳｃａ０６７１６については０．２５、ＣＣＲ１．０Ｆ＿５６１７７０６１については０．４１であった。このことから、検体乙宗は、ＣｍＳｃａ０６７１６及びＣＣＲ１．０Ｆ＿５６１７７０６１としてＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型を有していることが検出された。その他の各検体全てについても同様に、２種類のＤＮＡマーカーとなる遺伝子多型のうち、いずれを有しているのか検出することができた。

Claims (12)

1. 次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製するためのキットであって、
   複数種類の標的配列に対応する複数種類の第１のプライマーセットであって、前記第１のプライマーセットが第１のフォワードプライマー及び第１のリバースプライマーからなる、複数種類の第１のプライマーセットと、
   第２のフォワードプライマー及び第２のリバースプライマーからなる第２のプライマーセットと
   を含み、
   前記第１のフォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第１のシーケンスプライマーの塩基配列、及び前記標的配列を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列（フォワードマーカー配列）を含み、
   前記第１のリバースプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第２のシーケンスプライマーの塩基配列、及び前記標的配列を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（リバースマーカー配列）を含み、
   前記第２のフォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第１のアダプター配列、第１のバーコード配列、及び前記第１のプライマーセットにより増幅したＤＮＡ断片の全長を増幅できるフォワードプライマーの塩基配列（フォワードオーバーラップ配列）を含み、
   前記第２のリバースプライマーが、５’末端から３’末端の方向に、第２のアダプター配列、第２のバーコード配列、及び前記第１のプライマーセットにより増幅したＤＮＡ断片の全長を増幅できるリバースプライマーの塩基配列（リバースオーバーラップ配列）を含み、
   前記第１のアダプター配列が、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第１の１本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列であり、
   前記第２のアダプター配列が、次世代シーケンサーの固体支持体上に固定された第２の１本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列であり、
   前記第１及び第２のバーコード配列が、長さが４～１６ヌクレオチドの任意の塩基配列であり、
   前記第１のシーケンスプライマーの塩基配列が、次世代シーケンサーを用いた配列決定に用いるプライマーと（第１のプライマー）と同一の塩基配列を含む塩基配列であり、前記第２のシーケンスプライマーの塩基配列が、次世代シーケンサーを用いた配列決定に用いるプライマーであって前記第１のプライマーと異なる塩基配列を有するプライマー（第２のプライマー）と同一の塩基配列を含む塩基配列である、キット。
2. ２種類～１０種類の前記第１のプライマーセットを含む、請求項１に記載のキット。
3. 前記キットが複数種類の第２のプライマーセットを含み、各第２のプライマーセットがそれぞれ、異なる第１のバーコード配列及び／又は異なる第２のバーコード配列を有する、請求項１に記載のキット。
4. ２種類～５０００種類の前記第２のプライマーセットを含む、請求項３に記載のキット。
5. 前記第１のアダプター配列が、配列番号１で示される塩基配列を含み、前記第２のアダプター配列が、配列番号２で示される塩基配列を含む、請求項１に記載のキット。
6. 前記各第１のプライマーセットの濃度に対する、前記第２のプライマーセットの濃度比が、１．０～２０．０である、請求項１に記載のキット。
7. 検体から得られたＤＮＡを鋳型として、請求項１～６のいずれか１項に記載のキットを用いてＰＣＲを実施することを含む、次世代シーケンサー用ＤＮＡライブラリーを作製する方法。
8. 前記検体が２種類～５０００種類の検体であり、ＰＣＲの際に異なる検体に異なる第２のプライマーセットを用いられる、請求項７に記載の作製方法。
9. 請求項７に記載の作製方法により、検体のＤＮＡライブラリーを作製する工程、
   前記ＤＮＡライブラリーについて、次世代シーケンサーを用いてシーケンス反応を行う工程、
   前記フォワードマーカー配列及びリバースマーカー配列に基づき、前記標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する工程（標的配列選別工程）、及び、
   前記選別されたＤＮＡ断片の配列及び／又は長さに基づき、遺伝子多型を検出する工程、
   を含む、検体の遺伝子多型の検出方法。
10. 前記検体が複数の検体である場合、
    ＤＮＡライブラリーを作製する工程において、検体毎にＤＮＡライブラリーを作製し、各検体由来のＤＮＡライブラリーにおける標的配列を含むＤＮＡ断片が異なる第１のバーコード配列及び／又は異なる第２のバーコード配列を有し、
    シーケンス反応において、全てのＤＮＡライブラリーについてシーケンス反応を行い、
    前記方法が、標的配列選別工程の前に、前記第１のバーコード配列及び第２のバーコード配列の組合せに基づき、検体毎にＤＮＡ断片を選別する工程（検体選別工程）を更に含み、
    標的配列選別工程において、検体毎に標的配列毎のＤＮＡ断片を選別する、請求項９に記載の検出方法。
11. 前記検体が、２種類～５０００種類の検体である、請求項１０に記載の検出方法。
12. 前記遺伝子多型が、反復配列多型である、請求項９に記載の検出方法。
    
    

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