CN114891880A - 一种用于str连锁分析的引物组合物、检测方法和应用 - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本申请涉及一种用于STR连锁分析的引物组合物、检测方法和应用。所述引物组合物包括以下组分：组分A：荧光素标记的通用引物，其包括上游引物1和下游引物1，且所述上游引物1和下游引物1的至少一种标记有荧光素；组分B：用于扩增特定STR基因座的引物，其包括扩增特定STR基因座的上游引物和扩增特定STR基因座的下游引物，且所述扩增特定STR基因座的上游引物的碱基序列中包括所述上游引物1的碱基序列，所述扩增特定STR基因座的下游引物中包括所述下游引物1的碱基序列。利用上述引物组合物，配合两步法PCR扩增，能够有效且经济地进行STR连锁分析，进而能够较好地应用在UPD患者遗传来源的检测中。
Description
技术领域
本申请涉及分子遗传学检测技术领域，尤其是涉及一种用于STR连锁分析的引物组合物、检测方法和应用。
背景技术
染色体微阵列芯片(CMA)和高通量测序(NGS)已成为遗传病临床诊断的重要工具，二者除可发现全基因组范围内的拷贝数(CNV)变异，还可以发现基因组中拷贝数为2的纯合子状态区段ROH(regions of homozygosity)，其产生涉及血系同源IBD(identity bydescent)，近亲婚配以及UPD等原因。
近亲婚配会造成多条染色体产生ROH区段，通过计算常染色体中ROH的比例可以推测父母的近亲关系。IBD及UPD产生的ROH区段通常仅涉及单条染色体，但IBD现象产生的ROH并不会导致印记基因异常，而部分涉及印记基因的UPD会产生不同的临床表型，因此在临床中需要与UPD进行区分。通过家系SNP连锁、STR连锁分析或甲基化检测，可有效区别IBD和UPD，以及UPD的遗传来源。
短串联重复序列(short tandem repeat，STR)是存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的串联重复DNA序列，其核心序列一般由2-6个碱基构成。该核心序列在不同个体间的串联重复数不同而呈现出长度多态性。STR是一种高度多态性的遗传标记，其遗传相对稳定，分布在人体各染色体上。
遵循孟德尔遗传定律，即每对染色体都有等位基因STR位点，一条遗传自父亲，一条遗传自母亲，因此通过STR连锁分析能对UPD的遗传来源作出判断。
STR连锁分析过程中需要从多对STR引物中选择可有效区分的引物来判定遗传来源，采用荧光素直接标记引物的方法，虽然PCR扩增流程相对简单，但是成本高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本申请提供一种用于STR连锁分析的引物组合物，利用上述引物组合物进行STR连锁分析时，能够有效降低引物合成的成本。
为此，本申请第一方面提供了一种用于STR连锁分析的引物组合物，所述引物组合物包括以下组分：
组分A：荧光素标记的通用引物，其包括上游引物1和下游引物1，且所述上游引物1和下游引物1的至少一种标记有荧光素；
组分B：用于扩增特定STR基因座的引物，其包括扩增特定STR基因座的上游引物和扩增特定STR基因座的下游引物，且所述扩增特定STR基因座的上游引物的碱基序列中包括所述上游引物1的碱基序列，所述扩增特定STR基因座的下游引物中包括所述下游引物1的碱基序列。
本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
本发明中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和负链的指定发生互换时，对应的上游和下游引物命名也可随之互换。
本申请中，所述引物组合物中仅包括一对荧光素标记的通用引物，而用于扩增不同的特定STR基因座的多对引物中均不需要荧光素标记，进而有效降低了引物合成的成本。同时利用上述引物组合物，配合两步法PCR扩增，能够有效且经济进行STR连锁分析。
本申请所述两步法PCR扩增中，第一步PCR扩增时先用组分B中的不含荧光素标记的引物进行扩增，获得第一步扩增产物，第一步扩增产物为不带荧光素的特定STR基因座的DNA片段，且所述DNA片段中连接有组分A中通用引物的碱基序列或与上述碱基序列配对的互补序列；然后以第一步扩增产物为模板进行第二步PCR扩增，第二步PCR扩增时利用组分A中荧光素标记的通用引物进行扩增，获得第二步扩增产物，第二步扩增产物为带有荧光素的特定STR基因座的DNA片段；将第二步扩增产物进行毛细管电泳，通过激发光照射进而激活荧光素发出荧光，然后由设备采集并数据化存储，进而实现高效且经济的STR连锁分析。
在一些实施方式中，组分B中，所述上游引物1的碱基序列位于所述扩增特定STR基因座的上游引物的碱基序列的5’端；和/或所述下游引物1的碱基序列位于所述扩增特定STR基因座的下游引物的碱基序列的5’端。
本申请中，通过将上游引物1的碱基序列和下游引物1的碱基序列分别设计于所述扩增特定STR基因座的上游引物和下游引物的5’端，使得利用组分B中用于扩增特定STR基因座的引物既能扩增出特定STR基因座的DNA片段，又能使扩增出的上述DNA片段上连接有组分A中通用引物的碱基序列或与上述碱基序列配对的互补序列。
在一些实施方式中，组分A中，所述荧光素标记于所述上游引物1和/或下游引物1的5’端。由于PCR扩增时会以引物的3’端羟基为起点进行延伸，因此将荧光素标记于引物的5’端不会破坏引物3’端的羟基，进而不会影响引物的延伸性能。
本申请对所采用的荧光素的具体种类没有明确限定，其为本领域中的常规选择。在本申请的一些具体实施方式中，所述荧光素选自FAM、HEX、TMR和ROX中的任意一种。
在一些实施方式中，所述上游引物1的碱基序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO.1)；所述下游引物1的碱基序列为5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(SEQ ID NO.2)。
