JP7290228B2 - 混合物中の核酸を配列決定する方法およびそれに関する組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参考として本明細書に援用される2013年2月20日に出願された米国仮出願第61/766,841号に対して優先権を主張する。
個々の遺伝子はしばしば、種々の細胞もしくは分化ステージ(生物の生活環の中で通常は遭遇しない細胞、例えば、がん細胞;培養物中の細胞;発生的な神経-解剖学的異常の細胞が挙げられる)において新たなタンパク質を生じ得る。その種々のタンパク質は、発現している細胞におけるタンパク質を定めるメッセンジャーRNA(mRNA)の転写活性化および転写後RNAプロセシングの差次的パターンから生じる。
本開示は、異種混合物中に存在する個々のポリヌクレオチドの全長(端から端までの)配列を得ることに関する。それは、このような分析を可能にする特別な試薬の設計、合成および調製法にさらに関する。ある種の実施形態において、本開示は、高等な多細胞生物の細胞もしくは組織のトランスクリプトーム中のmRNAを完全に配列決定し、定量することに関する。開示される方法は、高等な多細胞生物の細胞および組織の分子表現型を特定する全長mRNAの効率的で、安価な配列決定を可能にする。ある種の実施形態において、本開示は、このような分析を行うための試薬および適用方法を含む商業用のキットに関する。
本発明のある種の実施形態では、例えば以下の項目が提供される:
(項目1)
a)サンプルとタグ付加するポリヌクレオチドの1群とを混合する工程であって、ここで該サンプルは、種々の長さおよび/もしくは種々の配列の核酸の混合物を含み、該タグ付加するポリヌクレオチドは、重複する配列とランダム配列を有する部分とを個々に含み、該混合する工程は、該タグ付加するポリヌクレオチドが該核酸と結合して、ランダム配列で個々にタグ付加された核酸を形成する条件下で行われる、工程;
b)ランダム配列で個々にタグ付加された該核酸混合物を、ホモポリマーの混合物へと複製する工程であって、ここで該ホモポリマーは、反復核酸および反復配列タグを含む、工程;
c)該ホモポリマーを壊して、ホモポリマーフラグメントを提供する工程;ならびに
d)該ホモポリマーフラグメントを配列決定する工程、
を包含する、方法。
(項目2)
前記ホモポリマーフラグメントと、前記タグ付加するポリヌクレオチド上の前記重複配列内の部位を切断する制限ヌクレアーゼとを混合して、切断されたホモポリマーフラグメントを提供する工程、および該切断されたホモポリマーフラグメントを配列決定する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ホモポリマーフラグメント内のタグ付加された配列を同定する工程、前記ランダム配列の部分の中の同一配列を分離する工程、および前記サンプル中にあった核酸配列を再構成する工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記タグ付加するポリヌクレオチドが、2本鎖セグメントへと自己ハイブリダイズするように構成されたパリンドローム配列を含み、ここで該2本鎖セグメントは、制限部位を含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記制限部位が、稀な制限部位である、項目2に記載の方法。
(項目6)
a)タグ付加する部分および標的部分を含む2本鎖核酸フラグメントを提供する工程であって、ここで該タグ付加する部分は、重複配列のセグメントおよび変化する配列のセグメントを含み、該重複配列は、第1のプライマー部位および制限部位を含む、工程、
b)該2本鎖フラグメントと該制限部位に対する制限酵素とを混合して、切断されたフラグメントを提供する工程;
c)該切断されたフラグメントと酵素とを、該切断されたフラグメントが環状フラグメントを形成するような条件下で混合する工程;
d)該環状フラグメントをランダムな点で壊して、剪断されたフラグメントを提供する工程;
e)該2本鎖核酸の末端にアダプターをライゲーションする工程であって、ここで該アダプターは、第2のプライマー部位を含み、アダプター核酸コンジュゲートを提供する、工程;
f)該アダプター核酸コンジュゲートを、該第1のプライマー部位および該第2のプライマー部位に対するプライマーを用いて増幅する工程であって、ここで該第1のプライマーは、その5’末端に第1の捕捉配列を含み、該第2のプライマーは、に5’末端に第2の捕捉配列を含んで捕捉標的タグ付加コンジュゲートを提供する、工程;ならびに
g)該捕捉標的タグコンジュゲートを配列決定する工程、
