CN111560470A - 一种流感病毒基因组末端检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流感病毒基因组末端检测方法，包括如下步骤：1)提取流感病毒基因组，经反转录、环化反应得到环化的cDNA；2)对步骤1)所得环化cDNA进行巢式反向PCR扩增，得到含有各个病毒基因片段3’和5’末端序列的PCR产物；3)将步骤2)所得PCR产物克隆进入载体后，挑取至少2个克隆进行测序并分析测序结果，通过流感病毒基因组各基因片段高度保守的3’末端非编码区序列和5’末端非编码区序列的定位，即可获得准确的5’和3’末端非编码区及其临近编码区内的核苷酸序列。采用本发明的检测方法，可简便、快速的完成流感病毒基因组各个片段的3’和5’末端序列扩增和检测，从而显著地提高B型流感病毒的拯救效率，推动B型流感疫苗的开发。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是一种流感病毒基因组末端检测方法及其在B型流感病毒反向遗传操作系统构建中的应用。
背景技术
B型流感病毒(Influenza B virus)属于正黏病毒科，B型流感病毒属，是单股、负链、分节段的RNA病毒。B型流感病毒常在流感流行季节中引起局部的暴发和流行，儿童、老年人和慢性病患者更为易感。流行病学调查显示，儿童感染流感病毒的死亡病例中有20％～44％的患者为B型流感病毒感染。在20世纪早期阶段，B型流感病毒只有一个分型。随着病毒的不断进化，在1980年以后，B型流感病毒形成2个分支—Victoria亚系和Yamagata亚系。不同亚系的B型流感病毒具有不同的抗原性，二者之间的交叉保护性较差，每年的流感流行季会以一个亚型的流感病毒为主导。2001年开始，2个亚系的B型流感病毒通常会同时出现在流感流行季节。由此，当前B型流感疫苗的设计和诊断方法的建立需要同时针对2个亚系的流感病毒均有效。
反向遗传操作是一项人工拯救流感病毒的技术，将流感病毒基因组的8个基因片段分别构建入RNA聚合酶I(Pol I)和RNA聚合酶I(Pol II)启动子/终止子双向表达载体中，8质粒转染细胞后，通过在体外细胞中模拟病毒基因组在宿主细胞中的转录、翻译和病毒包装过程，最终获得流感病毒。利用反向遗传操作技术，对流感病毒基因片段进行基因重组和基因改造，进而制备高产和高效的流感疫苗，是当前流感疫苗研究的重要方向。
流感病毒基因组内各个基片段的5’和3’末端非编码区(UTR)和邻近UTR的编码区部分序列(～150bp)共同组成了流感病毒基因组的包装信号。包装信号区域核酸序列对流感病毒拯救效率、重组病毒的生长、复制和致病力等方面都具有重要的影响。包装信号序列的突变、缺失等偏差，会直接影响基因片段包装入基因组的效率，影响病毒的生长和复制，甚至会导致病毒拯救的失败。在已有数据库(Genebank,GISAID等)中公布的B型流感病毒基因组各片段序列大多只包含完整的基因编码框(ORF)内的序列，非编码区序列缺失或者部分缺失。而非编码区序列属于基因片段的包装信号区，其序列的完整性和准确性决定了基因片段的包装效率，是流感病毒拯救成功与否的关键因素。因此，快速、准确的测定B型流感病毒基因片段5’和3’末端序列对于B型流感病毒反向遗传操作系统的建立以及后续新型流感疫苗设计与拯救、流病毒生长复制、致病性等研究工作都具有重要意义。
cDNA末端快速扩增技术(RACE)是准确测定cDNA末端以及全长的一种有效方法。传统的RACE技术原理为通过一段锚定序列和一个基因特异性引物进行PCR，具有非特异扩增严重的缺陷。并且，RACE技术需要分别对基因片段的5’和3’末端进行PCR扩增、克隆和测序，操作繁琐，费时费力。因此，有必要建立一种简便、准确、可同时测定B型流感病毒基因组片段3’和5’双末端序列扩增方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可简便地同时测定B型流感病毒基因组片段3’和5’双末端序列扩增方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一种流感病毒基因组末端检测方法，包括如下步骤：
1)提取流感病毒基因组，经反转录、环化反应得到环化的cDNA；
2)对步骤1)所得环化cDNA进行巢式反向PCR扩增，得到含有各个病毒基因片段3’和5’末端序列的PCR产物；
3)将步骤2)所得PCR产物克隆进入载体后，挑取至少2个克隆进行测序并分析测序结果，通过流感病毒基因组各基因片段高度保守的3’末端非编码区序列和5’末端非编码区序列的定位，即可获得准确的5’和3’末端非编码区及其临近编码区内的核苷酸序列。由此，采用本发明的检测方法，不仅可以检测病毒基因5’和3’末端非编码区序列，还可以准确地检测出与末端非编码区序列相邻的编码区内的核苷酸序列。
作为上述方案的进一步优化，所述流感病毒为B型流感病毒。需要说明的是，本发明的方法适用于检测B型流感病毒，但是并不限于B型流感病毒，还可以用于检测流感病毒的其它类型。