本申请中，具有上述碱基序列的上、下游引物1不会与待测样本中的DNA发生错配，同时也不会与扩增体系内的其他引物相互配对或自我配对，进而实现有效扩增。
本申请第二方面提供了一种利用如本申请第一方面所述的引物组合物进行UPD患者遗传来源的STR连锁分析的检测方法，所述方法包括如下步骤：
S1，将待测样本的DNA、所述引物组合物中的组分B和包含DNA聚合酶和dNTPs的反应液混合，获得扩增体系1；
S2，对所述扩增体系1进行第一步PCR扩增，得到扩增产物1；
S3，将所述扩增产物1、所述引物组合物中的组分A和包含DNA聚合酶和dNTPs的反应液混合，获得扩增体系2；
S4，对所述扩增体系2进行第二步PCR扩增，得到扩增产物2；
S5，对所述扩增产物2进行毛细管电泳，对所述电泳的结果进行分析并作出判断。
本申请中，术语“UPD(Uniparental Disomy，单亲源二体)”指来自父母一方的染色体片段被另一方的同源部分取代，或一个个体的两条同源染色体都来自同一亲体，前者称为节段性单亲源二体。
本申请中，进行上述方法之前需先确定UPD患者中发生UPD的具体染色体，然后选用上述染色体上的STR基因座作为组分B中的特定STR基因座。也即本申请中，所述组分B中的特定STR基因座位于所述患者的UPD染色体上。这样才能通过检测所述特定STR基因座对UPD患者遗传来源进行STR连锁分析。
在一些实施方式中，所述特定STR基因座在所述患者的双亲中的大小至少相差1个重复数(也即至少相差2～3个碱基)。这样才能对扩增出的STR基因座的遗传来源进行有效判断。
在一些实施方式中，若待测样本的电泳结果显示所扩增的特定STR基因座的大小与其父亲染色体中相应的特定STR基因座的大小一致，则所述患者的UPD染色体来源于父亲；若待测样本的电泳结果显示所扩增的特定STR基因座的大小与其母亲染色体中相应的特定STR基因座的大小一致，则所述患者的UPD染色体来源于母亲。
本申请中，术语“大小一致”并非指基因座的大小完全相同，而是指待测样本中的特定STR基因座的大小与其父亲或母亲染色体中相应的特定STR基因座的碱基数相差不大于1bp。
本申请中，进行PCR扩增时，所述包含DNA聚合酶和dNTPs的反应液中还可以包括一些促进PCR反应的试剂，例如KCl、MgCl2、Tris-HCl、二硫苏糖醇(DTT)等。
本申请中，所述DNA聚合酶优选为Taq酶。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述第一步PCR扩增的条件包括：
90℃～95℃预变性1～3分钟；
90℃～95℃变性15～30秒，60℃～65℃退火延伸30～50秒，70～72℃退火延伸30～50秒，3～5个循环；
90℃～95℃变性15～30秒，58℃～60℃退火延伸30～50秒，70～72℃退火延伸30～50秒，10～12个循环；
70～72℃延伸5～10分钟。
本申请中，所述第一步PCR扩增的目的是扩增出第二步PCR的模板，因此扩增产物的浓度无需太高，因此所述第一步PCR扩增的循环数一般控制在15个左右即可。
本申请中，所述第一步PCR扩增首先在较高温度(60℃～65℃)下进行延伸，可以确保扩增的特异性。
本申请中，“预变性”和“变性”的目的是破坏双链DNA上成对的互补碱基之间的氢键，从而允许双链分开成两条单链。
在一些实施方式中，步骤S4中，所述第二步PCR扩增的条件包括：
90℃～95℃预变性1～3分钟；
90℃～95℃变性15～30秒，58℃～60℃退火延伸30～50秒，70～72℃退火延伸30～50秒，30～35个循环；
70～72℃延伸5～10分钟。
在一些实施方式中，所述第一步PCR扩增和第二步PCR扩增在70～72℃延伸5～10分钟后，还可以进一步在65～68℃下继续延伸15～30min，以确保扩增产物的完整性。
在一些具体实施方式中，步骤S2中，所述第一步PCR扩增的条件具体为：
95℃预变性3分钟；
95℃变性30秒，65℃～60℃(每个循环减少1℃)退火延伸30秒，72℃退火延伸30秒，5个循环；
95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，72℃退火延伸30秒，12个循环；
72℃延伸5分钟；
68℃延伸30分钟。
在一些具体实施方式中，步骤S4中，所述第二步PCR扩增的条件具体为：
95℃预变性3分钟；
95℃变性30秒，60℃退火延伸30秒，72℃退火延伸30秒，35个循环；
72℃延伸5分钟；
68℃延伸30分钟。
本申请中，步骤S1中，所述待测样本的DNA可以通过对从UPD患者身上采集的样本进行提取后获得。本申请对所述提取方法没有明确限定，其可以为本领域常规采用的方法。
值得注意的是，本申请上述进行UPD患者遗传来源的STR连锁分析的检测方法为非疾病诊断目的的方法。
本申请第三方面提供了一种如本申请第一方面所述的引物组合物或第二方面所述的检测方法在UPD患者遗传来源检测中的应用。
有益技术效果：本申请所提供的用于STR连锁分析的引物组合物仅包括一对荧光素标记的通用引物，而用于扩增不同的特定STR基因座的多对引物中均不需要荧光素标记，进而有效降低了引物合成的成本。同时利用上述引物组合物，配合两步法PCR扩增，能够有效且经济进行STR连锁分析，进而能够较好地应用在UPD患者遗传来源的检测中。
附图说明
图1为本申请实施例1的6个有效STR基因座的电泳结果数值列表图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：采用本申请的引物组合物对UPD患者的遗传来源检测某患儿临床表型为运动、语言延迟。经CMA(SNP 750K)检测为1号染色体UPD患者。1号染色体UPD不同的遗传来源，表型有所差异，申请1号染色体UPD的STR检测进行遗传来源验证，辅助确认表型，具体步骤如下：