を包含する、方法。
(項目7)
前記変化する配列のセグメントが、前記第1のプライマー部位と前記標的部分との間にある、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記第1のプライマー部位が、前記変化する配列のセグメントと前記標的部分との間にある、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記制限部位が、前記変化する配列のセグメントと前記第1のプライマー部位との間にある、項目6に記載の方法。
(項目10)
前記変化する配列のセグメントが、前記制限部位と前記第1のプライマー部位との間にある、項目6に記載の方法。
(項目11)
前記核酸フラグメントが、変化する配列の2つのセグメントを含み、ここで該変化するセグメントは、同一配列であり、前記制限部位は、該同一配列の間にある、項目6に記載の方法。
(項目12)
a)サンプルとタグ付加するポリヌクレオチドの一群とを混合する工程であって、ここで該サンプルは、種々の長さおよび/もしくは種々の配列の核酸の混合物を含み、ここで該タグ付加するポリヌクレオチドは、重複配列とランダム配列を有する部分とを個々に含み、該タグ付加するポリヌクレオチドは、2本鎖セグメントへと自己ハイブリダイズするように構成されたパリンドローム配列を含み、ここで該2本鎖セグメントは、制限部位を含み、
ここで該ランダム配列を有する部分は、該2本鎖セグメント内にあり、
ここで該混合する工程は、該タグ付加するポリヌクレオチドが該核酸と結合して、ランダム配列で個々にタグ付加された核酸を形成する条件下で行われる、工程;
b)ランダム配列で個々にタグ付加された該核酸混合物を、ホモポリマーの混合物へと複製する工程であって、ここで該ホモポリマーは、反復核酸および反復配列タグを含む、工程;
c)該ホモポリマーフラグメントと、該タグ付加するポリヌクレオチド上の該重複配列に相関した部位を切断する制限ヌクレアーゼとを混合して、切断されたホモポリマーフラグメントを提供する工程;ならびに
d)該切断されたホモポリマーフラグメントを配列決定する工程、
を包含する、方法。
(項目13)
重複配列、ランダム配列を有する部分、ポリ-Tを有する部分、および制限部位を各々が個々に含むポリヌクレオチドの混合物を含む、組成物。
(項目14)
前記ポリ-Tが、3’末端のあたりにあり、前記ランダム配列を有する部分が、該ポリ-Tと制限部位との間にある、項目13に記載の組成物。
(項目15)
ポリヌクレオチドが、2本鎖セグメントへと自己ハイブリダイズするように構成されたパリンドローム配列を含み、ここで該2本鎖セグメントは、制限部位を含む、項目13または14に記載の組成物。
(項目16)
前記ランダム配列を有する部分が、前記2本鎖セグメント内にある、項目13~15のいずれかに記載の組成物。
(項目17)
前記ポリ-Tが、3’末端のあたりにあり、第2のポリ-Tが、5’末端のあたりにある、項目14に記載の組成物。
(項目18)
前記制限部位が、稀な制限部位である、項目13~17のいずれかに記載の組成物。
(項目19)
前記ランダム配列を有する部分が、ランダム塩基部位もしくは重複配列が散在する配列を含む、項目13~18のいずれかに記載の組成物。
(項目20)
重複配列、ランダム配列を有する部分、同じランダム配列を繰り返す第2の部分、ポリ-Tを有する部分、ならびに該ランダム配列を有する部分と該同じランダム配列を繰り返す第2の部分との間の制限部位を各々が個々に含むポリヌクレオチドの混合物を含む、組成物。
(項目21)
核酸を生成する方法であって、該方法は、
a)プライマーおよび複製試薬と、3’ポリ-T、重複配列、ランダム配列を有する部分、およびループを含む出発ヘアピンポリヌクレオチドとを混合して部分的に2本鎖のかつ部分的に1本鎖の核酸を形成する工程であって、ここで該プライマーは、該ループ配列に対するものである、工程;ならびに
b)該部分的に2本鎖のかつ部分的に1本鎖の核酸と、ポリ-Aプライマーおよび複製薬剤とを混合して、全体的に2本鎖の核酸を形成する工程、
を包含する、方法。
(項目22)
前記ポリ-Aプライマーを切断して、ポリ-Tテールを有する2本鎖核酸を提供する工程をさらに包含する、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記2本鎖核酸を変性させて、ポリ-Tテールを有するヘアピン核酸および前記出発ヘアピンポリヌクレオチドを形成する工程をさらに包含する、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記出発ヘアピンポリヌクレオチドが、固体支持体にコンジュゲート化される、項目21~23のいずれかに記載の方法。