作为上述方案的进一步优化，所述反转录采用的引物的碱基序列为AGCAGAAGC。
作为上述方案的进一步优化，所述巢式反向PCR扩增采用的引物包括针对B型流感病毒的每个基因设计的2对反向PCR简并引物。
作为上述方案的进一步优化，所述反向PCR简并引物的设计要求为：在B型流感病毒中相对保守，并保证最终扩增产物大于300bp，从而保证每个靶基因片段的包装信号区域得到充分扩增。
作为上述方案的进一步优化，所述反向PCR简并引物的碱基序列如SEQ ID NO.1～32所示。需要说明的是，本发明中的反向PCR简并引物的碱基序列包括但不限于如SEQ IDNO.1～32所示的碱基序列，还包括与SEQ ID NO.1～32所示的碱基序列一致性为95％以上的引物序列，只要能准确地扩增出病毒基因片段3’和5’末端序列即可。
作为上述方案的进一步优化，所述3’末端非编码区序列为AGCAGAAGC，所述5’末端非编码区序列为TGTTATCTACT。
在第二个方面，本发明提供了一种用于检测B型流感病毒基因组末端的引物组，其碱基序列如SEQ ID NO.1～32所示。
在第三个方面，本发明提供了一种用于检测B型流感病毒基因组末端的试剂盒，其包括上述的引物组，进一步地，还包括碱基序列为AGCAGAAGC的反转录引物和环化酶。
在第四个方面，本发明提供了上述的检测方法、引物组或试剂盒在B型流感病毒反向遗传操作系统构建中的应用。由此，依据本发明中的引物对和扩增方法测定得到的B型流感病毒基因组精确3’和5’末端序列，构建反向遗传平台中的各基因片段的重组质粒，大幅度地提高了B型流感病毒的拯救效率。
综上所述，本发明的有益效果为：
采用本发明的检测方法，可简便、快速的完成B型流感病毒基因组各个片段的3’和5’末端序列扩增和检测；该方法的建立显著地提高了B型流感病毒的拯救效率，推动B型流感疫苗的研究与制备工作；依据本发明中的引物对和扩增方法测定得到的B型流感病毒基因组精确3’和5’末端序列，构建反向遗传平台中的各基因片段的重组质粒，大幅提高了B型流感病毒的拯救效率。
附图说明
图1是本发明中B型流感病毒PB2基因5’和3’末端扩增方法的流程示意图；
图2是病毒基因组8个片段反向巢式PCR产物的电泳结果图，其中，泳道从左到右为：M,marker DL 2000；1PB2；2PB1；3PA；4HA；5NP；6NB；7M；8NS；A:B/Lee/1940，B:B/Brisbane/60/2008，C:B/Phuket/3073/2013；
图3是B/Lee/1940PB2基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图4是B/Lee/1940PB1基因cDNA5’和3’末端测序结果部分峰图；
图5是B/Lee/1940PA基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图6是B/Lee/1940HA基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图7是B/Lee/1940NP基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图8是B/Lee/1940NB基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图9是B/Lee/1940M基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图10是B/Lee/1940NS基因cDNA 5’和3’末端测序结果部分峰图；
图11是三株病毒基因组8片段pM重组质粒电泳图，其中，泳道从左到右为：M,marker DL 2000；1pM-PB2；2pM-PB1；3pM-PA；4pM-HA；5pM-NP；6
pM-NB；7pM-M；8pM-NS；
A:B/Lee/1940，B:B/Brisbane/60/2008，C:B/Phuket/3073/2013；
图12是三株病毒拯救病毒第一代尿囊液血凝价测定结果图。
具体实施方式
在一些实施例中，本发明公开了一种B型流感病毒基因组3’和5’末端序列的简便扩增方法及其在B型流感病毒反向遗传操作系统构建中的应用，为此，本发明提供了B型流感病毒8个基因片段(PB2,PB1,PA,HA,NP,NB,M,NS)基因内部保守序列区域设计的16对巢式引物序列和B型流感病毒基因组环化cDNA反向巢式PCR方法，可简便、快速的完成B型流感病毒基因组各个片段的3’和5’末端序列扩增。该方法的建立显著地提高了B型流感病毒的拯救效率，推动B型流感疫苗的研究与制备工作。
在一些实施例中，依据本发明中的引物对和扩增方法测定得到B型流感病毒基因组精确3’和5’末端序列。基于精准测序的片段末端序列来构建反向遗传平台中的各基因片段的重组质粒，可以确保不会由于病毒基因片段包装效率受损而引起的病毒拯救失败，从而可提高B型流感病毒的拯救效率。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本发明中的试剂、材料、质粒、载体、细胞和实验动物等均可从市场上或其它公开渠道获得。