(1)选取STR基因座并设计引物
选取1号染色体上的12个STR基因座，并根据所选取的基因座设计扩增相应基因座的引物，具体如表1所示。
表1
(2)合成荧光素标记的通用引物(组分A)，其碱基序列如下：
上游引物1：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物1：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(SEQ ID NO.2)；
其中上游引物1的5’标记有FAM荧光素。
上述荧光素标记的通用引物合成费用为180元(180元/对)。
(3)合成用于扩增特定STR基因座的引物(组分B)，具体如表2所示。
表2
上述用于扩增特定STR基因座的引物的合成费用为360元(12对*30元/对)。
(4)两步法PCR扩增
①第一步PCR扩增
利用表3中的引物对分别对表3中相应的特定STR基因座进行第一步PCR扩增，其扩增体系如表3所示。
表3
对表3所示的扩增体系进行第一步PCR扩增，扩增条件如表4所示。
表4
②第二步PCR扩增
以第一步PCR扩增的产物为模板，以合成的荧光素标记的通用引物为引物进行第二步PCR扩增，扩增体系如表5所示。
表5
对表5所示的扩增体系进行第一步PCR扩增，扩增条件如表6所示。
表6
按照上述步骤(4)依次对UPD患者中的上述12个STR基因座进行扩增，获得UPD患者的12个扩增产物。
然后再按照上述步骤(4)依次对UPD患者父亲中的上述12个STR基因座进行扩增，获得UPD患者父亲的12个扩增产物。
最后再按照上述步骤(4)依次对UPD患者母亲中的上述12个STR基因座进行扩增，获得UPD患者母亲的12个扩增产物。
上述PCR扩增的总费用为108元(72反应*1.5元/反应)。
(5)毛细管电泳和结果分析
对步骤(4)中获得的扩增产物依次进行毛细管电泳，根据毛细管电泳峰值，判断所扩增的STR基因座是否为有效基因座。有效基因座的判断标准为：毛细管电泳峰值清晰符合判断要求，且父母中该STR基因座区分明显。通过6个有效STR基因座的电泳结果(如图1所示)判断UPD患者1号染色体的遗传来源为父源。
上述毛细管电泳的总费用为360元(36个*10元/个)。
上述检测所花费的总费用为1008元。
对比例1：采用现有技术中的直接荧光标记引物对UPD患者的遗传来源检测所检测的UPD患者与实施例1相同，具体步骤如下：
(1)根据实施例1的表1所选取的STR基因座和设计的扩增相应基因座的引物直接合成荧光素标记的相应引物；其中相应的上游引物1的5’均标记有FAM荧光素。
引物合成费用为2160元(12对*180元/对)。
(2)一步法PCR扩增
利用步骤(1)合成的荧光素标记的引物对分别对表1中相应的特定STR基因座进行PCR扩增，其扩增体系如表7所示。
表7
对表7所示的扩增体系进行PCR扩增，扩增条件如表8所示。
表8
按照上述步骤(2)，采用所合成的荧光标记的引物直接依次对UPD患者中的上述12个STR基因座进行扩增，获得UPD患者的12个扩增产物；
然后再按照上述步骤(2)依次对UPD患者父亲中的上述12个STR基因座进行扩增，获得UPD患者父亲的12个扩增产物。
最后再按照上述步骤(2)依次对UPD患者母亲中的上述12个STR基因座进行扩增，获得UPD患者母亲的12个扩增产物
上述PCR扩增费用为54元(36反应*1.5元/反应)。
(3)毛细管电泳和结果分析
具体操作方式同实施例1中的步骤(5)。
上述毛细管电泳的费用为360元(36个*10元/个)。
上述检测花费的总费用为2574。
通过实施例1和对比例1可知，采用实施例1和对比例1的引物和方法均能对UPD患者的遗传来源作出准确判断，但是采用本申请的引物组合物和相应的方法的总花费仅为1008元，而采用对比例1所示的引物和相应的方法的总花费为2574。可见本申请的检测费用(12对引物)与直接荧光标记合成引物检测费用相比，节省约60％。当采用20对引物时能够节省约63％，当采用30对引物时能够节省约65％。因此本申请的检测方法更为经济。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
序列表
<110> 北京贝康医学检验所有限公司
<120> 一种用于STR连锁分析的引物组合物、检测方法和应用
<130> 2022
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物1(人工序列)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 下游引物1(人工序列)
<400> 2
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计的D1S468的上游引物(人工序列)
<400> 3
aattaaccgt tttggtcct 19
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 设计的D1S468的下游引物(人工序列)
<400> 4
gcgacacaca cttccc 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S2795的上游引物(人工序列)
<400> 5
ttagttggat tagacacggc 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计的D1S2795的下游引物(人工序列)
<400> 6
gagaccctga tgactgtgg 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 设计的D1S2694的上游引物(人工序列)
<400> 7