(項目25)
項目13~19に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
本明細書で記載される方法は、RNASeqのある種の制限を克服する。このRNA-Seqの制限、ならびに細胞および組織の表現型を推定もしくは説明するための全ゲノム配列決定もしくは「エクソーム配列決定」ストラテジーの制限は、単一の仮想分断遺伝子から生じ得る2つの選択的トランスクリプトームの図10に示される模式図で捕捉されている。個々の選択的スプライシングされたセグメント(ここでは2つのトランスクリプトームにおいて同一)の発現頻度を定量してさえも、エクソーム配列決定は、全く異なるタンパク質が発現される筋書き(疾患変異が機能に影響を及ぼし得る異なる構造的状況)を区別できないことは、明らかである。
(ここでaijは、エキソンejが欠失されるかもしくは保持される場合に、それぞれ、0もしくは1である保持係数(retention coefficient)である)によって特定されるか、またはより単純に、
si=aig・Xg
(ここでaigは、遺伝子gのi番目のメッセージに関する保持係数のベクトルであり、Xgは、gの保持されたエキソンのセットを指す)によって特定される。
si=aig・Ψg
τ=(p1, ..., pg ... ,pN)、ここでNは、遺伝子数であり;
そしてngは、遺伝子gの全てのバリアントに関するメッセージ分子の総数である。
そしてngiは、バリアントiに関するメッセージ分子の数である。実際の遺伝子配列エレメントをτgの中に吸い上げると、トランスクリプトームは、バリアント配列の重み付けした目録(例えば、通常所望される情報の形態)として再構成される。この条件では、
である。
Clinical Oncology,(2007) 125, 5815-5824を参照のこと。標的組織に存在するコアクチベーターおよびコインヒビターの相対的レベルを特徴付けることに、最も多くの注意が向けられてきた。比較して、これらレセプターのおよそ24種のスプライスバリアント、またはプロゲステロンおよびアンドロゲンレセプターにおける匹敵するバリエーションの組織特異的発現がこれら差異を説明するという可能性は、ほとんど考慮されてこなかった。本明細書で開示される実施形態を使用するmRNAプロファイリングは、これら可能性のうちの全てに関する情報を捕捉し得る。
ある種の実施形態において、本開示は、染色体DNAのように、任意の長いポリマーの配列決定およびデノボアセンブリのために使用され得る一方で、トランスクリプトミクスへの適用がこの節に記載される。この実施形態は、細胞もしくは組織のトランスクリプトームにおけるメッセージの混合集団から包括的な全長配列決定およびmRNAバリアントの相対量の定量を可能にする。
1)固有の識別子配列「タグ」を、混合物中の各ポリヌクレオチドに取り付ける工程;
2)上記タグ付加したポリヌクレオチド、典型的には(しかし必要ではない)タンデムのタグ付加されたホモポリマーとして複製する工程;
3)上記タグ付加し、複製した生成物を剪断して(例えば、物理的に)、ランダム点で、上記cDNAレプリカを壊す工程;
4)上記識別タグ内の規定された部位で酵素により切断して、上記識別子を各酵素切断生成物の一方の末端に位置づける工程;
5)あらゆるタグ付加されたフラグメントを配列決定して、上記識別子タグおよびランダム剪断点からの関連配列を捕捉する工程;
6)タグ付加された配列対を、識別された供給源分子に従って分離し、単一分子配列アセンブリし、同一配列のポリヌクレオチドを集計し、そして出発mRNA集団の統計的構造を再構成するための工程。
1.SMID検出工程 - 同定するランダム化配列は、隣接する配列エレメント(「ラッパー」)によって、または各ライブラリー鎖の一方の末端もしくは両方の末端での一様の配置によってかのいずれかで配置される。
本開示のある種の実施形態の状況において、以下の用語が企図される。
タグの種々のタイプが企図される:タイプI(単一マーカー)、タイプII-ps(2つのパリンドロームの対称的マーカー)、タイプII-pa(2つのパリンドロームの非対称的マーカー)、およびタイプII-t(タンデムでありパリンドロームでない2つのマーカー)。
5’-[テール]-[マーカー-ブロック]-[介在ループ]-[マーカーブロック]-[テール]-3’
ここでテールとは、このドメインが任意選択であることを示す。1個もしくは2つのテールを有するタグは、下付文字によって示される(例えば、それぞれ、1つもしくは2つのテールの形態の例としてタイプII-pa1もしくはタイプII-ps2)。