实施例1
B型流感病毒基因组分为8个基因片段，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NB、M和NS。本实施例涉及一种针对B型流感病毒8个基因片段3’和5’末端序列扩增检测的通用方法，包括如下步骤：
首先，以B型流感病毒基因组vRNA 3’末端非编码区高度保守的9个碱基设计反转录引物(*Uni9)，反转录扩增基因组全长cDNA。
利用环化酶将反转录获得的线性cDNA自身环化呈环状cDNA。
根据从Genebank和GISAID网站中下载的不同年份、地区、亚系的具有代表性的B型流感病毒基因组各基因片段序列比对结果，在各个基因编码区内，每条基因片段设计2对反向PCR简并引物(引物序列见表1)，引物序列要求在B型流感病毒中相对保守，并保证最终扩增产物大于300bp，从而保证每个片段的包装信号区域得到充分扩增。
化学合成得到引物后，分别用合成的各基因片段对应的2对引物，对环化cDNA进行巢式反向PCR扩增，得到含有各个基因片段3’和5’末端序列的PCR产物。
将PCR产物克隆进入载体后，挑取多个克隆进行测序并分析测序结果，通过B型流感病毒基因组vRNA各片段高度保守的3’末端非编码区9个碱基(AGCAGAAGC)和5’末端非编码区10个碱基(TGTT/ATCTACT)的定位，即可获得准确的5’和3’末端非编码区及其临近编码区内的核苷酸序列。
本发明的图1以PB2基因为例，概括说明了用本方法扩增单个基因3’和5’末端序列的流程。
根据测定出的各基因片段末端序列设计PCR引物(表1)，扩增病毒基因组各片段，并构建入反向遗传双向表达载体pM-vecor中，制备重组质粒，转染细胞，拯救病毒。
反转录引物*Uni9：5’-AGCAGAAGC-3’(5’末端磷酸化修饰)。
表1 B型流感病毒各基因片段末端扩增引物
应用例1三株B型流感病毒基因组8基因片段3’和5’末端序列鉴定及病毒拯救
本实验选取3株有代表性的B型流感病毒(B/Lee/1940,B/Brisbane/60/2008,B/Phuket/3073/2013)进行基因片段测序并根据末端测序结果，构建反向遗传重组质粒，并拯救病毒。
B/Lee/1940是于1940年首次分离得到的B型流感病毒，是实验室B型流感病毒研究的工具毒株，多用于制备小鼠感染模型和疫苗高产背景毒株。
B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2013分别为B型流感病毒Victory系和Yamagata系的代表毒株，同时也是近年季节性流感疫苗的组成成分。
在已有数据库中(Genebank,GISAID等)公布的B型流感病毒基因组各片段序列大多只包含完整的基因编码框(ORF)内的序列，非编码区序列缺失或者部分缺失。而非编码区序列属于基因片段的包装信号区，其序列的完整性和准确性决定了基因片段的包装效率，是流感病毒拯救成功与否的关键因素。
本应用例将以上述3种典型的B型流感病毒为模型，用实施例1中建立的B型流感病毒基因组3’和5’末端序列简便扩增方法进行基因片段末端序列测定，并根据测定的末端序列构建基因组8片段双向表达载体，进行病毒拯救。
反向遗传操作技术是深入研究B型流感病毒和疫苗研发提供必需的技术平台，快速简便的测定B型流感基因组8条基因末端序列，特别是非编码区序列，将为B型流感反向遗传操作系统快速成功的建立提供有力保障。
1.病毒基因组总RNA提取。
采用Magen病毒RNA提取试剂盒，从B/Lee/1940，B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2013毒株病毒尿囊液中提取基因组RNA，具体操作方法参考说明书。
2.病毒基因组cDNA制备
以Uni9*(5’-AGCAGAAGC-3’)为引物，采用PrimeScript 1st Strand II反转录试剂盒(Takara)对提取的B/Lee/1940，B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2013的基因组总RNA进行反转录获得cDNA。具体操作方法参考反转录试剂盒说明书。
3.cDNA的环化
将反转录得到的cDNA用RNase H处理，特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA后，用CircLigase ssDNA Ligase(Lucigen)对cDNA进行分子内部环化。具体操作为：取cDNA(10pM)模板与CircLigase(100U)和ATP(50μM)混合于60℃作用1h，然后于80℃作用10min灭活CircLigase。最后，用DNA纯化试剂盒(Qiagen)对环化cDNA产物进行纯化后，作为后续巢式PCR反应的模板。