aggtccaaga agcggag 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 设计的D1S2694的下游引物(人工序列)
<400> 8
tcacggggta ttaagtgg 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S228的上游引物(人工序列)
<400> 9
aactgcaaca ttgaaatggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S228的下游引物(人工序列)
<400> 10
gggaccatag ttcttggtga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S532的上游引物(人工序列)
<400> 11
atggtgcctg gaagatagtg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S532的下游引物(人工序列)
<400> 12
gagtgtgttc cacagcacaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S2819的上游引物(人工序列)
<400> 13
ggaaaccccc caaccttagt 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计的D1S2819的下游引物(人工序列)
<400> 14
cgtgaacatt tctgctggc 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计的D1S2687的上游引物(人工序列)
<400> 15
agcacattta tgccatgtt 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计的D1S2687的下游引物(人工序列)
<400> 16
tcagtgtacc ccttgaagt 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 设计的D1S2715的上游引物(人工序列)
<400> 17
cacaggattc tgcgtctaac t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S2715的下游引物(人工序列)
<400> 18
tgctccaaga actgaagtga 20
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 设计的D1S504的上游引物(人工序列)
<400> 19
tgtggaaaga caagatgc 18
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 设计的D1S504的下游引物(人工序列)
<400> 20
gcaaggttac atggagc 17
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S2629的上游引物(人工序列)
<400> 21
tgtccaacag cagataagtg 20
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 设计的D1S2629的下游引物(人工序列)
<400> 22
caattccatt catgttactg tca 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 设计的D1S2785的上游引物(人工序列)
<400> 23
cgtgaatatc ctcagggaat 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 设计的D1S2785的下游引物(人工序列)
<400> 24
attgtggcac cgtactcc 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 设计的D1S2682的上游引物(人工序列)
<400> 25
ccttctgcac cgtaacac 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 设计的D1S2682的下游引物(人工序列)
<400> 26
ccccttaaag gaacttgtc 19
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S468基因座的上游引物(人工序列)
<400> 27
tgtaaaacga cggccagtaa ttaaccgttt tggtcct 37
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S468基因座的下游引物(人工序列)
<400> 28
caggaaacag ctatgaccgc gacacacact tccc 34
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2795基因座的上游引物(人工序列)
<400> 29
tgtaaaacga cggccagttt agttggatta gacacggc 38
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2795基因座的下游引物(人工序列)
<400> 30
caggaaacag ctatgaccga gaccctgatg actgtgg 37
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2694基因座的上游引物(人工序列)
<400> 31