タイプIタグ付加試薬は、1回に1個のヌクレオチドの連続的固相合成によって、もしくは別個に生成されたセグメントを繋ぐことによって得られ得る。ランダム塩基部位は、ヌクレオチドの混合物を繋ぐことによって作られ得る。
(1)最終的な分子に所望される3’-1本鎖テールに対する相補体(例えば、5’-WA22(ここでWは、Vに対する相補的塩基である)であるが、これに限定されない)。
(2)マーカー-ブロック(5’-A-[B-SMID-C]-D 3’)(ここで「[B-SMID-C]」は、それ自体マーカーであり(そのエレメントは、最終的な配列決定するライブラリーにおいて複製および保持されている)、AおよびDは、マーカー-ブロックの近位の5’成分および3’成分である)。
(3)介在ループ;このループは、前駆体内に相補性の部位を有さない一方で、反応シリーズで第2鎖中間体の合成をプライミングするために使用され得るポリヌクレオチドに対して相補的な配列を含み得る(「ループプライマー」、LP)。
(4)マーカー-ブロックの3’からSMIDまでの部分に対する(例えば、C-Dのうちの一部もしくは全てに対する)相補体:これは、自己プライミングのための分子内「クランプ」と言及され得る。
(1)最終分子の中で望まれる3’テールに対する相補体を含むドメイン(例えば、限定されないが、5’-WA22)
(2)(必要に応じて)PCRプライマー相補的配列を含むドメイン
(3)DNA合成ブロッキングポリヌクレオチドに相補的な配列を含むドメイン
(4)自己プライミングクランプ配列に相補的な配列(SP-2相補体)を含むドメイン
(5)SMID相補性配列を含むドメイン
(6)自己プライミングクランプ配列に相補的な配列(SP-1相補体)を含むドメイン
(7)ポリヌクレオチドに相補的な配列(「LP-1」)を含むドメイン。LP-1結合部位は、ループプライマーLP-1の適切な結合およびphi 29 DNAポリメラーゼでの結合したプライマーの効率的伸長を可能にするために、ドメイン(5)の3’末端から数塩基だけ離れている。ドメイン(6)はまた、ライブラリー調製において使用されることになる制限エンドヌクレアーゼ(RE-L(図中の線))の稀な認識配列を含む。
(8)クランプ配列SP-2相補体(ドメイン3の反復)を含むドメイン
(9)ポリヌクレオチドに相補的な配列(「LP-2」)を含むドメイン。LP-2結合部位は、ループプライマーLP-2の適切な結合およびphi 29 DNAポリメラーゼでの結合したプライマーの効率的伸長を可能にするために、数塩基だけドメイン(7)の3’末端から離れている。ドメイン(8)はまた、タグ合成において使用されることになる制限エンドヌクレアーゼの認識配列(RE-T:(図中の二本線))を含む。LP-2配列は、望む場合、その3’末端に、ドメイン(8)を超えて次のドメインへと伸長してもよい。配列RE-Tは、LP-2の3’末端へと伸長しなければならないが、制限エンドヌクレアーゼがその末端にLP-2を有する2本鎖基質の両方の鎖を切断するのに十分な数の塩基だけその位置から離れているべきである。
(10)PCRプライマー相補的配列(存在する場合、ドメイン2の反復)を含むドメイン
(11)ドメイン(5)に相補的な自己プライミングクランプ配列1(SP-1)を含むドメイン。
Illumina High Seq機器のメイトペア配列決定モードおよびペアエンド配列決定モードにおいて、それぞれのライブラリーに組み込まれるDNAフラグメントは、末端仕上げ(end-polish)され、A-テール付加され、いくつかの機能的エレメント;PCR部位、捕捉配列、クラスター合成のための配列、コンセンサス切断部位および配列決定プライマー、を有するフォーク型のアダプターにライゲーションされる。
2.0)は、その内部で捕捉されるDNAフラグメントを増幅する。一方の末端にマーカーをおよび他方にcDNA内部配列を専ら有するライブラリーフラグメントを選択的に生成するために、改変されたアダプター、改変されたPCRプライマー。もしくはその両方が使用され得る。
ある種の実施形態において、本開示は、タグ付加するポリヌクレオチドの識別能を最大化するための異種懸濁物中のタグ付加するポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドの異種溶液中で、個々の分子は、それらの配列が異なる限りにおいて区別され得るに過ぎない。大規模並行の短い配列リードから定量的集団プロファイルを再構成するために、各分子は、その完全配列に基づいて全ての他の分子から最終的に区別可能であるように最初に改変される。