4.基因组8片段5’和3’末端序列的扩增和测序
4.1各基因片段反向巢式PCR引物对的设计
在流感病毒数据库中，下载B/lee/1940和1998-2019年间具代表性的B型流感病毒流行株的8个基因序列。用MegAlign软件进行序列比对分析，选取各基因内部相对保守区域，每条基因设计2对扩增5’和3’末端序列的巢式PCR引物(表1)。在必要的位置选择简并碱基，以保证所设计引物的扩增的广谱性。
4.2巢式PCR扩增
首先进行各基因片段的第一轮PCR扩增：以环化cDNA为模板，用PrimeSTAR(Takara)DNA聚合酶和各基因片段的外巢引物进行第一轮PCR反应。反应条件为：95℃5min；98℃10s，55℃15s，72℃7s(20个循环)；72℃5min。第一轮扩增产物用PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化。
第二轮PCR扩增：第一轮扩增PCR纯化产物为模板，用PrimeSTAR(Takara)DNA聚合酶和各基因片段的外巢引物进行第二轮PCR反应。反应条件为：95℃5min；98℃10s，53℃3s，72℃4s(30个循环)；72℃5min。第二轮PCR扩增后，即可得到B/Lee/1940，B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2013毒株各片段包含5’和3’末端的PCR产物，电泳检测有明显目的条带(图1)。
4.3序列测定与分析
PCR产物经胶回收试剂盒(Qiagen)纯化后，用DNA A-Tailing试剂盒(Takara)加入A尾，连接pMD-18T载体。每个基因片段挑取3～5个阳性重组克隆，交由测序公司进行序列测定。
测序结果分析：根据B型流感病毒cDNA 5’和3’末端保守的9个碱基序列(AGCAGAAGC)和10个碱基序列(TGTTT/ACTACT)，找到每个基因片段的3’和5’末端连接处，连接处两侧的序列即为该基因片段的末端序列。根据实施例1的方法测定的末端序列，将已有数据库中(Genebank,GISAID)中公布的末端序列不完整的基因片段补充完整，获得B/Lee/1940、B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2013三株病毒的完整基因组序列。
以B/Lee/1940基因组8片段的末端测序结果为实例，概述展示从测序结果中查找各个基因片段的5’和3’末端序列的方法(参见图3～图10)。
5.重组双向表达质粒的构建及病毒拯救
5.1重组质粒构建
利用同源重组技术，根据每个基因片段测得的末端序列，设计同源重组引物，分别将B/Lee/1940、B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2013的8个基因片段构建进入双向表达载体(pM)中，具体操作参见ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme)说明书。构建的三套8质粒反向遗传操作系统重组质粒经测序鉴定后，中提阳性重组质粒用于转染(参见图11)。
5.2病毒的拯救
将293H细胞与MDCK细胞以10:1比例混合铺至6孔板，次日细胞密度长至80％左右开始转染。分别取每种病毒的全套8质粒(pM-PB2、PB1、PA、HA、NP、NB、M、NS)，各1ug。将8质粒稀释后与稀释好的lipofectamine 2000混合，转至细胞板，转染后8h换液并加入1ug/mlTPCK胰酶，继续培养48h。收集细胞上清冻于-80度冰箱过夜，3000rpm离心5min，将0.2ml上清接至9日龄鸡胚，培养48h，收鸡胚检测病毒效价。如果血凝检测阳性，收获鸡胚尿囊液。提取RNA，RT-PCR扩增拯救病毒基因组，PCR产物测序鉴定。
根据本实验测定的3株病毒基因组各片段5’和3’末端所构建的3套重组质粒，均能一次成功拯救流感病毒。所拯救的第一代病毒血凝价(参见图12)可以达到B/Lee/1940(HA＝64)、B/Brisbane/60/2008(HA＝64)、B/Phuket/3073/2013(HA＝128)。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学
<120> 一种流感病毒基因组末端检测方法及其应用
<130> 2020
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ggaaarggag aagacgtc 18
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gctgctctgc tatgrgc 17
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggacaatagg acattt 16
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tggtctttgg gttttaa 17