tgtaaaacga cggccagtag gtccaagaag cggag 35
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2694基因座的下游引物(人工序列)
<400> 32
caggaaacag ctatgacctc acggggtatt aagtgg 36
<210> 33
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S228基因座的上游引物(人工序列)
<400> 33
tgtaaaacga cggccagtaa ctgcaacatt gaaatggc 38
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S228基因座的下游引物(人工序列)
<400> 34
caggaaacag ctatgaccgg gaccatagtt cttggtga 38
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S532基因座的上游引物(人工序列)
<400> 35
tgtaaaacga cggccagtat ggtgcctgga agatagtg 38
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S532基因座的下游引物(人工序列)
<400> 36
caggaaacag ctatgaccga gtgtgttcca cagcacaa 38
<210> 37
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2819基因座的上游引物(人工序列)
<400> 37
tgtaaaacga cggccagtgg aaacccccca accttagt 38
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2819基因座的下游引物(人工序列)
<400> 38
caggaaacag ctatgacccg tgaacatttc tgctggc 37
<210> 39
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2687基因座的上游引物(人工序列)
<400> 39
tgtaaaacga cggccagtag cacatttatg ccatgtt 37
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2687基因座的下游引物(人工序列)
<400> 40
caggaaacag ctatgacctc agtgtacccc ttgaagt 37
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2715基因座的上游引物(人工序列)
<400> 41
tgtaaaacga cggccagtca caggattctg cgtctaact 39
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2715基因座的下游引物(人工序列)
<400> 42
caggaaacag ctatgacctg ctccaagaac tgaagtga 38
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S504基因座的上游引物(人工序列)
<400> 43
tgtaaaacga cggccagttg tggaaagaca agatgc 36
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S504基因座的下游引物(人工序列)
<400> 44
caggaaacag ctatgaccgc aaggttacat ggagc 35
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2629基因座的上游引物(人工序列)
<400> 45
tgtaaaacga cggccagttg tccaacagca gataagtg 38
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2629基因座的下游引物(人工序列)
<400> 46
caggaaacag ctatgaccca attccattca tgttactgtc a 41
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2785基因座的上游引物(人工序列)
<400> 47
tgtaaaacga cggccagtcg tgaatatcct cagggaat 38
<210> 48
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2785基因座的下游引物(人工序列)
<400> 48
caggaaacag ctatgaccat tgtggcaccg tactcc 36
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2682基因座的上游引物(人工序列)
<400> 49
tgtaaaacga cggccagtcc ttctgcaccg taacac 36
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的用于扩增D1S2682基因座的下游引物(人工序列)
<400> 50
caggaaacag ctatgacccc ccttaaagga acttgtc 37
Claims (10)
1.一种用于STR连锁分析的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括以下组分：