(式中、Siは、特異的メッセンジャー配列を表し;qgiは、遺伝子gのi番目メッセージの相対的量を表し;そしてpgは、N個の発現された遺伝子の各々の転写物の相対レベルを表す)に関する。この情報は、トランスクリプトームの統計的構造を分析して、ゲノムと発現された細胞分子表現型との間の情報の獲得を左右する複雑な機構を明らかにするための基本を提供する。
k=Ν exp(-NL/rT)
Nについて解くと、以下のようになる:
N=-kA W-1(-1/A)
ここでA=rT/kLであり、W-1は、本発明者らの場合におけるNについての実数値(すなわち、複素数ではない)を戻す、実数値に基づくLambert-W関数の分岐である(Adv, Comparative Mathematics, 5, 329-359, 1996)。
用語「ポリヌクレオチド」もしくは「ポリヌクレオチド」とは、2個もしくはそれより多くのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド(好ましくは、3個より多く、通常は、10個より多い)から構成される分子を指す。正確なサイズは、多くの要因に依存し、これは、翻って、ポリヌクレオチドの最終的な機能もしくは使用に依存する。ポリヌクレオチドは、化学合成、DNA複製、逆転写、もしくはこれらの組み合わせを含め、任意の様式で生成され得る。
Acad. Sci. USA 1996, 93, 1156-1160を参照のこと。
細胞もしくは組織から得、ポリ-A mRNAを標準的キットで単離する。ゲノムDNAの残余の除去は、典型的である(DNA-FreeTM, LifeTechnology)。
Salzman, J. et al.は、以下を報告する:circular RNAs Are the Predominant Transcript Isoform from Hundreds of Human Genes in Diverse Cell Types. PloS One, 2012, vol 7, issue 2, e30733。これらは、ポリアデニル化されていない。このクラスのRNA生成物は、本明細書で記載されるとおりに、低化学量論で、ランダム3’終端配列を有するタグ付加試薬を使用し、RNAのコピーを作製し、続いて、環化およびプロセシングを行うこの技術を用いた配列決定に受け入れられる。
Claims (7)
- タグ付加試薬を合成する方法であって、該方法は、
a)複数のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで該複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは:
i)5’不変塩基、
ii)配列識別可能領域を含むマーカーブロックであって、ここで該配列識別可能領域は、単一の不変塩基の間に散在する一連のランダム塩基、および該配列識別可能領域の5’末端に隣接する不変塩基を含む第1の不変配列、および該配列識別可能領域の3’末端に隣接する不変塩基を含む第2の不変配列を含む、マーカーブロック、
iii)該マーカーブロックまたは該5’不変塩基に対して相補性の部位を持たないマーカーブロックのループ領域3’であって、ここで、該ループ領域はプライマー結合部位を含む、ループ領域3’、および
iv)該ループ領域の第3の不変配列3’であって、ここで該第3の不変配列は、該第2の不変配列に相補的な配列を含む、第3の不変配列3’
を含み、
ここで、該第3の不変配列は該第2の不変配列にハイブリダイズし、それにより一本鎖5’末端、二重鎖ステム、および該ループ領域を有するヘアピンを形成し、3’末端が該二重鎖ステムの一方の鎖を形成し、
該複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、該第2の不変配列または該ループ領域内に制限ヌクレアーゼ認識部位をさらに含む、工程;
b)該複数のオリゴヌクレオチドを、該3’末端を伸長して該マーカーブロックおよび5’不変塩基の相補体を形成するポリメラーゼと接触させ、それにより、平滑末端二重鎖および該ループ領域を有するヘアピンを生成する工程であって、ここで、該ヘアピンは3’末端および5’末端を有する、工程;
c)該ヘアピンを、該ループ領域の該プライマー結合部位に結合するループプライマーと接触させる工程;
d)鎖置換DNAポリメラーゼで該ループプライマーを伸長して該ヘアピンの該5’末端をコピーし、該3’末端を置換する工程であって、該3’末端はRNAオリゴヌクレオチドプライマーに相補的な配列を有する、工程;