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acggaacmtt cctcaagc 18
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
catgtcyctt aatactacc 19
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
atcaccagaa gagggag 17
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctggygttga agggtaa 17
Claims (10)
1.一种流感病毒基因组末端检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取流感病毒基因组，经反转录、环化反应得到环化的cDNA；
2)对步骤1)所得环化cDNA进行巢式反向PCR扩增，得到含有各个病毒基因片段3’和5’末端序列的PCR产物；
3)将步骤2)所得PCR产物克隆进入载体后，挑取至少2个克隆进行测序并分析测序结果，通过流感病毒基因组各基因片段高度保守的3’末端非编码区序列和5’末端非编码区序列的定位，即可获得准确的5’和3’末端非编码区及其临近编码区内的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流感病毒为B型流感病毒。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述反转录采用的引物的碱基序列为AGCAGAAGC。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述巢式反向PCR扩增采用的引物包括针对B型流感病毒的每个基因设计的2对反向PCR简并引物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述反向PCR简并引物的设计要求为：在B型流感病毒中相对保守，并保证最终扩增产物大于300bp，从而保证每个靶基因片段的包装信号区域得到充分扩增。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述反向PCR简并引物的碱基序列如SEQ ID NO.1～32所示。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述3’末端非编码区序列为AGCAGAAGC，所述5’末端非编码区序列为TGTTATCTACT。
8.用于检测B型流感病毒基因组末端的引物组，其碱基序列如SEQ ID NO.1～32所示。
9.用于检测B型流感病毒基因组末端的试剂盒，其包括权利要求8的引物组，进一步地，还包括碱基序列为AGCAGAAGC的反转录引物和环化酶。
10.权利要求1～7任一项的检测方法、权利要求8的引物组或权利要求9的试剂盒在B型流感病毒反向遗传操作系统构建中的应用。
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| CN202010277733.5A CN111560470A (zh) | 2020-04-09 | 2020-04-09 | 一种流感病毒基因组末端检测方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116875740A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-10-13 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 用于特异性扩增cva4病毒基因组非编码区的引物、试剂盒和方法 |
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| US20150133329A1 (en) * | 2012-05-03 | 2015-05-14 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of | Methods of detecting influenza virus |
| CN105121664A (zh) * | 2013-02-20 | 2015-12-02 | 埃默里大学 | 混合物及其相关组合物中的核酸的测序方法 |
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2020
- 2020-04-09 CN CN202010277733.5A patent/CN111560470A/zh active Pending
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