组分A：荧光素标记的通用引物，其包括上游引物1和下游引物1，且所述上游引物1和下游引物1的至少一种标记有荧光素；
组分B：用于扩增特定STR基因座的引物，其包括扩增特定STR基因座的上游引物和扩增特定STR基因座的下游引物，且所述扩增特定STR基因座的上游引物的碱基序列中包括所述上游引物1的碱基序列，所述扩增特定STR基因座的下游引物中包括所述下游引物1的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，组分B中，所述上游引物1的碱基序列位于所述扩增特定STR基因座的上游引物的碱基序列的5’端；和/或所述下游引物1的碱基序列位于所述扩增特定STR基因座的下游引物的碱基序列的5’端。
3. 根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，组分A中，所述荧光素标记于所述上游引物1和/或下游引物1的5’端；优选地，所述荧光素选自FAM、HEX、TMR和 ROX中的任意一种。
4.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述上游引物1的碱基序列为5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’；所述下游引物1的碱基序列为5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’。
5.一种利用如权利要求1-4中任意一项所述的引物组合物进行UPD患者遗传来源的STR连锁分析的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1，将待测样本的DNA、所述引物组合物中的组分B和包含DNA聚合酶和dNTPs的反应液混合，获得扩增体系1；
S2，对所述扩增体系1进行第一步PCR扩增，得到扩增产物1；
S3，将所述扩增产物1、所述引物组合物中的组分A和包含DNA聚合酶和dNTPs的反应液混合，获得扩增体系2；
S4，对所述扩增体系2进行第二步PCR扩增，得到扩增产物2；
S5，对所述扩增产物2进行毛细管电泳，对所述电泳的结果进行分析并作出判断。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组分B中的特定STR基因座位于所述患者的UPD染色体上；优选地，所述特定STR基因座在所述患者的双亲中的大小至少相差1个重复数。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，若待测样本的电泳结果显示所扩增的特定STR基因座的大小与其父亲染色体中相应的特定STR基因座的大小一致，则所述患者的UPD染色体来源于父亲；若待测样本的电泳结果显示所扩增的特定STR基因座的大小与其母亲染色体中相应的特定STR基因座的大小一致，则所述患者的UPD染色体来源于母亲。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述第一步PCR扩增的条件包括：
90℃~95℃预变性1~3分钟；
90℃~95℃变性15~30秒，60℃~65℃退火延伸30~50秒，70~72℃退火延伸30~50秒，3~5个循环；
90℃~95℃变性15~30秒，58℃~60℃退火延伸30~50秒，70~72℃退火延伸30~50秒，10~12个循环；
70~72℃延伸5~10分钟。
9.根据权利要求5-7中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述第二步PCR扩增的条件包括：
90℃~95℃预变性1~3分钟；
90℃~95℃变性15~30秒，58℃~60℃退火延伸30~50秒，70~72℃退火延伸30~50秒，30~35个循环；
70~72℃延伸5~10分钟。
10.一种如权利要求1-4中任意一项所述的引物组合物或权利要求5-9中任意一项所述的检测方法在UPD患者遗传来源检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210641053.6A CN114891880A (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 一种用于str连锁分析的引物组合物、检测方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210641053.6A CN114891880A (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 一种用于str连锁分析的引物组合物、检测方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114891880A true CN114891880A (zh) | 2022-08-12 |
Family
ID=82729204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210641053.6A Pending CN114891880A (zh) | 2022-06-08 | 2022-06-08 | 一种用于str连锁分析的引物组合物、检测方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114891880A (zh) |
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2022
- 2022-06-08 CN CN202210641053.6A patent/CN114891880A/zh active Pending
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