e)該ヘアピンを該RNAオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、該RNAオリゴヌクレオチドプライマーをDNAポリメラーゼで伸長して、該5’不変塩基、該マーカーブロック、ループドメイン、マーカーブロック逆相補体および5’不変塩基逆相補体を含む二重パリンドローム鎖を作成する工程;および
f)該二重パリンドローム鎖をRNaseと接触させて、より短い鎖およびより長い鎖を持つ二重パリンドローム鎖を作成する工程;および
g)該二重パリンドローム鎖を変性および再生して、該より短い鎖上にハイブリダイズしていない3’末端ドメインを含むヘアピン分子を生成し、それにより該タグ付加試薬を生成する工程
を含む、方法。 - タグ付加試薬を合成する方法であって、該方法は、
a)複数のオリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで該複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは:
i)5’不変塩基、
ii)配列識別可能領域を含むマーカーブロックであって、ここで該配列識別可能領域は、単一の不変塩基の間に散在する一連のランダム塩基、および該配列識別可能領域の5’末端に隣接する不変塩基を含む第1の不変配列、および該配列識別可能領域の3’末端に隣接する不変塩基を含む第2の不変配列を含む、マーカーブロック、
iii)該マーカーブロックまたは該5’不変塩基に対して相補性の部位を持たないマーカーブロックのループ領域3’であって、ここで、該ループ領域はプライマー結合部位を含む、ループ領域3’、および
iv)該ループ領域の第3の不変配列3’であって、ここで該第3の不変配列は、該第2の不変配列に相補的な配列を含む、第3の不変配列3’
を含み、
ここで、該第3の不変配列は該第2の不変配列にハイブリダイズし、それにより一本鎖5’末端、二重鎖ステム、および該ループ領域を有するヘアピンを形成し、3’末端が該二重鎖ステムの一方の鎖を形成し、
該複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、該第2の不変配列または該ループ領域内に制限ヌクレアーゼ認識部位をさらに含む、工程;
b)該複数のオリゴヌクレオチドを、該3’末端を伸長して該マーカーブロックおよび5’不変塩基の相補体を形成するポリメラーゼと接触させ、それにより、平滑末端二重鎖および該ループ領域を有するヘアピンを生成する工程であって、ここで、該ヘアピンは3’末端および5’末端を有する、工程;
c)該ヘアピンを、該ループ領域の該プライマー結合部位に結合するループプライマーと接触させる工程;
d)鎖置換DNAポリメラーゼで該ループプライマーを伸長して該ヘアピンの該5’末端をコピーし、該3’末端を置換する工程であって、該3’末端はDNAオリゴヌクレオチドプライマーに相補的な配列を有する、工程;
e)該ヘアピンを
i)該5’不変塩基内の配列に相補的な3’DNA配列;および
ii)該ヘアピンに相補的ではない遊離5’DNA配列
を含むDNAオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、核酸マーカーおよびその相補体を含む二重パリンドローム鎖を作成する工程であって、ここで該二重パリンドローム鎖は遊離3’末端を有する、工程;および
f)該二重パリンドローム鎖を変性および再生して、ハイブリダイズしていない3’末端ドメインおよびハイブリダイズしていない5’末端ドメインを含むヘアピン分子を生成し、それにより該タグ付加試薬を生成する工程
を含む、方法。 - 前記第3の不変配列は、その全長にわたって前記第2の不変配列に相補的ではない配列をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 工程a)の前記核酸マーカーが、ビオチン化されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)の前記核酸マーカーが、固体基材に付着している、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、前記第2の不変配列内に前記制限ヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、前記ループ領域内に前記制限ヌクレアーゼ認識部位をさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
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